מאמר שיטה

תהליך עבודה של טומוגרפיית קריו-אלקטרון לרקמות עבות שהודגם בהיפוקמפוס של עכבר

DOI:

10.3791/70192

⸱

27 במרץ 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתקן את טומוגרפיית הקריו-אלקטרון (קריו-ET) לרקמות עבות על ידי שילוב הקפאה בלחץ גבוה (HPF) עם שיטת הוופל, הרמת קרן יוני מוקד קריוגנית (crio-FIB), ורכישה מקבילה סימטרית במינון, מה שמניב למלות דקות ודגימות מזגוגות לניתוח שכפול בשטח בהיפוקמפוס העכבר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיית קריואלקטרונים (קריו-ET) מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של מבנה אולטרה-מבנה תאי טבעי, אך יישומה לרקמות עבות מוגבל בשל חוסר בוויטריפיקציה אמינה ובהכנת למלה בעלת תפוקה נמוכה. כאן מוצגת זרימת עבודה מקצה לקצה המשלבת הקפאה בלחץ גבוה (HPF; ~2100 בר; זמן פירוק להקפאה ≤90 שניות) באמצעות מכלול "וופל" עם נייר כסף מנחושת לרקמה דקה מוקדמת, הרמת קריו-FIB ודילול מבוקר ללמלות 120–200 ננומטר עם פיצוי הטיה יתר. ציפוי מוליך הוא סטנדרטי (Sputter-Pt 30 mA/15 s; מכסה GIS 0.5–1.0 מיקרון) כדי למזער את הווילון. איסוף נתונים אוטומטי, סימטרי במינון (0°, ±3°, ±6°... ל-±60–66°; גודל צעד של 2–3°; מינון כולל 100–150 e⁻/Å2) מיושם באמצעות סקריפטים של PACEtomo, כאשר זווית ההטיה ההתחלתית נגזרת מזווית המילוינג וכיוון הדגימה. עיבוד עם AreTomo 3 מספק פונקציות לתיקון תנועה, הערכת CTF, יישור ושיחזור WBP בזמן כמעט אמת; IsoNet עשויה באופן אופציונלי להפחית אניזוטרופיית יתד חסרה. ממוצע תת-טומוגרפי (RELION 4.0) פועל לפי אסטרטגיית פסאודו-סאבטומוגרמה עם דיווח רזולוציה המבוסס על סף FSC של 0.143. התהליך מודגם על היפוקמפוס עכברים, והוא מייצר באופן שגרתי דגימות מזגוגות היטב ולמלות אחידות (עובי יעד 150 ± 40 ננומטר) ומשיג איסוף בסדרת הטיה בתפוקה גבוהה (בדרך כלל 5–8 דקות לסדרת הטיה). פרוטוקול זה מציע מסלול שכפול ללימוד ביולוגיה מבנית במקום ישירות מסביבות רקמות מורכבות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיית קריו-אלקטרונים (קריו-ET) הפכה לטכניקה מרכזית להמחשת קומפלקסים מקרומולקולריים וארכיטקטורות תאיות במצבם ההידרטי במקור 1,2,3,4,5. על ידי שחזור נפחים תלת-ממדיים מסדרת הטיה של תמונות הקרנה, קריו-ET מגשר על הפער בין הקשר תאי לרזולוציה קרובה לאטומית, ומציע תובנות חסרות תקדים בביולוגיה מבנית במקום6. בעוד שזרימות העבודה של טומוגרפיה אלקטרונית קריו-אלקטרונית עבור דגימות תאיות7 (כולל תאים מדוללים בקריו-FIB בתלים ותאים דביקים) מבוססות היטב, ההרחבה הישירה שלהן לרקמות עבות ושלמות אדריכלית נותרה מאתגרת מאוד 8,9,10. זה נכון במיוחד לרקמות עם תכולת מים גבוהה כמו מוח11, שבהן ויטריפיקציה אמינה והכנת למלות שקופות אלקטרונים (בדרך כלל <200 ננומטר) ממשיכות להוות צווארי בקבוק מתמשכים12.

