השפעת חלבון 1 המכיל תחום CUB על רבייה ומעבר אפיתליאלי–מזנכימי בתאי קרצינומה נאזופרינגיאלית

סיכום

פרוטוקול זה נועד לחקור את הביטוי והתפקוד של חלבון 1 המכיל תחום CUB בקרצינומה נאזופרינגיאלית, באמצעות ניתוח רקמות קליני ו-in vitro .בדיקות להערכת תפקידו בוויסות המעבר האפיתלי-מזנכימלי דרך מסלול האיתות ERK1/2.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר גישה מתודולוגית לחקירת הביטוי והתפקיד התפקודי של חלבון 1 המכיל תחום CUB בקרצינומה נאזופרינגיאלית ומעורבותו הפוטנציאלית במעבר אפיתל למזנכימלי. נאספו דגימות רקמה קליניות ממטופלים עם קרצינומה נאזופרינגיאלית וריניטיס לניתוח ביטוי CDCP1 באמצעות PCR כמותי בזמן אמת ואימונוהיסטוכימיה. ניסויים במבחנה בוצעו באמצעות קווי תאי קרצינומה נאזופרינגיאלית של CNE2 ו-HK1. ביטוי יתר והפלה של CDCP1 הושגו באמצעות טרנספקציה עם פלסמיד CDCP1 או siRNA ספציפי. התרבות התאים הוערכה באמצעות בדיקת MTT, האפופטוזיס הוערכה באמצעות מדידת פעילות Caspase-3, והביטוי של סמנים הקשורים ל-EMT ורמות הפוספורילציה של ERK1/2 זוהו באמצעות Western Blot ו-PCR כמותי. כדי לאמת מעורבות במסלול, נערכו ניסויי חילוץ באמצעות המעכב הייחודי ל-ERK1/2 U0126. פרוטוקול זה מספק מסגרת שיטתית במבחנה ומחוץ לחיים להבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם CDCP1 עשוי לווסת את התקדמות הגידול בקרצינומה נאזופרינגיאלית.

מבוא

קרצינומה נאזופרינגיאלית היא הגידול הממאיר הראשוני הנפוץ ביותר של הנאזופרינקס, שמקורו באפיתל הנאזופרינגיאלי, ומהווה ממאירות ראש וצוואר עם תכונות התפוצה גאוגרפית ייחודיות ^1,2. כ-98% ממקרי קרצינומה נאזופרינגיאלית קשורים לזיהום EBV סמוי. מחלה זו בעלת שכיחות גבוהה באסיה אך נדירה באירופה, והופעתה עשויה להיות קשורה להרגלי תזונה וגורמים נוספים ^3,4,5. לפי סיווג היסטולוגי, ניתן לסווג את קרצינומה הנאזופרינגיאלית לסוגים I, II ו-III של ארגון הבריאות ^{העולמי 6,7,8}. בהשוואה לסוג I, קרצינומה נאזופרינגיאלית מסוג II ו-III רגישות יותר לקרינה מייננת⁹; לכן, הקרנותרפיה משמשת באופן נרחב בטיפול שלה^10,11. עם זאת, מטופלים עם קרצינומה נאזופרינגיאלית עדיין נמצאים בסיכון לגרורות תאי גידול, שהיא אחת הסיבות המובילות למוות^12,13. שיעור ההישנות הגבוה מדגיש את הצורך הדחוף להבהיר את המנגנונים המולקולריים המרכזיים המשפיעים על גרורות קרצינומה נאזופרינגיאלית ולחקור אינדיקטורים ביולוגיים חדשים שיכולים לחזות סיכון גרורות.

חלבון המכיל תחום CUB 1 (CDCP1) הוא חלבון ממברנה שממלא תפקיד מניע בתאי סרטן שונים 14,15,16. מחקרים אישרו כי CDCP1 מעורב בוויסות גרורות במספר גידולים^17,18. בסרטן ריאות, ביטוי CDCP1 מופרז ומקושר באופן הדוק להתרבות מופרזת של תאי הגידול, סוג פתולוגי, שלב TNM וגרורות בלוטות לימפה^19,20. עם זאת, מאפייני הביטוי והתפקוד של CDCP1 בקרצינומה נאזופרינקיאלית טרם דווחו. לכן, הבהרת המנגנון של CDCP1 בקרצינומה נאזופרינגיאלית היא בעלת חשיבות קלינית משמעותית לחשיפת מנגנוני הגרורות שלו ולפיתוח מטרות התערבות חדשות.

