הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירת השפעות תימוקינון על נוירוטוקסיות הנגרמת מביספנול A, איתות Keap-1/Nrf-2, לחץ חמצוני והתנהגות בעכברים

255 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70242

⸱

24 במרץ 2026

 , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה נועד לחקור את השפעות תימוקווינון על לחץ חמצוני, מסלול האיתות Keap-1/Nrf-2, והתנהגות בפלזמה, בקורטקס המוחי ובהיפוקמפוס של חולדות שנחשפו לביספנול A.

תקציר

חשיפה כרונית במינון נמוך לביספנול A (BPA), משבש אנדוקריני סביבתי נפוץ, נקשרה יותר ויותר לנוירוטוקסיות המתווכת על ידי לחץ חמצוני. תימוקינון (TQ), רכיב ביואקטיבי של Nigella sativa, מציג תכונות נוגדי חמצון חזקות; עם זאת, הפוטנציאל הנוירופרוטקנטי שלו נגד רעילות הנגרמת על ידי BPA עדיין לא מובן במלואו. בהתחשב באופי הנרחב של החשיפה ל-BPA, זיהוי אסטרטגיות נוירו-פרוטקטיביות ונגישות הופך לחשוב יותר ויותר. מחקר זה חקר את השפעות TQ על לחץ חמצוני, איתות Keap-1/Nrf-2, התנהגות ושינויים היסטופתולוגיים בעכברים שנחשפו ל-BPA. בסך הכל 24 זכרים בוגרים של Wister Albino חולקו באקראי לארבע קבוצות (n = 6 לקבוצה): ביקורת, BPA, BPA + 10 mg/kg TQ (BPA+TQ I), ו-BPA + 20 mg/kg TQ (BPA+TQ II). BPA (50 מיקרוגרם/ק"ג) ו-TQ ניתנו תוך-קיבה במשך 30 יום. חשיפה ל-BPA גרמה לליקויים התנהגותיים משמעותיים, לחץ חמצוני, הפרעה באיתות Keap-1/Nrf-2, ונזק היסטופתולוגי בולט בהיפוקמפוס ובקליפת המוח המרכזית. טיפול ב-TQ שיפר משמעותית את פעילות התנועה והתנהגות דמוית דיכאון, הפחית את פרוקסידציה של שומנים ורמות תחמוצת חנקן, החזיר את קיבולת נוגדי החמצון הקשורה לגלוטתיון, ונרמל את ביטוי Keap-1 ו-Nrf-2 (p < 0.001). השפעות ההגנה הללו היו בולטות יותר במינון הגבוה של TQ. ביחד, ממצאים אלו מראים שתימיוקינון מפחית נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי BPA באמצעות מודולציה של לחץ חמצוני ומסלול האיתות Keap-1/Nrf-2, ומדגיש את הפוטנציאל שלו כסוכן נוירו-מגן מפני חשיפה לסביבה של BPA.

מבוא

ביספנול A (BPA) הוא תרכובת סינתטית הנפוצה בפלסטיק ובשרפים אפוקסי, והיא מזוהה לעיתים קרובות בחומרי אריזת מזון, מערכות מים, מכשירים רפואיים ומוצרי בית1. חשיפה סביבתית מתמשכת העלתה חששות לגבי ההשפעות הנוירוטוקסיות האפשריות שלו, במיוחד בתנאים כרוניים במינון נמוך המשקפים חשיפה אנושית אמיתית.

למרות שסוכנויות רגולטוריות כמו מנהל המזון והתרופות האמריקאי והסוכנות להגנת הסביבה הגדירו 50 מיקרוגרם/ק"ג ליום כרמת השפעה שלילית שלא נצפתה, ראיות ניסיוניות ואפידמיולוגיות מתפתחות מצביעות על כך ששינויים התנהגותיים וקוגניטיביים עשויים להתרחש במינונים נמוכים יותר. כתוצאה מכך, הצריכה היומית הסבירה באירופה הופחתה ל-4 מיקרוגרם/ק"ג/יום, מה שמדגיש את הצורך לחקור השפעות מכניות של חשיפה סביבתית ל-BPA 1,2.

