מחקר זה גילה רמות מוגברות של HMGA1 וירידה ברמות ביטוי HAND1 בסרטן הגרון, מה שמעיד על קשר הפוך וקשרים משמעותיים בין גרורות לשלב קליני, מה שמרמז ששניהם תורמים להתקדמות הגידול.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מחקר זה גילה רמות מוגברות של HMGA1 וירידה ברמות ביטוי HAND1 בסרטן הגרון, מה שמעיד על קשר הפוך וקשרים משמעותיים בין גרורות לשלב קליני, מה שמרמז ששניהם תורמים להתקדמות הגידול.
מחקר זה חקר את פרופילי הביטוי של גני HMGA1 ו-HAND1 בקרצינומה של תאי קשקש של הגרון (LSCC) וכן ברקמות ריריות גרון תקינות סמוכות, באמצעות יישום שיטות אימונוהיסטוכימיה ו-RT-PCR. המטרה הייתה לחקור את תפקידם האפשרי בהתחלה, קידום, פלישה וגרורות של LSCC. גם HMGA1 וגם HAND1 זוהו ברקמות סרטניות וברקמות תקינות סמוכות. עם זאת, HMGA1 הראה ביטוי גבוה משמעותית ברקמות LSCC, בעוד ש-HAND1 הראה רמות ביטוי נמוכות משמעותית. ביטוי גבוה של HMGA1 היה קשור באופן חיובי לגרורות בבלוטות הלימפה (100.0% לעומת 50.0%) ולשלב קליני מתקדם (91.7% לעומת 44.4%), אך לא היה קשור לדרגת היסטולוגיה של הגידול, סוג קליני או גיל המטופל. לעומת זאת, ביטוי חלבון HAND1 מופחת היה קשור לגרורות בלוטות לימפה, שלב קליני ודרגה פתולוגית, מה שמרמז על תפקיד בהתקדמות הגידול ובגרורות. יתרה מזאת, נצפתה מתאם שלילי ליניארי בין הביטויים של HMGA1 ל-HAND1, מה שמרמז על אינטראקציה רגולטורית פוטנציאלית שבה HMGA1 עשוי לדכא את ביטוי HAND1. תוצאות אלו מרמזות של-HMGA1 ול-HAND1 יש תפקידים משלימים בפתוגנזה של LSCC, כאשר HMGA1 עשוי להקל על התפתחות הגידול ו-HAND1 משמש כמדכא. האינטראקציה בין שני הגנים הללו עשויה להציע פרספקטיבות חדשות על המנגנונים המולקולריים שמניעים את התקדמות ה-LSCC ואת הגרורות.
סרטן הגרון הוא הגידול הראשוני הממאיר השני בשכיחותו בראש ובצוואר, אחרי סרטן האף הלחי, ואחראי ל-26%–30% מכלל הגידולים בראש ובצווארברחבי העולם. יותר מ-90% מסוגי סרטן הגרון מסווגים כקרצינומה של תאי קשקש של הגרון (LSCC)2. הטיפולים העיקריים לסרטן הגרון הם ניתוחים וקרינות. הישנות מקומית וגרורות בבלוטות הלימפה הן הגורמים המובילים למוות אצל חולי סרטן הגרון. לכן, ניהול יעיל של הישנות וגרורות נותר אתגר קליני משמעותי. עם התקדמות הביולוגיה המולקולרית, זוהו גנים שונים עם ביטוי חריג בסרטן הגרון. עם זאת, המנגנונים שמאחורי פלישת הגידול והגרורות בסרטן הגרון נותרו לא ברורים ודורשים מחקר נוסף.
חלבוני קבוצת A (HMGA) בעלי ניידות גבוהה הם חלבונים שאינם קושרים לכרומטין היסטונים הממוקמים בגרעין התא. HMGA1 נקשר ל-DNA ולחלבונים נלווים, וגורם לשינויים מבניים בכרומטין המווסתים את שעתוק הגנים3. כרגולטור שעתוק הקשור לכרומטין, HMGA1 מווסת את הביטוי של גנים רבים הקשורים לגידולים המעורבים בהתרבות ובגרורות. מחקרים קודמים הראו כי HMGA1 מתבטא יתר במגוון רחב של סוגי סרטן אנושיים, כולל בלוטת התריס, המעי הגס, הלבלב וממאירות בראש ובצוואר 4,5,6,7, וכן בגידולים אפיתליים ומוצקים נוספים המדווחים בספרות. HMGA1 מווסת את הגידול על ידי ויסות ביטוי של גנים מטרה רבים במורד הזרם המעורבים בהתרבות ובגרורות8.
