הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
* These authors contributed equally
מחקר זה קבע מודל ביגל חדש בגוף חי של אי ספיקת כליות כרונית בינונית, בשילוב עם פרפור פרוזדורים באמצעות אמבוליזציה של עורק כליה טרנסקטטר וקצב מהיר בעלויות העליות, והראה כי שילוב זה פגע קשות בתפקוד אנדותל העלייה השמאלית, הגביר את פעילות הפרוקאגולנט והגביר את הסיכון לטרומבוזיס דרך מסלולים דלקתיים ומתווכי RAAS.
ההופעה המשותפת של פרפור פרוזדורים (AF) ואי ספיקת כליות (RI) מייצגת תופעה קלינית מורכבת עם שכיחות גבוהה. מחקר זה חקר את השפעת RI בינוני כרוני בשילוב עם AF על תפקוד אנדותל העלייה השמאלית בביגלים. RI כרוני נגרם על ידי אמבוליזציה דרך קטטר של הענף הראשי של עורק הכליה השמאלי באמצעות גרגירי ספוג ג'לטין, כאשר בעלי חיים נשמרו במשך 3 חודשים כדי לאפשר לנזק כרוני לפראנכימיה בכליות. לאחר מכן הושרה AF על ידי קצב מהיר ורציף בעלייה (אורך מחזור בסיסי, 60 מילישניות; מתח, פי 4 סף הקצב הדיאסטולי; 180 דקות). שינויים היסטולוגיים הוערכו באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין. פרמטרים הקשורים לתפקוד האנדותל, קרישה, פיברינוליזה, דלקת ופעילות מערכת רנין–אנגיוטנסין–אלדוסטרון (RAAS) בפלזמה וברקמות לב נבדקו באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזים, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת, ווסטרן בלוטינג. התוצאות הראו הקמה מוצלחת של מודל נזק כליה כרוני עם RI בינונית, שאושר על ידי קריאטינין בפלזמה גבוהה משמעותית, חנקן אוריאה והפחתת ניקוי קריאטינין. תפקוד האנדותל העליות השמאלית נפגע משמעותית בביגלים עם שילוב RI ו-AF, בליווי השפעות פרוקואגולנטיות מוגברות וירידה בפיברינוליזה. סמנים דלקתיים היו גבוהים לאחר הליך RI או השראת AF והועלו עוד יותר בקבוצת RI+AF המשולבת. בנוסף, פעילות RAAS, כפי שהוכחה בעלייה ברמות רנין ואלדוסטרון, הייתה מוגברת לאחר RI והוגדלה עוד יותר בשילוב עם AF. לסיכום, מחקר זה הצליח לבסס מודל בעל חיים בחיים של RI בינוני כרוני בשילוב עם AF בביגלים, והראה כי שילוב זה הפריע משמעותית לתפקוד האנדותל העליות השמאלי והגביר את הסיכון לקרישה.
פרפור פרוזדורים (AF), הצורה הנפוצה ביותר של הפרעת קצב לב ממושכת, קשורה קשר הדוק לתוצאות קליניות לא רצויות. בשל המאפיינים הפתופיזיולוגיים המערכתיים של פרפור פרפורים, הפרעת קצב זו עוסקת לעיתים קרובות בשיחות פתופיזיולוגיות מורכבות עם מגוון מחלות נלוות, כולל ירידה קוגניטיבית, דיכאון ותסחיף מערכתי1. מחלת כליות כרונית (CKD) זוהתה כגורם סיכון עצמאי הן להתפתחות AF והן להתרחשות אירועים טרומבואמבוליים. כ-15% עד 20% מהמטופלים שאובחנו עם CKD מושפעים מפרפור פורפורים, בעוד ששיעור המטופלים המקבלים טיפול החלפת כליה ומפתחים פרפור פרפורים נע בין 15% ל-40%. בינתיים, כ-30% עד 60% מהמטופלים שאובחנו עם פרפור פרופורים מופיעים במקביל באי ספיקת כליות קלה עד בינונית (RI)3. לכן, ההופעה המשותפת של AF ו-RI הפכה לתופעה קלינית מורכבת עם שכיחות גבוהה בקרב אוכלוסיות המטופלים. הקשר הדו-כיווני בין פרפור פרופורים ל-RI מעלה משמעותית את הסיכון לשכיחות פרפור פרפורים ומחמיר את התקדמות הפגיעה בכליות, ובסופו של דבר תורם לתוצאות קליניות גרועותיותר 4.