לחץ חמצוני נחשב למנגנון מרכזי העומד בבסיס נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי BPA. BPA משבש את איזון החמצון התאי על ידי הפחתת הגנות נוגדי חמצון כמו גלוטתיון (GSH) והגברת סמני החמצון השומניים, כולל מלונדיאלדהיד (MDA)3,4. עם זאת, מנגנוני הרגולציה במעלה הזרם השולטים בתגובות נוגדי חמצון תחת חשיפה ל-BPA עדיין אינם מאופיינים מספיק.

מסלול החלבון המקושר ל-ECH 1 (Keap-1)/גורם גרעיני אריתרואיד 2 (Nrf-2) הוא מנגנון הגנה עיקרי של נוגדי חמצון אנדוגניים. בתנאי לחץ חמצוני, Nrf-2 מתנתק מ-Keap-1, עובר לגרעין, ומפעיל ביטוי גן תלויי אלמנטים בתגובת נוגדי חמצון5. למרות תפקידו המוכר בהגנה תאית, המודולציה הספציפית לאזור של איתות Keap-1/Nrf-2 במוח במהלך חשיפה ל-BPA רלוונטית לסביבה לא נחקרה באופן מקיף בשילוב עם תוצאות התנהגותיות.

תימוקינון (TQ), המרכיב הביואקטיבי העיקרי בשמן זרעי ניג'לה סאטיבה, הוא בנזוקינון ליפופילי המסוגל לחצות את מחסום הדם-מוח. ל-TQ יש תכונות נוגדי חמצון, אנטי-דלקתיות ואנטי-אפופטוטיות, בין היתר באמצעות הפעלת איתות Nrf-2 והגברת קיבולת נוגדי החמצון האנדוגניים5,6. בעוד שמחקרים קודמים הראו את ההשפעות המגנות של TQ במודלים שונים של נוירוטוקסיות, גישה מתודולוגית משולבת להערכת סמני לחץ חמצוני, איתות Keap-1/Nrf-2 ופרמטרים התנהגותיים בתוך אותה פרדיגמת חשיפה ל-BPA חסרה 5,6,7.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ניסויי שניתן לשחזור עליו להערכת סמנים ביולוגיים של לחץ חמצוני, ביטוי מסלול Keap-1/Nrf-2, ושינויים התנהגותיים במודל עכברוש לחשיפה ל-BPA רלוונטית לסביבה, ולהערכת ההשפעות הנוירופרוטקטיביות של תימוקינון באזורים שונים במוח.

השענו שחשיפה ל-BPA במינון נמוך גורמת לליקויים התנהגותיים באמצעות דיסרגולציה המתווכת על ידי לחץ חמצוני של מסלול האיתות Keap-1/Nrf-2, וכי תימוקינון מפחית השפעות אלו על ידי שיקום איזון החמצון והפעלת תגובות נוגדי חמצון התלויות ב-Nrf-2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של ניסויים מוסדיים בבעלי חיים (אישור מס' 68429034/07).

בעלי חיים ועיצוב ניסויים
עשרים וארבעה זכרים בוגרים של עכברי ויסטר אלבינו (200-250 גרם) נאספו ממעבדת המחקר הניסיוני לבעלי חיים והוחזקו בנפרד בתנאים מבוקרים (12 שעות מחזור אור/חושך, 24 ± 2 מעלות צלזיוס) עם גישה חופשית לאוכל סטנדרטי ומי ברז. בעלי החיים הסתגלו לתנאי מעבדה לפני הניסוי, שנמשך 32 ימים.

חולדות חולקו באקראי לקבוצות ניסוי באמצעות שיטת אקראיות פשוטה שנוצרה ממוחשבת כדי למזער הטיית בחירה, כאשר מספר בעלי החיים הוקצה לכל קבוצה (n = 6 לקבוצה): ביקורת, BPA, BPA + 10 מ"ג/ק"ג תימוקינון (BPA + TQ I), ו-BPA + 20 מ"ג/ק"ג תימוקינון (BPA + TQ II). גודל המדגם נקבע על ידי ניתוח הספק מראש באמצעות תוכנת G*Power (גרסה 3.1). בהתבסס על גודל ההשפעה שדווח במחקרים קודמים 5,6,7 שהעריכו נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי BPA והתערבויות נוגדי חמצון, במיוחד למדדים ביוכימיים והתנהגותיים, הונחה עוצמה סטטיסטית של 0.80 עבור ANOVA חד-כיווני. בתנאים אלו, נדרש מינימום של שישה בעלי חיים בכל קבוצה כדי לזהות הבדלים מובהקים סטטיסטית בין קבוצות הניסוי.

