הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השפעות על איכות ה-RNA של PBMCs בזמנים שונים של שימור ושיטות עיבוד שונות אצל חולים עם סרטן ריאות מתקדם לא קטן

242 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70261

⸱

21 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biobank, Jilin Cancer Hospital, 2Medical Oncology Translational Research Lab, Jilin Cancer Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה משווה בין תגובת בידוד משולש (TRIzol) לבין התמיסה הקלאסית (FBS + DMSO) ל-PBMCs של מטופלי NSCLC שמרו בקירור. TRIzol שומר על שלמות RNA מספקת עד 6 חודשים, מה שהופך אותו למומלץ לשימור RNA איכותי.

תקציר

תאי הדם המונו-גרעיניים ההיקפיים (PBMCs) משומרים בקריופרציה (PBMCs) נמצאים בשימוש נרחב בריצוף RNA (RNA-seq), ואיכות ה-RNA שלהם משפיעה ישירות על תוצאות הבדיקה. עם זאת, הקפאה עלולה להוביל בקלות להתדרדרות RNA ב-PBMCs, והשאלה כיצד לשפר את איכות ה-RNA במהלך שימור קריופרט ארוך טווח נותרה בלתי פתורה. PBMCS מדגימות דם טריות שנאספו ממטופלים עם סרטן ריאות מתקדם לא תאים קטנים (NSCLC) שימשו כביקורת. יעילות שימור ה-RNA של דגימות PBMC הושוותה בין תמיסת הקירור הקלאסית של תאים (90% סרום בקר עוברי [FBS] + 10% דימתיל סולפוקסיד [DMSO]) לבין מגיב חילוץ RNA נפוץ (טריזול) בטמפרטורה של -80°C למשך חודשים, שלושה ושישה חודשים. ריכוז, טוהר ושלמות RNA (כפי שנמדד על ידי מספר שלמות ה-RNA [RIN]) הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח UV-Vis רב-דגימות וביואנלייזר אלקטרופורטי מיקרופלואידי אוטומטי, כדי לספק בסיס תיאורטי לשימור דגימות RNA איכותיות. מחקר זה הראה כי ריכוז, טוהר ושלמות ה-RNA ב-PBMCs ירדו עם משך שימור מוארך. למרות ששתי שיטות העיבוד לא השפיעו על ריכוז ה-RNA, הן כן השפיעו על טוהר ושלמות ה-RNA. שלמות ה-RNA של PBMCs שהוקפאו עם TRIzol במשך 6 חודשים נותרה מספקת. התוצאות שלנו מצביעות על כך שטריזול תורם לשימור קריופקול יעיל ושומר על RNA איכותי.