השגת הזגוג ברקמות היא אתגר בשל תכולת המים הגבוהה שלהן והעברת החום המוגבלת. בעוד שהקפאה טבילה יעילה לדגימות דקות (≤20 מיקרון)13, היא נכשלת ברוב הרקמות. הקפאה בלחץ גבוה (HPF) מדכאת את יצירת גרעין הקרח על ידי הפעלת לחץ גבוה, ומאפשרת ויטריפיקציה של דגימות עד ~200 מיקרון בתיאוריה. עם זאת, היעילות של HPF קונבנציונלי לעיתים קרובות אינה מיטבית בוויטריפיקציה של רקמות. לשיפור התוצאות, מאמצים אחרונים השתמשו באסטרטגיות כמו הוספת קריופרוטקטנטים14 וביצוע חתך מוקדם15,16 (למשל, שימוש בויברטום) כדי להקטין את עובי הדגימה מכנית לפני הקפאה 11,17. בעוד שגישות אלו יכולות לשפר את איכות הזגוגית, הן לעיתים כוללות טיפול ממושך ב-ex vivo ושימוש בתוספים כימיים המסכנים לשנות את המבנים הטבעיים. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, מחקר זה שינה את אסטרטגיית נושא ה"וופל" שפותחה במקור על ידי קלי ואחרים.18 על ידי שילוב אופטימיזציה קריטית: רקמת המוח נדחסת פיזית באמצעות שני נושאי נחושת מלוטשים לפני ההקפאה, מה שמדלל מראש את הדגימה תוך שמירה על הרשת המצולמת לנייר כסף מנחושת. עיצוב זה לא רק מקדם ויטריפיקציה מהירה ואחידה, אלא גם משפר משמעותית את היציבות המכנית, ובכך מונע ביעילות שבירת רשת ואובדן דגימות במהלך טיפול מאוחר, ומבסס בסיס איתן לקבלת דגימות רקמות קפואות שלמות ואיכותיות.

לאחר הוויטריפיקציה, הדילול נותר מחסום מרכזי הן לקצב הייצור והן לאיכות. כשיטה מוקדמת ואומצה באופן נרחב, קריו-אולטרה-מיקרוטומיה מאפשרת מחקרים מבניים בסיסיים רבים במקום. למרות זאת, הוא מציג לעיתים קרובות חפצי דחיסה וחיתוך19,20 שפוגעים בשלמות המבנה. לעומת זאת, כריזת קרן יונים ממוקדת קריו (cryo-FIB)21 מציעה דיוק מעולה ועיוות מינימלי 7,22. בתחילה, טחינת קריו-FIB יושמה ישירות על דגימות מזגוגות ברשתות ליצירת למלות23; עם זאת, גישה זו במיקום יעילה בעיקר עבור דגימות דקות24,25 (למשל, תאים מתורבתים או אזורים ברקמה היקפית) ואינה יכולה לגשת למבנים עמוקים יותר בתוך רקמות עבות ומגושמות. כדי להתגבר על מגבלת העומק הזו, פותחו אסטרטגיות ההרמה26, שאפשרו חילוץ אזורי עניין (ROIs) ממפנים הדגימות, בהתאם למקום. התקדמויות מתודולוגיות נוספות, כולל הרמת27 סדרתית וחתך סידורי על הרשת (SOLIST)28, שיפרו עוד יותר את קצב התפוקה, יציבות הלמלרית ואת דיוק המיקוד התלת-ממדי ברקמות מורכבות. בשנים האחרונות, חידושים ממשיכים לקדם את התחום, כולל שיטת החיבור בעל שישה צדדים מאת טאנג ואח', המשפרת ייצוב מכני במהלך הרמה ודילול, וכן גישות חדשניות של חינוק על הרשת של בנג'מין ס. קריקמור ואחרים, המאפשרות גישה למבנה עמוק תוך שמירה על הקשר רקמתי מקומי. למרות ההתקדמות הזו, הפרוטוקולים עדיין משתנים ביעילות, בשחזוריות ובגמישות בין סוגי רקמות שונים. פער קריטי נמשך בהקמת תהליך עבודה סטנדרטי, קל לשכפול ויישום רחב, שמשלב אופטימיזציות אלו לצינור קוהרנטי לרקמות עבות מגוונות.

פער זה נפתר כאן על ידי סינתזה של פרטים טכניים מרכזיים מתודולוגיות מבוססות ושיפורם לצינור כללי מקצה לקצה. פרוטוקול זה לא רק משתמש בשיטת HPF-וופל המשופרת לוויטריפיקציה עמידה, אלא גם משלב סדרת שלבים אופטימליים בהרמה ודילול קריו-FIB, כגון פיצוי שיטתי של הטיית יתר, ציפוי מוליך סטנדרטי, ורצפי מילינג מכוילים, שמגבירים יחד אחידות למלה, מפחיתים ארטיפקטים (למשל, וילונות) ומשפרים את קצב התפוקה. בניגוד לפרוטוקולים המותאמים לסוגי תאים ספציפיים או אורגניזמים מודליים, זרימת עבודה זו מעוצבת עם הכללה בלב שלה, ומספקת מסגרת גמישה המותאמת למגוון רחב של רקמות עבות ומורכבות, כולל כאלה שהן רכות יחסית ונוטות לדחיסה, מעבר להיפוקמפוס העכברי המודגם.