כדי לחקור את ביטוי CDCP1 בקרצינומה נאזופרינגיאלית והשפעתו על התנהגות ביולוגית של תאי הגידול, המחקר השתמש באסטרטגיה המשלבת דגימות רקמה קליניות עם ניסויים תאיים במבחנה . על ידי זיהוי רמת הביטוי של CDCP1 ברקמות קרצינומה נאזופרינגיאלית וקביעת מודלים של ביטוי יתר והשתקה בקו התאים של קרצינומה נאזופרינגיאלית CNE2, הוערך התרבות התאים באמצעות בדיקת MTT, הוערכה אפופטוזיס על ידי זיהוי פעילות קספס-3, והבעה של סמנים הקשורים למעבר אפיתליאלי-מזנכימי (EMT) וכן מצב ההפעלה של מסלול האיתות ERK1/2 נבדקו באמצעות PCR כמותי בזמן אמת ו ווסטרן בלוט. שיטות אלו משמשות רבות במחקר גידולים, ומספקות שחזוריות טובה ונוחות תפעול.

בהשוואה לגישות המבוססות על שיטת גילוי אחת, מחקר זה משלב בדיקות פונקציונליות רב-ממדיות עם ניתוח מסלולי איתות כדי להעריך באופן שיטתי יותר את מנגנון CDCP1 בקרצינומה נאזופרינגיאלית. מבחן MTT מתאים לזיהוי התרבות תאים בתפוקה גבוהה, עם פעולה פשוטה ועלות נמוכה; זיהוי פעילות קספאז-3 משקף כמותית את רמת האפופטוזיס; Western Blot ו-qRT-PCR יכולים לאמת את שינויי הביטוי של גורמים הקשורים ל-EMT ברמות החלבון וה-mRNA, בהתאמה. למרות שלשיטות אלו יש מגבלות מסוימות מבחינת עומק מכני, כמו חוסר היכולת לעקוב אחר שינויים דינמיים במסלולי איתות בזמן אמת, הן עדיין מספקות תמיכה טכנית אמינה לחקירה ראשונית של פונקציית CDCP1.

מחקר זה נועד להבהיר את דפוס הביטוי של CDCP1 בקרצינומה נאזופרינגיאלית, לחקור את מנגנון ויסות EMT, התרבות תאי גידול ואפופטוזיס דרך מסלול האיתות ERK1/2, ובכך לספק ראיות ניסיוניות להבהרת מנגנוני גרורות קרצינומה נאזופרינגיאלית ולזהות מטרות פוטנציאליות להתערבות.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים ליוואן, מכללת הרפואה טונגג'י, אוניברסיטת המדע והטכנולוגיה חואז'ונג [אישור מס' 2026IEC(RYJ016)]. כל המטופלים נתנו הסכמה מדעת, ואיסוף ושימוש בדגימות קליניות עמדו בהנחיות האתיות הרלוונטיות של הצהרת הלסינקי. החומרים והכלים הניסיוניים העיקריים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

איסוף דגימות רקמה קליניות וזיהוי ביטוי CDCP1

דגימות רקמה כירורגית נאספו משבעה מטופלים שאובחנו עם קרצינומה נאזופרינגיאלית בבית החולים שלנו בין ינואר 2019 לדצמבר 2019. במקביל, נאספו דגימות רקמת אף משישה חולים עם ריניטיס כביקורת. כל דגימות הרקמה הוקפאו מיד בחנקן נוזלי לאחר האיסוף לצורך חילוץ RNA נוסף.

חילוץ RNA וזיהוי PCR כמותי בזמן אמת

סך ה-RNA הופק מדגימות רקמה לפי הוראות היצרן. לכל דגימה, 50–100 מ"ג רקמה עובדו על קרח ב-1 מ"ל של תגובת חילוץ באמצעות הומוגניזר רקמות. ההומוגניזציה בוצעה במשך 30 שניות וחזרה על עצמה 3 פעמים כדי להבטיח הפרעה מוחלטת של הרקמה. לאחר הפרעה ברקמות, כל ליזאט קיבל 200 מיקרוליטר כלורופורם. הצינורות נערו בעוצמה על ידי מערבולת במשך 15 שניות, נשמרו בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות, ואז סובבו ב-12,000 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C להפרדת השלבים. השכבה המימית השקופה הוסרה מבלי להפריע לאינטרפאזה והועברה לצינור חדש.

RNA הוחזר מהחלק המימי הזה על ידי הוספת איזופרופנול ביחס נפח של 1:1. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, הדגימות צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להוציא את ה-RNA. הסופרנטנט נזרק, והכדור נשטף פעם אחת עם 1 מ"ל של 75% אתנול. לאחר שלב צנטריפוגציה שני בטמפרטורה של 7,500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הוסר שטיפת האתנול. כדור ה-RNA יובש באוויר למשך 5–10 דקות בטמפרטורת החדר והושהה מחדש ב-20 מיקרוליטר מים ללא RNase. כמות וטוהר ה-RNA נקבעו באופן ספקטרופוטומטרית.