מבוא

RNA-seq של PBMC בחולי NSCLC ממלא תפקיד קריטי בהערכת יעילות האימונותרפיה. סרטן ריאות לא קטן (NSCLC) הוא גידול ממאיר נפוץ ברחבי העולם, וכ-70% מהמטופלים מאובחנים בשלב מתקדם עם פרוגנוזה לקויה 1,2. אימונותרפיה חוללה מהפכה בפרדיגמת הטיפול של NSCLC, וסיפקה אסטרטגיות טיפוליות חדשניות 3,4. בטיפול במעכבי נקודות ביקורת חיסונית (ICI), ריצוף RNA (RNA-seq) של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) שהתקבלו מחולי NSCLC יכולים לעקוב אחר השינויים הדינמיים של היתרונות הקליניים של אימונותרפיה5. מקורות הדגימה ל-RNA-seq כוללים רקמת גידול ו-PBMCs 6,7, כאשר PBMCs משמשים כדגימה ביולוגית חיונית הן בניסויים קליניים והן במחקר מדעי בסיסי8. שימור בקירור הוא השיטה העיקרית לאחסון דגימות לטווח ארוך, תוך שמירה על תאים ורקמות במצב שקט תוך שמירה על הפוטנציאל הביולוגי והמאפיינים שלהם. כתוצאה מכך, שימור הקפאה של PBMCs הפך לגישה ישימה ואומצה באופן נרחב. PBMC משומר בקריו-שמור מקל על ניתוח אצווה של דגימות, ממזער שונות בתוך המעבדה ובין המעבדות, וממקסם את ניצול המשאבים 8,9. לדוגמה, מחקרים הראו כי שימוש במדיום RPMI-1640 קפוא עם תוספת של 40% סרום עגל עוברי (FCS) ו-20% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לשימור PBMC מראה כי הפרופורציות של תאי T ו-B המבטאים את שילוב CD39 ו-CD73 נשארו יציבים יחסית תוך שישה חודשים מהאחסון10. מחקר אחד השווה בין שלוש ערכות שימור מסחריות לקריופרופרציה ושני חומרים מגנים קריומגינים (90% RPMI-10% DMSO, 90% פלזמה-10% DMSO), וחשף דומות בחיוניות תאים (81.0%) ושיעורי התאוששות (73.7%) בשיטות שונות. עם זאת, כל ה-PBMCs המוקפאים הציגו ירידה משמעותית בחיוניות לעומת דגימות טריות5. מחקרים נוספים הראו כי PBMC מושקע מחדש במגיב TRIzol ומקפיא אותם מיד בטמפרטורה של -80°C. לאחר יום–יומיים, הם הבחינו שערך ה-RIN של PBMCs גבוה יותר מזה של דגימות דם מלא11.

מחקר נוסף השווה בין דגימות לויקוציטים שטופלו ב-TRIzol, RNAlater ותגובות נוספות, והראה שכל השיטות השיגו ערכי שלמות RNA (RIN) >7. שלמות ה-RNA הוערכה באמצעות אנלייזר מיקרופלואידי אלקטרופורטי אוטומטי, ו-RIN חושב כמדד כמותי לאיכות ה-RNA. דגימות עם RIN ≥7 נחשבו מתאימות לניתוח RNA-seq12. ראוי לציין כי קבוצת הלויקוציטים + RNAlater הציגה תפוקת RNA נמוכה משמעותית לעומת קבוצת הלויקוציט + טריזול12. עם זאת, המחקר הנוכחי על שימור PBMC מתמקד בעיקר בחיוניות התאים ובניתוח פנוטיפ תאי החיסון לאחר הפשרה; הוקדשה תשומת לב מוגבלת להערכה שיטתית וארוכת טווח של איכות ה-RNA בתנאי שימור שונים. יתרה מזאת, פרוטוקולים סטנדרטיים לשמירת דגימות PBMC בהקפאה לשמירת שלמות ה-RNA נותרו לא מפותחים 13,14,15. פער זה רלוונטי במיוחד לאימונותרפיה של NSCLC, שבה RNA איכותי מ-PBMCs שנאספו לאורך זמן חיוני לגילוי ביומרקרים אמינים ולניטור תגובת הטיפול.

במחקר זה, אנו משערים כי בחירת שיטת השימור משפיעה משמעותית על שלמות ואיכות ה-RNA לטווח הארוך שמקורו ב-PBMCs, ופרוטוקול אופטימלי יכול לשמור על התאמת ה-RNA לבדיקות רגישות כגון RNA-seq. כדי להתמודד עם זה, השתמשו ב-PBMCs מבודדים זה עתה מדגימות דם שנאספו ממטופלים מתקדמים עם NSCLC כביקורת. יעילות שימור ה-RNA של דגימות PBMC הושוותה בין שתי שיטות טיפול (90% FBS + 10% DMSO ו-TRIzol) בטמפרטורה של -80°C למשך חודש אחד, שלושה ושישה חודשים (איור 1). ריכוז, טוהר ושלמות RNA (כפי שנמדדו על ידי ה-RIN) הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח UV-Vis רב-דגימות וביואנלייזר אלקטרופורטי מיקרופלואידי אוטומטי. מחקר זה נועד לספק בסיס תיאורטי לשימור דגימות RNA איכותיות ולקדם מחקר תרגומי ושימור דגימות ברפואה מדויקת של גידולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות רקמה אנושית ודגימות קליניות במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לסרטן ג'ילין (אישור אתי מס' 202507-002-01). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים או מהאפוטרופוסים החוקיים שלהם לפני איסוף הדגימה. דגימות דם היקפיות (10 מ"ל למטופל) נאספו מ-19 מטופלים עם סרטן ריאות מתקדם לא קטן (NSCLC) בבית החולים לסרטן ג'ילין, והניבו בסך הכל 133 דגימות RNA. כדי להבטיח את בטיחות המעבדה, כל הפעולות הכוללות כימיקלים מסוכנים בוצעו בארון בטיחות ביולוגי.