כפי שהודגם במודל המאתגר של היפוקמפוס העכברים, הידוע ברגישותו לנזקי קרח ומורכבות מבנית, תהליך משולב וכללי זה מייצר באופן אמין למלות איכותיות (120–200 ננומטר) ותומך ברכישת טילט יעילה בסדרה (5–8 דקות לסדרה). איחוד שיטות עבודה מומלצות לפרוטוקול קוהרנטי, נגיש ורחב יישום מספק מסגרת ניתנת לשחזור שמורידה את המחסום הטכני ליישום קריו-ET במחקר רקמות עבות בהקשרים ביולוגיים וביו-רפואיים מגוונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכוללים רקמת בעלי חיים עמדו בדרישות SUSTech IACUC (פרוטוקול SUSTech-JY202501019). הרגנטים והציוד בו השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת תמיכה לדוגמה

  1. הכנת נושאי HPF (ראו איור 1A)
    1. השגת זוג נשאי HPF בנחושת 6 מ"מ (סוג B). ודא שלאחד הנושאים יש משטח שטוח.
    2. הרטיב את המשטח השטוח של הנושא והמשיך לטחון. ראשית, השתמש בנייר זכוכית 8000 עד שהסימנים המקוריים מוסרים לחלוטין. לאחר מכן, עברו לנייר זכוכית 12000 גריט והמשיכו לטחון עד שהשריטות מהשלב הקודם ייעלמו ברובן, מה שמוביל לגימור חלק ואחיד. איור 2 מציג תמונות טיפוסיות של פני הנושא במהלך תהליך הטחינה והליטוש.
    3. ללטש את משטח הקרקע באמצעות בד מטלוגרפי רך ומשחת יהלום W0.5: ראשית, מרחים את המשחה על הבד, ואז ליטשו את המשטח בתנועה מעגלית למשך 1–2 דקות עד להשגת גימור חלק ומלוטש מאוד. שטוף היטב את הנושא באתנול, ואז מים מזוקקים כדי להסיר את כל שאריות השוחק.
    4. טבלו את הנושאים המלוטשים ב-1-הקסדקן למשך מינימום של 4 שעות (או לילה) לפני השימוש.
      הערה: נשאים מלוטשים ומטופלים יכולים להיאחסן מתחת למים ב-1-הקסדקן.
      אזהרה: 1-הקסדקן דליק ומזיק אם נשאף אותו; לעבוד במכסה אדים עם ציוד מגן אישי.
  2. הכנת רשת תמיכה ל-TEM (ראו איור 1B)
    1. השתמש ברשתות נחושת של 100 רשתות עם סרט תמיכה רציף של פורמוואר/פחמן.
    2. ציפוי שני צידי הרשת בזהב באמצעות ציפוי ספטר: כוון את הזרם ל-50 מילי-אמפר וציפוי כל צד למשך 120 שניות כדי להגיע לשכבה של כ-6 ננומטר לכל צד.
  3. הכנת נייר נחושת (ראו איור 1C)
    1. השגת נייר נחושת טהור גבוה בעובי של 1 מיקרון.
      הערה: ההולכה התרמית של נחושת משתנה עם הטוהר, וטוהר נמוך יותר מוביל למוליכות תרמית נמוכה יותר. לכן, נדרש נייר נחושת טהור גבוה (Cu ≥ 99.9%).
    2. מחורר את נייר הנחושת לדיסקים בקוטר 3 מ"מ באמצעות חור עגול.