להכנת cDNA, השתמשו ב-1 מיקרוגרם של RNA כולל לשעתוק הפוך. התגובה בוצעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ואז חוממה ל-85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות. PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) בוצע לאחר מכן עם TB Green Premix Ex Taq II על מערכת PCR בזמן אמת. כל תגובה של 20 מיקרוליטר כללה 2 מיקרוליטר של תבנית cDNA, פריימרים קדמיים ואחוריים בקצב 0.4 מיקרומול/ליטר כל אחד, 10 מיקרו-ליטר של תערובת SYBR גרין, ומים ללא נוקליאז. פרוטוקול ההגברה החל בדנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לאחר מכן התקיימו 40 מחזורים, כאשר כל מחזור כלל 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לאנילינג/הארכה. רצפי פריימר מפורטים בטבלה 1.

זיהוי אימונוהיסטוכימי של ביטוי חלבון CDCP1

דגימות רקמה הוקבעו תחילה ב-4% פאראפורמלדהיד במשך 24 שעות, ולאחר מכן בוצעו ייבוש סטנדרטי, הטמעת פרפין והכנת חתכים בעובי 4 מיקרון. מקטעי הפרפין טופלו לאחר מכן בקסילן להסרת פרפין והודרו מחדש ברצף באמצעות תמיסות אתנול מדורגות. לצורך חשיפת אנטיגן, הסליידס הונחו בבופר ציטראט (pH 6.0) וחוממו בסיר לחץ למשך 3 דקות לאחר שהתמיסה הגיעה לרתיחה. פעילות פרוקסידאז אנדוגנית הופסקה על ידי חשיפת החתכים ל-3% מי חמצן למשך 10 דקות.

לאחר חסימת פעילות האנזים האנדוגנית, החתכים נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כאשר נוגדן האנטי-CDCP1 הראשוני מדולל ב-1:200. ביום הבא, המגלשות טופלו בנוגדן משני מצונף פרוקסידאז חזרת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוויזואליזציה של האותות בוצעה באמצעות ערכת מצע DAB, והחתכים צוברו לאחר מכן עם המטוקסילין. לבסוף, המצלפים יובשו, הותקנו ונבדקו תחת מיקרוסקופ אופטי.

תרבית תאים וקיבוץ

תאי קרצינומה נאזופרינגיאלית אנושיים של CNE2 ו-HK1 נשמרו ב-DMEM עתיר גלוקוז שהושלמו עם 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. תאים גודלו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שמכיל 5% CO₂. כאשר התאים הגיעו ל-70%–80% מפגש תאים, הם עברו טרנספקט לפי הקבוצות הבאות: קבוצת ביקורת (ביקורת): עברו טרנספקט עם siRNA וקטורי ריק או שלילי בביקורת; קבוצת ביטוי יתר CDCP1 (CDCP1-OE): עברה טרנספקט עם פלסמיד ביטוי יתר CDCP1 ; קבוצת השתקת CDCP1 (si-CDCP1): עברה עם siRNA של CDCP1 ; קבוצת ניסויי ההצלה (CDCP1-OE + U0126): טופלה במעכב הספציפי ל-ERK1/2 U0126 (10 מיקרומול/ליטר) במשך 48 שעות על בסיס ביטוי יתר של CDCP1 .

הטרנספקציה בוצעה לפי הוראות היצרן. התאים צורפו 24 שעות לפני הטרנספקציה בלוחות 6 בארות ב-2 ×-^{10 5} תאים לבאר, כאשר כל באר הכילה 2 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה. הטרנספקציה החלה כאשר התרביות הגיעו לכ-70% מפגש ביניהם. מדיום התרבית הוסר והוחלף במדיום טרי ללא סרום. לכל באר, הוכנו 2 מיקרוגרם DNA פלסמיד או 100 pmol של siRNA בנפרד מ-5 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה, כאשר כל רכיב מדולל ב-250 מיקרוליטר של תווך מופחת המכיל סרום. שתי התערובות נשמרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. החומצה הגרעינית המדוללת ומגיב הטרנספקציה שולבו והותרכו לעמוד במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ליצירת קומפלקסי הטרנספקציה. הקומפלקסים הללו נוספו לתאים בדרכה נמוכה, הופצו בעדינות ברחבי הבאר, ודגרו יחד עם התאים במשך 6 שעות. לאחר סיום תקופת הדגירה, תערובת הטרנספקציה הוסרה, והתאים סופקו במדיום שלם המכיל 10% FBS.

