מאמר שיטה

מיפוי חיסון תינוקות עם קלט מינימלי: פרופילינג אינטגרטיבי חד-תאי ומולטיאומי

DOI:

10.3791/70279

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר איסוף ושימור דגימות דם ממטופלים יילודים וילדים, וכן יישום של scRNA-seq, פרוטאומיקס וציטומטריית זרימה ספקטרלית לאפיון אוכלוסיות תאי החיסון מהדגימות הללו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלידה, מערכת החיסון של התינוקות מתמודדת בפתאומיות עם סביבה שונה לחלוטין, עשירה בגירויים מיקרוביאליים וסביבתיים. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שחסינות בגיל מוקדם אינה רק ילדותית, אלא מותאמת באופן ייחודי כדי לעמוד בדרישות הייחודיות של חלון ההתפתחות הזה. במהלך תקופה זו, מערכת החיסון דינמית מאוד, ועוברת שינויים מהירים כדי להתאים לנוף החיצוני המשתנה. הבנת הנוף החיסוני המורכב והמתפתח הזה דורשת מחקר ישיר בתינוקות. עם זאת, מגבלה מרכזית במחקרים כאלה היא נפח הדם הכולל הנמוך בתינוקות (~100 מ"ל/ק"ג), מה שמגביל את הכמות שניתן לאסוף בבטחה למחקר, במיוחד בתינוקות עם משקל לידה נמוך מאוד (ELBW) או פגים מאוד. בעבודתנו האחרונה, אנו מתמודדים עם מגבלה זו על ידי הדגמת האופן שבו ניתן לבצע פרופילינג חיסוני במימד גבוה באמצעות נפחים זעירים של דם יילודים. אנו מציגים סט של פרוטוקולים מותאמים לדגימה אורכית לאורך החיים המוקדמים ומיישמים טכניקות מתקדמות, כולל ציטומטריית זרימה, פרוטאומיקה וריצוף RNA חד-תא, כדי למקסם את המידע המתקבל מקלט מינימלי. ביחד, שיטות אלו מאפשרות מבט מקיפה על החתימות הטרנסקריפטומיות והפרוטאומיות של תאי חיסון במחזור הדם, ומציעות תובנות חדשות על המסלול הייחודי של מערכת החיסון המוקדמת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מותאם ל-100-250 מיקרוליטר דגימות דם המעובדות בתוך 12 שעות מהאיסוף, בין אם בהקפאה או בשימוש מיידי. בלידה, מערכת החיסון הניונאטלית נדחפת לסביבה שונה לחלוטין, מועשרת בגירויים מיקרוביאליים וסביבתיים שלא היו קיימים קודם לכן בסביבה תוך-רחמית מוגנת 1,2. שינוי זה דורש ממערכת החיסון להסתגל ולהגיב למגוון רחב של אנטיגנים חדשים, תהליך שהוא חיוני להישרדות אך גם מציב אתגרים משמעותיים 1,2. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שחסינות בגיל צעיר אינה רק ילדותית או גרסה מוקטנת של מערכת החיסון הבוגרת. במקום זאת, הוא מותאם באופן ייחודי לצרכים הספציפיים של תקופת ההתפתחות הקריטיתהזו 3,4. במהלך חלון התינוקות הזה, רכיבי התאים של מערכת החיסון, כולל סוגים שונים של תאי T, תאי B ותאי מיאלואידים, מתבשלים ומפתחים תכונות ותפקודים ייחודיים הייחודיים לחיים המוקדמים 5,6,7,8. למרות חשיבותה, חסינות יילודים נותרת קשה לחקר ישיר בשל מגבלות אתיות ומעשיות. מגבלה עיקרית היא נפח הדם הקטן ביילודים, ממוצע ~100 מ"ל/ק"ג 9.10. אתגר זה מתעצם עוד יותר כאשר אוספים דם מתינוקות פגים מאוד (נולדו לפני שבוע 30 להריון) ותינוקות ELBW, שיכולים לשקול רק 400 גרם עם 40 מ"ל דם במחזור הדם. דבר זה מגביל את כמות הדם שניתן לאסוף בבטחה, ומדגיש את הצורך בגישות שממקסימות את תפוקת הנתונים מדגימות מינימליות. כדי להתמודד עם אתגר זה, עבודתנו מדגימה פרוטוקולים אופטימליים לפרופילינג חיסוני מממד גבוה באמצעות נפחי דם זעירים (100-250 מיקרוליטר), כמו אלו שהתקבלו מתינוקות ELBW.