2. הקפאה בלחץ גבוה

  1. הנח טיפה של 10 מיקרוליטר עם תמיסת סוכרוז 10% על משטח זכוכית נקי.
  2. נתח במהירות את ההיפוקמפוס מעכבר שזה עתה הורד. כריתת חתיכות רקמה קטנות בגודל של כ-0.5–1 מ"מ 3 באמצעות להב גילוח חד (ראו איור 1D).
  3. העבר את הרקמה לרשת התמיכה הנחושת של TEM (100 רשתות) בתוך נשא ה-HPF באמצעות קיסם או מברשת דקה. השתמש ב-2-מתילבוטאן (איזופנטנ) כדי להזיז בעדינות את הרקמה למקומה תוך מזעור הלחץ המכני על הרשת.
    אזהרה: 2-מתילבוטאן (איזופנטאן) דליק מאוד. תטפל בו עם מכסה אדים בלי מקורות הצתה.
  4. כסו את הרקמה והרשת בדיסק אלומיניום בקוטר 3 מ"מ. השלים את ההרכבה על ידי הנחת נושא ה-HPF השני (שטוח עם הפנים כלפי מטה) למעלה ליצירת סנדוויץ' "וופל" אטום (ראו איור 1E).
    הערה: נייר הנחושת ממלא תפקיד מכני קריטי במכלול הוופל. הוא דוחף את הרקמה בין רשת ה-TEM לנייר האלומיניום עצמו. במהלך ההרכבה, תצורה זו מפעילה לחץ עדין, המסייע ליצור פרוסת רקמה דקה ואחידה יותר, האידיאלית לוויטריפיקציה. יתרה מזאת, הנייר מונע אובדן רקמות במהלך הטיפול ועוזר לפזר לחץ במהלך הקפאה בלחץ גבוה, מה שמפחית את הסיכון לשבירת הרשת. לאחר ההקפאה, הנייר גם מקל על הפרדת הנשאים מרשת הדגימות המזגוגת. עם זאת, שיטת הכנה זו עלולה לגרום לנזק דחיסה מכני ואינה מתאימה לדגימות הרגישות לארטיפקטים הנגרמות מלחץ. לדגימות כאלה, יש לשקול טכניקות חיתוך חלופיות שמשיגות עובי מתאים ללא דחיסה, כגון חתך ויברטום או ניקוב דגימה.
  5. יש להתחיל מיד את הליך ההקפאה בלחץ גבוה בהתאם לפרוטוקול התפעול של היצרן. קבע את לחץ היעד ל-~2100 בר וודא שהזמן הכולל מניתוח הרקמה ועד ההקפאה לא יעלה על 90 שניות.
    הערה: כל ההליך, מהניתוח ועד ההקפאה, צריך להסתיים תוך 90 שניות כדי למזער שינויים מבניים הקשורים לזמן אקס ויבו ממושך. טווח עובי הרקמות במוח הוא כ-20–40 מיקרון.

3. מילינג והרמה של ה-FIB

הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות מיקרוסקופ דו-קרני המצויד בשלב קריו. שמור על טמפרטורת הדגימה מתחת ל-170 מעלות צלזיוס לאורך כל הדרך.