BPA (50 מיקרוגרם/ק"ג) ו-TQ (10 או 20 מ"ג/ק"ג) ניתנו תוך-קיבה על ידי גוואג' פעם ביום במשך 30 יום. כל הטיפולים הוכנו טריים וניתנו בנפח כולל של 1 מ"ל/ק"ג. מינון ה-BPA ששימש במחקר הנוכחי (50 מיקרוגרם/ק"ג/יום) נבחר על סמך סיווגו כרמת השפעה שלילית ללא נצפית ומינון ייחוס על ידי סוכנות ההגנה הסביבתית של ארצות הברית ומנהל המזון והתרופות האמריקאי. מינון זה שימש רבות במחקרים ניסיוניים למידול חשיפה ל-BPA רלוונטית לסביבה ולבחינת שינויים נוירו-התנהגותיים וביוכימיים פוטנציאליים המתרחשים ברמות חשיפה שנחשבו בעבר לבטוחות. חשוב לציין שהצטברות ראיות ניסיוניות מצביעה על כך שעשויות להתרחש השפעות נוירולוגיות והתנהגותיות שליליות במינון זה או מתחתיו, מה שתומך ברלוונטיותו להערכת רעילות BPA במינון נמוך 1,2. בחירת מינוני ה-TQ (10 ו-20 מ"ג/ק"ג) התבססה על מחקרים ניסיוניים קודמים שהראו את יעילותו כנוירו-מגן ונוגד חדות מבלי לגרום לרעילות 5,6,7. מינונים אלו שימשו רבות במודלים של מכרסמים של נוירוטוקסיות, עקה חמצונית ודלקת עצבית, והם נמוכים בהרבה מספי רעילות מדווחים למתן חוזר. לא נערך מחקר פיילוט למציאת מינון; בחירת המינון הונחה על ידי קדימות ספרותית וקבעה פרופילי בטיחות כדי להבטיח הן יעילות והן רלוונטיות תרגומית.

BPA ניתנה במשך 30 ימים רצופים. הערכות התנהגות בוצעו בימים 31 ו-32 לאחר החשיפה הסופית. בעלי חיים הוקרבו ביום ה-32 לאחר סיום כל מבחני ההתנהגות. לוח זמנים זה תוכנן לאפשר מספיק זמן להערכת התנהגות תוך מזעור השפעות מבלבלות אפשריות של טיפול חריף או לחץ פרוצדורלי על ניתוחים ביוכימיים, מולקולריים והיסטופתולוגיים נוספים. תימוקינון ניתנה פעם ביום מיד לאחר BPA באותו מסלול תוך-קיבי. בדיקות התנהגות בוצעו לאחר מתן ה-BPA וה-TQ הסופיים. ציר הזמן הניסיוני מסוכם באיור 1.

מדידת משקל גוף
משקל הגוף נמדד באמצעות איזון מדויק דיגיטלי מכויל (רגישות ±0.1 גרם). כל עכבר נשקל בנפרד בבוקר לפני מתן הטיפול, והמדידות נרשמו בימים 1, 10, 20 ו-32 בתנאים סטנדרטיים כדי למזער שונות (איור 2).

הערכות התנהגותיות
כל פרמטרי ההתנהגות נמדדו על ידי צופה יחיד שהיה עיוור להקצאת קבוצות כדי למזער את הטיית הצופים ואת השונות בין הצופים. בעלי החיים התרגלו לחדר הניסויים לפחות 30 דקות לפני בדיקות התנהגות כדי להפחית לחץ שנגרם מחדשנות.

השימוש המשולב במבחן השדה הפתוח (OFT) ובמבחן השחייה הכפויה (FST) מאפשר הערכה מקיפה של רעילות נוירו-התנהגותית הנגרמת על ידי BPA, שכן הוכח כי ה-BPA משנה הן את התגובתיות הרגשית והן את הפעילות הניידת בקרב מכרסמים 2,3. תוצאות מוטוריות שמקורן ב-OFT נלקחו בחשבון של חוסר תנועה ב-FST כדי למזער השפעות מבלבלות אפשריות הקשורות לשינוי בפעילות מוטורית.