התקדמות אחרונה באיסוף ועיבוד דם אפשרה חקר תגובות חיסוניות באוכלוסיות שבהן איסוף דגימות הוא מסורתי קשה. מכשירי מיקרונידל כמו Tasso ומערכות Touch Activated Phlebotomy פותחו במקור לאיסוף דם ביתי נוח במבוגרים. מאז הם הותאמו לשימוש בתינוקות, ומאפשרים למטפלים הראשיים ולצוותים קליניים לאסוף דגימות עם מינימום אי נוחות. בנוסף, ניתן להשתמש בהם בבית ללאלחץ של ביקורים קליניים חוזרים, מה שמקל על עמידה בדרישות ונגישות. יש להשתמש במיקרוצינור עם אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA) עם המכשיר ולשלוח אותו ללילה למעבדה תוך שמירה על פרוטוקולי ביו-סיכון מתאימים. למחרת בבוקר, כאשר הדגימות מגיעות, הן אמורות לעבור עיבוד באמצעות שיטות פירוק תאי דם אדומים (RBC) ללכידתתאי מערכת החיסון במחזור הדם. ראוי לציין שצינורות EDTA מאפשרים בידוד תאים חיים, אך שיקולי זמן חשובים. לבדיקות פונקציונליות עם גירוי, יש לעבד דגימות בפחות מ-4 שעות ורצוי פחות מ-2 שעות מהאיסוף. בבדיקות הפנוטיפיות הלא-פונקציונליות המוצגות להלן, יש לעבד דגימות תוך 12 שעות כדי לאפשר משלוח לילה תוך הבטחת התאוששות, שכן עמידות התאים פוחתת עם הזמן12. בהשוואה להפרדה מסורתית בין צפיפות לגרדיאנט עם Ficoll, הליזה מהיר יותר, דורש פחות עבודה ומניב התאוששות גבוההיותר 13. עם זאת, בידוד תאי הדם ההיקפיים על ידי ליזיס עשוי להשאיר גרנולוציטים מזהמים, מה שמפחית את הטוהר, אך יכול להיות יתרון למחקרים המתעניינים בסוגי תאים אלו14. פשרות אלו מדגישות כיצד התאמות מתודולוגיות מאזנות בין היתכנות לדיוק בעת חקר דגימות קליניות נדירות או רגישות, כמו אלו של יילודים. טיפול במורד הזרם של תאים מבודדים נהנה גם הוא משיפורים מתודולוגיים. הקפאה באמצעות סרום בקר עוברי (FBS) ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) נותרה גישה איתנה לתאי חיסון, במיוחד בדם עוברי ויילודים, שם חיוניות והתאוששות התאים הן קריטיות. לצד אופטימיזציה של תהליך איסוף הדם, אימצנו גם טכניקות בהמשך המאפשרות הפקת מידע מקסימלי מנפחי דגימות קטנות. אנו מציגים סט של פרוטוקולים אופטימליים שמאפשרים דגימה לאורך כל החיים המוקדמים, ומאפשרים בדיקה מעמיקה של דינמיקת מערכת החיסון לאורך זמן. הגישה שלנו עושה שימוש בטכניקות מתקדמות כגון ציטומטריית זרימה ספקטרלית, פרוטאומיקה וריצוף RNA חד-תאים, המציעים יחד מבט שאין שני לו על החתימות הפרוטאומיות והשעתוקיות של תאי מערכת החיסון במחזור הפעולה בצעירותם. בנוסף, ציטומטריית זרימה ספקטרלית מציעה הזדמנויות לקבל תובנה פונקציונלית עם קלט תא מינימלי.

