כימות השינויים ביחידות היווצרות מושבות ביפידובקטריות ולקטובצילים במהלך טיפול בריפקסימין וג'ל סינביוטי במתנדבים בריאים

Summary

ניסוי קליני זה העריך ספירות של ביפידובקטריות ולקטובצילים לאחר שבוע של טיפול בריפקסימין וג'ל סינביוטי המורכב מ-Lactobacillus acidophilus NCFM ו-Bifidobacterium lactis Bi07, עם אינולין אגבה, במהלך הטיפול בריפקסימין ו-4 שבועות לאחר מכן, בהשוואה לג'ל פלצבו, מה שהראה כי ג'ל הסינביוטי עשוי לסייע בשמירה על לקטובצילים ובידידובקטריה.

Abstract

למרות שמיקרוביום המעי בדרך כלל יציב, הוא יכול להיות מושפע מטיפול אנטיביוטי. ריפקסימין, המשמש לטיפול בהפרעות במערכת העיכול, ניתן לעיתים קרובות יחד עם פרוביוטיקה להפחתת הסיכון לדיסביוזיס. לקטובצילוס אסידופילוס מתקשר עם תאי המעי ומשתמש בתרכובות פרה-ביוטיות. ביפידובקטריה, במיוחד Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, היא פרוביוטיקה שנקשרה להשפעות מועילות במעי. מחקרים במבחנה הראו את העליונות של פרוקטנים אגבה על פני אינולין צ'יקורי. לא תיעדו מחקרים שינויים בספירות הלקטובצילים והצואה ובבידידובקטריות לאחר מתן מקביל של ריפקסימין וסינביוטי. מטרתנו הייתה להעריך שינויים בספירות CFU של ביפידובקטריה במעיים ולקטובצילים אצל מתנדבים בריאים לאחר צריכת ג'ל סינביוטי, המכיל Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07, ואגבה אינולין כפרה-ביוטי, במהלך שבוע של טיפול בריפקסימין ולמשך 4 שבועות לאחר מכן. בניסוי קליני אקראי, מבוקר פלצבו, כפול-סמיות, משתתפים בריאים ללא טיפול אנטימיקרוביאלי בחודש הקודם חולקו באקראי 1:1 בשתי קבוצות (10 משתתפים בכל קבוצה). קבוצת ג'ל הסינביוטי קיבלה 10.32 גרם אינולין אגבה כפרה-ביוטיקה ו-4 ×^{10 9} CFU/g של Lactobacillus acidophilus NCFM ו-4 × 10⁹ CFU/g של Bifidobacterium lactis Bi07 ביום, למשך 5 שבועות, ו-200 מ"ג ריפקסימין פעמיים ביום בשבוע הראשון. קבוצת ג'ל הפלצבו קיבלה ג'ל פלצבו למשך 5 שבועות ו-200 מ"ג ריפקסימין פעמיים ביום בשבוע הראשון. שינויים חיידקיים הוערכו על ידי כימות CFU באמצעות הערכה מיקרוביולוגית של צואה. חמישה שבועות לאחר מכן, אוכלוסיות הלקטובצילים והביפידובקטריה לא השתנו. גילוי Lactobacillus acidophilus NCFM ו-Bifidobacterium lactis Bi07 בחלק מדגימות הצואה מצביע על קולוניזציה חולפת וחלקית, המדגיש את הצורך במחקרי מינון-תגובה עם מוצר סינביוטי זה.

Introduction

מיקרוביום המעי האנושי הוא קהילה צפופה הכוללת מינים מקומיים הקיימים לצמיתות ומיקרואורגניזמים חולפים נוספים. למרות שהרכבו משתנה בין אנשים, הוא נחשב בדרך כלל יציב. עם זאת, היא יכולה להיות מושפעת מגיל, זיהום וטיפול אנטיביוטי ^1,2,3. ריפקסימין, אנטיביוטיקה רחבת טווח עם ספיגת מעיים נמוכה, משמשת לטיפול בהפרעות מעיים ויכולה לשנות את המיקרוביוטה. חיידקים פרוביוטיים מהסוגים Lactobacillus ו-Bifidobacterium משמשים להפחתת השפעות אלו².

דווח כי זנים של Bifidobacterium spp. עמידים לריפקסימין², שיש לו אפקט מעניין בקידום אוכלוסיות של ביפידובקטריום במספרים מספקים של ביוטה במעי המכילות אוכלוסיות של Bifidobacterium spp. להשפעות פרוביוטיות מועילות.

יתרה מזאת, Lactobacillus acidophilus מוכר באופן נרחב בזכות יכולתו לקיים אינטראקציה עם אפיתל מערכת העיכול⁴ וביכולתו להשתמש בפרה-ביוטיקה כגון פוליסכרידים, אוליגוסכרידים ופרוקטוליגוסכרידים. עם זאת, זוהו רק כמה זנים פרוביוטיים, כגון זן Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM). לכן, חשוב לחקור את ההשפעות שלהם ב-in vivo, כמו גם נוכחות Bifidobacterium lactis Bi07 במערכת העיכול, כפי שנקשר^{ליתרונות בריאותיים שונים.} פרוביוטיקה זו דורשת פרה-ביוטיקה כדי לגדול בצורה מיטבית, ולכן סינביוטיקה המכילה גם פרוביוטיקה וגם פרה-ביוטית פועלת בסינרגיה; כלומר, ההשפעה החיובית שלו גבוהה יותר מזו של הפרוביוטיקה בלבד. יחד עם פרה-ביוטיקה, המשמשות כסבסטרטים לפרוביוטיקה, סימביוזה זו צפויה לשפר את הישרדות המיקרואורגניזמים הפרוביוטיים במערכת העיכול, ולהוביל לשיקום מוגבר של המיקרוביוטיקה^.

מקור חשוב לפרה-ביוטיקה הוא פרוקטני אגבה, שדווח כי יש להם השפעות חוץ גופיות טובות יותר על המיקרוביום מאשר שורש צ'יקורי (Cichorium intybus L.)⁷. מחקרים דיווחו על השפעות צריכת פרוביוטיקה; לדוגמה, אנגלברקטסון ואחרים העריכו האם צריכת פרוביוטיקה במהלך ואחרי מתן האנטיביוטיקה יכולה להפחית את השינויים במיקרוביום הנגרם על ידי אנטיביוטיקה⁸. הם מצאו שהקבוצה שקיבלה את תערובת הפרוביוטיקה הראתה התאוששות מהירה יותר של מיקרוביוטה רגילה מאשר אלו ללא המיקרוביוטה⁸. בנוסף, קונינג ועמיתיו חקרו דיסביוזה במיקרוביום המעי של 40 מתנדבים בריאים שטופלו ב-500 מ"ג אמוקסיצילין פעמיים ביום במשך 7 ימים, וכן את האפשרות להחלמה של המיקרוביום לאחר צריכת תערובת פרוביוטיקה. התוצאות הראו כי טיפול באמוקסיצילין השפיע על הרכב המיקרוביום המקומי. כאשר ניתנה תערובת פרוביוטיקה, המיקרוביום התאושש משמעותית לאחר חודשיים של צריכה⁹.

עם זאת, הספרות מדווחת כי לא חקרו מחקרים את השפעת צריכת הסינביוטיקה (עם פרוקטנים של אגבה כפרביוטיקה) על מיקרוביום המעי במהלך ואחרי מתן האנטיביוטיקה, כגון ריפקסימין; מצאנו רק מחקרים עם פרוביוטיקה. לכן, מחקר זה העריך שינויים בספירות CFU של ביפידובקטריות ולקטובצילים במעיים במתנדבים בריאים לאחר צריכת ג'ל סינביוטי, המכיל Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07, ואגובה אינולין כפרה-ביוטי, במהלך שבוע של טיפול בריפקסימין ולמשך 4 שבועות לאחר מכן.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית למחקר ביו-רפואי בבני אדם (CIIBH) של המכון הלאומי למדעי הרפואה והתזונה סלבדור זובירן (INCMNSZ) (REFERENCE 1734). כל המשתתפים נתנו הסכמה מדעת לפני הכללתם במחקר זה.

עיצוב המחקר ואוכלוסייה

זה היה ניסוי קליני אקראי, מבוקר פלצבו, כפול-סמיות, עם תקופת מעקב של 5 שבועות. עובדי INCMNSZ הוזמנו להשתתף במחקר, ומתנדבים בריאים בגילאי 20–50 ללא טיפול אנטימיקרוביאלי בחודש הקודם, שקיבלו וחתמו על טופס ההסכמה מדעת, נכללו בין 2011 ל-2012. נבדקי המחקר חולקו באקראי 1:1 לקבוצת ג'ל סינביוטי עם 10.32 גרם אינולין אגבה כפרה-ביוטיקה ו-4 × 10⁹ CFU/גרם של Lactobacillus acidophilus NCFM ו-4 × 10⁹ CFU/g של Bifidobacterium lactis Bi07 ביום, ב-4 שקיקים למשך 5 שבועות, ו-200 מ"ג ריפקסימין פעמיים ביום בשבוע הראשון. קבוצת פלצבו ג'ל קיבלה 4 חבילות של 15 גרם ג'ל פלצבו, עם אותו מראה ותכונות חושיות כמו הג'ל הסינביוטי, למשך 5 שבועות, ו-200 מ"ג ריפקסימין פעמיים ביום בשבוע הראשון (איור 1).

הערכה קלינית

בשתי קבוצות המחקר, התסמינים ומראה הצואה הוערכו באמצעות סולם בריסטול. נמדדו גם משקל, גובה ומדד מסת גוף (BMI). יומן שימש להערכת צריכת ג'ל סינביוטי, ג'ל פלצבו וריפקסימין ולתיעוד נוכחות או היעדר תופעות לוואי הקשורות לאכילת ג'ל.

צריכת סיבים

צריכת הסיבים הוערכה באמצעות יומן מזון וקריאה שבועית של 24 שעות בשתי הקבוצות.

הקפדה על הטיפול

ההיצמדות לצריכת ריפקסימין וג'ל הוערכה על ידי ספירת מינוני ריפקסימין ומספר שקיות ג'לים סינביוטיים ופלצבו שנצרכו לכל משתתף. נוכחות של Lactobacillus acidophilus ו-Bifidobacterium lactis זוהתה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR).

הערכה מיקרוביולוגית של צואה

בביקור 0 ובשבוע במשך 5 ביקורים (6 ביקורים) בכל קבוצה, הוערכו מספר הלקטובאציליים, הביפידובקטריים והאנטרובקטריים ב-120 דגימות צואה בשיטת ספירת הצלחות. שיטה זו מודדת יחידות יצירת מושבות (CFU) על ידי הנחת דגימות מדוללות על מדיום מוצק ייעודי¹⁰. נאספו דגימות צואה בתחילת כל ביקור.

כדי לזהות מיקרואורגניזמים, נאספו דגימות צואה ואוחסנו בצינורות BBL. בקבוקון PBG שימש לטיפול בחיידקים אנאירוביים, ודגימות הצואה הועברו במקרר קלקר שכלל חבילות ג'ל קפואות לשמירה על טמפרטורה נמוכה לפני העיבוד במעבדה. הפקק של בקבוק PBG לטיפול בקופרוקולטורה הוסר, ודגימת הצואה נאספה באמצעות מטוש, כדי להבטיח שהמטוש יהיה ספוג בדגימה. לאחר מכן הוכנס האפליקטור לצינור המכיל מדיום תרבית מוצק.

עבור חיידקים אנאירוביים, הבקבוקים נשקלו ונאספו 5–10 גרם צואה באמצעות כף. הצואה עורבבה עם תכולת הבקבוקון ונאטמה היטב. לעיבוד דגימות, נשקלו הבקבוקונים עם הדגימות ושקיות הסטומבר הסטריליות. הדגימה רוקנה לשקית, צונטריפוגה במשך 60 שניות, ואז נוספו 4.5 מ"ל מים של 0.1% פפטון. לאחר מכן, 500 מיקרוליטר מהדגימה הועברו לבקבוקון ועברו וורטקס כדי להומוגן את התערובת. לאחר ש-100 מיקרוליטר מהדגימה הוקלטו בכפיל על כל פלטה של המדיום הסלקטיבי הספציפי, מדיום Man Rogosa Sharpe (MRS) ללקטובצילים ומדיום DP Beerens עם ציסטאין + ציקלוהקסימיד (להסרת פלורה לא רצויה) עבור ביפידובקטריה, עד דילול 8 (מקדם דילול 0.1 מ"ל). לאנטרובקטריה, מדיום מקונקי שימש בדילול 5–8 (מקדם דילול 0.1 מ"ל), שם מופרדות וכימתו את מושבות החיידקים¹¹. כל אבקה מדיום הומס במים מזוקקים מטוהרים, התמיסה חוממה לרתיחה כדי להבטיח התמוססה מלאה, והיא עוברה עיקור באוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. התערובת צוננה ל-46.5 מעלות צלזיוס לביצוע טכניקת היציקה, כאשר יצקה 1 מ"ל לכל צלחת בכפילה לתוך צלחות פטרי סטריליות המכילות 15–20 מ"ל חומר גידול, ואפשרה לצלחות להתמצקות. דגימות שחוסנו נדגרו בטמפרטורה של 37°C באטמוספרה מועשרת ב-CO₂ במערכות GasPak אנאירוביות לשמירה על תנאים אנאירוביים למשך 24–48 שעות. יחידות היווצרות מושבות (CFU) סומנו בעט ונספרו¹². הנוסחה הבאה יושמה:

CFU/mL = (מספר המושבות × גורם הדילול הכולל)/נפח התרבית המצופה (mL)

זיהוי מאפיינים מורפולוגיים של לקטובצילים וביפידובקטריה

Gram Stain שימש לזיהוי המאפיינים המורפולוגיים של הדגימה. דגימה של מושבות חיידקים מכל זן הונחה על שקופית מיקרוסקופ, צובעה בסגול קריסטלי למשך דקה, ואז נשטפה במים מזוקקים. תמיסת יוד הונחה במשך דקה אחת ואז שטפה במים מזוקקים. תמיסת אלכוהול-אצטון שימשה לעשר שניות כמסיר צבע ונשטפה במים מזוקקים. לבסוף, הספרנין הונח כצבע נגד למשך דקה אחת ושטף במים מזוקקים. שקופיות המיקרוסקופ נצפו תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות שמן טבילה עם אובייקטיב 100x.

הכימות הכולל בוצע באמצעות תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR) על דגימות צואה שנבחרו באקראי מחמישה נבדקים בכל קבוצה, והתקבלה בסך הכל 60 דגימות במשך 5 שבועות. מבודדים ממדיום התרבית עובדו לצורך הפקת חומר גנטי. ה-PCR בוצע באמצעות פריימרים חיידקיים אוניברסליים להגברת קטע מגן 16S rRNA¹³. מוצרי PCR טוהרו וסודרו. הרצפים אומתו והוגשו למסד הנתונים של GenBank כדי לאשר את נוכחות זני לקטובצילוס וביפידובטריאליים שבודדו מדגימות הצואה.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כתדרים מוחלטים ויחסיים או כחציון (p25th-p75). חומרת התסמינים המצטברת נקבעה באמצעות ציון ליקרט (קל, 1; בינוני, 2; חמור, 3) בכל מעקב. בוצעו השוואות בין-קבוצתיות באמצעות מבחן סכום הדרגה של וילקוקסון ומבחן כי-ריבוע או מבחן פישר המדויק. השוואות תוך-קבוצתיות בין שבועות 0 ל-5 בוצעו באמצעות מבחן פרידמן והשוואות מרובות עם דורבין-קונובר. המשמעות הסטטיסטית נקבעה ב-P < 0.05.

Results

עשרים מתנדבים בריאים חולקו באקראי לקבוצת ג'ל סינביוטי (n = 10) וקבוצת ג'ל פלצבו (n = 10) (איור 2 וטבלה 1). בקבוצת הג'ל הסינביוטי, שבעה גברים ושלוש נשים, עם גיל חציוני של 31 שנים (טווח, 27–35 שנים); בקבוצת פלצבו ג'ל, שלושה גברים ושבעה נשים, עם גיל חציוני של 33 שנים (טווח, 28–38 שנים). הקבוצות היו דומות בגיל, מין, משקל ו-BMI. ההיצמדות לטיפול הייתה 100% בקבוצת הג'ל הסינביוטי ו-90% בקבוצת ג'ל הפלצבו.

Discussion

במחקר הנוכחי, מצאנו ירידה משמעותית בספירות אנטרובקטריאליות בדגימות הצואה של נבדקים בקבוצת הפלצבו מהשבוע הראשון של ההתערבות ובנבדקים בקבוצת הג'ל הסינביוטי בשבוע הראשון והשני. שינוי זה ניתן להסבר באמצעות ריפקסימין, שתואר כמפחית צמיחת יתר חיידקים פתוגניים¹⁴. במחקר שלנו, קבוצת הג'ל הסינביוטי שעקבה אחרי ריפקסימין הראתה השפעה חיובית: האוכלוסייה החציונית של זן לקטובצילוס לא השתנתה מהבסיס לאורך תקופת ההתערבות, וביפידובקטריה ירדה בפחות מ-1 לוג'יתרון CFU בהשוואה לג'ל הפלצבו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינור BBL	NA	NA	כל מותג יכול לשמש
DP בינוני	NA	NA	כל מותג יכול לשמש
חבילות ג'ל קפואות
מדיום מקונקי	NA	NA
MRS מדיום	NA	NA	כל מותג יכול לשמש
בקבוק PBG			בופר פוספט, ג'לטין, מלחים 0.05% ציסטאין כחומר מפחית עבור 02
צלחת פטרי
תערובת פלצבו	קוראגו ביוטק-בייביקט.	NA	אותן תכונות פיזיקליות וחושיות כמו הג'ל הסימיוטי, אבל בלי המרכיבים הפעילים
קונטינר קלקר
תערובת סימביוטית	קוראגו ביוטק-בייביקט.	NA	מוצר שאינו חלבי המורכב מלקטובצילוס acidophilus NCMF ו-Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  CFU/g), ו-17.2 גרם אינולין אגבה כפרה-ביוטי במארז של 15 גרם