הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברוש בצינור הלימפה הצווארי להערכת הובלה לימפה מהראש ומהמוח

853 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70217

⸱

10 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, 2MOE Joint International Research Laboratory of Target Discovery and New Drug Innovation, China Pharmaceutical University, 3Department of Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול ניסויי זה מדגים מודל עכברוש מחובר לצינור לימפה צווארי עמוק, המאפשר הערכה ישירה וכמותית של ניקוז לימפה מאזור הראש. המודל מאפשר ניתוח מפורט של מומסים שמקורם במערכת העצבים המרכזית (CNS), אוכלוסיות תאי חיסון, והפצה וניקוי של טיפולים ממוקדים במערכת העצבים המרכזית.

תקציר

הלימפה זורמת ממערכת העצבים המרכזית (CNS) דרך סדרה של כלי לימפה (LVs) ובלוטות לימפה שמתכנסות בצינורות הלימפה הצוואריים. בנוסף לשמירה על איזון נוזלים, תעלות הלימפה הללו ממלאות תפקיד מרכזי בהובלת מגוון רחב של חומרים, כולל מטבוליטים אנדוגניים, מולקולות איתות, תאי חיסון ותרופות קטנות ומקרומולקולריות. דבר זה קריטי להומאוסטזיס פיזיולוגי ולתפקוד החיסון הן באזורים תוך-גולגולתיים (למשל, מוח) והן באזורים חוץ-גולגולתיים (למשל, חללי אף ופה). פגיעה בניקוז הלימפה מהמוח נקשרה יותר ויותר למגוון הפרעות נוירולוגיות וניווניות נוירודגנרטיביות. קנולציה של צינור הלימפה הצווארי מאפשרת איסוף לימפה המנקזת את הראש והמוח, ומאפשרת מדידת ריכוז וקצב ההובלה של חומרים שונים דרך מערכת הלימפה. ניתן גם לקבוע שינויים בגורמים אלו בתגובה לאתגרים שונים (כגון סמים, לחץ, טראומה) ומחלות (כגון שבץ, זיהום, מחלת אלצהיימר). כאן, אנו מתארים מודל עכברוש מורדם בצינור הלימפה הצווארי העמוק, המאפשר איסוף לימפה למשך מספר שעות לאחר הניתוח. השיטה יכולה להיות משולבת עם טכנולוגיות הדמיה ומולטי-אומיקס למדידת טווח רחב של פרמטרים מעניינים בלימפה. דבר זה מסייע במחקר פיזיולוגי ופתופיזיולוגי בסיסי באזור הראש והצוואר, וכן במחקרים פרמקוקינטיים/פרמקודינמיים של תרופות, במיוחד לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית.

מבוא

מערכת הלימפה, המפוזרת בכל הגוף, חיונית לשמירה על הומאוסטזיס נוזלי, ויסות תגובות חיסוניות והקלה על העברת חומרים מזינים ומולקולות איתות1. הלימפה ההיקפית מתחילה בנימים הלימפתיים, שאוספים נוזלים אינטרסטיציאליים ומומסים ומתנקזים לכלי לימפה גדולים יותר, בעלי שכבת שריר חלק מסביב; כלי שיט אלו מעבירים לימפה לבלוטות לימפה מקומיות לעיבוד חיסון 2,3. רשת הלימפה שמנקזת את אזור הראש חשובה להומאוסטזיס של איברים תוך-גולגולתיים (למשל, מוח) ושל חוץ-גולגולתי (למשל, חללי אף ופה). המבנה והארגון של רשת הלימפה החוץ-גולגולתית נחשבים כדומים לאלו של הלימפה ההיקפית בכל הגוף, בעוד שמערכת הלימפה התוך-גולגולתית מציגה תכונות אנטומיות ותפקודיות ייחודיות (ראו איור 1 לייצוג סכמטי מפורט במודלים של חולדות)4,5. למרות ש-LVs טיפוסיים אינם קיימים בפרנכימת המוח, תפקודים דמויי לימפה מתווכים על ידי מערכת ההובלה הלימפטית התלויה בגליאליה (גלימפה) המיוחדת, שמקלה על ההחלפה בין נוזל מוח-שדרה (CSF) לנוזל הבין-תדרתי (ISF)6. בעוד שמערכת הגלימפה מאפשרת ערבוב של ISF בתוך הפרנכימה של המוח עם CSF, ה-LVs המנינגיאליים, הפריוסקולריים והנאזופרינגיאליים מעבירים מומסים מה-CSF הרחק מחלל הגולגולת. במיוחד, מסלול הלימפה המנינגיאלי מכוון את נוזל הנוזל הנשמלי מהמרחב התת-עכבישי אל LVs המנינגיאליים, ומקשר בין דינמיקת נוזלים תוך-גולגולתית לניקוי הלימפה ההיקפי7. במקביל, מסלולים פרינוירונים מאפשרים את פליטת נוזל הנוזל הנחומי (CSF) ומומסים נלווים לאורך מעטפות עצבי הגולגולת והעמוד השדרה, בעיקר דרך עצבי הריח אל מקלעת הלימפה הנזופרינגיאלית 5,8. עבודה מקבילה של מערכות אלו שומרת על הומאוסטזיס נוזלי בתוך המוח 6,7,8. התקדמויות אחרונות בהבנת מערכת הלימפה המנקזת מערכת העצבים המרכזית סיפקה תובנות חדשות בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה של המוח. ממצאים אלו עשויים להציע דרכים חדשות להתערבות טיפולית במחלות מערכת העצבים המרכזית9.

figure-introduction-1
איור 1: ייצוג סכמטי של מסלולי ניקוי הלימפה של מערכת העצבים המרכזית. מסלולים אלו כוללים (א) את המסלול הגלימפה דרך מרחבים פריוסקולריים; (B) מסלול הלימפה הנאזופרינגיאלי, ו-(C) ה-LVs של מנינגיאל. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של האיור הזה.