בדיקת התרבות תאים

ב-48 שעות לאחר הטרנספקציה, נאספו ותאי CNE2 ו-HK1 מכל קבוצה ונזרעו בלוחות של 96 בארות בצפיפות של 3 ×-^{10 3} תאים לבאר עם 100 מיקרוליטר מדיום בכל באר, עם חמישה בארות שכפול בכל קבוצה. לאחר תרבית התאים למשך 24, 48 או 72 שעות, נוספו 10 מיקרוליטר תמיסת MTT ב-5 מ"ג/מ"ל לכל באר. הלוחות דגרו שוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 4 שעות נוספות. לאחר דגירה זו, הסופרנטנט התרבית הושלך בזהירות, ונוספו 100 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן. הלוחות נערבבו במשך 10 דקות כדי להבטיח פירוק מוחלט. הספיגה נרשמה לאחר מכן באמצעות קורא מיקרופלט ב-570 ננומטר, תוך שימוש ב-630 ננומטר כאורך גל ייחוס.

בדיקת פעילות אפופטוזיס

לאחר 48 שעות לאחר הטרנספקציה, נאספו תאי CNE2 מכל קבוצה, ופעילות קספאז-3 זוהתה באמצעות ערכת בדיקת פעילות Caspase-3 לפי הוראות היצרן. סך הכל 100 מיקרוליטר של בופר ליזיס נוסף ל-1 × 10^{תאים ב-6} תאים, לוזז על קרח למשך 15 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופנטנט שהתקבל הועבר לניתוח מאוחר יותר. למבחן Caspase-3, כל באר קיבלה 50 מיקרוליטר של בופר תגובה ו-5 מיקרוליטר של תת-קספס-3 (DEVD-pNA). הפלטה נשמרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, והספיגה נמדדה ב-405 ננומטר עם קורא לוחות מיקרו.

ניתוח כתמים מערביים

ב-48 שעות לאחר הטרנספקציה, תאי CNE2 ו-HK1 מכל קבוצת ניסוי נאספו לצורך הפקת חלבון. תאים הופרעו בבופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז והוחזקו על הקרח למשך 30 דקות. הליזטים שהתקבלו עברו צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן נאספו חלקי הסופרנטנט. ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.

לניתוח ווסטרן בלוט, 30 מיקרוגרם חלבון כולל מכל דגימה עורבבו עם בופר טעינה פי 5 וחוממו בטמפרטורה של 100°C למשך 10 דקות כדי לדנטור את החלבונים. הדגימות הופרדו על ג'לים SDS-PAGE של 10% ב-120 וולט למשך 90 דקות, ולאחר מכן הועברו לממברנות PVDF בזרם קבוע של 300 mA למשך 90 דקות. לאחר ההעברה, הממברנות נחסמו בחלב דל שומן של 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר.

הממברנות דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CDCP1 (1:1,000), E-cadherin (1:1,000), Vimentin (1:1,000), p-ERK1/2 (1:2,000), ERK1/2 (1:1,000) ו-GAPDH (1:5,000).

ביום הבא, הממברנות נשטפו ב-TBST שלוש פעמים, כאשר כל שטיפה נמשכה 10 דקות. לאחר מכן נחשפו לנוגדנים משניים מצומדים פרוקסידאז של חזרת למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות נוספות של TBST, אותות החלבון הוצגו באמצעות מצע כימילומינסנציה של ECL. עוצמת הרצועות נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ, ו-GAPDH שימש כבקרת הנורמליזציה.

ניתוח סטטיסטי
כל הניסויים נערכו באופן עצמאי 3x. התוצאות מוצגות כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ההבדלים בין קבוצות מרובות הוערכו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA), ושיטת טוקי שימשה להשוואות זוגיות לאחר מכן. ערך P של < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

תוצאות

CDCP1. הגברת רגלציה ברקמות קרצינומה נאזופרינקסית

רמת הביטוי של mRNA של CDCP1 בשבע רקמות קרצינומה נאזופרינגיאלית ושש רקמות ריניטיס זוהתה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. התוצאות הראו כי ביטוי mRNA של CDCP1 ברקמות קרצינומה של הנזופרינגיאלית היה גבוה משמעותית מאשר ברקמות ריניטיס (P < 0.05, איור 1A). בנוסף, בוצעה צביעה אימונוהיסטוכימית לזיהוי מיקום ורמת הביטוי של חלבון CDCP1 ברקמות. התוצאות הראו ...