גני נגזרות הלב והסמל העצבי המובעות (HAND) הן חברות במשפחת bHLH (סליל בסיסי–לופ–סליל), כולל HAND1 ו-HAND2. HAND1, כגורם שעתוק, משחק תפקיד בהתמיינות טרופובלסטים ובהתפתחות הלב9. עם זאת, מנגנון הביטוי של HAND1 בשכבת התא החוץ-עוברית נותר לא ברור. אושר כי HMGA1 נקשר ישירות למקדם HAND1, ומעכב את פעילות HAND1 הן בחיים והן במבחנה10. HAND1, כחלבון מדכא, מעורב בוויסות התמיינות תאים והיווצרות סרטן. מחקרים מצאו כי הביטוי של HAND1 מושתק ומועבר להיפרמתילציה בסרטן הקיבה האנושי11, סרטן הלבלב12, סרטן השחלות13, וסרטן בלוטת התריס14. עם זאת, למיטב ידיעתנו, מחקרים מוגבלים חקרו ביטוי HAND1 ברקמות סרטן הגרון.
במחקר הנוכחי נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה (שיטת זיהוי דו-שלבית) ותגובת שרשרת פולימראז הפוכה (RT-PCR) לזיהוי ביטוי של חלבוני HMGA1 ו-HAND1 ו-mRNA ב-LSCC וברקמות ריריות תקינות סמוכות. אימונוהיסטוכימיה מאפשרת הדמיה של מיקום חלבונים בתוך ארכיטקטורת הרקמה, בעוד RT-PCR מאפשרת זיהוי רגיש של ביטוי גנים ברמת השעתוק, ומספקת תובנות משלימות לדפוסי ביטוי חלבונים ו-mRNA. בהשוואה ל-PCR כמותי (qPCR), שמציע רגישות גבוהה וכימות מדויק, ווסטרן בלוטינג, שמאפשר אימות ברמת חלבון אך חסר הקשר מרחבי, וריצוף RNA (RNA-seq), שמספק פרופיל טרנסקריפטומי מקיף אך דורש ניתוח חישובי מתקדם, השימוש המשולב באימונוהיסטוכימיה ו-RT-PCR מייצג אסטרטגיה חסכונית וקלינית לבדיקת סמנים ביולוגיים. המחקר נועד לבחון את התפקיד והקורלציה של שני גורמים אלו בהופעה, התפתחות, התקדמות וגרורות של LSCC. יתרה מזאת, הערכת ביטוי HMGA1 ו-HAND1 עשויה לספק סמנים ביולוגיים לאבחון והערכה פרוגנוסטית בסרטן הגרון, מה שעשוי לשפר את הסטריפיקציה של הסיכון ולסייע בקבלת החלטות קליניות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המחקרית של בית החולים העממי שיג'יאג'ואנג (אישור מס' YKLS 2026 מס' 041; 27 במרץ 2026). המחקר נערך בהתאם לתקנות לסקירה אתית של מחקר ביומדיצי הכולל נבדקים אנושיים, תקנות לסקירה אתית של מדעי החיים ומחקר רפואי הכולל נבדקים אנושיים, הצהרת הלסינקי, וההנחיות האתיות הבינלאומיות למחקר בריאותי הכולל בני אדם. דגימות רקמה אנושית נאספו מדגימות כירורגיות מאוחסנות בהתאם לדרישות אתיות מוסדיות, תוך הבטחת אנונימיזציה וסודיות של נתוני המטופלים. הושגה הסכמה בכתב מדעת מהמשתתפים, או ויתור על הסכמה ניתן על ידי ועדת האתיקה לשימוש בדגימות אנונימיות בארכיון, לפי הצורך.