רשתות הלימפה הננקזות מהראש וממערכת העצבים המרכזית מתכנסות לתעלות הלימפה הצוואריות הממוקמות בצוואר, שם הלימפה מסוננת דרך בלוטות הלימפה הצוואריות לפני כניסה למחזור המערכתית. בלוטות הלימפה הצוואריות מסווגות לבלוטות לימפה שטחיות (sCLNs) ולבלוטות לימפה צוואריות עמוקות (dCLNs) בהתאם למיקומן האנטומי בצוואר. שינויים בהרכב נוזל הלימפה בצינורות הלימפה הצווארי נחשבים כמשקפים שינויים פתופיזיולוגיים בסיסיים במוח, כאשר מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), פגיעת מוח טראומטית (TBI) ופגיעה קוגניטיבית לאחר שבץ (PSCI) הן דוגמאות מייצגות 9,10,11,12,13 . במיוחד, ב-AD, פגיעה בניקוז של חלבוני עמילואיד-β (Aβ) וטאו מזרחן (P-tau) דרך מסלולי הלימפה הללו נחשבה לגורם תורם להתקדמות המחלה 9,10,14. על ידי חיבור ישיר של צינורות הלימפה לוורידים סמוכים כדי לשנות את הניקוז הלימפתי, נחקר אנסטומוזה ורידית לימפטית (LVA) הן בבעלי חיים והן בבני אדם כאסטרטגיה טיפולית לשיפור זרימת הלימפה מהמערכת המרכזית המרכזית, ובכך להקל על ניקוי Aβ מהמוח ואולי לעכב את התקדמות מחלת 6,15,16 לספירה.. חשיבות מסלול זה מודגשת עוד יותר בתצפיות בעכברים שעברו הסרה ניתוחית של בלוטות הלימפה הצוואריות (לימפאדנקטומיה), מה שמוביל להפחתת ניקוי הלימפה הצווארי. ניקוי לקוי מוביל להצטברות רעילה של Aβ ו-P-טאו, עם הפעלה מאוחרת של מסלולי איתות קינאז פתולוגיים. שינויים אלו קשורים להחמרה הדרגתית בטאופתיה דמוית AD ולסיכון מוגבר להתנהגויות דמויות חרדה ודיכאון14,16. יתרה מזאת, מחקרים מבוססי נוזל מוחי מצביעים על כך שגידולי מערכת העצבים המרכזית, כגון לימפומות מוח, יכולים לחסום פיזית את פינוי הלימפה דרך צינורות הלימפה הצוואריים העמוקים תוך העלאת ריכוזי האונקופרוטאין ב-CSF 9,17,18. עדויות ממחקרים מבוססי דלקת של מערכת העצבים המרכזית מצביעות על כך שתאים שמקורם במנינגות יכולים לנדוד דרך ה-LVs של קרום המוח אל בלוטות הלימפה הצוואריות 8,19. תאים אלו מורכבים בעיקר מלימפוציטים, עם אוכלוסיות קטנות יותר של תאי דנדריטיים, מקרופאגים ותאי אנדותל19,20. במהלך דלקת או לאחר פגיעה או ניתוח במערכת העצבים המרכזית, תנועת תאי מערכת החיסון הלימפה מתחזקת באופן ברור, מלווה ברמות גבוהות של סמנים ביולוגיים חיסוניים כגון ציטוקינים, כימוקינים ומתווכים דלקתיים אחרים21.

בנוסף לתפקידיה הפתו-פיזיולוגיים, רשת הלימפה הצווארית מוכרת יותר ויותר כצינור חשוב לטיפול בתרופות. מחקרים קודמים על בעלי חיים הראו כי מספר נוסחאות תרופתיות המיועדות למתן מערכת העצבים המרכזית יכולות לעבור ניקוי מהמוח דרך צינורות הלימפה והצווארי ובלוטות הלימפה (ברמות משתנות), כפי שמודגם על ידי תרופות מבוססות ננו-חלקיקים הניתנים על ידי הדרך-מוחי (כגון למוטריגין, טלאזופריב) וביולוגיים (למשל, נוגדנים מונוקלונליים, חלבוני מעקב מסומנים ברדיו)22,23,24,25. בבני אדם, מחקרי הדמיית MRI הראו שמולקולות מסוימות, כמו גדובוטרול, עוברות הובלה פעילה ממערכת הגלימפה אל צינורות הלימפה הצוואריים26.

כאמור, בלוטות הלימפה הצוואריות, הן sCLN והן dCLNs, מנקזות לימפה מאזורים מובחנים בראש; עם זאת, האזורים הגולגולתיים הספציפיים שמתנקזים על ידי כל צומת אינםברורים 27,28. שטחי ניקוז חופפים, שונות אנטומית בין-אישית, והבדלים מבניים פוטנציאליים בין מינים מסבכים עוד יותר את תיאור דפוסי הניקוז הלימפה הצווארי בבעלי חיים ובבני אדם29. בתוך רשת הלימפה הצווארית המורכבת, זוהו תעלות הלימפה הצוואריות העמוקות כנתיבי יציאה עיקריים לנוזל מוחי (CSF), הממוקמים במורד הזרם מ-LVs הנאזופרינגיאלי והמנינגיאלי8. בהשוואה לצינורות הלימפה הצוואריים השטחיים, היוצרות רשתות דקות ומשתנות ברקמה התת-עורית ושונות מאוד בגודל ובהסתעפות בין חולדות בודדות, צינור הלימפה הצווארי העמוק מציע מסלול נגיש ומעשי יותר לאיסוף לימפה שמקור במערכת העצבים המרכזית במודלים של בעלי חיים קטנים20,30. לכן, הפרוטוקול הנוכחי מתמקד ביצירת שיטה אמינה לאיסוף לימפה מצינור הלימפה הצווארי העמוק.