במהלך השנים, מספר טכניקות, כגון ספירות דם מלאות (CBCs), שימשו לניתוח תאי חיסון שמקורם בדם15, בעוד שאחרות ניתחו יחסי תאי חיסון בדגימות דם מלא של יילודים באמצעות מתילציה של DNA16,17. בעוד שטכניקות אלו סייעו בלמידת הפרופורציות של תאי מערכת החיסון הידועים, עדיין קיימות מגבלות ביכולתנו לקבל תובנות מעמיקות על תאים ללא מערכת מולטי-אומיק. CBCs מספקים רק מדדים רחבים של סוגי תאי דם עיקריים, מה שהופך אותם לשימושיים לקביעת מצב חיסוני כללי בסביבה קלינית אך מוגבלים ביכולתם לפתור תת-סוגים או מצבים תפקודיים. לאחרונה, מחקרים החלו להתמודד עם מגבלה זו על ידי שימוש בשינויים טרנסקריפטומיים ומטבולומיים שמקורם בפלזמה בתינוקות כבר בשבוע הראשון לחיי18. פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה הותאמה לחקר פרופילים חיסוניים בדגימות יילודים19. גישה זו עוצמתית למדידת מגוון רחב של חלבונים באופן בלתי מוטה ולזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים. עם זאת, מגבלות מרכזיות כוללות את הצורך בקלט חלבונים יחסית גדול והיעדר מידע ישיר על זהות התא, למרות שמכילים חלבונים מסיסים ובלתי מסיסים. מבחן פרוטאומיקה ממוקד (TMPA) מציע חלופות לדגימות בעלות קלט נמוך. שיטות אלו משתמשות בזיהוי ממוקד מבוסס נוגדנים, המספקות פרופיל רגישות גבוהה לדגימות עם חומר מוגבל. אחד מהם, במיוחד, שימש למעקב אחר מסלולי התפתחות מערכת החיסון המוקדמים לאורך20.

ציטומטריית זרימה מאפשרת ניתוח כמותי של חלבוני תאי החיסון ברמת תא יחיד על ידי העברת תאים מסומנים פלואורסצנטית דרך קרן לייזר ממוקדת ומדידת פיזור אור ואותות פלואורסצנציה שנוצרים. בטכניקה זו, נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית נקשרים לחלבונים מסוימים על פני השטח או לתוך-תאי. דבר זה מאפשר זיהוי וכימות סימולטני של מספר תת-סוגים של תאי מערכת החיסון ומאפייניהם המגדירים אותם בהתבסס על פרופילי הפלואורסצנציה שלהם. ציטומטריית זרימה ספקטרלית מרחיבה גישה זו על ידי לכידת ספקטרום הפליטה המלא של כל פלואורוכרום, ומאפשרת פירוק ספקטרלי מדויק וזיהוי סימולטני של למעלה מ-35 סמנים במבחן אחד 21,22,23. דבר זה מאפשר ניתוח של הרבה יותר סמנים מאשר לוחות ציטומטריית זרימה קונבנציונליים, המוגבלים ל-~8-12 סמנים. בהשלמת טכניקות ציטומטריות אלו, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) שינה מחקרים אימונולוגיים בכך שאפשר פרופיל טרנסקריפטומי ברזולוציה גבוהה ובלתי מוטה מחומר קלט מינימלי24. למרות עלויות גבוהות יותר ותלות בחיוניות התאים, scRNA-seq מספק תובנות שאין שני להן לגבי הטרוגניות חיסונית בשלבים מוקדמים בהשוואה לריצוף בתפזות. יחד, התקדמויות אלו מדגימות כיצד חידושים באיסוף, שימור וניתוח מותאמים כדי להתגבר על האתגרים הייחודיים של חקר חיסון עוברי ויילודים.

פרוטוקול זה מותאם לניתוח תאי חיסון היקפיים ששמרו בקריופרציה המבודדים באמצעות פירוק תאי דם סדרתי. חוקרים צריכים לשקול פרוטוקול זה אם מחקריהם דורשים פרופילינג חיסוני ברזולוציה גבוהה מנפחים קטנים של דם (100-500 מיקרוליטר), במיוחד כאשר ניתוח אורך הוא קריטי. השיטה מתאימה באופן רחב הן לתינוקות במועד והן לפגים, ותואמת למגוון רחב של ניתוחים בהמשך, מה שהופך אותה למתאימה לשאלות מחקר מגוונות באימונולוגיה של יילודים וילדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הובטחו הסכמה מדעת של ההורים ועמידה מלאה בתקנות אתיות לאומיות רלוונטיות בהתאם לוועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ייל (IRB). כפי שמצוין בפרוטוקול IRB המאושר, צוות המחקר פנה להורים בשבוע הראשון לאחר לידת התינוק לקבלת הסכמה לפני ההרשמה. לא החלו הליכי מחקר עם חומרים שמקורם בבני אדם לפני אישור אתי מתועד.