FST: התנהגות דמוית דיכאון הוערכה באמצעות מבחן השחייה בכפייה ביום ה-32, שקדם לו מבחן קדם של 15 דקות שנערך 24 שעות קודם לכן. העכברים הונחו בנפרד במיכלים גליליים (קוטר 35 ס"מ, גובה 50 ס"מ) מולאו במים (עומק 30 ס"מ, 25 ± 1 מעלות צלזיוס) ואפשרו לשחות במשך 5 דקות. התנהגויות של חוסר תנועה, שחייה וטיפוס תועדו באמצעות מצלמת וידאו ונותחו באופן מקוון להערכת ייאוש התנהגותי7.

OFT: התנהגות דמוית חרדה ופעילות תנועה ספונטנית הוערכו באמצעות מבחן שדה פתוח ביום ה-31. כל חולדה הונחה בנפרד בזירת פלקסיגלס לבנה (90 ס"מ על 35 ס"מ) מחולקת ל-24 ריבועים שווים, והורשה לחקור בחופשיות במשך 5 דקות. התנועות תועדו באמצעות מצלמת וידאו. הזמן שהוקדש לאזורים המרכזיים והפריפריאליים ומספר המעברים עם כל ארבע הרגליים נמדדו כמדדים להתנהגות ותנועה הקשורה לחרדה8.

איסוף דגימות
ביום ה-32, חולדות עברו הרדמה עמוקה עם קטמין תוך-שריר (45 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג). עומק ההרדמה המתאים אושר על ידי היעדר רפלקס המשיכה של הפדלים. דם נאסף באמצעות דקירה לבבית באמצעות מזרק סטרילי, וכ-3-5 מ"ל דם נלקח מכל בעל חיים. המתת חסד הושלמה על ידי הרדמה עמוקה. דגימות הדם הועברו לצינורות המכילים נוגדי קרישה וצנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 10-15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הפלזמה המופרדת נלקחה ונשמרה בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לניתוח ביוכימלי.

ההיפוקמפוס והחצי המוחי השמאלי ננתחו במהירות, נשקלו, הוקפאו בחנקן נוזלי ואוחסן בטמפרטורה של −80°C לניתוחים ביוכימיים נוספים, בעוד שההמיספרה הימנית המוחית קיבעה בפורמלין ניטרלי ב-10% לצורך הערכות היסטופתולוגיות ואימונוהיסטוכימיות. כדי להבטיח עקביות מתודולוגית ולמזער שונות בין דגימות, החצי הכדור השמאלי הוקצה באופן שיטתי למדידות ביוכימיות והחצי הכדור הימני לניתוחים מורפולוגיים בכל בעלי החיים. חשוב לציין כי קיבוע הפורמלין הוגבל אך ורק לרקמות המיועדות להליכים היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים, ולא נעשה שימוש ברקמה קבועה לבדיקות ביוכימיות מבוססות חלבונים, ובכך מנע פירוק חלבונים הקשור לקיבוע. להערכות ביוכימיות, כמויות מוגדרות של רקמת מוח קפואה (בדרך כלל 50-100 מ"ג לבדיקה) הומוגנו באמצעות בופרי הומוגניזציה ספציפיים למבחן ויחס רקמה לבופר סטנדרטיים בהתאם לדרישות כל פרמטר ביוכימי. כל הניתוחים בוצעו באמצעות כמויות רקמה שוות בכל בדיקה בין קבוצות ניסוי.

ריכוז החלבון הכולל בהומוגננטים ברקמות נקבע באמצעות מבחן חלבון פלואורומטרי בהתאם להוראות היצרן. כל הפרמטרים הביוכימיים נמדדו באמצעות ריכוזי חלבון סטנדרטיים ושווים בכל בדיקה כדי להבטיח השוואה בין דגימות וקבוצות ניסוי.