רק מספר מוגבל של מחקרים שנערכו בעשור האחרון תיארו איסוף נוזלי לימפה צוואריים לחקר מחלות מערכת העצבים המרכזית או ניתוח התפלגות התרופות. מחקר קודם תיאר מדידת ריכוזי תרופות בלימפה צווארית על ידי שטיפה או סחיטה של נוזלים מחלקי רקמה מבודדים (כגון אלה הסמוכים ל-dCLN יחיד)31. עם זאת, פרוטוקולים ניסיוניים לאיסוף רציף של לימפה מצינורות הלימפה הצוואריים אצל בעלי חיים קטנים במעבדה, במיוחד חולדות, נותרו לא מפותחים. פרוטוקול זה קובע שיטה נגישה וניתנת לשחזור לקנולציה של צינור הלימפה הצווארי (העכברוש) כדי לאפשר איסוף רציף של הלימפה ולחקור הובלת הלימפה של מערכת העצבים, תגובות חיסוניות ופרמקוקינטיקה. היתרון המרכזי שלה הוא היכולת לכמת את זרימת הלימפה והרכב לאורך פרקי זמן מוגדרים, ובכך לאפשר מדידה כמותית של תרופות, שומנים, חומצות שומן ורכיבים תאיים. במיוחד, מודל זה לוכד תהליכי העברה לימפתיים שאינם מיוצגים כראוי על ידי טכניקות דגימה או דימות של פלזמה/נוזל נוזלי נוזלי, ומציע תובנות חדשות על סידור התרופות במערכת העצבים המרכזית, הובלת שומנים וחומרים מזינים, ואיתות חיסוני20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים באוניברסיטה ובוצעו בהתאם להנחיות האתיות הניסיוניות של אוניברסיטת הרוקחות הסינית. לפני תחילת כל הליך הקשור לבעלי חיים, יש לקבל אישורים נדרשים מוועדת האתיקה המוסדית או הארגונית הרלוונטית. זכרים מסוג Sprague-Dawley (SD) במשקל 220 עד 250 גרם משמשים כבעלי חיים ניסיוניים. בעלי החיים מגיעים מספקי בעלי חיים ניסיוניים מורשים (ראו טבלת חומרים) ומוחזקים בכלובים ייעודיים עם גישה חופשית למזון ומים עד תחילת הניסוי. בפרוטוקול זה, קנולציה של צינור הלימפה הצווארי העמוק השמאלי מתוארת כדוגמה מייצגת. נכון להיום, קיימות עדויות מוגבלות המתארות הבדלים אנטומיים בין צינורות הלימפה הצוואריים העמוקים השמאלי והימני. בהתבסס על תצפיות מניסויים שהושלמו בעבר, לא נרשמו הבדלים משמעותיים בין שני הצדדים, כולל בקצב זרימת הלימפה.

1. אמצעי זהירות ונהלים בטיחותיים

  1. לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית, וכל הצוות צריך לקבל הכשרה מספקת בטכניקות מיקרוכירורגיה, טיפול ניסיוני בבעלי חיים ובטיחות כימית לפני ביצוע פרוטוקול זה.
  2. יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ניתוחיות ומשקפי מגן, לאורך כל ההליך. מכיוון שמשתמשים בהרדמה נדיפה (איזופלורן) ועלולה לגרום לדיכוי במערכת העצבים המרכזית ולרעילות קרדיווסקולרית בבני אדם לאחר חשיפה ממושכת, יש לבצע את ההליך בסביבה מאווררת היטב. אסור להכנס מזון ושתייה למעבדה, ולוודא שהמים הזורמים נגישים בכל עת.
  3. לטפל בכל הפריטים החדים, כולל מחטי מזרקים, להבי גילוח ומספריים מיקרו, בזהירות ולהשליך אותם מיד לאחר השימוש במיכלים ייעודיים; בשום פנים ואופן אסור להשתמש שוב בחפצים חדים חד-פעמיים.
  4. טפלו בכל הדגימות הביולוגיות (למשל, לימפה שנאספו) ונוזלי גוף בעלי החיים (למשל, דם) כמסוכנות פוטנציאלית, וטפלו בכל ציוד האיסוף בזהירות תוך שמירה על הדגימות רחוקות מאזור הניתוח. במקרה של פציעת מחט או מגע עור עם חומרים מסוכנים, יש לשטוף מיד את האזור הפגוע בסבון ומים ולדווח על האירוע בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות המוסדיים.

2. הכנה ביום שלפני הניתוח

  1. צום או האכיל את העכברים בהתאם לדרישות הניסוי הספציפי. פרוטוקול זה אינו מחייב צום מסוים או מצב מזון מסוים.
  2. הכינו תמיסה נוגדת קרישה על ידי דילול הפארין או אתילנדיאמינטטטראצטית (EDTA) לריכוז סופי של 10 IU/mL. טעינו מראש את התערובת (כ-0.7 מ"ל) לתוך מזרק אינסולין סטרילי בנפח 1 מ"ל המצויד במחט 30 G, כדי לצפות מראש את פני השטח הפנימיים של קנולה הפוליאתילן (PE) (המשמשת לקנולציה בצינורות הלימפה). אחסן את התערובת המוכנה בתנאים סטריליים עד לשימוש.
  3. הכינו קנולות לאיסוף דגימות לימפה על ידי הרכבת קנולה PE בתצורת ראש לזנב, תוך שימוש בקוטר חיצוני 0.5 מ"מ (OD), 0.3 מ"מ קוטר פנימי (ID) לשני החלקים הסופיים וצינורות ID בקוטר 0.6 מ"מ OD ו-0.5 מ"מ לחלק האמצעי.
    1. חתכו את מקטעי הקנולה לאורך של 2 ס"מ לחלק הפרוקסימלי שמחובר למחט המזרק, 40 ס"מ לחלק האמצעי, ו-8 ס"מ לחלק הדיסטלי המיועד לקניולציה.
    2. חתכו והזיזו את הקצה הדיסטלי של מכלול הקנולה בזווית של כ-45° כדי לאפשר הכנסה חלקה לתעלה הלימפה הצווארית. עיין באיור 2 לאיור מפורט של הרכבת הקנולה.
      הערה: שיפוע זה מקל על החדרה חלקה לצינור הלימפה ומפחית את הסיכון לחסימה על ידי הגדלת שטח החתך היעיל. לאחר קנולציה מוצלחת, החתך הפרוקסימלי (2 ס"מ) מנותק, והלימפה נאספת ישירות מהקצה הפרוקסימלי החשוף של החלק האמצעי (כפי שמתואר בפירוט בשלבים 4.9 ו-4.10).