חומרים ניסיוניים
מקור הדגימות
בסך הכל התקבלו 42 מקרים של רקמות LSCC ו-25 מקרים של רקמות רירית גרון תקינות סמוכות מדגימות כריתה כירורגית של LSCC במחלקת אוזן-גרון-ראש וצוואר בחביי בין פברואר 2011 לאוגוסט 2012. מתוכם, 25 מקרים של רירית סמוכה תקינה (נלקחה מאתר > 1.0 ס"מ מקצה הסרטן) אושרו פתולוגית כרירית דלקתית או תקינה. 42 דגימות LSCC אושרו כולן פתולוגית כקרצינומה של תאי קשקש. כל הרקמות נשמרו בטמפרטורה של -80°C. 42 המטופלים היו גברים, ללא מטופלות נשים. מבין המקרים של LSCC, 15 היו מופרזים היטב, 18 היו מובחנים בינונית, ו-9 היו מופרדים בצורה לקויה. ב-18 מקרים היו גרורות בבלוטות הלימפה, בעוד ש-24 מקרים לא. השלב הקליני התבסס על מערכת הסיווג והסטאזינג של TNM (UICC, 2002), עם 20 מקרים בשלבים I ו-II, ו-22 מקרים בשלבים III ו-IV. היו 30 מקרים של סוג סופרגלוטי, 11 מקרים של סוג גלוטי, ומקרה אחד של סוג תת-גלוטי. טווח הגילאים של המטופלים היה 40–75 שנים, עם גיל חציוני של 60 שנים. אף אחד מהמטופלים לא קיבל רדיותרפיה או כימותרפיה לפני הניתוח, והנתונים הקליניים היו שלמים.
שיטות ניסיוניות ושלבים
הליך צביעת HE
הכנת שקופית וצביעת המטוקסילין–אאוסין
שקופיות זכוכית לאימונוהיסטוכימיה הושרו תחילה בחומצה מרוכזת למשך 24 שעות, לאחר מכן שטפו היטב במי ברז זורמים לפחות 10 דקות להסרת חומצה שנותרה, וטבילה במים מזוקקים במשך 30 דקות פעמיים עם ערבוב עדין להבטחת שטיפה מלאה. לאחר השרייה של 95% אתנול במשך שעתיים, הסליידס יובשו בתנור של 60 מעלות צלזיוס, ואז טבלו בתערובת APES: אצטון (1:49, v/v) למשך דקה עם ניעור עדין להבטחת ציפוי אחיד, ולאחר מכן שטיפה באצטון טהור. לבסוף, הם יובשו באוויר בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) כדי להבטיח היצמדות תקינה של הרקמה במהלך הליכי הצביעה הבאים.
מקטעי הרקמה המוטמעים בפרפינים הוטבעו ברצף בקסילן I וקסילן II במשך 10 דקות כל אחד להסרת פרפין, ולאחר מכן הוחזרו למים באמצעות אתנול מדורג (100%, 95%, 80%) למשך 5–10 דקות כל אחד, ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים למשך 2 דקות. לאחר מכן החלקים עברו צביעת המטוקסילין–אאוזין (HE) כך: צביעת המטוקסילין למשך 4 דקות, שטיפה במי ברז זורמים למשך 3 דקות עם זרימה רציפה להסרת כתמים עודפים, התמיינות באמצעות חומצה כלורית 1% באתנול למשך 30 שניות, שטיפה שלוש פעמים במי ברז לסיום ההתמיינות, וצביעת אאוזין למשך 10 שניות. התייבשות מדורגת שגרתית בוצעה ברצף על ידי שימוש רציף ב-70% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול, אתנול אנהידרוס I, ואתנול אנהידרוס II למשך 5 דקות כל אחד. לאחר הייבוש, המחסנית הותקנה באמצעות בלסם נייטרלי.
הליך אימונוהיסטוכימיה
קטעי פרפין בעובי 4 מיקרון נחתכו, הונחו שטוחים על מחסניות מצופות APES, והונחו בתנור בטמפרטורה של 67°C ללילה, ולאחר מכן בוצעו דה-פרפיניזציה עם Xylene I ו-II למשך 10 דקות כל אחד. התייבשות הדרגתית בוצעה תוך שימוש ב-100%, 90% ו-70% אלכוהול למשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן שטיפה במי ברז ומים מזוקקים למשך 3 דקות. כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית, דגרו שקופיות בתמיסת מי חמצן של 3% מתנול-מימן שהוכנה טרי, מה שהבטיח כיסוי מלא של חתך הרקמה בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם מים מזוקקים במשך 5 דקות ב-0.01 מטר PBS.