במחקרים קודמים, לעיתים קרובות נעשה שימוש בעכברים ליצירת מודלים של RI; עם זאת, גודל הלב הקטן שלהם אינו מתאים לניסויים אלקטרופיזיולוגיים של הלב. כלבים, לעומת זאת, משמשים לעיתים קרובות במודלים של בעלי חיים בינוניים וגדולים של אי ספיקת כליות, כאשר נפרקטומיה משמשת כשיטת המודלים העיקרית5. עם זאת, גישה זו קשורה לשיעור הצלחה מוגבל במודלים. חשוב יותר, מכיוון שנפרקטומיה אינה גורמת ישירות לנזק פרינכימלי לכלייתי, היא נכשלת בדימוי יעיל של תהליכים פתולוגיים של חוסר ספיקת כליות. לכן, יצירת מודל בעלי חיים מתאים עם RI ו-AF היא חיונית. ראוי לציון, ליאנג ז' ואחרים הצליחו להקים מודל RI קל בביגלים על ידי אמבוליזציה של ענפים קטנים של עורק הכליה בכליה השמאלית במשך שבועיים באמצעות גרגירי ספוג ג'לטין, שהיו קשורים ל-AF6; עם זאת, תקופת תצפית של שבועיים נחשבת בדרך כלל לבלתי מספקת לסימולציה של מחלת כליות קלינית, שכן המאפיינים הבולטים של נפרופתיה כרונית, כולל גלומרולוסקלרוזיס ופיברוזיס טובולואינטרסטיציאלי, דורשים תקופות ממושכות של נזק פרנכימלי כלייתי ממושך כדי להתפתח במלואו במודלים של בעלי חיים 7,8. דבר זה מדגיש את הצורך במודל כרוני עם תקופת תצפית ארוכה יותר, שמסכם בצורה נאמנה יותר את האופי המתקדם של מחלת כליות כלית כלית קלינית.
לכן, המחקר הנוכחי נועד להקים מודל בעל חיים של RI כרוני בינוני בשילוב עם AF על ידי ביצוע אמבוליזציה טרנס-קטטרית של הגזע הראשי של עורק הכליה השמאלי בביגלים ושמירה על בעלי החיים למשך 3 חודשים כדי לאפשר פיתוח פתולוגיה כליתית כרונית מבוססת. בנוסף, חקרנו את הפתוגנזה של תפקוד לקוי של אנדותל פרוזדורים שמאל בתנאים פתולוגיים אלו, ובדקנו את ההשערה ששילוב של RI בינוני כרוני ו-AF יפגע באופן סינרגטי בתפקוד האנדותליל השמאלי באמצעות דלקת מוגברת והפעלת RAAS, ובכך להגדיל את הסיכון לטרומבוזיס מעבר לשני המצבים בלבד. ממצאים אלו עשויים להעניק הבנה מעמיקה יותר של RI כרוני בשילוב עם AF ולהוות בסיס לחקירות נוספות על יתרונות הטיפול בנוגדי קרישה בחולים עם AF ו-RI.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (פרסום מס' 85-23, מתוקן 1996). פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של בית החולים אנז'ן בבייג'ינג (אישור מס' 81700293). פרוטוקול המחקר נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המוסד שלנו. נעשו כל המאמצים למזער את סבל בעלי החיים ולהפחית את מספר בעלי החיים ששימשו במחקר. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.
1. מודל בעלי חיים ועיצוב ניסויי
2. אמבוליזציה של עורקי הכליה לצורך השראה של RI כרוני בינוני
קטטר רב-תכליתי 5F הוכנס דרך המעטפת העורקית והתקדם בהנחיית פלואורוסקופיה בזרוע C אל האאורטה הבטנית. בוצעה קנולציה סלקטיבית לעורק הכליה השמאלי, ובוצעה אנגיוגרפיה בסיסית של עורק הכליה על ידי הזרקת 5–8 מ"ל של חומר ניגוד לא יוני יודיני בקצב של 3 מ"ל/שנייה כדי להמחיש את כל עץ העורקים הכלייתי. מיקום הקטטר המוצלח אושר על ידי הדגמת כל עורק הכליה השמאלי וענפיו בתמונות האנגיוגרפיות.