  1. הכנת רשת המקלטים
    1. השגת רשת זהב חדשה עם 300 רשתות שתשמש כרשת המקלט הסופית להליך ההרמה.
    2. מתחת למיקרוסקופ סטריאו-מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר, חבר בעדינות את הרשת לטבעת AutoGrid קריו-FIB תואמת.
    3. אחסן את ה-AutoGrid המורכב ישירות בתנור יבש המתוחזק בטמפרטורה של כ-40°C כדי למזער הצטברות כפור לפני השימוש.
      הערה: במהלך החיתוך ודא שהרשת מונחת שטוחה ובמרכז כדי למנוע כיפוף או חוסר יישור.
  2. שליפת והרכבת רשת הרקמה המזגוג
    1. בעת טבילה רציפה של ההרכבה בחנקן נוזלי (LN₂), הפרדו בזהירות את רשת ה-TEM המזגוג (המכילה את הרקמה ואת נייר הנחושת) מרכיבי ההרכבה ה"וופל" שמסביב.
      הערה: מרווח נייר הנחושת בדרך כלל הופך את הרשת לקלה להפרדה מהנשאים.
    2. בתחנת עבודה טעינה קריו-מקוררת מראש, התקן את רשת הרקמה המבודדת בטבעת AutoGrid שנייה של קריו-FIB תחת הגנת LN₂.
  3. טעינה משותפת של רשתות על מעבורת הקריו-טרנסר
    1. טען את שני ה-AutoGrids לחריצים המיועדים של מעבורת ההקפאה.
    2. כוון כל AutoGrid כך שחריץ המילוינג פונה החוצה ויהיה אנכי.
    3. השאירו את השאטל הטעון בטבילה של LN₂ או מקורר מראש עד להעברה למיקרוסקופ FIB/SEM.
  4. לוקליזציה וציפוי מוליך ב-FIB/SEM
    1. לאחר העברה קריוג'ית למיקרוסקופ, יש לנווט לרשת הרקמה בהגדלת SEM נמוכה.
    2. מרח ציפוי מוליך ומגן על כל משטח הרשת.
      1. ציפוי את פני הרשת בפלטינה (Pt) ב-30 mA למשך 15 שניות.
      2. הפקדו מכסה Pt אורגנומטלי בעובי 0.5–1.0 מיקרון באמצעות מערכת הזרקת גז (GIS).
      3. מרח שכבת Pt סופית מצופה ספאטר על פני הרשת ב-30 mA למשך 15 שניות.
        הערה: תקרת ה-GIS קריטית להפחתת ארטיפקטים של וילונות.
  5. בידוד והרמה של חסימת רקמה (ראו איור 3)
    1. בחירת אתר והכוונה
      1. ניווט לאזור העניין הנבחר (ROI) ברשת הרקמה באמצעות תמונת קרן האלקטרונים של SEM.
      2. כוון את הדגימה לחריטה בצד הקדמי. מיקום שלב טיפוסי מוגדר לסיבוב של 110° והטיה של 7°, ומיקום זה מציג את פני הדגימה בזווית המתאימה לגישה לקרן היונים.
        הערה: בהיעדר סמנים פלואורסצנטיים ניתן להשתמש באסטרטגיית סינון מוקדם. אסטרטגיה זו שואפת לאתר את אזור הרקמה היעד ולהוציא אזורים המכילים מגן קריופרוטקט או רכיבים אחרים שאינם רקמתיים. לאחר בחירת אזור שנראה חופשי מקרח פני השטח, חצו תעלה קטנה באמצעות זרם קרן גבוה יותר (למשל, 15 ננו-אמפר ב-30 קילו-וולט) בכיוון הקדמי הסטנדרטי וליטשו באמצעות זרם קרן נמוך יותר (למשל, 1 ננו-אמפר ב-30 קילו-וולט). עברו לקרן האלקטרונים כדי לבדוק את החתך: הרקמה מציגה ניגודיות מצוינת תחת קרן האלקטרונים, תכונה הבולטת במיוחד במבנים קמברניים ואזורים עשירים ביסודות כבדים; לעומת זאת, הקריופרוטקטנט בדרך כלל מציג ניגודיות אחידה תחת קרן האלקטרונים. דבר זה מאפשר אימות מהיר לפני ביצוע הליך ההרמת המלא.
    2. טחינת תעלות לבידוד הבלוק (איור 3A)
      1. הגדר תעלה מלבנית סביב בלוק הרקמה המטרה באמצעות קרן יונים הפועלת ב-30 קילו-וולט.
      2. התחל לטחינה במרחק מסוים מהבלוק באמצעות זרם גבוה יחסית של 15 ננו-אמפר כדי להשיג הסרת חומר מהירה.
      3. כאשר קירות התעלה מתקרבים לבלוק למרחק של כמה מיקרומטרים, הפחיתו את זרם קרן היונים ל-7 ננו-אמפר. הפחתת הזרם משיגה שליטה מדויקת יותר וממזערת נזק לקרן היונים ולחימום החומר הביולוגי באזור העניין.
      4. השאירו צד אחד של הבלוק מחובר לחומר הגדול כ"לשון" כדי להחזיק אותו במקום זמנית.
    3. חריטה תת-קרקעית אופציונלית לבלוקים עבים (איור 3B)
      1. לבלוקים רקמתי בעובי מוערך מעל 20 מיקרון, יש לבצע שלב חיתוך מתחת מהצד ההפוך כדי להקל על ההרמה הסופית.
      2. סובב את הבמה (למשל, ל-70- מעלות) ומתאים את נטיית הבמה (למשל, ל-23°) כדי להגיע לתחתית הבלוק.
      3. לטחון את החיבור התחתון באמצעות ה-FIB של 30 קילו-וולט וזרם של 3 ננו-אמפר.
    4. חיבור למחט המיקרומניפולטור (איור 3C)
      1. כדי לחבר את הדגימה למחט, יש לבצע דפוסי חריקה בחתך רוחב רציף.
        הערה: ניתן להוציא את גוש הזהב מתוך מוט של רשת זהב בת 300 רשת.
    5. הרמת בלוק הרקמה (איור 3D)
      1. חתך את ה"טאב" שנותר שמחבר את הבלוק לדגימת המנה באמצעות ה-FIB (30 kV, 1 nA).
      2. תמרן בזהירות את מחט המיקרומניפולטור כדי להרים את בלוק הרקמה המבודד כך שיהיה נקי לחלוטין מהתעלה ומהרשת המקורית שמסביב. לאחר מכן, משוך את המחט והעביר את הבלוק לרשת המקלט.
    6. העברת בלוקים, ריתוך וציפוי מחדש
      1. נווט את המחט לרשת מקלטים זהב עם 300 רשתות מקוררות מראש.
      2. הורד את הבלוק על ריבוע רשת שנבחר. הביאו את בלוק הרקמה למגע עם הסרט על הרשת, ואז הרמו את הבלוק אנכית כדי לנתק את המגע. לטחון פרוסה בעובי ~3–4 מיקרון מהבלוק אל סרט הרשת באמצעות קרן היונים (30 kV, 1 nA) (איור 3E).
        הערה: אם יש שאריות קרח, יש לנקות מראש את אתר החיבור בדפוס מלבני (30 קילו-וולט, 50 pA). ודא שהבלוק נוגע בסרט הרשת כדי להפחית מטען אלקטרוסטטי, שעלול להזיז את הפרוסה באופן אקראי.
      3. רתכו את הפרוסה בצורה בטוחה על ידי מילינג באמצעות דפוסי חתך ניקוי משני צידי הצומת (30 קילו-וולט, 30 pA) (איור 3F).
      4. החלו מחדש את הציפוי המוליך/המגן כפי שמתואר בשלב 3.4.2 (איור 3G).
        הערה: בשלב ציפוי GIS זה ניתן לקצר את משך הזמן בהתאם לגודל הבלוק.
    7. דילול למלה
      1. סובבו את הבמה (למשל, ל-70- מעלות והגדרו הטיית שלב ראשונית (למשל, 15°) (איור 3H).
        הערה: מחזיק הדגימה כולל הטיה מוקדמת של 45°.
      2. הגדר את מיקום הלמלה הסופי באזור חלק של בלוק הרקמה.
        הערה: אשר שהאזור שנבחר נקי מזיהום קרח.
      3. בצע מילינג שיטתי באמצעות זרמי קרן היונים המפורטים בטבלה 1. ההתקדמות מתבצעת מזרמים גבוהים לנמוכים ככל שמתקרבים למישור המטרה (איור 3I,J). באופן אופציונלי, כאשר המרחק של 1–2 מיקרון מהלמלה, ניתן לחפור תעלה להקלה על מתחים במרחק של כ-1.5 מיקרון כדי למנוע כיפוף או עיקול של הלמלה 30,31.
        הערה: כאשר החומר הנותר נמצא בטווח ~1 מיקרון ממישור המטרה, הגבל את העובי שהוסר בכל מעבר.