דיון

מחקר זה חקר באופן שיטתי, לראשונה, את מאפייני הביטוי של CDCP1 ברקמות קרצינומה נאזופרינגיאלית ואת השפעותיו על התנהגות ביולוגית של תאי הגידול, והבהיר באופן ראשוני את המנגנון המולקולרי שבו CDCP1 מקדם מעבר אפיתליאלי-מזנכימי באמצעות הפעלת מסלול האיתות ERK1/2. הממצאים מצביעים על כך ש-CDCP1 ממלא תפקיד פרוטומגני בקרצינומה נאזופרינגיאלית, ומספק ראיות ניסיוניות חדשות להבנת מנגנוני הגרורות במחלה זו.

מחקר זה מצא כי ביטוי CDCP1. היה מווסת באופן משמעותי ברקמות קרצינ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת בדיקת חלבון BCA	תרמו פישר, ארה"ב	23225	לקביעת ריכוז החלבון
ערכת בדיקת פעילות Caspase-3	ביוטיים, סין	C1403	מבחן קולורימטרי לפעילות Caspase-3
פלסמיד ביטוי יתר של CDCP1	לא צוין	לא צוין	עבור העברה של ביטוי יתר ב-CDCP1
נוגדן ראשוני ל-CDCP1	אבקאם, ארה"ב	ab137706	עבור IHC ו-Western Blot; דילול 1:200 (IHC) או 1:1000 (WB)
siRNA של CDCP1	לא צוין	לא צוין	להשתקת גנים CDCP1
קו תאים CNE2	מרכז סין לאוסף תרבות טיפוס (CCTCC), סין	לא צוין	קו תאי קרצינומה נאזופרינגיאלית אנושית
מדיום סוכר גבוה DMEM	הייקלון, ארה"ב	SH30243.01	תרבית תאים
DMSO	סיגמא, ארה"ב	D2650	להמסה של גבישים במבחן MTT
נוגדן ראשוני E-cadherin	טכנולוגיית איתות סלולרי, ארה"ב	3195S	כתם מערבי; דילול 1:1000
ERK1/2 נוגדן ראשוני	טכנולוגיית איתות סלולרי, ארה"ב	4695S	כתם מערבי; דילול 1:1000
נוגדן ראשוני ל-GAPDH	אבקאם, ארה"ב	ab8245	בקרת טעינת כתמים מערביים; דילול 1:5000
קו התאים HK1	מרכז סין לאוסף תרבות טיפוס (CCTCC), סין	לא צוין	קו תאי קרצינומה נאזופרינגיאלית אנושית
ליפופקטמין 2000	אינויטרוגן, ארה"ב	11668019	תגובת טרנספקציה
קורא מיקרופלט	ביוטק, ארה"ב	לא צוין	זיהוי ספיגה (MTT, Caspase-3)
MTT	סיגמא, ארה"ב	M2128	בדיקת התרבות תאים; הוכן ב-5 מ"ג/מ"ל ב-PBS
אופטי-MEM	גיבקו, ארה"ב	31985070	מדיום סרום מופחת לטרנספקציה
p-ERK1/2 נוגדן ראשוני	טכנולוגיית איתות סלולרי, ארה"ב	4370S	כתם מערבי; דילול 1:2000
PrimeScript RT Master Mix	טקארה, יפן	RR036B	מגיב שעתוק הפוך ל-PCR בזמן אמת
ממברנת PVDF	מיליפור, ארה"ב	IPVH00010	העברת חלבון; 0.45 & mu; גודל נקבוביות M
מערכת PCR בזמן אמת QuantStudio 5	Applied Biosystems, ארה"ב	A34322	זיהוי qPCR
RIPA Lysis Buffer	ביוטיים, סין	P0039	הפקת חלבון; בופר פירוק RIPA מלא
נוגדן משני (מצ'ומד HRP)	דקו, דנמרק	לא צוין	עבור IHC ו-Western Blot
בופר נתרן ציטראט	לא צוין	לא צוין	לשאיבת אנטיגנים של IHC, pH 6.0
TB Green Premix Ex Taq II	טקארה, יפן	RR820A	תגובת qPCR; 200 תגובות
הומוגניזר רקמות	IKA T10, גרמניה	לא צוין	להומוגניזציה של חילוץ RNA רקמתי
ריאגנט טריזול	אינויטרוגן, ארה"ב	15596026	חילוץ RNA
U0126	סלק, ארה"ב	S1102	מעכב ספציפי ל-ERK1/2; שימש ב-10 & mu; mol/L
נוגדן ראשוני לוימנטין	טכנולוגיית איתות סלולרי, ארה"ב	5741S	כתם מערבי; דילול 1:1000