figure-protocol-1
איור 2: דיאגרמה סכמטית של מכלול הקנולה (לא בקנה מידה). התרשים ממחיש את מידות כל רכיב בצינור ה-PE המורכב המשמש לבניית הקנולה. משמאל לימין, הקנולה המורכבת תיקרא מעתה הקצה הפרוקסימלי, החלק האמצעי והקצה המרוחק, בהתאמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.  

  1. הכינו את מערכת שאיפת ההרדמה על ידי טעינת איזופלוראן נוזלי למיכל בלחץ המצויד באדוי. לפני השימוש, יש לבצע ריצת בדיקה (פריימינג) של המאדה כדי לוודא אטימות אוויר ולהבטיח זרימת גז יציבה ועקבית.
  2. אם נדרש, הכן את מועמד התרופה לבדיקה ברכב מתאים. בצע בדיקות יציבות לאישור שלמות הנוסחה במהלך האחסון ובמהלך תקופת ההזנה. כלול סוכנים נוספים (למשל, צבעים ביולוגיים כמו Evans Blue) כאשר רלוונטי.
  3. הכינו את המיכלים לאיסוף לימפה על ידי שקילה מוקדמת של צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים ורישום משקלם ההתחלתי. סמן כל צינור ברצף לפי נקודות זמן איסוף מתוכננות (למשל, מרווחי שעה). הוסיפו הפארין מרוכז (או EDTA) לכל צינור והסרו את הממס באמצעות אידוי חנקן, והשאירו 2 עד 5 IU של הפארין היבש (או EDTA) לכל צינור כדי למנוע דילול לא אחיד של הלימפה שנאספה.

3.  הכנות מיד לפני הניתוח

  1. בדוק את הפטנטיות של כל קנולה על ידי שטיפה עם תמיסת נוגד הקרישה המוכן. חבר מזרק לקצה הפרוקסימלי של הקנולה המורכבת ושחרר בעדינות נפח קטן של תמיסה. ודא שהתמיסה יוצאת בצורה חלקה מהקצה המרוחק ללא סימני דליפה. אם מתגלה דליפה, כפי שמצוין בדרך כלל כאשר נוזל יוצא מנקודת החיבור, יש להשליך את כל מכלול הקנולה ולבנות מחדש מחדש לפי שלב 2.3.
    הערה: שלב זה מצופה מראש את פני השטח הפנימיים של הקנולה בנוגד קרישה (שלב זה עשוי להתבצע גם ביום שלפני הניתוח, כך שהקנולה מצופה מראש במהלך הלילה).
  2. התחל להזריק איזופלורן שנשאף דרך מסכת חרוט האף כ-5 דקות לפני תחילת הניתוח. שמרו על הרדמה לאורך כל ההליך בקצב אספקה של 0.4 עד 0.6 ליטר לדקה תחת לחץ של 101.3 קילופסקל בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. וודא עומק ההרדמה על ידי הערכת תגובת צביטת האצבע.
    1. עקוב באופן רציף אחרי עומק ההרדמה. מיד יש להמית את העכברוש אם מופיעים סימני מצוקה או חוסר יציבות פיזיולוגית.
  3. מקם את העכברוש על הגב על כרית ניתוח מחוממת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הטי את הראש והאריך את הצוואר, תוך שימוש בתמיכה קטנה (כרית) במידת הצורך, כדי למקסם את החשיפה של אזור צוואר הרחם. אבטח את הראש בתוך מסכת ההרדמה כדי להבטיח אספקה רציפה של איזופלורן, והגב בעדינות את הגפיים הקדמיות באמצעות גומיות או סרטי ניתוח כדי למזער תנועה במהלך ההליך.
  4. שטוף את הפרווה מעל אזור צוואר הרחם עם מי מלח סטריליים רגילים כדי להקל על הגילוח. גלח היטב את כל אזור הניתוח (באמצעות להב גילוח בטיחות דו-צדדי), בדרך כלל את הצוואר ואזור הבריח, כדי להבטיח הסרה מלאה של הפרווה לפני החתך (ראו איור 3A לדוגמה של אזור הצוואר המגולח).
  5. נקה את כל האזור המגולח עם חומרי חיטוי, כמו חומר המכיל יוד.
  6. סמן את אתר הניתוח על ידי ציור קו מקווק של 2.5 ס"מ לאישור אורך החתך הראשוני. מקם את הקו מעט ימינה לקו האמצע של גוף העכברוש. הניחו את הקצה העליון של החתך כ-1 עד 1.5 ס"מ מתחת לשפה התחתונה (ראו איור 3B לדוגמה של אתר החתך, עם מדידות בעזרת סרגל).