הערכת פרמטרי לחץ חמצוני
פרוקסידציה של ליפידים הוערכה על ידי מדידת רמות MDA באמצעות שיטת החומרים הריאקטיביים של חומצה תיובארבטורית (TBARS) בדגימות פלזמה ורקמה7. רמות תיול מופחת (RSH) ו-GSH נקבעו ספקטרופוטומטרית באמצעות בדיקות מבוססות 5,5′-דיתיוביס (חומצה ניטרובנזואית 2) (DTNB)7. רמות תחמוצת החנקן הכוללת (NO) בפלזמה ובהומוגנטים של רקמות נמדדו באמצעות תגובת גריס לאחר הפחתת ניטראט7. כל הפרמטרים הביוכימיים מבוטאים כ-nmol/g חלבון או μmol/g רקמה, כפי שמוצג באיור 3 ובאיור 4. כל הבדיקות הביוכימיות בוצעו בכפילות, וערכי הממוצע שימשו לניתוח סטטיסטי.

בנוסף לניתוחי רקמות מוח, בוצעו הערכות ביוכימיות בדגימות דם כדי להעריך את מצב החמצון המערכתי שנגרם מחשיפה ל-BPA. רמות הפרוקסידציה של ליפידים בפלזמה נקבעו בשיטת TBARS, והתוצאות הובעו כשקולות MDA. רמות סולפידריל (RSH) מופחתות נמדדו באמצעות DTNB, ורמות NO כוללות הוערכו באמצעות תגובת גריס לאחר הפחתת ניטראט, כפי שתוארקודם 7. ערכי הספיגה נרשמו ספקטרופוטומטרית ב-532 ננומטר (TBARS), 412 ננומטר (RSH) ו-540 ננומטר (NO). כל הבדיקות בוצעו בשכפול בתנאים סטנדרטיים.

BPA הוא רעיל סביבתי נפוץ שנכנס למחזור הדם המערכתי ומפעיל השפעות רב-איבריות; לכן, סמני לחץ חמצוני בסירקולציה מספקים מידע משלים המשקף את חוסר האיזון הכולל של החמצון 1,2. הערכת פרמטרים ביוכימיים מבוססי דם מאפשרת להעריך את הקשר בין שינויים חמצונים מרכזיים להיקפיים ומגבירה את הרלוונטיות התרגומית של הממצאים, שכן סמנים כאלה משמשים לעיתים קרובות במחקרים סביבתיים וקליניים למעקב אחר רעילות הקשורה לחשיפה.

ניתוח כתמים מערביים
בוצע ניתוח ווסטרן בלוט כדי לקבוע את רמות חלבוני Keap-1 ו-Nrf-2 ברקמת ההיפוקמפוס. כ-50 מ"ג רקמה הומוגנית ב-500 מיקרוליטר של בופר RIPA המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז. הומוגנטים צונטרו ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנטים נאספו. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות מבחן כימות חלבון פלואורומטרי לפי הוראות היצרן, והריכוזים חושבו מעקומת כיול סטנדרטית. כמויות שוות של חלבון (30 מיקרוגרם) עורבבו עם בופר Laemmli המכיל β-מרקפטואנול, חוממו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, הופרדו על ג'לים של SDS-PAGE ב-10%, והועברו לממברנות PVDF ב-110 וולט למשך 60-90 דקות. הממברנות נחסמו עם 3% BSA ודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד Keap-1 ו-Nrf-2 (1:3000) ו-β-אקטין (1:1000), ואחריהם דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP. רצועות החלבון הוצגו באמצעות כימילומינסנציה, ועוצמות הרצועות נמדדו באמצעות ניתוח צפיפות וננורמו ל-β-אקטין.

ניתוח היסטופתולוגי
דגימות רקמת המוח מההמיספרה הימנית הוקצו ב-10% פורמלין בופר נייטרלי במשך 72 שעות, יובשו באמצעות סדרות אתנול מדורגות, נוקו בקסילן, והוטמעו בפרפין לפי נהלים היסטולוגיים סטנדרטיים9. רקמות טריות נשמרו לניתוחים ביוכימיים. חתכים קורונליים (5 מיקרון) נלקחו ברמות הקורטקס של ההיפוקמפוס והאנטורין בהתבסס על אטלס מוח עכברוש10. ארבעה חתכים עוקבים לכל בעל חיים הותקנו על שקופיות זכוכית להערכות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות, והבטיחו עובי חתך עקבי ומיקום אנטומי. החתכים עברו דה-פרפין, הודרו מחדש וצבועו בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) בהתאם לפרוטוקולי צביעה שגרתיים11. בדיקה היסטופתולוגית בוצעה תחת מיקרוסקופיה אור על ידי צופה מאומן יחיד, עיוור לקבוצות הניסוי, במטרה למזער הטיה ולבטל שונות בין צופים.