4. איסוף נתוני קריו-ET

  1. לאחר הכנת למלה מוצלחת, טעינו בזהירות את הרשת למיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM) המצויד במחזיק קריו, מסנן אנרגיה ותוכנת טומוגרפיה (למשל, SerialEM).
  2. רכוש מפת אטלס של כל הרשת (למשל, איור 4A; ההגדלה הטיפוסית היא 155×).
  3. ניווט למיקום הלמלה וקבל מפת מונטאז' (למשל, איור 4B; הגדלה טיפוסית היא 3600× עם דה-פוקוס של -100 מיקרון).
  4. הגדר את ההגדלה הנומינלית של ההקלטה ווודא שגודל הפיקסל מתאים לרזולוציה המיועדת; במחקר הנוכחי נעשה שימוש בגודל פיקסל של 2.109 Å. כוונן את פרמטרי התאורה המתאימים, כולל גודל נקודה, קוטר צמצם C2 ושטח ההארה, כדי להשיג קצב מינון אופטימלי לגלאי האלקטרונים הישיר.
  5. הגדר את תנאי הפוקוס ותנאי התאורה הניסיוניים כך שיתאימו לאלו שנקבעו עבור פרמטר ה-Record.
  6. בצע איסוף נתונים באמצעות סקריפטים של PaceTomo32, בהתאם לשלבים הבאים:
    1. בחר מראש מטרות במפת המונטאז' באמצעות פונקציית "הוספת נקודות" בניווט, כדי להבטיח שהתכונה הראשונה תראה ניגודיות מספקת.
    2. בחר מטרות באמצעות סקריפטPACEtomo_selectTargets.py 32, תוך התאמת האזור המוצג בהגדלת התצוגה המקדימה במידת הצורך. אזורים טיפוסיים של עניין מוצגים באיור 4C.
    3. רכישת סדרת הטיה באמצעות סכמת סימטרית מינון (למשל, 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... עד ±60°–66°) עם תוספת של 2° או 3°. הגדר פרמטרי רכישה בסקריפט PACEtomo.py: זווית ההטיה ההתחלתית נקבעת על ידי זווית המילוינג המוגדרת בשלב 3.7.1 (כלומר, 8°), כאשר הסימן שלה תלוי בכיוון עומס הדגימה בקריו-EM; זוויות ההטיה המינימליות והמקסימליות מתייחסות לערכים מוחלטים; וגודל הצעד מתאים לתוספת ההטיה (למשל, 3°).
      הערה: זווית ההטיה ההתחלתית הזו מיועדת למקם את הלמלה אופקית ובניצב לקרן האלקטרונים. אם זווית הטחינה אינה ידועה, הטה את התמונה כדי להציג את הלמלה בגובה הנראה הגבוה ביותר שלה; זה מספק יישור מדויק מספיק.
    4. שמור על מינון אלקטרונים מצטבר של 100–150 e⁻/Å2 המפוזרת בכל ההטיות. אם זמין, השתמש במסנן אנרגיה ברוחב חריץ של 10 eV.
    5. התחל באיסוף נתונים. מיקוד ומעקב אוטומטיים מיושמים בכל זווית הטיה. זמן הרכישה הטיפוסי לסדרת הטיה בודדת הוא 5–8 דקות.
      הערה: מדריך לפתרון תקלות מסופק בטבלה 2.