מידע מפורט על המכשירים, התגובות והצרכנים ששימשו בניסוי סופק בטבלת החומרים.

בידוד PBMC
דגימות דם היקפיות עובדו לבידוד PBMC בתוך שעתיים לאחר האיסוף. ה-PBMCs בודדו וטוהרו באמצעות צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות Ficoll-Paque בטמפרטורה של 400 × גרם למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הבלם מושבת. לאחר הצנטריפוגה, שכבת הלימפוציטים הלבנה והחלבית הבינונית (המכילה PBMCs) נשאבה בזהירות16. חשוב לציין שסטנדרטיזנו בקפדנות את ריכוז הקלט של PBMC לכל דגימה ולכל קבוצה כדי להבטיח מספרי תאים עקביים בכל תנאי הניסוי, ובכך לצמצם שונות הנגרמת על ידי קלט ועיבוד התאים. דבר זה מבטיח שההבדלים שנצפו משקפים השפעות אמיתיות של שיטות שימור שונות ולא של שונות טכנית. לכל מטופל, PBMCs מבודדים חולקו ל-7 צינורות: צינור אחד שימש להפקת RNA מיידית, והוערכו הריכוז, הטוהר והשלמות. ששת הצינורות הנותרים הוקפאו בקצב קירור של -1 מעלות צלזיוס לדקה: שלושה טופלו ב-1 מ"ל של 90% FBS + 10% DMSO, ושלושת האחרים ב-1 מ"ל טריזול, ואחריהם אחסון בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הוצאת RNA והערכת איכות בוצעה לאחר חודש אחד, שלושה ושישה חודשים של אחסון קפוא.

חילוץ RNA
הדגימות הוצאו מאחסון בטמפרטורה של -80°C והפשרו ב-4°C עד להפשרה מלאה17. דגימות שנשמרו עם 90% FBS + 10% תמיסת שימור DMSO או טריזול נשטפו פעם אחת עם PBS, צונטרו ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנט הושלך כדי לשמור על כדור התא. סך ה-RNA הוצא באמצעות טריזול. במיוחד, נוסף תגובת טריזול לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל את הדגימה המעובדת, ערבב בהיפוך, ודגרה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי להבטיח ליליזה מלאה. לאחר מכן נוספו 200 מיקרוליטר כלורופורם, התערבבו היטב בניעור, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר צנטריפוגה ב-2400 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, השלב המימי העליון נשאף בזהירות והועבר לצינור אפנדורף חדש. איזופרופנול (0.5 מ"ל) נוסף לאחר מכן, ערבב היטב ונדגר בטמפרטורת החדר למשך 5–10 דקות. לאחר צנטריפוגה ב-2400 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הסופרנטנט נזרק, וה-RNA נשאר משקע בתחתית הצינור.