שליפת אנטיגנים בוצעה על ידי הטבלת שקופיות בבופר ציטראט (pH 6.0) וחימום בסיר לחץ בטמפרטורה ~95–100°C למשך 8 דקות עבור HMGA1 ו-10 דקות ל-HAND1 עם מכסים סגורים היטב לשמירה על תנאי לחץ עקביים. החלקים צונחו בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) ונשטפו שלוש פעמים ב-0.01 מטר PBS למשך 3 דקות כל אחד תחת ערבוב עדין. נוגדנים ראשוניים נגד HMGA1 ו-HAND1 דוללו בדילול נוגדנים (1:150 ו-1:100, בהתאמה) וערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג לפני שהוחלו באופן אחיד לכיסוי מלא של כל חלק רקמה. המגלשות דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C בתא לח. לאחר דגירה במהלך הלילה, הוסרו המחסניות מהתא הלח והותירו לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. המחסניות נשטפו שלוש פעמים עם 0.01 מיליון PBS (5 דקות לכל שטיפה) תחת ערבוב עדין להסרת נוגדנים לא קשורים. נוזל עודף הוסר, ונוספו נוגדנים משניים (אנטי-ארנב/עכבר פולימרי המסומן על ידי HRP) כדי לכסות במלואם את משטחי חתכי הרקמה. הדגירה נוספת בוצעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות.
תמיסת תת-ה-DAB הונחה בטיפה כדי לכסות את הרקמה, והתפתחות הצבע נבדקה תחת מיקרוסקופ במשך 1–3 דקות עד שהופיע צביעה חומה ונעצרה מיד על ידי שטיפה במים מזוקקים לאחר שהושגה עוצמת צביעה אופטימלית. בוצעו צביעת המטוקסילין מחדש, התמיינות אלכוהול בחומצה כלורית ותמיסת אמוניה להיפוך כחול. לאחר מכן בוצעו ייבוש אלכוהול מדורג שגרתית, שקיפות קסילן, והרכבה עם בלסם ניטרלי לצפייה תחת מיקרוסקופ. PBS שימש כאמצעי בקרה ריק במקום הנוגדן הראשוני. בנוסף, קטעי רקמת קרצינומה קשקשית בראש ובצוואר שאושרו בעבר ב-HMGA1 וחתכי רקמת שליה חיוביים ל-HAND1 שימשו כאמצעי ביקורת חיוביים להבטחת איכות ועקביות של הכתמים.
קביעת תוצאה
הכרוגן ששימש בניסוי זה הוא מערכת DAB-H2O2. לאחר צביעת המטוקסילין מחדש, צביעת HMGA1 ו-HAND1 חיובית נצפית בעיקר בגרעין התא, עם צביעה ציטופלזמית מסוימת. להערכה, האזור עם הצפיפות הגבוהה ביותר של תאים צבועים חיובית זוהה תחת הגדלה נמוכה (×40). בהגדלה של ×100, נבחרו חמישה שדות עם צפיפות תאים חיובית גבוהה, ו-100 תאים נספרו בכל שדה. האחוז הממוצע של תאים חיוביים מתוך חמשת השדות משמש כתוצאה לכל שקף. קריטריוני הדירוג היו כדלקמן: ללא תאים מוכתמים (-), תאים חיוביים < 25% (+), תאים חיוביים 25%–50% (++), ותאים חיוביים > 50% (+++), בהתבסס על שיטת ניקוד אחוזים חצי-כמותית הנפוצה בניתוחים אימונוהיסטוכימיים. ההערכה בוצעה באופן עצמאי על ידי שני פתולוגים מוסמכים באופן כפול-סמיות 15,16,17. אם הדעות שלהם שונות, עליהם לדון ולהגיע למסקנה18.
שיטת RT-PCR
מבנים
הפריימרים תוכננו באמצעות תוכנת עיצוב פריימר המבוססת על רצפי גנים יעדיים, תוך דגש על ספציפיות הפריימר, תאימות טמפרטורת ההתכה וגודל המוצר הצפוי. רצפי הפריימרים המפורטים, גדלי המוצר וטמפרטורות החישוש מסוכמים בטבלה 1. הפריימרים סונתזו לריכוז של 2 OD, חולקו לשני צינורות, ודיוללו ל-10 pmol/μL עם מים שטופלו ב-DEPC לאחסון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. טמפרטורת האנילינג חושבה באמצעות הנוסחה: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)
טיפול RNase בחומרים וציוד ניסיוניים:
פריטי פלסטיק (למשל, קצות פיפטה, צינורות EP): הפריטים הפלסטיים הונחו בבקבוק תגובת רחב-פה מעוטר, נוספו מים מעובדים ב-DEPC עד שהפריטים היו טבולים לחלוטין, והחומרים דוגרו במהלך הלילה במכסה אדים בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס). לאחר מכן הם עוברו עיקור בלחץ למשך 120 דקות ויובשו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
פריטי זכוכית: כלי הזכוכית הושרתו למשך הלילה בחומצה, נשטפו היטב, יובשו, עטופו בנייר אלומיניום, ונאפו בתנור של 200°C למשך 6 שעות ונשמר במקום נקי לשימוש עתידי.