1. איסוף, עיבוד ואחסון דגימות (איור 1)

  1. איסוף דם אשפוזי
    1. לאסוף ולעבד דגימות תינוקות לאחר קבלתן, לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולעבד תוך 12 שעות מהאיסוף.
    2. אסוף ~250 מיקרוליטר דם מלא ואחסן בצינור איסוף דם נוגד קרישה EDTA. הפוך את צינור איסוף הדם 8 פעמים כדי לערבב את נוגד הקרישה.
    3. המשך לעיבוד הדם המלא באמצעות פירוק דם אדום כפי שמתואר בסעיף 1.3 (עיבוד דגימת דם מלאה).
    4. כדי לאסוף כתמי דם יבשים, השתמשו בלנסט סטרילי כדי ליצור דקירה באצבע/עקב הנקייה.
      1. חלופה נוספת היא פיפטה ~25-30 מיקרוליטר דם מצינור ה-EDTA על נייר הסינון. נגעו בעדינות בנייר הפילטר בטיפת הדם.
    5. מלא לפחות עיגול אחד בדם זורם בחופשיות, טיפה אחת לכל עיגול. תן לכתם הדם להתייבש. השאר את נייר הסינון פתוח עד שכתמי הדם יתייבשו לחלוטין.
    6. תייגו כראוי עם זמן האיסוף, תאריך העיבוד, נקודת הזמן וזיהוי הדגימה.
    7. שים בשקית אחסון עם רוכסן פלסטיק שקוף. אחסן את כרטיסי כתמי הדם בטמפרטורה של −20°C או −80°C ליציבות מורחבת יותר עד שמוכנים לניתוח פרוטאומי.
  2. איסוף דם אמבולטורי
    הערה: באישור מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ייל, הורים של משתתפים אמבולטוריים קיבלו את האפשרות לאסוף דגימות דם בבית באמצעות מכשיר איסוף עצמי עם מחטים מיקרו. מכשיר זה מקבל דם נימי דרך לנצט המונח על העור. הורים שבחרו בשיטה זו קיבלו הכשרה במרפאה באמצעות ערכות הדגמה, ולאחר מכן קיבלו הוראות כתובות מפורטות וערכות איסוף לשימוש ביתי.
    1. רחצו ידיים ולבשו כפפות לפני השימוש. אסוף את כל הפריטים הנדרשים, כולל מראה אם רק אחד ההורים מבצע את איסוף הדם.
    2. הסר את המכשיר מהערכת הכלים וסובב את הפקק מצינור תואם.
    3. לחץ את הצינור לתוך המכשיר עד שיהיה צמוד עם קווי מילוי הפונים החוצה.
    4. הסירו את החיתול של התינוק והחזיקו אותו זקוף.
    5. עקוב אחרי הוראות שקית החימום כדי להפעיל.
      הערה: אם אין חבילה זמינה, השתמשו בשיטת חימום אחרת, כמו יד.
    6. החזק את שקית החימום במקום (הישבן) למשך 2-4 דקות כדי להתחמם ולהגביר את זרימת הדם.
    7. נקה את האזור עם כרית אלכוהול ותן לו להתייבש.
    8. הסר את הכיסוי השקוף מהכפתור האדום. קילף את הלשונית מהמכשיר והדביק היטב את החלק המלא ביותר של הישבן של התינוק תוך כדי החזקתו זקוף.
      הערה: התאימו את היציבה לפי הצורך כדי לשמור על הצינור אנכי לחלוטין לצורך איסוף דם תקין.
    9. לחץ על הכפתור עד הסוף פעם אחת ושחרר. הגדר את הטיימר ל-5 דקות. צפה במילוי הצינור באמצעות המראה לפי הצורך.
    10. ייתכן שדם לא יופיע בדקה הראשונה-שתיים. הסר את המכשיר אחרי מקסימום של 5 דקות בסך הכל או מוקדם יותר אם הדם מתמלא לקו האינדיקטור העליון לפני 5 דקות.
    11. הסר את הצינור מהמכשיר עם סיבוב קל ומשך למטה. תסגור במהירות את הפקק במלואו אל הצינור. הפוך את הצינור לפחות פי 10, כדי לוודא שהדם נוגע בפקק בכל היפוך כדי למנוע קרישה.
    12. שלח דגימות בלילה לאחר האיסוף.
  3. עיבוד דגימת דם מלאה
    1. עבד דגימות דם בארון בטיחות ביולוגי.
    2. העבר בזהירות את 250 מיקרוליטר הדם לצינור קוני בגודל 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של בופר ליזיס של תאי דם אדומים אחד. שטוף את צינור איסוף הדם ב-10 מ"ל של בופר ליזיס של תאי דם דם עד שהוא מתרוקן. תן לתאים להתפרץ בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
    3. לאחר סיום הליזה, מוסיפים ~30 מ"ל PBS ב-RT לשטיפה ולסובב ב-430 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט באמצעות ואקום, מבלי להפריע לכדור.
    4. המשך להעביר ולשטוף את הדגימה כפי שמתואר בשלב 1.3.2 עד שהכדור התאי נראה נקי מתאי דם אדומים גלויים. צנטריפוגה ב-430 × גרם למשך 5 דקות, ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
    5. לכל 250 מיקרוליטר דם שנאספ, יש להשעות מחדש את כדור התא המתקבל ב-2 מ"ל של מדיום הקפאה (10% DMSO ב-FBS) ולחלק לשני קריוביאלים לשימור.
    6. בדוק את שכנות התאים על ידי ספירת תאים שתלויים במדיום הטעינה באמצעות המוציטומטר באמצעות הדרת טריפאן בלו.
    7. העבר 1 מ"ל משלב 1.3.5 לכל קריוביאלי. יש לסמן באופן מתאים את זמן האיסוף, תאריך העיבוד, נקודת הזמן וזיהוי הדגימה.
    8. יש לאחסן קריוביאל ביניים בטמפרטורה של -80°C במיכל קפוא עם איזופרופנול. לאחר 24 שעות, להעביר את הקריוביאל לחנקן נוזלי עד שיהיה מוכן לניתוח.