ניתוח אימונוהיסטוכימי
אזורים בעלי עניין, כולל ההיפוקמפוס והקורטקס האנטורינלי, נבחרו בהתבסס על פגיעותם לנוירוטוקסיות הנגרמת על ידי BPA ותפקידם בוויסות קוגניטיבי ורגשי 1,2. צביעת אימונוהיסטוכימיה ל-Nrf-2 ו-Keap-1 בוצעה על חלקי מוח מוטמעים בפרפין. החתכים עברו דה-פרפין בקסילן, הודרו מחדש באמצעות סדרות אתנול מדורגות, ונחשפו לשאיפת אנטיגנים מונעת חום בבופר ציטראט (pH 6.0). פעילות פרוקסידאז אנדוגנית הופסקה לפני הדגירה.

החתכים נבנו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד Nrf-2 (1:100) ו-Keap-1 (1:200). הזיהוי בוצע באמצעות מערכת זיהוי HRP מבוססת פולימר זמינה מסחרית, המכילה נוגדנים משניים ספציפיים למין המקושר לפרוקסידאז של חזרת, לפי הוראות היצרן. אימונוריאקטיביות הוצגה באמצעות 3,3′-דימינובנזידין (DAB) כרומוגן, ולאחר מכן צביעת נגד בהמטוקסילין. החלקים יובשו, פונו והוסרו מכיסוי.

מקטעי ביקורת שליליים עובדו במקביל ללא דגירה ראשונית של נוגדנים. לניתוח כמותי, הוערכו שלושה מקטעים לא סמוכים לכל בעל חיים. התמונות צולמו תחת הגדרות חשיפה זהות לכל הקבוצות. שישה-עשר שדות לא חופפים בכל קטע נותחו באמצעות תוכנת ImageJ. האזורים הרלוונטיים סומנו ידנית, הצביעה על הרקע הופחתה, ואימונוריאקטיביות הובאה לידי ביטוי כערך אפור ממוצע. הערך הממוצע לכל בעל חיים חושב ושימש לניתוח סטטיסטי.

ניקוד היסטופתולוגי
שינויים היסטופתולוגיים הוערכו באופן חצי-כמותי על חתכים מוצבעים ב-H&E. נבדקו עשרה שדות שנבחרו באקראי ואינם חופפים בכל מקטע, ופרמטרים פתולוגיים דורגו באופן עצמאי. חומרת הנזק בהיפוקמפוס ובקליפת האנטורינל דורגה באמצעות סולם של ארבע נקודות המבוסס על שיעור התאים המושפעים: ציון 0 (<5%), ציון 1 (≤ שליש), ציון 2 (שליש עד שני שלישים), וציון 3 (> שני שלישים). ציונים ממוצעים לכל בעל חיים שימשו לניתוח סטטיסטי.

ניתוח סטטיסטי
הנתונים נותחו באמצעות תוכנת SPSS (גרסה 29.0) והוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). גודל המדגם נקבע בהתבסס על מחקרים קודמים וניתוח עוצמה, מה שהצביע על כך ששישה בעלי חיים בכל קבוצה מספקים >80% כוח לזיהוי הבדלים ביולוגיים רלוונטיים. נורמליות התפלגות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן שפירו-וילק. הומוגניות של שונות הוערכה באמצעות מבחן לוון. השוואות קבוצתיות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי. המובהקות הסטטיסטית נקבעה כ-p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

משקל גוף
לא נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית במשקל הגוף בין קבוצות בימים 1 ו-32 של המחקר (F(3,20)=2.750, p > 0.05; איור 2).

