$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים ליוואן, מכללת הרפואה טונגג'י, אוניברסיטת המדע והטכנולוגיה חואז'ונג [אישור מס' 2026IEC(RYJ016)]. כל המטופלים נתנו הסכמה מדעת, ואיסוף ושימוש בדגימות קליניות עמדו בהנחיות האתיות הרלוונטיות של הצהרת הלסינקי. החומרים והכלים הניסיוניים העיקריים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
איסוף דגימות רקמה קליניות וזיהוי ביטוי CDCP1
דגימות רקמה כירורגית נאספו משבעה מטופלים שאובחנו עם קרצינומה נאזופרינגיאלית בבית החולים שלנו בין ינואר 2019 לדצמבר 2019. במקביל, נאספו דגימות רקמת אף משישה חולים עם ריניטיס כביקורת. כל דגימות הרקמה הוקפאו מיד בחנקן נוזלי לאחר האיסוף לצורך חילוץ RNA נוסף.
חילוץ RNA וזיהוי PCR כמותי בזמן אמת
סך ה-RNA הופק מדגימות רקמה לפי הוראות היצרן. לכל דגימה, 50–100 מ"ג רקמה עובדו על קרח ב-1 מ"ל של תגובת חילוץ באמצעות הומוגניזר רקמות. ההומוגניזציה בוצעה במשך 30 שניות וחזרה על עצמה 3 פעמים כדי להבטיח הפרעה מוחלטת של הרקמה. לאחר הפרעה ברקמות, כל ליזאט קיבל 200 מיקרוליטר כלורופורם. הצינורות נערו בעוצמה על ידי מערבולת במשך 15 שניות, נשמרו בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות, ואז סובבו ב-12,000 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C להפרדת השלבים. השכבה המימית השקופה הוסרה מבלי להפריע לאינטרפאזה והועברה לצינור חדש.
RNA הוחזר מהחלק המימי הזה על ידי הוספת איזופרופנול ביחס נפח של 1:1. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, הדגימות צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להוציא את ה-RNA. הסופרנטנט נזרק, והכדור נשטף פעם אחת עם 1 מ"ל של 75% אתנול. לאחר שלב צנטריפוגציה שני בטמפרטורה של 7,500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הוסר שטיפת האתנול. כדור ה-RNA יובש באוויר למשך 5–10 דקות בטמפרטורת החדר והושהה מחדש ב-20 מיקרוליטר מים ללא RNase. כמות וטוהר ה-RNA נקבעו באופן ספקטרופוטומטרית.
להכנת cDNA, השתמשו ב-1 מיקרוגרם של RNA כולל לשעתוק הפוך. התגובה בוצעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ואז חוממה ל-85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות. PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) בוצע לאחר מכן עם TB Green Premix Ex Taq II על מערכת PCR בזמן אמת. כל תגובה של 20 מיקרוליטר כללה 2 מיקרוליטר של תבנית cDNA, פריימרים קדמיים ואחוריים בקצב 0.4 מיקרומול/ליטר כל אחד, 10 מיקרו-ליטר של תערובת SYBR גרין, ומים ללא נוקליאז. פרוטוקול ההגברה החל בדנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לאחר מכן התקיימו 40 מחזורים, כאשר כל מחזור כלל 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לאנילינג/הארכה. רצפי פריימר מפורטים בטבלה 1.
זיהוי אימונוהיסטוכימי של ביטוי חלבון CDCP1
דגימות רקמה הוקבעו תחילה ב-4% פאראפורמלדהיד במשך 24 שעות, ולאחר מכן בוצעו ייבוש סטנדרטי, הטמעת פרפין והכנת חתכים בעובי 4 מיקרון. מקטעי הפרפין טופלו לאחר מכן בקסילן להסרת פרפין והודרו מחדש ברצף באמצעות תמיסות אתנול מדורגות. לצורך חשיפת אנטיגן, הסליידס הונחו בבופר ציטראט (pH 6.0) וחוממו בסיר לחץ למשך 3 דקות לאחר שהתמיסה הגיעה לרתיחה. פעילות פרוקסידאז אנדוגנית הופסקה על ידי חשיפת החתכים ל-3% מי חמצן למשך 10 דקות.
לאחר חסימת פעילות האנזים האנדוגנית, החתכים נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כאשר נוגדן האנטי-CDCP1 הראשוני מדולל ב-1:200. ביום הבא, המגלשות טופלו בנוגדן משני מצונף פרוקסידאז חזרת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוויזואליזציה של האותות בוצעה באמצעות ערכת מצע DAB, והחתכים צוברו לאחר מכן עם המטוקסילין. לבסוף, המצלפים יובשו, הותקנו ונבדקו תחת מיקרוסקופ אופטי.
תרבית תאים וקיבוץ
תאי קרצינומה נאזופרינגיאלית אנושיים של CNE2 ו-HK1 נשמרו ב-DMEM עתיר גלוקוז שהושלמו עם 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. תאים גודלו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שמכיל 5% CO₂. כאשר התאים הגיעו ל-70%–80% מפגש תאים, הם עברו טרנספקט לפי הקבוצות הבאות: קבוצת ביקורת (ביקורת): עברו טרנספקט עם siRNA וקטורי ריק או שלילי בביקורת; קבוצת ביטוי יתר CDCP1 (CDCP1-OE): עברה טרנספקט עם פלסמיד ביטוי יתר CDCP1 ; קבוצת השתקת CDCP1 (si-CDCP1): עברה עם siRNA של CDCP1 ; קבוצת ניסויי ההצלה (CDCP1-OE + U0126): טופלה במעכב הספציפי ל-ERK1/2 U0126 (10 מיקרומול/ליטר) במשך 48 שעות על בסיס ביטוי יתר של CDCP1 .