5. עיבוד נתונים

  1. תהליך תיקון תנועה בסדרת הטיה, הערכת CTF, יישור ושיחזור טומוגרפיה תלת-ממדית באמצעות AreTomo3 33 לביצוע שלושה שלבים מרכזיים: (1) תיקון תנועה של פריימים גולמיים של תמונה, (2) הערכת פונקציית העברת הניגודיות (CTF) לכל תמונת הטיה, ו-(3) יישור כל סדרת ההטיה.
    1. לאחר יישור, שחזור טומוגרמות תלת-ממדיות (3D) באמצעות אלגוריתם ההקרנה האחורית המשוקללת. הקלטים הנדרשים לשלב זה כללו: מסגרות תמונה גולמיות, קבצי מטא-דאטה של mdoc (המתעדים פרמטרי רכישה בסדרת הטיה), וציר הסיבוב שנקבע מראש של הדגימה.
  2. תיקון טריז חסר
    1. לאחר השחזור, הטומוגרמות שנוצרו עברו תיקון טריז חסר באמצעות IsoNet34.
  3. בחירת חלקיקים ואוצרות
    1. בצע איסוף חלקיקים ב-EMAN 2.935 באמצעות שיטת התאמת התבנית. לאחר הבחירה האוטומטית, חיוביים שגויים (כלומר, אזורים שאינם מטרה או אזורים שנבחרו בטעות) הוצאו ידנית כדי להבטיח את איכות מאגר הנתונים של החלקיקים הנבחרים.
  4. ממוצע תת-טומוגרפי
    1. ייבא את סדרת ההטיה ואת קואורדינטות החלקיקים המתאימות ל-RELION 4.0. בצע ממוצע תת-טומוגרפי בהתאם לזרימת העבודה הסטנדרטית המפורטת בתיעוד RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), שמבטיח עמידה בפרקטיקות הטובות ביותר לשחזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יישום מוצלח של פרוטוקול זה מאפשר ייצור למלות רקמות איכותיות ומזגוגות ושיחזור טומוגרפיות המגלות מבנה תאי טבעי. התוצאות הבאות, שהודגמו באמצעות רקמת היפוקמפוס של עכברים, מייצגות ניסוי מוצלח.

בלוקי רקמה שעובדו בהקפאה בלחץ גבוה בשיטת "וופל" הציגו מראה אחיד ושקוף אלקטרון (איור 4B,C). דגימות מזגוגות לחלוטין לא הראו ניגודיות דיפרקציה הקשורה לקרח גבישי קרח. ספקטרום ההספק שמקורם בסדרות הטיה הציגו פרופיל מפוזר ללא טבעות דיפר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה המוצגת כאן יוצרת צינור כללי, אופטימלי וניתן לשחזור עבור טומוגרפיה אלקטרונית קריו-מקומית של רקמות עבות ילידיות. התרומה העיקרית שלו אינה בהמצאת טכניקות ייחודיות, אלא באינטגרציה שיטתית, שיפור ותקנון מפורט של כל התהליך, מהוויטריפיקציה החזקה בשיטת וופל-HPF מותאמת ועד פרוטוקול הרמת ודילול קריו-FIB מדויק. סינתזה זו מתמודדת עם הפער הקריטי של השחזוריות והנגישות שלעיתים נתקלים בו כאשר מיישמים קריו-ET על רקמות מורכבות.