המשקע הושעה מחדש ב-75% אתנול (1 מ"ל) בניעור עדין, ולאחר מכן בצנטריפוגה ב-1600 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט הושלך, והכדור של ה-RNA הותר להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 5–10 דקות. לבסוף, דגימות ה-RNA הומסו במים שטופלו ב-DEPC בנפח 50 מיקרו ודגרו באמבט מים בטמפרטורה של 55–60 מעלות צלזיוס למשך 5–10 דקותו-18 דקות. זיהוי ריכוז וטוהר ה-RNA. ריכוז וטוהר ה-RNA נמדדו באמצעות שיטת ספיגת אולטרה סגול עם ספקטרופוטומטר מיקרו-נפחי UV-Vis רב-דגימות (טווח מדידה: 2.5–3000 ng/μL). ריכוז ה-RNA נקבע בהתבסס על ערך הספיגה ב-260 ננומטר, בעוד שטוהר ה-RNA הוערך באמצעות יחס A260/A280. תוכנת המדידה הושקה; "חומצה גרעינית" נלחץ בממשק הראשי. פלטפורמת הגילוי נשטפה פעמיים במים מזוקקים כפול, ואז 1.5 מיקרוליטר מדגימת ה-RNA הוזנחה עליה. נבחר RNA-40 לסוג המדגם, נלחץ על "מדידה", ונרשמו ערכי הריכוז וטוהר A260/280. יחס A260/A280 בין 1.9 ל-2.1 הצביע על טוהר RNA גבוה, בעוד שערכים מתחת ל-1.8 הצביעו על זיהום חלבון, וערכים מעל 2.2 הצביעו על פירוק RNA פוטנציאלי או איזותיוציאנט19 שארית.

זיהוי שלמות RNA
שלמות ה-RNA (RIN) הוערכה באמצעות אנלייזר ביולוגי מיקרופלואידי אלקטרופורטי אוטומטי וערכת גילוי. ה-RIN נע בין 1 ל-10, כאשר 1 מציין RNA מפורק מאוד ו-10 מציין RNA שלם. לצורך הניתוח, 1.2 מיקרוליטר RNA הונח בצינור PCR, עבר דנטורה תרמית ב-70°C למשך 2 דקות באמצעות מחזור תרמי, והונח מיד על קרח. לאחר מכן, 1 מיקרוליטר RNA מנותק נוסף לבארות הגילוי של השבב לניתוח20. התוכנה הושקה, נבחר "Assays", ו-"RNA" נבחר מתפריט הנפתח. התוכנית "Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy" נבחרה בהתאם לחומר השימוש. "התחל" נלחץ כדי להתחיל זיהוי. לאחר כ-10 דקות, מספר השיא וגובה השיא של הסולם נבדקו לנורמליות.

שיטות סטטיסטיות
בוצעו בדיקות נורמליות לכל הנתונים. נתונים מבוזרים נורמלית הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD), בעוד שנתונים שאינם מבוזרים נורמלית הוצגו כחציון (טווח בין-רבעוני, IQR). השוואות בין שתי קבוצות נותחו באמצעות מבחן t זוגי עבור נתונים מבוזרים נורמליים ומבחן לא-פרמטרי של מדגמים קשורים לנתונים שאינם מבוזרים נורמלית. להשוואות בין שלוש קבוצות או יותר, נעשה שימוש בניתוח שונות במדדים חוזרים עבור נתונים מבוזרים נורמליים, ומבחן לא-פרמטרי בדגימות קשורות שימש לנתונים שאינם מבוזרים נורמלית. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות SPSS 19.0 ו-GraphPad Prism 9.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השפעות של זמני הקפאה שונים ושיטות עיבוד על ריכוז ה-RNA בדגימות PBMC
השפעת זמני הקפאה שונים: דגימות PBMC טריות של מטופלי NSCLC מתקדמים שימשו כקבוצת הביקורת. הדגימות טופלו ב-TRIzol או ב-90% FBS + 10% DMSO ונשמרו בטמפרטורה של -80°C למשך חודש, 3 ו-6 חודשים; ה-RNA הכולל הוצא למדידת ריכוז ה-RNA. עבור דגימות שטופלו בטריזול, ריכוזי ה-RNA בארבע הקבוצות היו כדלקמן: 523.5 (485.0) ng/μL טרי, חודש אחד 279.3 (261.7) ng/μL, 3 חודשים 217.9 (186.9) ng/μL, ו-6 חודשים 195.8 (294.8) ng/μ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גורמים רבים משפיעים על איכות ה-RNA בדגימות ביולוגיות, כולל משתנים טרום-אנליטיים, תנאי העברה, משך העיבוד בטמפרטורת הסביבה, נמק רקמות, טמפרטורה ותוצרי הקפאה, גודל ומספר ה-aliquot, וכן משך האחסון, משפיעים משמעותית על איכות ה-RNA21. עבור דגימות זהות, שינויים בזמן הקריופרד ובשיטות העיבוד יכולים להשפיע משמעותית על איכות ה-RNA. מחקרים קודמים הדגישו את החשיבות הקריטית של שלמות ה-RNA, שכן ערכי RIN נמוכים יותר מצביעים על שיעור גבוה יותר של מולקולות RNA מפורקות, מה שעלול לפג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים ומודים למשתתפים על עזרתם בניסוי ועל תמיכתם בקרן. מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז ג'ילין (מענק מס' YDZJ202501ZYTS691), ועדת הבריאות של מחוז ג'ילין (מענק מס' 2023jc064).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנלייזר ביולוגי Agilent 2100אג'ילנטG2939Bזיהוי שלמות ה-RNA, הערכת איכות ה-RNA על ידי יצירת מספר שלמות ה-RNA (RIN)
Agilent RNA 6000 ננוקיטאג'ילנט5067-1511         בשיתוף עם הביואנלייזר Agilent 2100, המספק תגובות ושבבים ייעודיים לשלמות ה-RNA
צנטריפוגה                                                         אפנדורף   5424Rלהפקת RNA
צנטריפוגה                                           אפנדורף   5810Rלהפקת PBMC
כלורופורם                                 תאגיד קבוצת התרופות הלאומי של סין20191031לצורך הפקת RNA בשיטת טריזול, משמשת להפרדת ה-RNA בשלב המימי לבין השלב האורגני המכיל זיהומים
דימתיל סולפוקסידבייג'ינג דינגגואו צ'אנגשנגDH105-2כפתרון לשימור קירור עבור PBMCs, המאפשר אחסון ארוך טווח של דגימות בטמפרטורה של -80 ו-°g; C
צינורקורנינגMCT-150-Cלאחסון דגימות, ערבוב תגובה, צנטריפוגציה ופעולות ניסיוניות נוספות
אתנולשאנדונג לירקאנג25071901AIIn הפקת RNA בשיטת טריזול, המשמשת לשטיפת משקעי RNA להסרת שאריות
סרום בקר עובריXpbiomedC04001-500כפתרון לשימור קירור עבור PBMCs, מאפשר אחסון ארוך טווח של
פתרון הפרדת פיקולBeijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTDCC0161לבידוד וטיהור של PBMC באמצעות צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות
GeneTouch(Plus) Thermal CyclerביוארTC-EA-48DAלדנאטורציה תרמית של RNA (70 & deg; C למשך 2 דקות), ואחריה זיהוי באמצעות הביואנלייזר
איזופרופנולתאגיד קבוצת התרופות הלאומי של סין20210929בהפקת RNA בשיטת טריזול, המשמשת לשקיעת RNA
ספקטרופוטומטר Nanodrop 8000ג'ין קומפניND-8000לריכוז RNA (המבוסס על ספיגה ב-260 ננומטר) וטוהר (בהתבסס על יחס A260/A280) באמצעות שיטת הספיגה האולטרה-סגול
צינורות PCRקורנינגPCR-02-Cלדנאטורציה תרמית של RNA (70 & deg; C למשך 2 דקות), ואחריה זיהוי באמצעות הביואנלייזר
מלח מפופר בפוספט מערכת פרוסלPB180327לליסס ישיר ושימור של PBMCs, או RNA כולל לאחר מכן
מגן בידוד משולש אדסיןADS60154לליסס ישיר ושימור של PBMCs, או RNA כולל לאחר מכן