תוצאות מבחני התנהגות
ניתוח בדיקות שדה פתוח גילה שחשיפה ל-BPA הפחיתה משמעותית את פעילות התנועה, כפי שמעיד על ירידה במספר החציות בהשוואה לקבוצת הביקורת (p < 0.001). טיפול ב-10 מ"ג/ק"ג ו-20 מ"ג/ק"ג TQ העלה משמעותית את מספרי ההעברה ביחס לקבוצת ה-BPA (p < 0...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר הנוכחי העריך את השפעות ה-BPA, רכיב מבני בפלסטיק פוליקרבונט הנחשב בטוח על ידי ה-USEPA במינון של 50 מיקרוגרם/ק"ג 1,2, על לחץ חמצוני, איתות Keap-1/Nrf-2, התנהגות ושינויים היסטופתולוגיים במוח העכברוש. בנוסף, ההשפעות הנוירופרוטקטיביות הפוטנציאליות של TQ, תרכובת טבעית עם תכונות נוגדי חמצון מתועדות היטב, נחקרו בשני מינונים שונים (10 מ"ג/ק"ג ו-20 מ"ג/ק"ג)5,6,7

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

הפרויקט נתמך על ידי משרד תיאום פרויקטי מחקר מדעי של האוניברסיטה (מספר פרויקט TIP. A4.24.003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Thermo Scientific  69-78-3 
Benchtop centrifuge NF048Nüve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, United States7D2C10
Bisphenol AMerck239658
BSA solution  Proteintech, United States)66201-1-Ig
Butylated hydroxytolueneSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatör Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuvarcih
azlari.com/urun/daihan-hg-
15d-dijital-homojenizator-set
-a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc
HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2
2Xhp00tgwWhJ-86Vc
Hematoxylin–eosin Bio OpticaW01030708
Hydrochloric acidMerck7647-01-0
Image J software program NIH; Washington, U.S.A.https://imagej.net/ij/
Immunohistochemical staining kit Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polyvalentHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Germanyhttps://www.leicabiosystems.
com/histology-equipment/mic
rotomes/histocore-autocut/
Light microscope Nikon, Eclipse Ni-U, 940728
N-(1-Naphthyl)ethylenediamineThermo Scientific 1465-25-4
Nano Microplate ReaderBMG LABTECHSPECTROstar Nano
phosphate-buffered saline MerckP4417
Primary antibodies Keap-1 ProteintechCat No. 10503-2-AP, 1:200
Primary antibodies Nrf-2 ProteintechCat No. 16396-1-AP, 1/100
Qubit Protein BR Assay Kit ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
sodium citrateMerck03-04-6132
Sodium Dodecyl SulfateThermo Scientific 151-21-3
sodium hydroxideMerck1310-73-2
Sodium nitrateMerck7631-99-4
Streptavidin Peroxidase Thermo Scientific SHRP248-B
sulfanilamideThermo Scientific  63-74-1 
thiobarbituric acid Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
Tricarballylic acid, 99%Thermo Scientific Chemicals 139360500
Trichloroacetic acidThermo Scientific Chemicals76-03-9
Tris-HClThermo Scientific  1185-53-1 
Vanadium(III) chlorideSigma Aldrich7718-98-1
West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate and the iBright 750 Thermo Fisher Scientific systemhttps://www.clinxsci.com/product/mini
_chemiluminescence_imaging_system
?gad_source=1&gad_campaignid=
16224184202&gbraid=0AAAAAoN6
UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g
clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA
L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD
aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD
BoCgLoQAvD_BwE
Zinc sulfate solutionMerck7733-02-0