2. TMPA מכתמי דם יבשים (DBS) (איור 2)

  1. ביום העיבוד, הבא את נייר הסינון ל-RT. באמצעות מנקב מתכת בקוטר 3 מ"מ, נקב 2-3 מעגלים בנייר הסינון במקום שבו עבר הדם, במרכז ככל האפשר על נקודת הדם.
  2. הרם כל חור בקוטר 3 מ"מ עם פינצטה והוסף לבאר של לוח עם 96 בארות או צינור PCR עם קישור נמוך המכיל 20 מיקרוליטר של בופר שחרור (1x PBS, 1x מעכב פרוטאז, 0.05% Tween 20). תוודא שהפאנצ'ר מכוסה בבופר אילושן.
  3. סגור את הצינורות או כסה את הפלטה בחצאית פלסטיק, והניח אותם על מערבולת דיגיטלית שמסתובבת ב-600 סל"ד למשך 60 דקות ב-RT.
  4. בסיום הדגירה, העבר בזהירות את האלואט לצינור חדש עם קישור נמוך או לפלטת 96 בארות. זרוק את הצינורות או הפלטה עם הניקובים המסננים.
  5. כמת את תכולת החלבון באמצעות בדיקת BCA.
    1. קחו 2 מיקרוליטר מכל דגימה או תקן BSA כדי לבצע דילול סדרתי של 1:10 ו-1:100 במים. הכינו דגימות ותקנים כפולים על ידי הוספת 15 מיקרוליטר דגימות מדוללות או סטנדרטיות ל-200 מיקרוליטר של תמיסה עובדת 1x. דגמו דגימות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. קרא את האות ב-562 ננומטר בקורא לוחות. חשב את ריכוז החלבון הסופי בהתבסס על השיפוע הסטנדרטי של BSA ורקע בופר ההזזה.
  6. יצר קליעות של 30 מיקרוליטר לדגימות ב-0.5-1 מ"ג/מ"ל במיקרו-צינורות עם מכסה בורג של 1.5 מ"ל עם חיבור נמוך. הקפיאו דגימות ב-80 מעלות צלזיוס לצורך הגשה מאוחרת לעיבוד באמצעות שירות TMPA.

