מאמר שיטה

לקטילציה ליזין ספציפית לאתר באמצעות התרחבות קוד גנטי ב-E. coli ובתאים יונקים

DOI:

10.3791/70209

⸱

24 בפברואר 2026

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology Center for Chinese Medicine, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה קבע שיטה המשתמשת בהרחבת הקוד הגנטי כדי לשלב בהצלחה את לקטיל-ליזין (Klac) באתרים ספציפיים של האנולאז-1 (hENO1) והסופרפולקציה GFP (sfGFP) באשריכיה קולי ותאי יונקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לקטילציה היא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) שהתגלה לאחרונה עם פונקציות ביולוגיות מגוונות. מאז זיהויה הראשוני ב-2019 כרגולטור של קיטוב מקרופאגים, היסטון לקטיליציה הפכה לקישור מרכזי המקשר בין חילוף החומרים התאים לויסוי פונקציונלי. ביוכימית, הוא כולל העברה קוולנטית של קבוצת לקטיל לשאריות ליזין, המתווכת או על ידי לקטילטרנספראזות המשתמשות בלקטיל-CoA כתורם אציל, או על ידי סינתזות אמינואציל-tRNA (AARSs) דרך מתווך לקטיל-AMP. באמצעות מנגנונים אלו, רמות הלקטט התוך-תאי קשורות ישירות לשינוי ותפקוד החלבון. לקטילציה מתווכת מגוון תהליכים תאיים קריטיים, החל מתפקודים פיזיולוגיים כגון ויסות גנים, תיקון DNA, תכנות מחדש מטבולי ומודולציה חיסונית ועד לתהליכים פתולוגיים כמו התקדמות גידול וגרורות. למרות זיהוי אתרי לקטילציה רבים באמצעות פרוטאומיקה, השגת לקטילציה ליזין ספציפית לאתר באמצעות מוטגנזה נותרה מאתגרת. כדי להתמודד עם זה, אנו משתמשים בטכנולוגיית הרחבת קוד גנטי, תוך שימוש בסינתטאז אמינואציל-tRNA ספציפי ללקטיל-ליזין (KlacRS) וב-tRNA המקביל שלו, כדי לשלב בדיוק את לקטיל-ליזין (Klac) בשאריות המוגדרות. אסטרטגיה זו מאפשרת יצירת וריאנטים של חלבונים עם לקטיליציה הומוגנית למחקרים פונקציונליים ישירים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ללקטילציה חלבונית ספציפית למקום, מאומת הן בתאי E. coli והן בתאי יונקים, תוך שימוש באנולאז-1 אנושי (hENO1) ו-gfp סופרפולדר (sfGFP) כמערכות מודל.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לקטילציה של ליזין (Klac), שזוהתה במקור בהיסטונים, הפכה לצומת מרכזי המקשר בין מטבוליזם גידולי חריג לבין ויסות אפיגנטי1. הצטברות לקטט הנובעת מגליקוליזה אירובית מוגברת בתאי הגידול מספקת בסיס מטבולי ללקטילציה, ומאפשרת ללקטט לפעול לא רק כתוצר לוואי מטבולי אלא גם כמולקולת איתות שמווסתת ישירות את תפקוד החלבון. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שלקטילציה משתתפת באופן רחב בהתחלה והתקדמות הגידול על ידי תיאום התרבות תאי הסרטן 2,3,4,5, גרורות 6, תכנות מחדש מטבולי7, ועמידות טיפולית 8,9.

ברמה הפנוטיפית, לקטילציה מוגברת קשורה קשר הדוק לאגרסיביות גידולית מוגברת. לדוגמה, בקרצינומה של תאי כליה שקופים (ccRCC), לקטילציה של H3K18 מעודדת התרבות וגרורה על ידי הגברת קולטני β גדילה שמקורם בטסיות (PDGFRβ), ובכך יוצרת לולאת משוב חיובי בין הצטברות לקטט לאיתות אונקוגני10. באופן דומה, בסרטן המעי הגס (CRC), לקטילציה מוגברת של H3K18 מקדמת את התקדמות הגידול באמצעות שעתוק משופר של משפר אוטופגיה דמוי רוביקון (RUBCNL), ובכך מקדם את הבשלה של האוטופגוזומים ותומך בהישרדות תאי הסרטן11.