figure-protocol-2
איור 3: הכנת אתר הניתוח. (א) אזור הצוואר מגולח כהכנה לחתך; (ב) אורך ומיקום משוערים של החתך, המסומנים בקו המקוקו בקוטר 2.5 ס"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. קנולציה של צינור הלימפה הצווארי

  1. מקם את העכברוש כשהראש שלו מופנה לכיוון המפעיל. השתמשו במיקרוסקופ לשלב זה בגלל הקוטר הקטן יחסית של צינור הלימפה הצווארי.
  2. באמצעות סכין סטרילית, חתכו בזהירות את השכבה השטחית של שרירי צוואר הרחם לאורך הסימן שאורכו 2.5 ס"מ, שממוקם כמעט במקביל לקו האמצע (ראו איור 4A לשכבת העור השטחית הפתוחה).
  3. הפרדו בעדינות את שכבות השרירים הנותרות, בעיקר את הפאסיה הצווארית השטחית, כדי לחשוף את העורק הצווארי, שלרוב ניתן להבחין בו בצבעו האדום.
  4. משוך את שריר הסטרנומסטואיד ואת בלוטת הלסת התת-לסתית והטה אותם בזהירות הרחק משדה הניתוח כדי לאפשר זיהוי צינור הלימפה הצווארי. השתמשו במרחיב רקמות לשמירה על חלון הניתוח והשתמשו במקלון צמר גפן כדי להחזיק זמנית את רקמת השריר תוך כדי איתור בלוטת הלימפה וצינור הלימפה הנלווה. ודאו שמרחיב הרקמה נמצא במקומו לאורך כל תהליך הקנולציה (ראו איור 4B לחלון הניתוח הפתוח עם מרחיב הרקמה במקומו).
  5. אתר את צינור הלימפה הצווארי (רצוי תחת מיקרוסקופ): התעלה נראית ככלי אטום וחסר צבע בקוטר של כ-0.2 עד 0.5 מ"מ והיא עוברת מיד במקביל לעורק התרדמה. לעיתים קרובות ניתן לראות dCLN אחד או יותר, בצבע עור, סמוך לאורך מסלול תעלת הלימפה הצווארית (ראו איור 4C לתצוגה מיקרוסקופית של צינור הלימפה הצווארי העמוק החשוף ושל dCLN סמוך).
    הערה: לצינורות הלימפה הצוואר יש בדרך כלל צבע דומה מאוד לרקמות הסובבות, וזיהוי שלהם דורש לעיתים בדיקה קפדנית, במיוחד בעכברים עם יותר רקמת שומן. למטרות פרקטיקה כירורגית (אך לא למחקרים על הובלה לימפטית של תרופות או חומרים אנדוגניים), ניתן להזריק את אוונס בלו תת-עורית מתחת לצוואר בתחילת הניתוח, כדי שניתן יהיה לראות טוב יותר את צינור הלימפה הצווארי כאשר הצבע מתנקז דרך הלימפה.
  6. באמצעות זוג מלקחיים קהים, עברו בעדינות דרך רקמות החיבור המופרדות ושמרו על המלקחיים במקומם כדי להבטיח שצינור הלימפה הצווארי יישאר גלוי בבירור בשדה הניתוח.
  7. בודדו בזהירות את צינור הלימפה הצווארי מרקמות החיבור והשומן הסובבות באמצעות דיסקציה קהה, תוך זהירות מיוחדת למניעת נזק, שכן כלי הדם עדין מאוד.
  8. השתמש בזוג מיקרוסיסורים כדי ליצור חתך קטן בחלק העליון של התעלה החשופה. אל תנתק את התעלה לחלוטין; שני החצאים חייבים להישאר שלמים.
  9. בדקו וודאו שהקנולה המוכנה מראש עם תמיסת נוגדי קרישה (כפי שמתואר בשלב 2.3) נקייה מבועות אוויר על ידי ביצוע שטיפה עדינה. מיד לפני ההכנסה, אחזו בזהירות בקצה המרוחק של הקנולה עם מלקחיים, ומכוונים אותו כך שהפנים המשופעות יהיו מכוונות כלפי מעלה. לאחר מכן, התקדמו בעדינות את הקנולה כ-2 מ"מ לתוך התעלה דרך החתך, ומכוונים אותה לכיוון הראש (ראו איור 4D להמחשה של קניולציה מוצלחת). עומק ההחדרה בפועל עשוי להשתנות בהתאם לעכברוש הספציפי.
    הערה: מכיוון שהכנסת הקנולה בהליך זה רדודה יחסית, נקודת קיבוע נוספת לאזור הסובב יכולה להיות מועילה. זה מושג על ידי יצירת חור עור קטן (חור) כ-1.5 ס"מ מחלון הניתוח באמצעות מספריים. פתח זה ייצב עוד יותר בשלבים הבאים (למשל, עם תפר או דבק). איור 4E מדגים שלב זה בהקשר של שימוש בדבק רקמה. יש להעביר את הקנולה דרך החור כדי לסייע בקיבוע מיקומה.
  10. נתק את מזרק האינסולין יחד עם המקטע הפרוקסימלי הקצר (2 ס"מ) של הקנולה משאר מכלול הקנולה. ניתן לאסוף את הלימפה ישירות מהקצה הפרוקסימלי החשוף של המקטע האמצעי בקוטר גדול יותר. עקבו אחרי הקצה המרוחק של קטע האיסוף הזה למשך 1–2 דקות. אשר הצלחה בקניולציה על ידי יציאה נראית, איטית ויציבה של נוזל לימפה מהצינור המנוצל.
  11. לאחר שהקנולציה מאושרת כמוצלחת, אבטחו את הקנולה על ידי מריחת טיפה קטנה של דבק רקמת ציאנואקרילט עם פיפטה הן באתר חתך צינור הלימפה והן בחור הקיבוע המשני (ראו איור 4E להדגמת קיבוע הקנולה). יש להיזהר במיוחד כדי להימנע מחסימת כלי הדם או לפגוע בזרימת הלימפה.
  12. התבוננו בזרימת הלימפה במשך מספר דקות כדי לאשר יציאה יציבה (טיפה נראית לעין בדרך כלל נוצרת בקצה הקנולה בתוך דקה). לאחר האימות, הסר בזהירות את מרחיב הרקמה מחלון הניתוח והחזיר את בלוטת הלסת התת-לסתית למיקומה המקורי.
  13. חברו צינור מיקרוצנטריפוגה מצופה נוגדי קרישה מסומן מראש (ראו שלב 2.6) לקצה המרוחק של הקנולה כדי לאסוף את הלימפה הזורמת בחופשיות.

figure-protocol-3
איור 4: קנולציה של צינור הלימפה הצווארי. (א) אתר חתך באזור הצוואר; (ב) חלון ניתוח נפתח עם מרחיב רקמות במקומו והבלוטה התת-לסתית נסוגה ימינה; (C) צינור הלימפה הצווארי ו-dCLN אחד הנראה תחת מיקרוסקופ. (ד) קנולציה מוצלחת, המסומנת בקו הירוק המקווקד (מבט מיקרוסקופי). (ה) דבק רקמה הונח על אתר החתך, ונעשה דקירה משני בעור באמצעות פיפטה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

5. תקופה לאחר ניתוח ומתן תרופות

  1. לאחר סיום קנולציית צינור הלימפה הצווארי, החזירו את כל שכבות השרירים למיקומן המקורי. לאחר מכן, סגרו את חתך העור עם תפרים ו/או דבק רקמה; בדרך כלל, חתך באורך 2.5 ס"מ יכול להיות נסגר כראוי עם 8 תפרים (ראו איור 5A לחלון ניתוחי סגור בתפר). הסר את הגומייה(ים) המגבילה או סרטי הניתוח מהגפיים הקדמיות לאחר סיום שלב זה.
  2. הזרקת תרופות ל-CSF באמצעות מסלול מתאים, כגון הזרקה תוך-ציסטרנה מאגנה (ICM), תוך-חצי-מוחי (ICV) או הזרקה תוך-תוך-מותנית (LIT). באמצעות מתן ICM כדוגמה, יש לזהות את אתר ההזרקה בצירנה מגנה, הממוקם בבסיס הגולגולת ונראה כשקע הרך היחיד על פני השטח הגבי. גילח את הפרווה הסובבת לפי הצורך כדי להקל על הראייה (ראו איור 5B לאזור מתאים מסומן להזרקת ICM).
    הערה: כדי לשמור על לחץ תוך-גולגולתי (ICP) במהלך הזרקת ICM, לעיתים נמשכים נפח שווה של CSF לפני מתן התרופה. מומלץ להשתמש במזרק חדש ומלא מראש להזרקה. כיפוף מחט המזרק יכול להקל על מתן (ראו איור 5C להדגמה של הזרקת ICM באמצעות מחט מזרק מעוקלת).
  3. השאר את העכברוש על הגב על כרית הניתוח המחוממת (נשמרת על 37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאחר ההזרקה ובמהלך תקופת איסוף הדגימות.

figure-protocol-4
איור 5: ניהול לאחר הניתוח. (א) אתר חתך סגור באמצעות תפר משי. (ב) מיקום משוער של ציסטרנה מגנה עם פרווה מגולחת סביבו. (ג) מתן ICM של מועמד לתרופה באמצעות מזרק אינסולין עם מחט מעוקמת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. איסוף דגימות לימפה וניתוח

  1. לאסוף את הלימפה ברציפות לצינורות מיקרוצנטריפוגה מצופים נוגדי קרישה, והחלפת הצינורות במרווחים קבועים מראש (בדרך כלל כל שעה). אחסן את הדגימות שנאספו עם שקיות קרח באמצעות קופסת קירור. עיין באיור 6 לדגימת לימפה צווארית שנאספה בצינור מיקרוצנטריפוגה.
  2. עם סיום תהליך איסוף הלימפה, יש להמתים את העכבר בצורה הומנית בהתאם לפרוטוקולים המתאימים.
  3. קבעו את קצב זרימת הלימפה על ידי מדידת נפח הלימפה שנאסף בכל פרק זמן מתוכנן (לשעה).
  4. למדוד את ריכוזי התרופות (או החומרים המעניינים) בלימפה באמצעות שיטות אנליטיות מתאימות, כולל HPLC, HPLC-MS או ערכות בדיקה זמינות מסחרית, כדי לאפיין את קינטיקת הניקוי שלהן מהמערכת המרכזית דרך מערכת הלימפה.
  5. חשב את העברת המסה של התרופות הלימפתיות על ידי הכפלת ריכוזי התרופות הנמדדים בנפחי הלימפה המתאימים.

figure-protocol-5
איור 6: איסוף דגימות לימפה. צילום של דגימה שנאספה (כ-100 מיקרוליטר) בצינור מיקרוצנטריפוגה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

7. טיפול לאחר ההליך והשלכת פסולת

  1. יש לאחסן זמנית את העכברים(ים) שהושמתו במיכלי פסולת רפואית ייעודיים בתוך אזור אחסון קר ייעודי (למשל, מקרר) עד שיאספו ויושלכו על ידי צוות מקצועי לעיבוד פסולת רפואית.
  2. אסוף את כל הפריטים החדים שהושלכו במיכל חדים ייעודי, נפרד מכל פסולת אחרת.
  3. השליכו את כל שאר הפריטים הלא חדים ששימשו בניסוי (למשל, מטליות כותנה, גומיות, קנולות PE) בשקיות פסולת רפואית, ואל תזרקו אותם עם פסולת ביתית או כללית. ודאו שאין חפצים חדים בשקית הזו.
  4. לנקות ולחטא את כל הכלים הרב-פעמיים שנותרו בהתאם לפרוטוקולי המעבדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התקבל מערך נתונים מייצג של קצבי זרימת הלימפה השעתית (mL/h) באמצעות מודל הקנולציה של הלימפה הצוואר (ראו איור 7 לגרף המתאים). בניסוי זה שכלל שלושה (n = 3) חולדות מחקר, נאספה הלימפה ברציפות לצינורות מיקרוצנטריפוגות, שהוחלפו מדי שעה במשך תקופה של 6 שעות.

figure-results-1
איור 7: זרימת הלימפה צווארי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה קובע שיטה ניתנת לשחזור לקניולציה של צינור הלימפה הצווארי בעכברים, ומאפשר איסוף רציף של לימפה לאורך תקופות ממושכות. עם אימון מיקרוכירורגי מספק, ניתן לבצע את ההליך ביעילות ומניב דגימות לימפה עקביות בתנאים פיזיולוגיים יציבים, הנשמרים על ידי הרדמה רציפה, מה שהופך אותו למתאים לשימוש ניסיוני שגרתי. לאחר שהשתלט על ההליך, ההליך בדרך כלל דורש כ-40 עד 50 דקות להשלמה, מה שמאפשר עיבוד של מספר בעלי חיים במפגש ניסויי אחד. יתרה מזאת, איסוף רציף לאורך תקופות ממושכות, בניגוד לדגימה בנקודת זמן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שעשויים להיראות משפיעים על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

המחברים מודים בכנות למר ג'נגלין האו ולגברת ג'יה ג'או במרכז הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת התרופות הסינית על תמיכתם בביצוע ניסויים בבעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 30 גייג'יושו הלט'משמש לחיבור הקצה הפרוקסימלי של הקנולה (0503) עם מזרק הפארין
מפזר הרדמה עם מכשיר אידויחברת הכלים YYUN
מלקחיים קהיםRWD מדעי החייםF22002-10 
מטליות כותנהביוטכנולוגיה של צ'ינגדאו שולץMQ-02משמש להחזיק רקמת שריר במקום זמנית
כרית ניתוח מחוממתשנגחאי ייהנג אינסטרומנטסמימד 15 & פעמים; 20 ס"מ
הפארין נתרןטכנולוגיית הביוכימיה של שנגחאי אלאדיןH123383נדרשת דילול לפני השימוש
מזרק אינסולין (1 מ"ל)יושו הלט'U100-1MLמשמש רק לציפוי מקדים של הפארין
תמיסת איזופלוראן לשאיפהRWD מדעי החייםR510-22-10משמש להרדמה דרך אידוי
עטי טושכל מותגלא זמין
צינור מיקרו-צנטריפוגה (1.5 מ"ל)ציוד ניסיוני בננטונג היירויHR10003משמש לאיסוף לימפה
מיקרו-מספרייםRWD מדעי החייםGD234BA0007925
תפר ניתוח ניילון  שנגחאי ייהנג אינסטרומנטס4-0 35 ס"מ
פיפטה (ניתנת לכוונון נפח, מדידה בין 5 ל-50 ו-mu; L)Dragon Laboratory Instruments בע"מ7030301006משמש למדידת דבק רקמה בלבד
טיפים לפיפטה  ביושארפ לייף סיינסBS-10-Tמשמש להעברת דבק רקמה בלבד, ללא נפח נדרש ספציפי
קנולה פוליאהילן (PE) 0.5 מ"מ OD, 0.3 מ"מ ID (0503)AniLab Scientific Instruments (נינגבו)PE-0503
קנולה פוליאהילן (PE) 0.6 מ"מ OD, 0.5 מ"מ ID (0605)AniLab Scientific Instruments (נינגבו)PE-0605
להבי גילוחגילט שנגחאיQ31/0115000301C004משמש רק לגילוח פרווה
גומייהכל מותגלא זמיןמשמש להגבלת גפיים קדמיות של חולדות
שליטכל מותגלא זמין
להבי סקיפל (#23)RWD מדעי החייםS31010-01
תמיסת כלוריד נתרן (0.9%) להזרקהשיג'יאג'ואנג מס' 4 פארמהH20066533 (מספר אישור)משמש לשטיפת פרווה בלבד
ספרג-דולי ראטסמעבדת נהר ויטל בייג'ינג טכנולוגיית בעלי חיים101משקל 220 עד 250 גרם, ללא דרישת גיל
אור ניתוחיבייג'ינג היאו ביו-טקXHA011-1
מיקרוסקופ כירורגיטכנולוגיית אופטואלקטרוניקה של שנחאי צ'וויSMZ755Tמיקרוסקופ ניתוח ללא במה מכנית, ניתן לצייד במעמד נשלף
דבק רקמה3M ווטבונד1469SBהמרכיב העיקרי ציאנואקרילט 
מרחיב רקמות (קוליברי)RWD מדעי החייםR22029-04טווח הרחבה 20 מ"מ/4 ס"מ