פריטי מתכת (למשל, מספריים, פינצטה): פריטי המתכת נוקו, נאפו בתנור של 200 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ואוחסן במקום נקי לשימוש עתידי.
הכנת פתרונות
תמיסת DEPC של 0.1% (v/v): נוסף 1 מ"ל DEPC למים מזוקקים של 1000 מ"ל כדי להגיע לריכוז סופי של 0.1% (v/v), נער היטב, דגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, עובר חיטוי באוטוקלאב ואוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
תמיסת אתנול 75% (v/v): 75 מ"ל אתנול מוחלט עורבבה עם 25 מ"ל מים שטופלו ב-DEPC כדי להגיע לריכוז סופי של 75% (v/v), ואוחסן בטמפרטורה של 4°C.
הפקת RNA כוללת מרקמה
לאחר חילוץ ה-RNA, הוערכה שלמות ה-RNA לפני שעתוק הפוך וניתוח במורד הזרם. 80 מ"ג רקמה נשקלה באמצעות מאזן אלקטרוני, נחתכה לחתיכות קטנות והונחה בהומוגניזר זכוכית מטופל מראש. נוסף תגובת חילוץ RNA מקוררת מראש של 1 מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והדגימה הומוגנית על קרח באמצעות טחינה חוזרת עד שהושג ליזאט אחיד ללא שברי רקמה גלויים, וכך נמנעה היווצרות בועות. התערובת ההומוגנית הועברה לצינור EP ללא RNase בנפח 1.5 מ"ל ונדגרה על קרח במשך 5 דקות. 400 מיקרוליטר כלורופורם נוסף לכל צינור, תוך מערבולת בעוצמה במשך 10–15 שניות כדי להבטיח ערבוב פאזה מלא, ולאחר מכן דגירה על קרח למשך 5 דקות. הצינורות צונטרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 x גרם למשך 15 דקות. לאחר הצנטריפוגה, השלב המימי העליון נשאף בזהירות באמצעות פיפטה ללא RNase מבלי להפריע לשכבת הבין-פאזה לצינור חדש. נוסף נפח שווה של איזופרופנול, מעורבב על ידי הפיכת הצינור בעדינות 8-10 פעמים עד שהשכבות נעלמו, ודגרה בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך לפחות 10 דקות. התערובת צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 x גרם למשך 10 דקות. שכבת הסופרנטנט הושלכה, והוספה 400 מיקרולטר של 75% אתנול קר כדי להשעות את כדור ה-RNA. התערובת שוב צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 12,000 x גרם למשך 5 דקות. שכבת הסופרנטנט הושלכה, וכדור ה-RNA התייבש מעט. כדור ה-RNA הומס במים ללא RNase ואוחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
זיהוי שלמות RNA
לצורך זיהוי שלמות RNA, 5 מיקרוליטר דגימת RNA מעורבבת עם 5 מיקרוליטר של בופר עומס כחול ברומופנול, ובוצעה אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 2%. שלמות ה-RNA נחשבה מקובלת כאשר פסי 28S, 18S ו-5S שקופים היו נראים ללא טשטוש ברור.
שעתוק הפוך (RT) לסינתזת cDNA
6 מיקרוליטר RNA חוממו מראש בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז 25 מ"מ MgCl2 (4.0 מיקרוליטר), dNTP (2.0 מיקרוליטר), AMV (0.7 מיקרוליטר), 10× בופר AMV (2.0 מיקרוליטר), אוליגו (dT) (1.0 מיקרוליטר), RNasin (0.5 מיקרוליטר) ומים דה-יוניים נוספו ברצף על קרח להשגת נפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר, ואחריו ערבוב עדין וצנטריפוגה קצרה. תנאי התגובה היו 25 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, 98 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז נשמר בטמפרטורה של 4 מעלות למשך זמן בלתי מוגבל. כאשר התגובה הגיעה ל-4 מעלות צלזיוס, המוצר הוצא ממכונת ה-PCR, שימש כתבנית cDNA לתגובה הבאה של PCR, ונשמר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
הגברת PCR
לכל תגובת PCR, התערובת הכילה תבנית cDNA (1 מיקרוליטר), פריימר קדמי ייעודי ל-HMGA1, HAND1 או GAPDH (1 מיקרוליטר), פריימר הפוך ייעודי לגן היעד או GAPDH (1 מיקרוליטר), תערובת ראשית PCR (10 מיקרוליטר) ומים מטופלים ב-DEPC (7 מיקרוליטר), לנפח כולל של 20 מיקרוליטר. הוכנו תגובות נפרדות לכל גן מטרה (HMGA1, HAND1) וגן הבקרה הפנימית (GAPDH), כאשר כל תגובה מכילה את זוג הפריימר הקדמי והאחורי הספציפי לגן שלה.