3. ציטומטריית זרימה ספקטרלית של דם מרוסק על ידי תאי דם אדומים (איור 3)

  1. ביום הניסוי, יש להפשיר במהירות בקבוקון של תאי דם אדומים במים באמבט מים בטמפרטורה של 37°C עד שנשארת טיפה קטנה של קרח.
  2. הוסף את מתלה התא לצינור קונוסי של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל RPMI מלא מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) (מוכן עם 500 מ"ל RPMI 1640, 50 מ"ל FBS, 5.6 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו-5.6 מ"ל תוסף גלוטמין). צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.
  3. החזירו בעדינות את הכדור ל-3 מ"ל RPMI מלא וקבעו את ספירת התאים בשיטה מתאימה.
  4. סובב את התאים המוחזרים ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
  5. כוון את ריכוז התאים ל-1 ×10 6 תאים למ"ל ב-RPMI מלא. הזרקו 100 מיקרוליטר לכל באר (0.1 × 10⁶ תאים) ללוח V-תחתית עם 96 בארים. צנטריפוגה ב-764 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והסרת הסופרנטנט.
  6. הוסף 100 מיקרוליטר של צבע חי/מת ב-PBS בדילול של 1:2,000 עם בלוק Fc ובלוק מונוציטים (דילול של 1:100) לכל הדגימות, למעט הבקרה הלא מוצבעת. דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C.
  7. שטוף עם 100 מיקרוליטר PBS וצנטריפוגה ב-764 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    הערה: חיוני להשתמש בבלוק Fc ובלוק מונוציטים כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדנים.
  8. הוסף 100 מיקרוליטר מהקוקטייל השטחי המדולל (דילול של 1:200) בבופר FACS (500 מ"ל PBS, 2.5 גרם אלבומין סרום בקר (BSA), 2 מ"מ EDTA, pH 8.5) לכל הדגימות, למעט הביקורת הלא מוצבעת. דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  9. שטוף עם 100 מיקרוליטר של בופר FACS וצנטריפוגה ב-764 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
  10. תיקון התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 4% פאראפורמלדהיד לכל דגימה. תדגור 15 דקות ב-RT בחושך.
  11. שטיפה עם 100 מיקרו-ליטר של בופר FACS, צנטריפוגה ב-764 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4°C, והשעה מחדש ב-200 מיקרוליטר של בופר FACS.
  12. הכינו חרוזים אולטרה-קומפוזיים כבקרים בצבע יחיד. צבע את חרוזי הבקרה בצבע יחיד לפי אותו פרוטוקול כמו הדגימות, כולל קיבוע אם הדגימות היו קבועות.
  13. הכינו בקרות פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) באותו הליך כמו בדגימות.
    הערה: חשוב להתייחס לבקרות הצבע היחיד ול-FMO באותו אופן כמו לסמפלים. לדוגמה, אם הדגימות מקובעות לאחר הצביעה, יש לתקן גם את ה-FMO ואת בקרות הצבע היחיד.
  14. הרץ את הדגימות, בקרות בצבע יחיד, בקרות לא מוכתמות ובקרות FMO על ציטומטר זרימה קונבנציונלי/ספקטרלי. נתח את הנתונים באמצעות תוכנה.
  15. הגדר שערים לפי איזוטיפ ובקרות FMO מתאימות. ראשית, תאי שער לבחירת אוכלוסיית הלויקוציטים באמצעות תרשים פיזור קדמי (FSC) לעומת פיזור צד (SSC), המסייע להוציא פסולת ולבחור תאים לפי גודל וגרעיניות.
  16. לאחר בחירת לויקוציטים, תאי שער לשלול דאבלטים באמצעות גרף של שטח פיזור קדמי (FSC-A) לעומת גובה פיזור קדמי (FSC-H).
    הערה: זה מבטיח את בחירת התאים הבודדים (סינגלטים), כאשר תאים הנופלים לאורך האלכסון נחשבים כסינגלטים, בעוד שכפולים וגושים אינם כלולים.
  17. תאי שער לחיות, תוך שימוש בצבע חיוניות כדי להוציא תאים מתים, מה שמבטיח שהניתוח הבא יכלול רק תאים חיים.
  18. לאחר שלבי השער הראשוניים הללו, משטרים תאים בודדים חיים נוספים עבור סמני שושלת ספציפיים כדי לסווג תת-אוכלוסיות תאי חיסון שונות. חלקו את התאים הבודדים החיים לתאי מיאלואידים CD33+ ולימפוציטים CD33- בהתבסס על ביטוי CD33.
  19. בתוך אוכלוסיית CD33+ , יש להבדיל מונוציטים של CD14+ ולזהות תאים דנדריטיים (DCs) של CD11c+ כתאים המבטאים CD11c אך לא CD14.
  20. בתוך אוכלוסיית הלימפוציטים של CD33, יש לשער תאי T של CD3+ ולתת-שער לזיהוי תת-קבוצות תאי T של CD4+ ו-CD8+.
  21. בנוסף, זיהוי תאי CD56+ הרג טבעיים (NK) לפי ביטוי CD56, וזיהוי תאי CD19+ B לפי ביטוי CD19.