הטרנספקציה בוצעה לפי הוראות היצרן. התאים צורפו 24 שעות לפני הטרנספקציה בלוחות 6 בארות ב-2 ×-10 5 תאים לבאר, כאשר כל באר הכילה 2 מ"ל של מדיום ללא אנטיביוטיקה. הטרנספקציה החלה כאשר התרביות הגיעו לכ-70% מפגש ביניהם. מדיום התרבית הוסר והוחלף במדיום טרי ללא סרום. לכל באר, הוכנו 2 מיקרוגרם DNA פלסמיד או 100 pmol של siRNA בנפרד מ-5 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה, כאשר כל רכיב מדולל ב-250 מיקרוליטר של תווך מופחת המכיל סרום. שתי התערובות נשמרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. החומצה הגרעינית המדוללת ומגיב הטרנספקציה שולבו והותרכו לעמוד במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ליצירת קומפלקסי הטרנספקציה. הקומפלקסים הללו נוספו לתאים בדרכה נמוכה, הופצו בעדינות ברחבי הבאר, ודגרו יחד עם התאים במשך 6 שעות. לאחר סיום תקופת הדגירה, תערובת הטרנספקציה הוסרה, והתאים סופקו במדיום שלם המכיל 10% FBS.
בדיקת התרבות תאים
ב-48 שעות לאחר הטרנספקציה, נאספו ותאי CNE2 ו-HK1 מכל קבוצה ונזרעו בלוחות של 96 בארות בצפיפות של 3 ×-10 3 תאים לבאר עם 100 מיקרוליטר מדיום בכל באר, עם חמישה בארות שכפול בכל קבוצה. לאחר תרבית התאים למשך 24, 48 או 72 שעות, נוספו 10 מיקרוליטר תמיסת MTT ב-5 מ"ג/מ"ל לכל באר. הלוחות דגרו שוב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 4 שעות נוספות. לאחר דגירה זו, הסופרנטנט התרבית הושלך בזהירות, ונוספו 100 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן. הלוחות נערבבו במשך 10 דקות כדי להבטיח פירוק מוחלט. הספיגה נרשמה לאחר מכן באמצעות קורא מיקרופלט ב-570 ננומטר, תוך שימוש ב-630 ננומטר כאורך גל ייחוס.
בדיקת פעילות אפופטוזיס
לאחר 48 שעות לאחר הטרנספקציה, נאספו תאי CNE2 מכל קבוצה, ופעילות קספאז-3 זוהתה באמצעות ערכת בדיקת פעילות Caspase-3 לפי הוראות היצרן. סך הכל 100 מיקרוליטר של בופר ליזיס נוסף ל-1 × 10תאים ב-6 תאים, לוזז על קרח למשך 15 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופנטנט שהתקבל הועבר לניתוח מאוחר יותר. למבחן Caspase-3, כל באר קיבלה 50 מיקרוליטר של בופר תגובה ו-5 מיקרוליטר של תת-קספס-3 (DEVD-pNA). הפלטה נשמרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, והספיגה נמדדה ב-405 ננומטר עם קורא לוחות מיקרו.
ניתוח כתמים מערביים
ב-48 שעות לאחר הטרנספקציה, תאי CNE2 ו-HK1 מכל קבוצת ניסוי נאספו לצורך הפקת חלבון. תאים הופרעו בבופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז והוחזקו על הקרח למשך 30 דקות. הליזטים שהתקבלו עברו צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן נאספו חלקי הסופרנטנט. ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.
לניתוח ווסטרן בלוט, 30 מיקרוגרם חלבון כולל מכל דגימה עורבבו עם בופר טעינה פי 5 וחוממו בטמפרטורה של 100°C למשך 10 דקות כדי לדנטור את החלבונים. הדגימות הופרדו על ג'לים SDS-PAGE של 10% ב-120 וולט למשך 90 דקות, ולאחר מכן הועברו לממברנות PVDF בזרם קבוע של 300 mA למשך 90 דקות. לאחר ההעברה, הממברנות נחסמו בחלב דל שומן של 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר.
הממברנות דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד CDCP1 (1:1,000), E-cadherin (1:1,000), Vimentin (1:1,000), p-ERK1/2 (1:2,000), ERK1/2 (1:1,000) ו-GAPDH (1:5,000).
ביום הבא, הממברנות נשטפו ב-TBST שלוש פעמים, כאשר כל שטיפה נמשכה 10 דקות. לאחר מכן נחשפו לנוגדנים משניים מצומדים פרוקסידאז של חזרת למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות נוספות של TBST, אותות החלבון הוצגו באמצעות מצע כימילומינסנציה של ECL. עוצמת הרצועות נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ, ו-GAPDH שימש כבקרת הנורמליזציה.
ניתוח סטטיסטי
כל הניסויים נערכו באופן עצמאי 3x. התוצאות מוצגות כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ההבדלים בין קבוצות מרובות הוערכו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA), ושיטת טוקי שימשה להשוואות זוגיות לאחר מכן. ערך P של < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.