נפח התגובה הכולל היה 20 מיקרוליטר. לאחר ערבוב עדין של רכיבי התגובה וצנטריפוגה קצרה במשך 5–10 שניות במהירות נמוכה, הצינור הונח במכונת PCR מחוממת מראש והוגבר בהתאם לתנאי התגובה בטבלה 2.
אישור וניתוח של מוצרים מוגברים על ידי PCR
הכנת ג'ל
2 גרם אגרוז נשקלו והונחו בבקבוק משולש. נוספו 2 מ"ל של בופר אלקטרופורזה 50× TAE ו-100 מ"ל מים מזוקקים (הכינו ג'ל אגרוז 2%), ואז חוממו במיקרוגל עם סיבובים לסירוגין (מרווחים של 15–20 שניות) עד שהאגרוז נמס לחלוטין. לאחר קירור לכ-55 מעלות צלזיוס, נוספו 10 מיקרוליטר של תמיסת EB וערבבו היטב. הג'ל נשפך לאחר מכן למגש ג'ל נקי בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס), נשטף במים מזוקקים, והוכנס מסרק ליצירת בארות דגימה. עובי הג'ל היה 0.4 ס"מ. המגש הונח על משטח שטוח בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות עד שהג'ל התקשה לחלוטין. המסרק הוסר בזהירות.
טעינת דגימות
4 מיקרו-ליטר מכל דגימת DNA נוספה לבארות הג'ל, וסמן DNA נוסף לבאר השמאלית ביותר.
אלקטרופורזה
מגש הג'ל הטעון הונח במיכל אלקטרופורזה מלא בבופר אלקטרופורזה TAE, כדי להבטיח שרמת הבופר תישאר כ-1 מ"מ מעל פני הג'ל. קצה אחד של הבארות היה בקתודה (כדי לאפשר ל-DNA לנדוד לכיוון האנודה). מערכת האלקטרופורזה הייתה מחוברת לספק כוח ופעלה במתח של 120 וולט ו-60 mA במשך כ-45 דקות, עד שבופר הטעינה עבר מעבר לקו האמצע של הג'ל, ולאחר מכן החשמל נותק.
תצפית והדמיה של תוצאות
לאחר האלקטרופורזה, הג'ל הוסר בזהירות, והתוצאות נצפו תחת מכשיר טרנסליומינר UV והושוו לסמן ה-DNA כדי לקבוע האם המשקל המולקולרי של הקטעים המוגברים מופיע במיקומים הצפויים. מערכת הדמיית הג'ל שימשה ללכידת תמונות ולשמירת התוצאות במחשב.
הגדרת הבקרה
השתמשו במים מזוקקים במקום cDNA כאמצעי בקרה שלילי.
ניתוח חצי-כמותי
תוצאות האלקטרופורזה של ג'ל האגרוז נותחו ונאספו באמצעות מערכת הדמיית הג'ל. תוכנת ניתוח תמונות שימשה לניתוח בהירות הרצועות. נמדדו ערכי ה-OD המשולבים המוחלטים של תחום ההגברה של הגן היעד ושל תחום ההגברה של גן הבקרה הפנימית המתאים. התוצאות הוצגו כיחס בין ערך ה-OD המשולב המוחלט של רצועת היעד לערך ה-OD האינטגרלי של תחום הבקרה הפנימי המתאים.
כלומר, ביטוי יחסי = ערך OD של גן היעד / ערך OD של גן הבקרה הפנימית.
ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים אורגנו באמצעות Excel ונותחו באמצעות תוכנה סטטיסטית. משתנים רציפים הובאו לידי ביטוי כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) והושוו בין שתי קבוצות באמצעות מבחן t של דגימות בלתי תלויות. משתנים קטגוריים נומינליים, כולל שיעורי ביטוי חיוביים באימונוהיסטוכימיה, נותחו באמצעות מבחן χ2 . משתנים קטגוריים אורדינליים, כולל דרגה פתולוגית ושלב קליני, נותחו באמצעות מבחן סכום דרגה (מבחן Mann-Whitney U להשוואות בין שתי קבוצות, כאשר רלוונטי). הוערך מתאם בין ביטוי HMGA1 ל-HAND1 באמצעות ניתוח קורלציה ליניארית. כל המבחנים היו דו-זנביים; P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית, ו-P. < 0.01 נחשב למובהק מאוד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות זיהוי אימונוהיסטוכימי
מוצגות תמונות ייצוגיות של צביעת המטוקסילין–אאוזין (HE) הממחישות את המורפולוגיה ההיסטולוגית של רירית הגרון הסמוכה התקינה ו-LSCC עם דרגות שונות של הבחנה (טוב, בינונית ודלה). בפרט, איור 1A מציג את רירית הגרון הסמוכה התקינה, איור 1B מציג LSCC מופרז היטב, איור 1C מציג LSCC מתמיין במידה בינונית, ואיור 1D
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
סרטן הגרון, אחד הגידולים הנפוצים ביותר בראש ובצוואר, הראה שכיחות הולכת וגדלה בשנים האחרונות, ככל הנראה קשורים לגורמים סביבתיים וקשורים לאורח החיים. כמו גידולים ממאירים אחרים, החזרה והגרורות שלו נשארות הגורמים המובילים למוות. עם התקדמות בביולוגיה מולקולרית, זוהו גורמים רבים הקשורים להתפתחות סרטן הגרון, אך מנגנוני ההופעה והגרורות עדיין אינם מובנים במלואם. HMGA1, כרגולטור שעתוק, הפך למוקד מחקר בשנים האחרונות בשל תפקידו בהתפתחות והתקדמות הגידולים. דווח כי הוא מתבטא מאוד במספר סוגי סרטן ויכול...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים רוצים להודות לתמיכת המוסד שלהם ועל כל האנשים שתרמו למחקר זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכונת הטמעת רקמות אוטומטית | סאקורה פינטק, טוקיו, יפן | Tissue-Tek TEC 5 | הטמעת פרפין |
| מיקרוטום | לייקה מיקרוסיסטמס, וצלר, גרמניה | RM2135 | חתכים (4 ו-mu; m) |
| מייבש שקופיות | שיאוגאן הונגיה מדיקל אינסטרומנט בע"מ, סין | CS-VI | ייבוש עם שקופיות |
| חממת חימום | חברת שנגחאי יאנגגואנג ניסיוני אינסטרומנט בע"מ, סין | 303-4A | דגירה מבוקרת טמפרטורה |
| מיקרוסקופ אופטי | תאגיד אולימפוס, טוקיו, יפן | BX41 | תצפית היסטולוגית |
| מערכת לכידת תמונות | QImaging, קנדה | QCapture Pro 7 | הדמיית מיקרוסקופיה |
| ספסל נקי | מפעל ציוד מוליכים למחצה בבייג'ינג שיצ'נג, סין | SW-CJ-1FD | מרחב עבודה סטרילי |
| צנטריפוגה מקוררת | מפעל תיקון מכשירים רפואיים בבייג'ינג, סין | LXJ-64-01 | הפרדת RNA |
| צנטריפוגה שולחנית | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., סין | PQ-1600A | עיבוד RNA/DNA |
| מערבל מגנטי | מפעל כלי הציוד הרפואי ג'יאנגסו ג'ינטאן, סין | HJ-3 | הכנת תמיסה |
| מיני מיקסר | שנגחאי פנג s Industrial Co., Ltd., סין | H-1 | מיקס דגימות |
| איזון אלקטרוני | מטלר טולדו, שווייץ | PB3002-S | שקילת דגימה |
| מגבר PCR | אפנדורף AG, גרמניה | מאסטרסייקלר 5333 | הגברת PCR |
| ספק כוח לאלקטרופורזה | מפעל הכלים ליויי בבייג'ינג, סין | DYY-6C | בקרת מתח |
| מיכל אלקטרופורזה | מפעל הכלים ליויי בבייג'ינג, סין | DYCZ-24DN | אלקטרופורזה בג'ל |
| מיקרוגל | מכון מחקר יישומים רפואיים של שנחאי ג'ונגדה, סין | WD800SL23 | הכנת אגרוז |
| טרנסליומינטור UV | מפעל הכלים ליויי בבייג'ינג, סין | WD-9403B | ויזואליזציה של DNA |
| מערכת הדמיית ג'ל | אנלאי בע"מ, סין | AlphaImager HP | תיעוד ג'ל |