מקורות

  1. Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
  2. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol. 9 (1), 207-299 (2018).
  3. Moore, J. E. Jr, Bertram, C. D. Lymphatic system flows. Annu Rev Fluid Mech. 50, 459-482 (2018).
  4. Dupont, G., et al. Our current understanding of the lymphatics of the brain and spinal cord. Clin Anat. 32 (1), 117-121 (2019).
  5. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  6. Xu, J., et al. The lymphatic system: a therapeutic target for central nervous system disorders. Neural Regen Res. 18 (6), 1249-1256 (2023).
  7. Raper, D., Louveau, A., Kipnis, J. How do meningeal lymphatic vessels drain the CNS. Trends Neurosci. 39 (9), 581-586 (2016).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. J Clin Invest. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Salvador, A. F. M., Abduljawad, N., Kipnis, J. Meningeal lymphatics in central nervous system diseases. Annu Rev Neurosci. 47 (1), 323-344 (2024).
  10. Guo, X., et al. Emerging roles of meningeal lymphatic vessels in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 94 (S1), S355-S366 (2023).
  11. Mestre, H., et al. Cerebrospinal fluid influx drives acute ischemic tissue swelling. Science. 367 (6483), eaax7171(2020).
  12. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  13. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8 (1), 7(2019).
  14. Wu, C., et al. Tauopathy after long-term cervical lymphadenectomy. Alzheimers Dement. 21 (4), e70136(2025).
  15. Fang, Y., et al. A new perspective on cerebrospinal fluid dynamics after subarachnoid hemorrhage: from normal physiology to pathophysiological changes. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (4), 543-558 (2022).
  16. Yen, Y. H., Chen, M. W., Lim, J. X., Chew, K. Y. Exploring lymphovenous anastomosis for Alzheimer's disease: addressing brain lymphatic dysfunction, feasibility, and outcome metrics. Plast Reconstr Surg. , (2025).
  17. Rubenstein, J., Ferreri, A. J., Pittaluga, S. Primary lymphoma of the central nervous system: epidemiology, pathology and current approaches to diagnosis, prognosis and treatment. Leuk Lymphoma. 49 (1), 43-51 (2008).
  18. Camilleri-Broët, S., et al. A uniform activated B-cell-like immunophenotype might explain the poor prognosis of primary central nervous system lymphomas: analysis of 83 cases. Blood. 107 (1), 190-196 (2006).
  19. Papadopoulos, Z., Herz, J., Kipnis, J. Meningeal lymphatics: from anatomy to central nervous system immune surveillance. J Immunol. 204 (2), 286-293 (2020).
  20. Hoang, T. A., et al. Development and application of a novel cervical lymph collection method to assess lymphatic transport in rats. Front Pharmacol. 14 (1), 1111617(2023).
  21. Licastro, E., et al. Glymphatic and lymphatic communication with systemic responses during physiological and pathological conditions in the central nervous system. Commun Biol. 7 (1), 229(2024).
  22. Sarker, A., et al. Intrathecal [(64)Cu]Cu-albumin PET reveals age-related decline of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid. Sci Rep. 13 (1), (2023).
  23. Khang, M., et al. Intrathecal delivery of nanoparticle PARP inhibitor to the cerebrospinal fluid for the treatment of metastatic medulloblastoma. Sci Transl Med. 15 (720), eadi1617(2023).
  24. Pizzo, M. E., et al. Intrathecal antibody distribution in the rat brain: surface diffusion, perivascular transport and osmotic enhancement of delivery. J Physiol. 596 (3), 445-475 (2018).
  25. Yan, J., et al. Lymphatic clearance is the main drainage route of lamotrigine-loaded micelles following delivery to the brain. J Pharm Pharmacol. 71 (10), 1488-1496 (2019).
  26. Ringstad, G., Eide, P. K. Glymphatic-lymphatic coupling: assessment of the evidence from magnetic resonance imaging of humans. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 131(2024).
  27. Pan, W. R., Suami, H., Taylor, G. I. Lymphatic drainage of the superficial tissues of the head and neck: anatomical study and clinical implications. Plast Reconstr Surg. 121 (5), 1614-1624 (2008).
  28. Bou-Assaly, W. The forgotten lymph nodes: review of the superficial head and neck lymphatic system. Radiol Imaging. 1 (1), 9-13 (2016).
  29. Yağmurlu, K., et al. Anatomical features of the deep cervical lymphatic system and intrajugular lymphatic vessels in humans. Brain Sci. 10 (12), 953(2020).
  30. Suami, H., Scaglioni, M. F. Lymphatic territories (lymphosomes) in the rat: an anatomical study for future lymphatic research. Plast Reconstr Surg. 140 (5), 945-951 (2017).
  31. Zawieja, D. C., et al. Lymphatic cannulation for lymph sampling and molecular delivery. J Immunol. 203 (8), 2339-2350 (2019).
  32. Hoang, T. A., et al. Quantifying the lymphatic transport of model therapeutics from the brain in rats. Mol Pharm. 21 (5), 2473-2483 (2024).
  33. Hoang, T. A., et al. Acute neuroinflammation alters the transport of a model therapeutic protein from the brain into lymph and blood. Mol Pharm. 21 (10), 5138-5149 (2024).
  34. Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
  35. Trevaskis, N. L., et al. The mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport. J Vis Exp. (97), e52389(2015).
  36. Gakuba, C., et al. General anesthesia inhibits the activity of the glymphatic system. Theranostics. 8 (3), 710-722 (2018).
  37. Miao, A., et al. Brain clearance is reduced during sleep and anesthesia. Nat Neurosci. 27 (6), 1046-1050 (2024).
  38. Bachmann, S. B., et al. Differential effects of anaesthesia on the contractility of lymphatic vessels in vivo. J Physiol. 597 (11), 2841-2852 (2019).
  39. Ruscic, K. J., Padera, T. P. Silence of the lymphs: some anaesthetic regimens inhibit lymphatic pumping. J Physiol. 597 (11), 2827-2828 (2019).
  40. Dahan, A., et al. The effect of general anesthesia on the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs: comparison between anesthetized and freely moving conscious rat models. Eur J Pharm Sci. 32 (4), 367-374 (2007).
  41. de Jong, W. H., et al. Long-term cannulation of the vena cava of rats for blood sampling: local and systemic effects observed by histopathology after six weeks of cannulation. Lab Anim. 35 (3), 243-248 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל עכברוש בצינור הלימפה הצווארי להערכת הובלה לימפה מהראש ומהמוח
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.