מקורות

  1. Castillo, L. Y., et al. Juvenile exposure to BPA alters the estrous cycle and differentially increases anxiety-like behavior and brain gene expression in adult male and female rats. Toxics. 10, 513 (2022).
  2. Fan, Y., et al. Preconception paternal bisphenol A exposure induces sex-specific anxiety and depression behaviors in adult rats. PLoS One. 13, e0192434 (2018).
  3. Sevastre-Berghian, A. C., et al. Neurotoxicity of bisphenol A and the impact of melatonin administration on oxidative stress, ERK/NF-?B signaling pathway, and behavior in rats. Neurotoxicol Res. 40, 1882-1894 (2022).
  4. Elswefy, S. E., et al. Inflammation, oxidative stress and apoptosis cascade implications in bisphenol A-induced liver fibrosis in male rats. Int J Exp Pathol. 97, 369-379 (2016).
  5. Dong, J., et al. Thymoquinone prevents dopaminergic neurodegeneration by attenuating oxidative stress via the Nrf2/ARE pathway. Front Pharmacol. 14, 615598 (2021).
  6. Fadishei, M., et al. Effects of Nigella sativa oil and thymoquinone against bisphenol A-induced metabolic disorder in rats. Phytother Res. 35, 2005-2024 (2021).
  7. Kuzay, D., et al. Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847 (2022).
  8. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  9. Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , (2013).
  10. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2022).
  11. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123 (2013).
  12. Helli, B., et al. The protective effects of syringic acid on bisphenol A-induced neurotoxicity possibly through AMPK/PGC-1?/FNDC5 and CREB/BDNF signaling pathways. Mol Neurobiol. 61, 7767-7784 (2024).
  13. Lotfi, M., et al. Thymoquinone improved nonylphenol-induced memory deficit and neurotoxicity through its antioxidant and neuroprotective effects. Mol Neurobiol. 59, 3600-3616 (2022).
  14. Hatipoglu, D., et al. Neuroprotective role of Nigella sativa seed oil in mitigating bisphenol A-induced neurodegeneration. Sci Rep. 15, 22477 (2025).
  15. Kobayashi, K., et al. Effects of bisphenol A on oxidative stress in the rat brain. Antioxidants (Basel). 9, 240 (2020).
  16. Elbakry, M., et al. Nattokinase attenuates bisphenol A- or gamma irradiation-mediated hepatic and neural toxicity by activation of Nrf2 and suppression of inflammatory mediators in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 29, 75086-75100 (2022).
  17. Tekin, S., et al. Molecular insights into the antioxidative and anti-inflammatory effects of p-coumaric acid against bisphenol A-induced testicular injury: In vivo and in silico studies. Reprod Toxicol. 125, 108579 (2024).
  18. Sahu, C., et al. Zinc-deficient diet increases the toxicity of bisphenol A in rat testis. J Biochem Mol Toxicol. 34, e22549 (2020).
  19. Hua, D., et al. Tetramethyl bisphenol A inhibits Leydig cell function in late puberty by inducing ferroptosis. Ecotoxicol Environ Saf. 236, 113515 (2022).
  20. Okoh, O. S., et al. Thymoquinone inhibits neuroinflammatory mediators and vasoconstriction injury via NF-?B-dependent NeuN/GFAP/Ki-67 pathways in hypertensive dams and F1 male pups exposed to bisphenol A analogues. Toxicol Appl Pharmacol. 494, 117162 (2025).
  21. Abdel-Wahab, W. M. Thymoquinone attenuates toxicity and oxidative stress induced by bisphenol A in the liver of male rats. Pak J Biol Sci. 17, 1152-1160 (2014).
  22. Abu-Elfotuh, K., et al. Protective effects of thymoquinone and/or thymol against monosodium glutamate-induced ADHD-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-catenin pathways. Biomed Pharmacother. 155, 113799 (2022).
  23. Qadri, M., et al. Thymoquinone ameliorates carfilzomib-induced renal impairment by modulating oxidative stress markers, inflammatory/apoptotic mediators, and augmenting Nrf2 in rats. Int J Mol Sci. 24, 10621 (2023).
  24. Patisaul, H. B., Bateman, H. L. Neonatal exposure to endocrine-active compounds or an ER? agonist increases adult anxiety and aggression in gonadally intact male rats. Horm Behav. 53, 580-588 (2008).
  25. Singh, S. P., et al. Evaluation of p21 expression and related autism-like behavior in bisphenol A-exposed offspring of Wistar albino rats. Birth Defects Res. 114, 536-550 (2022).
  26. Elkader, H. T. E., et al. Perinatal bisphenol A exposure has age- and dose-dependent associations with thyroid allostasis and anxiogenic-depressive-like behaviors in male rats. Physiol Behav. 288, 114732 (2025).
  27. Morin, A., et al. Adult male rats show resilience to adolescent bisphenol A effects on hormonal and behavioral responses, while co-exposure with hop extracts supports synergistic actions. Front Toxicol. 3, 639820 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AKeap 1 Nrf 2
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.