שלבים קריטיים ואופטימי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לצוות מרכז Cryo-EM באוניברסיטה הדרומית למדעים וטכנולוגיה על התמיכה הטכנית. הפרויקט נתמך על ידי החדשנות הלאומית במדע וטכנולוגיה (טכנולוגיית מדעי המוח וטכנולוגיית המוח – הפרויקט הלאומי למדע וטכנולוגיה, מענק מס' 2022ZD0211905) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 32200998 ומס' 32161133022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-הקסדקןסיגמא-אלדריץ'H2131כימיקלים וחומרים ריאגנטים
2-מתילפנטאןסיגמא-אלדריץ'M65807כימיקלים וחומרים ריאגנטים
קליפ-רינגתרמו פישר סיינטיפיק1131750; 1188953מוצרי צריכה
נייר כסף מנחושתחומרי מתכת פנגצ'נג1 ומיקרו; עובי mמוצרי צריכה
רשתות TEM תמיכה בנחושת (100 רשתות)בייג'ינג ג'ונגג'ינגקיי טכנולוגיה בע"מBZ10021bמוצרי צריכה
קריו-EMתרמו פישר סיינטיפיקKrios G4ציוד  
קריו-FIBתרמו פישר סיינטיפיקאקילוס 2ציוד  
Cryo-FIB Autogridתרמו פישר סיינטיפיק1205101מוצרי צריכה
רשתות (UltrAufoil R 1.2/1.3 רשת 300)קוונטיפוילאלטראופוילמוצרי צריכה
מקפיא בלחץ גבוהלייקה מיקרוסיסטמסEM ICEציוד  
נשא HPF, נחושתלייקה מיקרוסיסטמססוג B (6 מ"מ)מוצרי צריכה
ציפוי יונים עם ספטרקוורוםQ150RS פלוסציוד  
משחת ליטוש מטלוגרפיתLab-testecW0.5מוצרי צריכה
בד ליטושגוראלB00809מוצרי צריכה
נייר זכוכיתנייר זכוכית של מותג איגל8000-גריט, 12000-גריטמוצרי צריכה
סטריאומיקרוסקופלייקה מיקרוסיסטמסS9i<שם="טווח! D17">Equipment 
סוקרוזהסיגמא-אלדריץ'200-334-9כימיקלים וחומרים ריאגנטים
תוכנת רכישה בסדרת Tilthttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9תוכנה
יישור סדרת הטיה ו-Tilt תוכנת שחזורhttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3תוכנה
תוכנת רכישה בסדרת Tilthttps://github.com/eisfabian/PACEtomoפייסטומותוכנה
יישור סדרת הטיה ו-Tilt תוכנת שחזורhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetתוכנה
יישור סדרת הטיה ו-Tilt תוכנת שחזורhttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2תוכנה
יישור סדרת הטיה ו-Tilt תוכנת שחזורhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlרליון 4תוכנה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
  2. Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: The resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52 (1), 339-360 (2023).
  4. Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature. 628 (8006), 47-56 (2024).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 58, 1-9 (2019).
  6. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  7. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  8. McCafferty, C. L., et al. Integrating cellular electron microscopy with multimodal data to explore biology across space and time. Cell. 187 (3), 563-584 (2024).
  9. Pöge, M., et al. Making plant tissue accessible for cryo-electron tomography. Elife. 106455, 1-41 (2025).
  10. Bäuerlein, F. J. B., et al. Cryo-electron tomography of large biological specimens vitrified by plunge freezing. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  11. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. -W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma fib milling. Nat Commun. 15 (1), 2660(2024).
  12. Chen, Z., Guo, Q. Innovations in cryo-electron tomography for tissues: Challenges and future prospects. Curr Opin Struct Biol. 93, 103112(2025).
  13. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (2009).
  14. Matsui, A., et al. Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses. Elife. 13, RP98458(2024).
  15. Ning, J., et al. Uncovering synaptic and cellular nanoarchitecture of brain tissue via seamless in situ trimming and milling for cryo-electron tomography. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  16. Zhang, J., et al. Vhut-cryo-fib, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography. J Struct Biol. 213 (3), 107763(2021).
  17. Glynn, C., et al. A generalizable and targeted molecular biopsy approach for in situ cryogenic electron tomography of vitreous brain tissue. Cell Rep Methods. 5 (7), 101080(2025).
  18. Kelley, K., et al. Waffle method: A general and flexible approach for improving throughput in fib-milling. Nat Commun. 13 (1), 1857(2022).
  19. Pierson, J., Ziese, U., Sani, M., Peters, P. J. Exploring vitreous cryo-section-induced compression at the macromolecular level using electron cryo-tomography; 80s yeast ribosomes appear unaffected. J Struct Biol. 173 (2), 345-349 (2011).
  20. Alamoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 150 (1), 109-121 (2005).
  21. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  22. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. J Struct Biol. 192 (2), 262-269 (2015).
  23. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nat Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  24. Engel, B. D., et al. Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography. Elife. 4, e04889(2015).
  25. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).
  26. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy. J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).
  27. Schiøtz, O. H., et al. Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms. Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).
  28. Nguyen, H. T. D., et al. Serialized on-grid lift-in sectioning for tomography (solist) enables a biopsy at the nanoscale. Nat Methods. 21 (9), 1693-1701 (2024).
  29. Tang, X., et al. Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis. Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).
  30. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae. J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).
  31. Berger, C., Watson, H., Naismith, J. H., Dumoux, M., Grange, M. Xenon plasma focused ion beam lamella fabrication on high-pressure frozen specimens for structural cell biology. Nat Commun. 16 (1), 2286(2025).
  32. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Methods. 20 (1), 131-138 (2022).
  33. Peck, A., et al. Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  34. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  35. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  36. Yang, Q., et al. The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis. Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).
  37. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).
  38. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Elife. 11, e82891(2022).
  39. Yang, J., et al. Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  40. Li, S., et al. Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  41. Medeiros, J. M., et al. Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography. Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).
  42. Goetz, S. K., et al. A modular platform for automated cryo-fib workflows. Elife. 10, e70506(2021).
  43. Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. Smart parallel automated cryo-electron tomography. Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).
  44. Swulius, M. T., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

High Pressure FreezingTissue Lamella PreparationCryo FIB MillingPlatinum Sputter CoatingSubtomogram AveragingCorrelative MicroscopyNative Cellular UltrastructureSynaptic Structures

מאמרים קשורים