לאחר מכן, RI בוצע באמצעות אמבוליזציה דרך קטטר של הענף הראשי של עורק הכליה השמאלי באמצעות גרגירי ספוג ג'לטין נספגים (קוטר 50 מ"ג). גרגירי ספוג הג'לטין הוכנו בתערובת על ידי ערבוב של כ-50 מ"ג גרנולות עם תערובת 1:1 של חומר ניגוד ומלח רגיל לנפח כולל של כ-2–3 מ"ל. תערובת האמבוליזציה הוזרק באיטיות באמצעות הזרקה ידנית דרך הקטטר במשך כ-2–3 דקות תחת ניטור פלואורוסקופי רציף. אמבוליזציה מוצלחת אושרה על ידי אנגיוגרפיה חוזרת של עורק הכליה השמאלי, שהראתה היעדר אטימות עורקי דיסטלי בענפים המעורבים באמבוליזציה. לאחר אישור אנגיוגרפי, הוסרו הקטטר והנרתיק, והעורק הירך תוקן עם תפר פוליפרופילן 6-0. הפצע הכירורגי נסגר בשכבות, והחיות הורשו להחלים תחת השגחה צמודה.
בקבוצת הביקורת ובקבוצת הפרפורפור (פרוצדורה מדומה), בוצע תהליך קטטריזציה זהה, והוזרק נפח שווה (2–3 מ"ל) של סליין רגיל לעורק הכלייתי השמאלי דרך הקטטר הרב-תכליתי לאחר אנגיוגרפיה של עורק הכליה.
3. השראת AF באמצעות קיצב עליזתי מהיר
שלושה חודשים לאחר הליך RI (או פרוצדורה מדומה), הושרה AF בקבוצת AF ובקבוצת RI+AF. AF הושרתה בסך הכל ב-12 ביגלים (n = 6 בקבוצת AF ו-n = 6 בקבוצת RI+AF). לאחר הרדמה חוזרת וגישה כלי דם כפי שתואר לעיל, הוריד הירך הימני עבר קנולציה לצורך הכנסת קטטר. קטטר אלקטרודה מרובע מסוג 6F (ראו טבלת חומרים) הוקדם בהנחיה פלואורוסקופית והוצב על הקיר הצידי של האטריום הימני. מיקום נכון של קטטר אושר על ידי הקלטת אלקטרוקרמות עלייתיות אופייניות בערוץ התוך-לבבי, שהראו סטיות ברורות וחדות של הפרוזדורים. סף הקצב הדיאסטולי נקבע על ידי הפחתה הדרגתית של מתח יציאת המגרה ב-0.1 וולט מ-5 וולט עד שנצפה אובדן לכידת העליתים; המתח הנמוך ביותר שהגיע ללכידה עקבית של 1:1 בעלייה נרשמה כסף הקצב הדיאסטולי. קצב מהיר בעלייה (אורך מחזור בסיסי, 60 מילישניות, המתאים לקצב קצב של 1000 פעימות לדקה; רוחב פולס פלט, 2 מילישניות; מתח, פי 4 מסף הקצב הדיאסטולי, בדרך כלל 2–4 וולט) סופק ברציפות במשך 180 דקות באמצעות מגרה לבבי ליצירת AF, כפי שתוארקודם 9. השראה מוצלחת ל-AF אושרה על ידי הופעת מרווחי R-R לא סדירים ממושכים על פני השטח של ה-ECG ופוטנציאלים מהירים ולא מסודרים של אלקטרוגרם תוך-לבבי שנמשכו לפחות דקה אחת לאחר הפסקה קצרה של הקיצוב. כל 12 הביגלים (100%) השיגו AF מתמשך עם סיום פרוטוקול הקצב. משך הזמן הממוצע של הפרפור המתמשך לאחר הפסקת הקצב נע בין 3–8 דקות לפני קרדיוברסיה ספונטנית לקצב סינוסים.
חשוב לציין כי, בניגוד לפרוטוקולי קצב פרץ (בדרך כלל התפרצויות של 3–10 שניות) המשמשים להערכת רגישות ל-AF, הגישה הרציפה של 180 דקות לקיצוב מהיר בפרוזדורים במחקר זה נועדה במיוחד למודל AF מתמשך ולעורר עיצוב מולקולרי מוקדם. פרוטוקול זה מבוסס היטב ואושר באופן נרחב במחקרי AF כלבים 9,10.
4. עיצוב ניסוי והקצאת קבוצות
בעלי החיים הניסיוניים חולקו באקראי לארבע קבוצות (n = 6 לכל קבוצה): קבוצת הביקורת, קבוצת RI, קבוצת AF, וקבוצת RI בשילוב עם קבוצת AF (RI+AF). ביגלים בקבוצת RI ובקבוצת RI+AF עברו את הליך האמבוליזציה של RI בתחילת הדרך, ובביגלים בקבוצת הביקורת ובקבוצת ה-AF קיבלו הזרקה מדומה של סליין תקין לעורק הכליה. שלושה חודשים לאחר מכן, הושרה AF בקבוצות AF ו-RI+AF כפי שתואר לעיל. סקירה סכמטית של כל עיצוב הניסוי וציר הזמן מוצגת באיור 1.
5. קביעת פינוי קריאטינין
ניקוי קריאטינין (CCr) נקבע באמצעות שיטת ניקוי קריאטינין אנדוגנית של 30 דקות11. בקצרה, לאחר הרדמה, הוכנס קטטר פולי לשלפוחית השתן בתנאים אספטיים, ושלפוחית השתן התרוקנה לחלוטין. לאחר מכן החלה תקופת איסוף השתן בת 30 דקות, שבמהלכה כל השתן נאסף דרך הקטטר לכלי איסוף מכויל. בסיום תקופת האיסוף בת 30 הדקות, שלפוחית השתן שוב התרוקנה כדי להבטיח החלמה מלאה מהשתן. במקביל, נלקחה דגימת דם אמצעית מהווריד היוגולרי לקביעת קריאטינין בפלזמה. CCr חושב באמצעות הנוסחה הסטנדרטית: CCr (mL/min/kg) = (ריכוז הקריאטינין בשתן × נפח השתן) / (ריכוז קריאטינין בפלזמה × זמן איסוף), מנורמל למשקל הגוף.
6. איסוף רקמות ודגימת דם
דגימות דם נאספו מהווריד היורדי בתחילת הדרך ולפני ההקרבה לצינורות מפריד סרום EDTA ונוגדי קרישה פשוטים11. בסופו של דבר, כל הביגלים הושתו בהזרקה תוך ורידית של מינון קטלני של נתרן פנטוברביטל במינון של 150 מ"ג/ק"ג לפני ההחלמה מההרדמה. כליות נלקחו לבדיקה היסטולוגית. הלבבות נקטפו, ותוספת העלייה השמאלית (LAA) ננתכה בקפידה, הוקפאה בחנקן נוזלי תוך 5 דקות מהכריתה ונשמרה בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לניתוח מולקולרי. ה-LAA נבחר לניתוח רקמות משום שהוא האתר הנפוץ ביותר להיווצרות קרישי דם אצל חולי AF ולכן מייצג את המיקום האנטומי הרלוונטי ביותר מבחינה קלינית להערכת תפקוד האנדותל וסיכון לקרישה.
7. תצפית היסטולוגית
רקמות הכליה הוקצו בפארפורמלדהיד ניטרלי 10% במשך 24 שעות, יובשו באמצעות סדרת אתנול מדורגת (70%, 80%, 90%, 95% ו-100% אתנול, שעה אחת כל אחת), נוקו עם קסילן (שני שינויים, 30 דקות כל אחד), הוטבעו בפרפין, וחתכו לפרוסות בעובי 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום סיבובי. לאחר מכן, הפרוסות הוכתמו ב-HE כדי לצפות בשינויים היסטופתולוגיים. במיוחד, החלקים עברו דה-פרפין בקסילן (שני שינויים, 10 דקות כל אחד), הודרו מחדש באמצעות סדרת אתנול יורדת, צובעו בתמיסת המטוקסילין במשך 5 דקות, הופרדו בחומצה הידרוכלורית–אתנול של 1% למשך 30 שניות, שטפו במי ברז זורמים במשך 10 דקות, צבועו נגד בתמיסת אאוזין למשך 2 דקות, יובשו, נוקו והותקנו בבלסם ניטרלי. החתכים נבדקו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלות של 100× ו-400×.
8. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזים (ELISA)
דגימות הדם צנטריפוגה ב-3000 × גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות, ולאחר מכן נאספה הסופרנטנטה (פלזמה) ונשמרה בטמפרטורה של −80°C עד לניתוח. רמות הפלזמה של קריאטינין, חנקן אוריאה, פקטור פון וילברנד (vWF), תרומבומודולין (TM), דימתילרגינין אסימטרי (ADMA), תחמוצת חנקן (NO), מעכב מפעיל פלסמינוגן-1 (PAI-1), מפעיל פלזמינוגן רקמתי (t-PA), פקטור נמק גידול-α (TNF-α), חלבון C-ריאקטיבי ברגישות גבוהה (hs-CRP), אינטרלוקין-6 (IL-6), רנין ואלדוסטרון (ALD) נבדקו באמצעות ערכות ELISA מסחריות לפי הוראות היצרנים. בקצרה, נוספו 100 מיקרוליטר של דגימת פלזמה או סטנדרט למיקרופלטות מצופות נוגדנים עם 96 בארות, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, נשטפו ארבע פעמים עם בופר שטיפה, דגרו בנוגדן זיהוי ביוטינילטיבי במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נשטפו שוב, דגרו עם קונצ'וגט סטרפטווידין-HRP למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן התפתחות מצע TMB למשך 15–20 דקות בחושך. התגובה הופסקה עם 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה, והספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. כל הדגימות נבדקו בכפילות.
9. PCR בזמן אמת כמותי (qRT-PCR)
חילוץ ה-RNA הכולל מרקמות ה-LAA בוצע באמצעות תגובת טריזול, ולאחר מכן בוצע זיהוי טוהר וריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ביחס ספיגה של 260/280 ננומטר (טווח מקובל 1.8–2.0). סך הכל של 1 מיקרוגרם RNA הועתק הפוך ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכת תגובת PrimeScript RT. תגובת השעתוק ההפוכה בוצעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחריה השבתה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות. לאחר מכן בוצע PCR כמותי בזמן אמת על מערכת ה-PCR באמצעות SYBR Green Master Mix. תוכנית המחזור התרמי כללה דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריה 40 מחזורי דנאטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ואנילינג/הארכה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. אות הפלואורסצנציה זוהה בסוף כל שלב הארכה באמצעות ערוץ SYBR Green. ערכי מחזור הסף (Ct) נקבעו אוטומטית על ידי תוכנת המכשיר. השינויים בקפלים ברמות ה-mRNA נקבעו באמצעות שיטת 2−ΔΔCt . β-אקטין שימש כבקרה פנימית. כל הדגימות נערכו בשלושה עותקים.
10. כתמים מערביים
חלבון כולל הופק מרקמות LAA באמצעות בופר ליזיס של RIPA (מבחן רדיואימונופרציפיטציה (RIPA) (מורכב מ-50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS, בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז; ראו טבלת חומרים). הרקמות הומוגנו על קרח וצנטריפוגות ב-12,000 × גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות, והסופרנטנט נאסף. ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. לאחר מכן, כמויות שוות של חלבון (30 מיקרוגרם לכל נתיב) הועברו ל-12% SDS-PAGE להפרדה ב-80 וולט למשך 30 דקות (ג'ל ערימה), ולאחר מכן 120 וולט לכ-60 דקות (ג'ל מפרוס) ולאחר מכן הועברו לממברנות פוליווינילידין פלואוריד (PVDF) ב-300 מילי-אמפר למשך 90 דקות בבופר העברה (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 20% מתנול). הממברנות נחסמו עם חלב דל שומן 5% מומס ב-TBST (מלח טריס-בופר עם 0.1% Tween-20) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן נבדקו עם נוגדנים ראשוניים (ראו טבלת חומרים למקורות נוגדנים, מספרי קטלוג ודילול) בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. ביום הבא, הממברנות נשטפו שלוש פעמים עם TBST (10 דקות כל אחת) ודגרו עם הנוגדן המשני המתאים ל-HRP (ראו טבלת חומרים) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות נוספות של TBST (10 דקות כל אחת), הוצגו כתמים באמצעות ערכת כימילומינסנציה משופרת (ECL) באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה. גליצראלדהיד-3-פוספט דה-הידרוגנאז (GAPDH) שימש כבקרה פנימית. ניתוח דנסיטומטרי בוצע באמצעות תוכנת ImageJ, ורמות הביטוי היחסיות של חלבונים הותאמו ל-GAPDH. המשקלים המולקולריים המשוערים של החלבונים שזוהו היו כדלקמן: vWF (~260 kDa), TM (~60 kDa), סינתאז תחמוצת חנקתית אנדותליאלית (eNOS, ~130 kDa), סינתאז תחמוצת חנקן מושרה (iNOS, ~130 kDa), PAI-1 (~45 kDa), t-PA (~70 kDa), ו-GAPDH (~36 kDa). תמונות באורך מלא, לא חתוכות של כתם מערבי, מסופקות באיור משלים 1 ובאיור משלים 2.
11. ניתוח סטטיסטי
כל הערכים נותחו באמצעות תוכנה סטטיסטית וגרפית ומוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). נורמליות התפלגות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן שפירו-וילק לפני ניתוח פרמטרי. הומוגניות השונות הוערכה באמצעות מבחן לוין. עבור נתונים שעומדים בהנחות של נורמליות והומוגניות של שונות, בוצעה השוואת הבדלים באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של דאנט להשוואות מרובות מול קבוצת הביקורת. עבור נתונים שאינם עומדים בהנחת הנורמליות, הוחל מבחן קרוסקאל-ווליס הלא-פרמטרי ואחריו מבחן הפוסט-הוק של דאן. במחקר זה, כל המשתנים עמדו בהנחות הנורמליות והשונות השוותה; לכן, ניתוחים פרמטריים יושמו לאורך כל הדרך. בתוכנת הניתוח, הנתונים הוזנו לטבלאות נתונים מקובצות, ANOVA חד-כיווני נבחר מתפריט ניתוחי עמודות, מבחן דאנט נבחר להשוואות לאחר מכן, וסף המובהקות נקבע על p < 0.05.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מודל בעלי חיים של RI ו-AF כרוניים בינונים
סקירה סכמטית של עיצוב הניסוי וציר הזמן מוצגת באיור 1. התמונות המייצגות של אנגיוגרפיית עורק הכליה השמאלי לפני ואחרי אמבוליזציה דרך הקטטר, המוצגות באיור 2A,B, הראו כי ענפי העורק הכלייתי הקטנים נסתמו בהצלחה לאחר אמבוליזציה דרך הקטטר, כפי שניתן לראות בהיעדר אטימות עורק דיסטלי באנגיוגרפיה חוזרת. שלושה חודשים לאחר ההליך של רוד איילנ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחקר הנוכחי קבע מודל בעל חיים בחיים של RI בינוני בשילוב עם AF וחקר את הפתוגנזה של תפקוד לקוי של אנדותל העליות השמאליות בתנאים פתולוגיים אלו. הממצאים המרכזיים של מחקר זה הם כדלקמן: ראשית, אמבוליזציה של עורק הכליה הראשי השמאלי במשך 3 חודשים בביגלים הובילה בהצלחה ל-RI בינוני. שנית, דגם AF הוקם למעשה בביגלים. שלישית, תפקוד האנדותל העליות השמאלית נפגע משמעותית בבעלי חיים עם RI ו-AF, בליווי השפעות פרוקואגולנטיות מוגברות וירידה בפיברינוליזה, מה שעלול להוביל לסיכון מוגבר לטרומבוזיס. רב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המדע והטכנולוגיה הלאומי למחלות כרוניות לא מדבקות (מס' 2024ZD052500, מס' 2024ZD0521504), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 81700293 ומס' 81970272) ומימון מחקר ברמה גבוהה של בית החולים בייג'ינג אנז'ן (פרויקט מימון מס' 2025AZB5005).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תפר פוליפרופילן 6-0 | Ethicon (Johnson & Johnson) | 8706H | לתיקון עורק הירך |
| קטטר רב-תכליתי 5F | Cordis (Cardinal Health) | 521-550S | לחסימת עורק הכליה ובידוד |
| קטטר אלקטרודה רב-קוטבי 6F | St. Jude Medical | 401443 | להחשמלת הפרוזדור הימני |
| נדן מכניס וסקולרי 6F | Terumo | RS*A60K10SQ | לגישה לעורק הירך |
| מערכת ABI 7500 Real-Time PCR | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 4351105 | למחזור תרמי ל-qRT-PCR וגילוי פלואורסצנטי |
| גרגירים ספוגיים מסוגלים לספיגה (קוטר 50 מג) | Jinling Pharmaceutical | — | לחסימת עורק הכליה טרנס-קטטרית; מוכן כמו תערובת רפה עם מדיום ניגוד ומי מלח (1:1) |
| ערכת ADMA ELISA (כלב) | Cusabio | CSB-E09297c | למדידת ארגינין דמתילאס מטרי לא סימטרי בפלזמה |
| ערכת אלדוסטרון ELISA (כלב) | Cusabio | CSB-E08014c | למדידת אלדוסטרון בפלזמה |
| ערכת BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | לכימות ריכוז חלבון |
| ביגלים (זכר, 4–5 שנים, 10–12 ק"ג) | Shanghai Jiao Tong University Agricultural Experimental Animal Farm Co., Ltd. | — | ביגלים בריאים; מוחזקים בנפרד בתנאים סטנדרטיים |
| מערכת פלואורוסקופיה עם זרוע C | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | לניטור פלואורוסקופי במהלך צנתור ואנגיוגרפיה |
| מערכת הדמיית כימולומינסנציה | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | להדמיית רצועות ב-Western blot |
| ערכת קריאטינין ELISA (כלב) | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C011-2-1 | למדידת קריאטינין בפלזמה |
| צינור אנדוטרכיאלי עם קפיץ (ID 7.0–8.0 מ"מ) | Covidien (Medtronic) | 86449 | להחדרה אנדוטרכיאלית ואוורור מכני |
| מגרה לבבי DF-5A | Suzhou Dongfang Electronic Technology Research Institute | DF-5A | להחשמלה מהירה של הפרוזדור; הגדרות: BCL 60 מ"ס, רוחב פולס 2 מ"ס, מתח 4× סף |
| חומר תגובה ECL Western Blotting | Thermo Fisher Scientific | 32106 | חומר תגובה משופר לכימולומינסנציה להדמיית blot |
| צינורות EDTA נוגדי קרישה | BD Vacutainer | 367835 | לאיסוף דם (הפרדת פלזמה) |
| נוגדן ראשוני eNOS (ארנב) | Cell Signaling Technology | 32027 | דילול 1:1000; ל-Western blot (~130 ק"ד) |
| תמיסת יאושן Y (מימית) | Solarbio | G1100 | להדמיית נגד H&E (2 דקות) |
| צינור שתן Foley (8 Fr) | C.R. Bard | 0165SI08 | לאוסף שתן מתוזמן בזמן קביעת CCr |
| נוגדן ראשוני GAPDH (ארנב) | Cell Signaling Technology | 5174 | דילול 1:1000; בקרה פנימית ל-Western blot (~36 ק"ד) |
| GraphPad Prism (גרסה 8.0) | GraphPad Software | — | https://www.graphpad.com; לניתוח סטטיסטי (ANOVA בכיוון אחד, מבחן Dunnett's) |
| תמיסת המטוקסילין (האריס) | Solarbio | G1140 | להדמיית גרעין H&E (5 דקות) |
| זריקת נתרן הפרין (לא מופרד) | Changzhou Qianhong Biopharma | H32022088 | 4000 IU מדוללים ב-10 מ"ל מי מלח רגיל; למניעת קרישה במהלך צנתור |
| נוגדן משני HRP-conjugated עם עז לאנטי-עכבר IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | דילול 1:5000; ל-Western blot |
| נוגדן משני HRP-conjugated עם עז לאנטי-ארנב IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | דילול 1:5000; ל-Western blot |
| ערכת hs-CRP ELISA (כלב) | Cusabio | CSB-E08557c | למדידת חלבון C-reactive רגיש מאוד בפלזמה |
| ערכת IL-6 ELISA (כלב) | R&D Systems | CA6000 | למדידת אינטרלוקין-6 בפלזמה |
| תוכנת ImageJ (גרסה 1.53) | National Institutes of Health | — | https://imagej.nih.gov/ij/; לניתוח צפיפות בלוט בווסטרן |
| נוגדן ראשוני iNOS (ארנב) | Abcam | ab178945 | דילול 1:1000; ל-Western blot (~130 ק"ד) |
| תמיסת רינגר לקטטית | Baxter | 2B2324 | נוזל תוך ורידי; מוזרק בקצב של 5–10 מ"ל/ק"ג/שעה במהלך הליכים |
| מיקרוסקופ אור | Olympus | BX53 | לבדיקה היסטולוגית של חתכי כליה צבועים ב-HE |