4. scRNA-seq של דם בלייז של תאי דם אדומים (איור 4)

  1. הפשיר בקבוקון אחד של תאי דם אדומים מוקפרים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף את הדגימה ל-10 מ"ל של מדיה מסוג T בצינור קוני של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-430 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
  2. הוסף עוד 10 מ"ל של 1x PBS לדגימה. צנטריפוגה ב-430 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
  3. ספרו את התאים והערכו את הקיימות עם טרייפן בלו. אם הקיימות היא פחות מ-70%, יש לעבור להסרת תאים מתים עם ערכת הסרת תאים מתים.
    1. הסרת תאים מתים
      1. מדלל את ה-20x Binding Buffer Stock באמצעות מים סטריליים ומזוקקים כפול כדי לקבל תמיסה עובדת פי 1.
      2. השעה את כדור התא ב-100 מיקרו-ליטר של מיקרו-חרוזי הסרת תאים מתים לכל 1 ×-10-7 תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגרו 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      3. הכנס את עמוד ההפרדה המגנטי למעמד המגנטי המתאים. שטוף את העמודה עם 500 מיקרוליטר של 1x Binding Buffer כדי להתאזן לפני השימוש.
      4. העלה את נפח התא ל-500 מיקרוליטר עם בופר קישור 1x. מרחים את תליית התא על העמודה ואסוף את הזרימה בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.7 מ"ל.
      5. שטוף פעמיים עם 500 מיקרוליטר של בופר קישור. אסוף את הזרימה באותו צינור מיקרוצנטריפוגה.
      6. צנטריפוגה את ה-eluate ב-300 × גרם למשך 10 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
    2. ספרו את התאים והערכו את החיוניות שלהם עם טרייפן בלו.
    3. החזר 20,000 תאים ברי קיימא ב-40 מיקרוליטר PBS עם 0.04% BSA בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.7 מ"ל.
    4. שלחו את התאים על הקרח מיד למתקן ליבה גנומית ליצירת ספרייה וריצוף. אסוף את תוצאות הריצוף בפורמט של פלטי Cell Ranger.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אספנו כרטיסי DBS מ-10 תינוקות פגים מאוד בשלוש נקודות זמן: שבוע אחד (n = 12), חודש אחד (n = 7), ו-2 חודשים (n = 3) לניתוח פרוטאומי TMPA6 (איור 2A). דגימות אלו נותחו לצד דם טבורי תינוקות במועד מלא (TCB; n = 4) ודם בוגר בריא (AB; n = 5). ביטוי החלבונים המנורמל (NPX) של 92 חלבונים הקשורים לחיסונית נמדד באמצעות פלטפורמת TMPA (איור 2B). הניתוח הסטטיסטי הראה ביטוי גבוה משמעותית של גן הפעלת לימפוציטים 3 (LAG3) וש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קבלת נתונים אימונולוגיים איכותיים מכמויות מינימליות של דם יילודים ותינוקות דורשת התאמות מתודולוגיות בשלבים שונים. בפרוטוקול זה אנו מתארים ארבע אסטרטגיות משלימות: (i) אופטימיזציה של איסוף דם ושימור קריופאור לשימור תאים חיוניים לשימוש במורד הזרם, (ii) יישום ציטומטריית זרימה ספקטרלית לאימונוטיפינג רב-פרמטרי, (iii) scRNA-seq לפתרון הטרוגניות חיסונית ברזולוציה גבוהה, ו-(iv) TMPA. ביחד, גישות אלו ממקסמות את תפוקת הנתונים תוך התמודדות עם האתגרים הטכניים של נפחי דגימות מוגבלים ואוכלוסיות תאים שב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למתקנים המרכזיים הבאים בייל: ליבת ציטומטריית זרימת ייל; מרכז ייל לניתוח גנום. אנו מודים למרכז המחקר הקליני של ייל, למשרד לפיתוח