מעבר להשפעות הישירות על אגרסיביות הגידול, לקטילציה גם מתווכת תכנות מחדש מטבולי של הגידול על ידי ויסות הביטוי והפעילות של גנים הקשורים למטבוליזם7. בסרטן ריאות לא תאים קטנים (NSCLC), לקטילציה של היסטונים מפחיתה את האנזימים הקשורים לגליקוליזה תוך ויסות אנזימי מחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA), מגבירה את קליטת הגלוקוז בתאי הגידול ומחמירה את הפרעת הוויסות המטבולי12. באופן עקבי, פרופיל לקטילומה גלובלי מגלה כי לקטילציה מכוונת בעיקר לאנזימים המעורבים במסלולים מטבוליים מרכזיים, כולל מטבוליזם גלוקוז, מחזור TCA, מטבוליזם חומצות אמינו/חומצות שומן, ושינויים אלו קשורים מאוד לפנוטיפים אגרסיביים של גידול7.

חשוב לציין שההשלכות הביולוגיות של לקטילציה תלויות מאוד באתר, ושינוי זה הפך לגורם מרכזי לעמידות טיפולית לגידולים. ב-CRC, לקטילציה של K673 של רקומבינציה מיוטית 11 (MRE11) משפרת את תיקון הרקומבינה ההומולוגית (HR), ובכך מעניקה עמידות לכימותרפיה ולמעכבי פוליאמוראז (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP)13. בגליובלסטומה (GBM), אינטראקציה בין חבר משפחת אלדהיד דה-הידרוגנאז 1 A3 (ALDH1A3) לבין פירובט קינאז M2 (PKM2) מגבירה את ייצור הלקטט, ובהמשך גורמת ללקטילציה של K247 של חלבון משלים 1 (XRCC1) לתיקון קרני רנטגן (XRCC1) לשיפור תיקון נזק ל-DNA, ובכך להניע עמידות רדיואקטיבית וכימו-עמידות לטמוזולומיד (TMZ)14. מחקרים אלו מדגישים יחד כי שליטה מדויקת בלקטילציה בשיירי ליזין מוגדרים היא חיונית לניתוח מכני ומיקוד טיפולי.

התקדמות בספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה חשפו לקטילציה רחבה באנזימים מטבוליים, גורמי שעתוק וטרנסדוסרים, מה שמדגיש את תפקידה הרחב בשליטה על חילוף חומרים, העברת אותות ופיזיולוגיה תאית 15,16,17,18. עד כה דווחו מספר אנזימים כותבים שמזרזים לקטילציה – לדוגמה, AARS1 מתווך לקטילציה של p53 לקטילציה לקטילציה (tumourigenes)19, ו-AARS1/2 מווסת את הלקטילציה של cGAS כדי לדכא את החיסון המולד – אך אנזימים אלו הם סלקטיביים לסובסטרט וכיום אינם יכולים להשיג לקטילציה ספציפית לחלוטין לאתר על חלבוניםשרירותיים 20. לכן, התחום נותר מאתגר כיצד למניפולציה של קלאק באופן מכוון למטרות מחקר או טיפול.

מחקרים פונקציונליים עדיין מסתמכים בעיקר על מוטגנזה מכוונת אתר – בדרך כלל מחליפים ליזין (K) בגלוטמין (Q) כדי לחקות את המצב הלא טעון של שינויים באציל-ליזין כגון אצטילציה או לקטילציה 21,22,23,24. עם זאת, לגישה זו יש מגבלות משמעותיות בסיכום נאמן של לקטילציה טבעית: המבנה הכימי והגיאומטריה של שרשרת הצדדים של גלוטמין שונים מאלו של ליזין לקטיליט, וחשוב לציין, החלפת K ל-Q אינה יכולה להבחין בין מצבים אצטיליים למצבים עם לקטילציה כאשר שני השינויים עשויים להתרחש באותו אתר.

הרחבת קוד גנטי (GCE) מספקת פתרון עוצמתי למגבלות אלו בכך שהיא מאפשרת שילוב ישיר של חומצות אמינו לא-קנוניות בחלבונים באתרים מוגדרים. באמצעות סקר חיובי של ספריית מוטנטים של Methanosarcina mazei pyrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS), זיהינו בעבר וריאנט המציג גדילה תלויה בקלק. מוטנט זה, שמכיל מוטציות L301M, Y306L, L309A ו-C348F, קיבל את הסימון KlacRS1 25,26. KlacRS1 מאמינואצילציה את ה-tRNA האורתוגונלי הקוגנאטי שלו עם Klac, מדכא את קודון הענברים ומאפשר שילוב יעיל וספציפי לאתר של Klac בחלבוני היעד. בנוסף ל-KlacRS1, דווחו מספר גרסאות aaRS נוספות המסוגלות לשילוב Klac, כולל LacKRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) ו-LacKRS3 (Y271M/C313S)19,27, וכן LacKRS (C348T/Y384F)28 שמקורו ב-MbPylRS. יחד, כלים אלו יוצרים ערכת כלים גנטית רב-שימושית לייצור וריאנטים חלבונים עם לקטילציה ספציפית לאתר להבנת ההשלכות הביולוגיות של אירועי לקטילציה בודדים.

במחקרים הקודמים שלנו, יישמנו מערכת מבוססת GCE זו לביטוי חלבוני ALDOA הנושאים לקטילציה ספציפית לאתר ב-Lys147 הן ב-E. coli והן בתאי יונקים. ניתוחים פונקציונליים הראו כי לקטילציה ב-Lys147 מפעילה אפקט משוב שלילי על גליקוליזה, משפרת את היציבות התרמית והכימית של ALDOA, ומקדמת את המעבר שלה מהציטופלזמה לגרעין. תוצאות אלו לא רק חשפו מנגנון רגולטורי שלא זוהה קודם לכן של ALDOA, אלא גם אישרו את החוסק, הרב-שימושיות והתועלת המעשית של פלטפורמת הלקטילציה הספציפית לאתר25,26. בהתבסס על בסיס זה, כאן אנו משתמשים באנולאז-1 אנושי (hENO1) וב-GFP סופרפולדרי (sfGFP) כדוגמאות מייצגות לתיאור אסטרטגיה יעילה לשילוב מדויק של Klac באמצעות מערכת KlacRS/tRNA האורתוגונלית שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מוטגנזה של קודון ענבר סטופ לקידוד גנטי של לקטיליזין לגן המטרה

  1. הכנסת קודון ענבר TAG במיקום 89 של גן hENO1 ומיקום 149 של גןs-fGFP באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר בהתאם לפרוטוקול היצרן, טיהור מוצר ה-PCR וביצוע רקומבינציה הומולוגית. השתמשו בפריימרים הבאים:
    ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
    ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTTCTGTGACGTCAGTTCTTG
    sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATATCACCGCCGACAAGC
    sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTACTCCAGC
    הערה: לצורך שילוב ספציפי של ליזין לקטיליט, יש לעבור מוטציה לאתר היעד לקודון ענבר עצירה (TAG), או קודונים חסרי משמעות אחרים, ויש להשתמש ב-TAA או TGA כקודון העצירה האמיתי.
  2. הפשיר תאים מיומנים ב-DH5α על הקרח, ערבב 5 מיקרוליטר מתוצר הרקומבינציה עם 50 מיקרוליטר תאים, ודגרה על קרח למשך 30 דקות. העבירו את התערובת לזעזוע חום של 45 שניות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס, ואז מניחים אותה על הקרח למשך 2-3 דקות. הוסף 350 מיקרוליטר של מדיום LB ודוגר ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור (220 סל"ד) למשך שעה.
  3. מרחו את התאים על פלטת LB מחוממת מראש המכילה אמפיצילין ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות. בחר שתי מושבות בודדות לריצוף סנגר כדי לאשר את המוטציה.

2. ביטוי של חלבון לקטילציה בתאי E. coli

  1. קו-טרנספורמציה של 50 מיקרוליטר של תאי E. coli DH10B הכירים כימית עם כ-100 נגרם כל אחד מ-pBad-ENO1-K89TAG, שמקודד את הגן היעד, ו-pEvol-MmKlacRS1 (Addgene plasmid # 232157), שמקודד את זוג KlacRS ו-tRNA.
  2. דגרו את התערובת על קרח למשך 25 דקות, החזירו את התערובת בחום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, והחזרו לקרח למשך 3 דקות. הוסיפו 350 מיקרוליטר של מדיום LB בטמפרטורת החדר, נערו בעוצמה ב-220 סל"ד למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. פזרו את תרבית התאים על LB/צלחת עם תוספת של 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין (Amp 100) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול (ס"מ50). דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
  4. בחר מושבה אחת לחיסון תרבית התחלה של 4 מ"ל ולדוגר במהלך הלילה. ביום הבא, הרחיב את תרבות הלילה ל-400 מ"ל של LB/Amp100ס"מ50 ואז נער בעוצמה ב-220 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס עד ש-OD 600 מגיע ל-0.6-0.8.
  5. השראה עם 0.2% L-ערבינוז ו-1 מ"מ קלאק; דגירה ב-30 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד לעוד 16 שעות.

3. קידוד גנטי של לקטיליזין בתאי HEK 293T

  1. תאי זרעים בלוחות של 12 בארות בצפיפות של 1 על 10תאים בבאר עם 1 מ"ל של מדיום DMEM. לאחר 24 שעות של דגירות, כאשר המפגש של התאים מגיע ל-70%-80%, יש לבצע טרנספקציה.
    הערה: מפגש של 70%-80% מומלץ לטרנספקציה, בעוד שבדיקות היווצרות מושבות דורשות צפיפות זריעה נמוכה יותר, שיש לקבוע אמפירית.
  2. להכנת תמיסת DNA מדוללת, הוסף 0.75 מיקרוגרם של pcDNA-sfGFP-N149TAG ו-pNeu-KlacRS (פלסמיד Addgene # 232155) ביחס 1:1 לתוך 38 מיקרוליטר DMEM ללא סרום עם רמות סוכר גבוהות. מפעיל פיפט עדין למעלה ולמטה או מערבולת קצרה כדי לערבב.
  3. להכנת תגובת טרנספקציה מדוללת, הוסף 2.25 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ל-38 מיקרוליטר DMEM ללא סרום עם סוכר גבוה. מפעילים פיפטה עדינה למעלה ולמטה 3x-4x כדי לערבב.
    הערה: האם ניתן להשתמש ב-Opti-MEM תלוי בהוראות היצרן, שכן תכולת הסרום שלו עלולה להפריע ליעילות הטרנספקציה.
  4. הוסף מיד את תגובת הטרנספקציה המדוללת לתמיסת ה-DNA המדוללת בבת אחת.
    הערה: אין לערבב את התמיסות בסדר הפוך.
  5. מיד הפיפט למעלה ולמטה 3x-4x או מערבולת לזמן קצר כדי לערבב. דגרו במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר יצירת קומפלקסים של טרנספקציה/DNA.
    הערה: יש להשתמש בקומפלקס הטרנספקציה/DNA בתוך 20 דקות מההכנה.
  6. הוסף את תערובת הטרנספקציה/DNA של 50 מיקרולטר טיפה לתוך המדיום בכל באר ואחיד את התערובת על ידי סיבוב עדין של הצלחת.
  7. ב-6 שעות לאחר הטרנספקציה, החלף את המדיום ב-DMEM טרי המכיל 1 מ"מ קלאך קלאק. תרבות ל-24-48 שעות.
    הערה: בהתבסס על הנתונים הקודמים שלנו, Klac בריכוזים של 1-5 mM לא הראה השפעות ציטוטוקסיות על תאים26. יש למקסם את ריכוז העבודה של Klac בהתאם לרמת ביטוי החלבון. אם החלבון המטרה נוטה לאובדן שינוי הלקטילציה, מומלץ לתת מעכבי HDAC (למשל, טריכוסטטין A) או מעכב סירטואין NAM (ניקוטינמיד).

4. טיהור His-Tag של חלבון לקטיליטציה בתאי E. coli

  1. קצור את התאים בצנטריפוגה ב-6,900 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. השעתי מחדש ב-50 מ"ל של בופר ליזיס (20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 200 מ"מ NaCl). ליז באמצעות אולטרסוניקציה על קרח למשך 3 שניות פולס, מרווח של 8 שניות ב-200 וואט למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב-13,800 x g, 4°C למשך 30 דקות ואז איסוף סופרנטנט.
    הערה: אם החלבון המטרה רגיש לגזירה מכנית, שלב האולטרסוניקציה יכול להיות מוחלף בניתוק תאים עדין באמצעות תגובת חילוץ חלבון מנוסחת המתאים ל-E. coli.
  2. מסנן את הסופרנטנט דרך ממברנה של 0.45 מיקרון כדי לאסוף את השברים המסיסים. טעין את הליזטים המובהרים על עמוד כבידה Ni-NTA של 1 מ"ל. שטיפה עם כ-5 מ"ל של בופר A (20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 200 מ"מ NaCl,
    5 מ"מ אימידזול) עד שלא נמצא חלבון מזוהה באלואט. השאירו את החלבון עם 1 מ"ל בופר B (20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 200 מ"מ NaCl, 200 מ"מ אימידזול) ל-5x. שמור את כל השברים. בדוק אם יש חלבון שנפלט עם בדיקת ברדפורד מהירה.
  3. משלבים את חלקי החלבון המטוהרים ומבצעים חילופי בופר לתוך בופר האחסון (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). מחלקים את החלבונים המרוכזים ל-50 מיקרוליטר בכל צינור, מקפיאים בזק, ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח הבא.

5. אפיון ביוכימי של החלבון הלקטילטלי

  1. SDS-PAGE ו-Western Blotting
    1. הפריד את החלבון באמצעות SDS-PAGE (90 וולט ל-20 דקות, ואז 150 וולט ל-50 דקות). צבע את הג'ל ב-Coomassie Blue, חמם 15 שניות במיקרוגל, ודסט עם תמיסת הסרת צבע (40% אתנול מוחלט, 10% חומצה אצטית קרחונית, ו-50% מים דה-יוניים) על שייקר (50 סל"ד, 15 דקות). חזור על שלב הסרת הצביעה עד שרצועות החלבון נראות בבירור.
    2. הפעל ממברנת PVDF במתנול למשך דקה. הרכיבו את ערימת ההעברה בסדר: ספוג, נייר סינון, ג'ל, ממברנה, נייר סינון, ספוג. בצע את ההעברה ב-250 mA למשך שעה בבופר מקורר מראש. חסום את הממברנה עם 5% חלב דל שומן במשך 1.5 שעה, ואז שטוף 3 פעמים עם TBST (10 דקות כל אחת).
    3. דגרו עם נוגדנים ראשוניים (אנטי-הי 1:10,000; אנטי-לקטיל ליזין 1:1,000) בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. שטוף 3 פעמים עם TBST.
      הערה: יש לקבוע באופן אמפירי את יחסי הדילול האופטימליים עבור נוגדנים המתקבלים ממקורות מסחריים שונים.
    4. דגרו עם נוגדן משני לארנב (1:10,000) למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר. שטוף 3 פעמים עם TBST. תמונה באמצעות כימילומינסנציה ושמירת נתונים במעבדת תמונות.
  2. ניתוחי ספקטרומטריית מסה
    1. לניתוח מסה שלמה, דיללו את החלבונים לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר עם מים המכילים 0.1% חומצה פורמית (FA) ולאחר מכן חשפו אותם למערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC). השלב הנייד כלל ממס A (0.1% FA במים) וממס B (אצטוניטריל, ACN) בקצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה.
    2. מדדו את המשקלים המולקולריים של hENO1-89Klac באמצעות ספקטרומטר מסה מרובע-קוטבי (Q-TOF) ברזולוציה גבוהה עם טווח m/z מוגדר ל-300-2000. איסוף ועיבוד כל הנתונים באמצעות תוכנת MassLynx.
    3. לאנליזה פרוטאומית, ניתן לנתח את הליזטים של התאים המעכלים כפי שתואר קודם, באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בזרימה ננומטרית המחוברת לספקטרומטר מסה טריבריד ברזולוציה גבוהה המצויד באנלייזר. השלב הנייד כלל ממס A (0.1% FA במים) וממס B (ACN/מים, 8:2, v/v) בקצב זרימה של 300 nL/min.
    4. פפטידים נפרדים בעמוד C18 קפילרי הפוך (75 מיקרון x 250 מ"מ) עם שיפוע של 90 דקות: 3%-8% B (0-5 דקות), 8%-28% B (5-60 דקות), 28%-38% B (60-75 דקות), 38%-100% B (75-80 דקות), ו-100% B (80-90 דקות). רכוש ספקטרום MS1 מעל m/z 350-1800 ברזולוציה של 120,000 ויעד AGC של 4e5. יצר ספקטרום MS2 על ידי פריסת התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD) (אנרגיית התנגשות = 32%), עם מסה ראשונה של m/z 110, רזולוציה של 30,000, ויעד AGC של 5e4.
  3. ניתוח ציטומטריית זרימה
    1. שטפו את התאים פעמיים עם בופר PBS מקורר מראש, ואחר כך בצנטריפוגציה ב-1,380 גרם למשך 3 דקות אחרי כל שטיפה. החזירו את הכדור התא שהושג לאחר הצנטריפוגה ב-500 מיקרוליטר של בופר PBS והפיפטה בעדינות לערבוב. סנן את תליית התא דרך גזה סטרילית בת 300 רשתות, אסוף את הסינון לצינור ציטומטריית זרימה כדי למזער הפרעות מאגרגטים תאים במהלך הזיהוי. נתח את הדגימה המוכנה באמצעות ציטומטר זרימה עם לייזרים כפולים, עם עירור ב-405 ננומטר וזיהוי ב-488 ננומטר עבור אותות הפלואורסצנציה המתאימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחילה הערכנו את הספציפיות של Klac לחלבונים ב-E. coli. הגן של אנולאז 1 האנושי (hENO1) תוכנן להכיל קודון ענבר עצור בשארית K89 (hENO1-89TAG), ומבנה זה הובע במשותף עם KlacRS האורתוגונלי וזוג tRNA קוגנאטי שלו ב-E. coli. בהיעדר תוספת של 1 mM Klac, לא זוהה hENO1 באורך מלא; לעומת זאת, כאשר נוספו 1 mM Klac למדיום הגידול, hENO1 באורך מלא המכיל Klac במיקום 89 (hENO1-89Klac) הופק בתפוקה של ~1.2 mg/L (איור 1A). נוכחות hENO1 באורך מלא ושילוב סלקטיבי של Klac אושרו על ידי אימונובל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה לשילוב אתר ספציפי של Klac בחלבונים הן בתאים פרוקריוטיים והן בתאים אאוקריוטיים. על ידי הכנסת קודון עצירה ענבר במיקום הרצוי של הגן המטרה וביטויו יחד עם זוג KlacRS/tRNA האורתוגונלי בתאי המארח, ניתן להטמעת לקטיל ליזין אותנטי בדיוק בחלבונים בתאים חיים, ומספק כלי עוצמתי לחקירת ביולוגיה ייחודית ללקטילציה.

הדגמנו את היתכנות תהליך העבודה הזה באמצעות החלבון הפונקציונלי המייצג hENO1 ו-sfGFP כמערכות מודל. hENO1 הוא אנזים גליקוליטי רב-תכליתי שמזרז ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (22377058), המימון הבין-תחומי לביולוגיה סינתטית ברפואה סינית מסורתית של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית, ותוכניות התמיכה המיוחדות לכישרונות ברמה גבוהה (תוכנית 10,000 כישרונות) - כישרונות צעירים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6*שלו, התג שלו נוגדן מונוקלונלי רקומביננטיפרויטנטק84814-1-RRקבוצה של אימונוגלובולינים ספציפיים המיועדים ל-6&Times; התג שלו (פפטיד קצר המורכב משש שאריות היסטידין רצופות, HHHHHH) בחלבונים רקומביננטיים.
מערכת ACQUITY UPLCמיםUltraPerformance Liquid Chromatography
אנטי-L-לקטיליזין ארנב mAbPTM BiolabsPTM-1401RMקבוצה של אימונוגלובולינים ספציפיים המיועדים ל-L-Lactyl Lysine (Klac), שינוי פוסט-תרגומי (PTM) של חלבונים.
ערכת שיבוט חד-שלבי ClonExpress IIואזימה C112בהתבסס על טכנולוגיית שיבוט DNA פשוטה, מהירה ויעילה, ניתן לשכפל מקטעי הinsert בכיוון לכל אתר של כל וקטור.
ציטומטר זרימה CytoFlexבקמן קולטרציטומטר זרימה עם יכולת זיהוי רגישות גבוהה וניתוח רב-צבעוני
DH10BביוראביטEC005H-Sסוג של תאים מיומנים לטרנספורמציית פלסמידים, שיבוט גנים וסקר כחול-לבן.
DH5αואזימה C502סוג של תאים מיומנים לטרנספורמציית פלסמידים, שיבוט גנים וסקר כחול-לבן.
מערכת EASY-nano LC 1200תרמו פישר סיינטיפיקכרומטוגרפיה ננו-נוזלית להפרדת דגימות מורכבות ברגישות גבוהה ורזולוציה גבוהה
ספקטרומטר המסה של Orbitrap Eclipse Tribridתרמו פישר סיינטיפיקמערכת דגל מתקדמת לכרומטוגרפיה נוזלית טריברידית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS)
Phanta Max Super-Fidelity DNA פולימראזואזימה P505אנזים יחיד באיכות גבוהה המשלב הגברה מהירה ונאמנות
פוליג'טSignaGenSL100688תגובת טרנפקציה של DNA פוליג'ט במבחנה נוסחה כמגיב טרנספקציה עוצמתי שמבטיח טרנספקציה יעילה וניתנת לשחזור עם פחות ציטוטוקסיות.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  2. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  3. Pan, L., et al. Demethylzeylasteral targets lactate by inhibiting histone lactylation to suppress the tumorigenicity of liver cancer stem cells. Pharmacol Res. 181, 106270(2022).
  4. Xu, H., et al. Royal jelly acid suppresses hepatocellular carcinoma tumorigenicity by inhibiting H3 histone lactylation at H3K9la and H3K14la sites. Phytomedicine. 118, 154940(2023).
  5. Chai, P., Zhao, F., Jia, R., Zhou, X., Fan, X. Lactate/lactylation in ocular development and diseases. Trends Mol Med. 31 (12), 1073-1076 (2025).
  6. Wang, G., et al. The relationship and clinical significance of lactylation modification in digestive system tumors. Cancer Cell Int. 24 (1), 246(2024).
  7. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  8. Chen, L., et al. Lactate-lactylation hands between metabolic reprogramming and immunosuppression. Int J Mol Sci. 23 (19), 11943(2022).
  9. Sun, X., et al. The diapause-like colorectal cancer cells induced by smc4 attenuation are characterized by low proliferation and chemotherapy insensitivity. Cell Metab. 35 (9), 1563-1579 (2023).
  10. Yang, J., et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 18 (8), 3470-3483 (2022).
  11. Li, W., et al. Tumor-derived lactate promotes resistance to bevacizumab treatment by facilitating autophagy enhancer protein Rubcnl expression through histone H3 lysine 18 lactylation (H3K18la) in colorectal cancer. Autophagy. 20 (1), 114-130 (2024).
  12. Jiang, J., et al. Lactate modulates cellular metabolism through histone lactylation-mediated gene expression in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 11, 647559(2021).
  13. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311 (2024).
  14. Li, G., et al. Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma. Cell Metab. 36 (8), 1696-1710.e10 (2024).
  15. Liberti, M. V., Locasale, J. W. The warburg effect: How does it benefit cancer cells. Trends Biochem Sci. 41 (3), 211-218 (2016).
  16. Varner, E. L., et al. Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues. Open Biol. 10 (9), 200187(2020).
  17. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311.e21 (2024).
  18. Chen, H., et al. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 631 (8021), 663-669 (2024).
  19. Zong, Z., et al. Alanyl-trna synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis. Cell. 187 (10), 2375-2392.e33 (2024).
  20. Ju, J., et al. The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer. J Clin Invest. 134 (10), e174587(2024).
  21. Sun, L., et al. Lactylation of METTl16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 14 (1), 6523(2023).
  22. Mao, Y., et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 34 (1), 13-30 (2024).
  23. Lv, L., et al. Mitogenic and oncogenic stimulation of K433 acetylation promotes PKM2 protein kinase activity and nuclear localization. Mol Cell. 52 (3), 340-352 (2013).
  24. Okada, A. K., et al. Lysine acetylation regulates the interaction between proteins and membranes. Nat Commun. 12 (1), 6466(2021).
  25. Wan, N., et al. Cyclic immonium ion of lactyllysine reveals widespread lactylation in the human proteome. Nat Methods. 19 (7), 854-864 (2022).
  26. Shao, C., et al. Genetic code expansion reveals site-specific lactylation in living cells reshapes protein functions. Nat Commun. 16 (1), 227(2025).
  27. Sun, Y., et al. Genetic encoding of ε-N-L-lactyllysine for detecting delactylase activity in living cells. Chem Commun (Camb). 58 (61), 8544-8547 (2022).
  28. Ren, C., et al. Expanding the scope of genetically encoded lysine post-translational modifications with lactylation, β-hydroxybutyrylation and lipoylation. Chembiochem. 23 (18), e202200302(2022).
  29. Hu, Y., et al. Engineering unnatural cells with a 21st amino acid as a living epigenetic sensor. Nat Commun. 16 (1), 9388(2025).
  30. Elsasser, S. J., Ernst, R. J., Walker, O. S., Chin, J. W. Genetic code expansion in stable cell lines enables encoded chromatin modification. Nat Methods. 13 (2), 158-164 (2016).
  31. Zhu, W., Fan, C., Hou, Y., Zhang, Y. Lactylation in tumor microenvironment and immunotherapy resistance: New mechanisms and challenges. Cancer Lett. 627, 217835(2025).
  32. Mills, E. M., Barlow, V. L., Jones, A. T., Tsai, Y. H. Development of mammalian cell logic gates controlled by unnatural amino acids. Cell Rep Methods. 1 (6), 100073(2021).
  33. Italia, J. S., et al. Genetically encoded protein sulfation in mammalian cells. Nat Chem Biol. 16 (4), 379-382 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Escherichia ColitRNA

מאמרים קשורים