מקורות

  1. Ettinger, D. S., et al. NCCN guidelines insights: Non-small cell lung cancer, version 1.2020. J Natl Compr Canc Netw. 17 (12), 1464-1472 (2019).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  3. Reck, M., et al. Five-year outcomes with pembrolizumab versus chemotherapy for metastatic non-small-cell lung cancer with PD-L1 tumor proportion score ≥ 50. J Clin Oncol. 39 (21), 2339-2349 (2021).
  4. Kim, H., et al. Clonal expansion of resident memory T cells in the peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer during immune checkpoint inhibitor treatment. J Immunother Cancer. 11 (2), (2023).
  5. Juhl, M., Christensen, J. P., Pedersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Cryopreservation of peripheral blood mononuclear cells for use in proliferation assays: First step towards potency assays. J Immunol Methods. 488, 112897(2021).
  6. Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 289(2022).
  7. Fehlings, M., et al. Late-differentiated effector neoantigen-specific CD8+ T cells are enriched in the peripheral blood of non-small cell lung carcinoma patients responding to atezolizumab treatment. J Immunother Cancer. 7 (1), 249(2019).
  8. Gautam, A., et al. Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods. PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).
  9. Tompa, A., Nilsson-Bowers, A., Faresjö, M. Subsets of CD4 (+), CD8 (+), and CD25 (hi) lymphocytes are in general not influenced by isolation and long-term cryopreservation. J Immunol. 201 (6), 1799-1809 (2018).
  10. Liang, X., et al. Recovery and functionality of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells using five different xeno-free cryoprotective solutions. Cryobiology. 86, 25-32 (2019).
  11. Turner, R. J., et al. Comparison of peripheral blood mononuclear cell isolation techniques and the impact of cryopreservation on human lymphocytes expressing CD39 and CD73. Purinergic Signal. 16 (3), 389-401 (2020).
  12. Schroeder, A., et al. The rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3(2006).
  13. Li, X., et al. The effects of cryopreservation on the PBMC transcriptome profile. Front Immunol. 16, 1690316(2025).
  14. Bovinder Ylitalo, E., Vidman, L., Harlid, S., Van Guelpen, B. mRNA extracted from frozen buffy coat samples stored long term in tubes with no RNA preservative shows promise for downstream sequencing analyses. PLoS One. 20 (3), e0318834(2025).
  15. Browne, D. J., Miller, C. M., Doolan, D. L. Technical pitfalls when collecting, cryopreserving, thawing, and stimulating human T-cells. Front Immunol. 15, 1382192(2024).
  16. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  17. Trakunram, K., Champoochana, N., Chaniad, P., Thongsuksai, P., Raungrut, P. MicroRNA isolation by trizol-based method and its stability in stored serum and cDNA derivatives. Asian Pac J Cancer Prev. 20 (6), 1641-1647 (2019).
  18. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using Trizol (Tri Reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5439(2010).
  19. Stephenson, N. L., et al. Quality assessment of RNA in long-term storage: All our families' biorepository. PLoS One. 15 (12), e0242404(2020).
  20. Zhang, X., et al. Biobanking of fresh-frozen gastric cancer tissues: Impact of long-term storage and clinicopathological variables on RNA quality. Biopreserv Biobank. 17 (1), 58-63 (2019).
  21. Craciun, L., et al. Tumor banks: A quality control scheme proposal. Front Med (Lausanne). 6, 225(2019).
  22. Liu, X., et al. Comparison of six different pretreatment methods for blood RNA extraction. Biopreserv Biobank. 13 (1), 56-60 (2015).
  23. Li, X., et al. Importance of messenger RNA stability of toxin synthetase genes for monitoring toxic cyanobacterial blooms. Harmful Algae. 88, 101642(2019).
  24. Fan, X. J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA, and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  25. Calleros-Basilio, L., et al. Quality assurance of samples and processes in the Spanish renal research network (redinren) biobank. Biopreserv Biobank. 14 (6), 499-510 (2016).
  26. Zhang, J. Y., Xu, Q. N., Liu, X. L., Li, C. T. Effects of peripheral blood different pretreatment methods and preservation time on RNA quality. Fa Yi Xue Za Zhi. 37 (6), 825-831 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PBMCsRNARNATRIzolUV Vis
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.