| מקרר (4 מעלות; C) | הייר ביומדיקל, סין | BC-165D | אחסון דגימות |
| מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד | הייר ביומדיקל, סין | DW-86L388 | אחסון (-80 & deg; C) |
| קרח | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., סין | FZ-IB-20L | הובלת דגימות |
| שקיות אחסון קריוגניות | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., סין | YL-ULT-50 | שימור דגימות |
| פיפטות מחקר | אפנדורף AG, גרמניה | ריסרץ' פלוס | טיפול בנוזלים |
| תגובת חילוץ RNA (טריזול) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), ארה"ב | 15596026 | חילוץ RNA |
| ערכת תמלול הפוך | Takara Bio Inc., יפן | RR037A | סינתזת cDNA |
| מיקס מאסטר PCR | Takara Bio Inc., יפן | RR820A | הגברת PCR |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., יפן | 4030 (טיפוסי) | רכיב PCR |
| מעכב RNase (RNasin) | פרומגה, ארה"ב | N2111 | הגנה על RNA |
| מדריך Oligo(dT) | Takara Bio Inc., יפן | 3806 (טיפוסי) | פריימר סינתזת cDNA |
| אגרוז | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | A9539 | הכנת ג'ל |
| בופר TAE (50×) | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | TAE50X-1L (טיפוסי) | בופר אלקטרופורזה |
| סמן DNA (סולם) | Takara Bio Inc., יפן | DL2000 (3421A) | התייחסות לגודל |
| אתידיום ברומיד (EtBr) | ביו-רד, ארה"ב | 1610433 | ויזואליזציה של DNA |
| בופר PBS | גיבקו (תרמו פישר סיינטיפיק), ארה"ב | 10010023 | בופר שטיפה |
| מים מטופלים ב-DEPC | אינויטרוגן, ארה"ב | AM9916 | הגנה על RNA |
| כלורופורם | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | C2432 | חילוץ RNA |
| איזופרופנול | מרק, גרמניה | 109634 | משקעי RNA |
| אתנול (מוחלט) | מרק, גרמניה | 100983 | התייבשות |
| מתנול | מרק, גרמניה | 106009 | חסימת פרוקסידאז |
| מי חמצן (H2O2) | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | H1009 | חסימת פרוקסידאז אנדוגנית |
| קסילן | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | 534056 | דה-פראפיניזציה |
| בופר שחזור אנטיגנים של ציטראט | אבקאם, בריטניה | ab93678 | שליפת אנטיגנים |
| מדלל נוגדנים | דקו, דנמרק | S3022 | דילול נוגדנים |
| נוגדן ראשוני HMGA1 | אבקאם, בריטניה | ab129153 | דילול 1:150 |
| נוגדן ראשוני ל-HAND1 | אבקאם, בריטניה | ab200040 | דילול 1:100 |
| נוגדן משני (מצמיד HRP) | דקו, דנמרק | K5007 | מערכת גילוי |
| ערכת מצע DAB | דקו, דנמרק | K3468 | גילוי כרומוגני |
| כתם המטוקסילין | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | H9627 | צביעה גרעינית |
| אאוסין סטיין | סיגמא-אלדריץ', ארה"ב | E4009 | צביעת ציטופלזמה |
| מדיום התקנת בלסם נייטרלי | חברת Sinopharm Chemical Reagent, סין | 10004160 | התקנת מחסנית |
| פריימרים של HMGA1 | סינתזה מותאמת אישית (למשל, IDT/Sangon) | לא זמין | הגברת גנים |
| פריימרים של HAND1 | סינתזה מותאמת אישית (למשל, IDT/Sangon) | לא זמין | הגברת גנים |
| פריימרים של GAPDH (בקרה פנימית) | סינתזה מותאמת אישית | לא זמין | גן ניקיון |
| APES (אמינופרופילטריאתוקסילן) | סיגמא-אלדריץ' | לא זמין | ציפוי סלייד |
| צינורות מיקרוצנטריפוגות ללא RNase | אפנדורף | לא זמין | טיפול ב-RNA |
| טיפים לפיפט ללא RNase | אפנדורף | לא זמין | טיפול בנוזלים |
| מגש ומסרק יציקת ג'ל אגרוז | גנרי | לא זמין | הכנת ג'ל |
| תוכנת עיצוב פריימר | טכנולוגיות DNA משולבות, ארה"ב | כלי PrimerQuest | עיצוב פריימר |
| תוכנת ניתוח תמונות | מדיה סייברנטיקס, ארה"ב | Image-Pro Plus 6.0 | כימות רצועות |
| תוכנת ניתוח סטטיסטי | IBM Corp., ארה"ב | גרסת SPSS 13.0 | ניתוח סטטיסטי |