רופאים-מדענים ומדענים של ייל, ולתוכנית פיתוח מדעני טיפול נמרץ וטראומה בילדים/NICHD. מחקרי רספירומטריה בוצעו על ידי Chemical Metabolism Core באוניברסיטת ייל. עבודה זו מומנה ממענקים ל: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), קרן סיסטיק פיברוזיס (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), פרס הרטוול (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), בית הספר לרפואה של ייל, המחלקה לרפואת ילדים (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). התוכן נמצא באחריות המחברים בלבד ואינו בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. איור 1 נוצר ב-BioRender. גאון, ק. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTA, pH 8.0תרמו פישר סיינטיפיק 15575-038 
1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 3177165 
ערכת בדיקת חלבון BCA  אבקאם AB287853 
BD Microtainer MAP מיקרוטיובפישר סיינטיפיק  22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1° C Freeze Controller מיליפור סיגמא 41122800 
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אלדריץ'  A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 אנטי-אנושי CD3 תרמו פישר סיינטיפיק 364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 אנטי-אנושי CD11c BD BioScience 612968 
Brilliant Vil750 אנטי-אנושי CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 אנטי-אנושי CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 אנטי-אנושי CD56 BioLegend 318336 
קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA קומפליט, מיני, ללא EDTAמיליפור סיגמא 11836170001 
ערכת הסרת תאים מתים Miltenyi Biotec  130-090-101 
דימתיל סולפוקסיד (DMSO) תרמו פישר סיינטיפיק BP231-100 
דולבקו' s מלח עם בופר פוספט (DPBS), ללא סידן, ללא מגנזיום תרמו פישר סיינטיפיק 14190144 
סרום בקר עוברי (FBS) Gibco A5256801 
מיקסר דיגיטל וורטקס פישרברנד תרמו פישר סיינטיפיק 02215418 
Fixation Buffer BioLegend 420801 
תוסף GlutaMAXGibco 35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec  130-042-303 
עמודות MS  Miltenyi Biotec  130-042-201 
שםהחברהמספר קטלוג
מפריד OctoMACS  Miltenyi Biotec  130-042-109 
פסיפיק בלו אנטי-אנושי CD4 BioLegend 344619 
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)תרמו פישר סיינטיפיק 15140-122 
RB780 אנטי-אנושי CD33 BD Biosciences 755606 
Rierdge 3mm Metal Puncher  רירדג' SDD231031PC-01 
RPMI 1640 בינוניGibco 11875-093 
Spark UV 387 אנטי-אנושי CD19 BioLegend 302289 
ערכות אוסף טאסוטאסו לא זמין
מיקרו צינורות עם מכסה בורג תרמו-סיינטיפיקטיתרמו פישר סיינטיפיק 14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva 41111700 
ערכת עמידות ניתנת לתיקון NIR זומבים  BioLegend 423105 
<חזק>תוכנה וחבילות
אדובי אילוסטרייטור2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
פריזמת GraphPad9.4.0
שםגרסה
סקנפי1.9.1
סרובלט0.2.3
<מבחנים חזקים>מסחריים
תא יחיד כרום 5' קיט10X גנומיקהPN-1000263
אולינק  חשיפה או מטרה 96 פאנל דלקתיאולינקhttps://olink.com/products/olink-target-96

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים