עם העניין הגובר באימונותרפיה תוך-גידולית, בחירת מודלים נגישים ומעשיים היא חיונית. גידולים תת-עוריים קלים לזיהוי אך קשה לדמיין ולמניפולציה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטות ליצירת גידולים תוך-עוריים המספקות נראות ונגישות משופרת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתלת גידול תוך-עורי כמודל חזק למחקרי אימונותרפיה תוך-גידולית בסרטן עכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הקמת מודלים של גידולי עכברוסים ניתנים לשחזור היא חיונית להערכת ביולוגיה של סרטן ואסטרטגיות אימונותרפיה. אימונותרפיה תוך-גידולית מטפלת בגידולים מבוססים באמצעות תגובות מגרות חיסון כדי להפוך את הדיכוי החיסוני המקומי ולעורר חיסון אנטי-גידולי מערכתית. רוב מחקרי הסרטן בעכברים מגדירים את הגידולים במרחב התת-עורי, מה שיש לו אתגרים מובנים באימונותרפיה תוך-גידולית ניסיונית בשל חוסר היכולת לדמיין את ההזרקות התוך-גידוליות. הזרקה תוך-עורית של תאי גידול מספקת גישה אמינה ליצירת גידולים ניתנים לוויזואליים התומכים בהזרקה תוך-גידולית מדויקת וניתנת לשחזור ולניטור של קינטיקת הגדילה ותגובות טיפוליות. כאן אנו מציגים שיטה ניתנת לשחזור לקביעת וטיפול בגידולים תוך-עוריים באמצעות מודל המלנומה B16F10 בעכברי C57BL/6 כדוגמה. השעיית תאי הגידול מוזרקת לתוך העור, ו-7–10 ימים לאחר השתלת הגידול, כאשר הגידולים מגיעים לעומק ~60מ"מ 3, ניתן לבצע זריקה תוך-גידולית של חומרים מעוררי חיסון או טיפול פיזי כמו אלקטרופורציה או חימום. דבר זה מאפשר מתן טיפולים מדויק ומדידת גדילה באמצעות קליפרים, ומונע את האתגר של השונות הטבועה בטיפולים מרובים של גידולים תת-עוריים שאינם ניתנים לראות. על ידי מתן תובנות מפורטות על טכניקה זו, מאמר זה שואף לתמוך בשחזוריות ולקדם מחקר קדם-קליני באימונותרפיה תוך-גידולית.
מבוא
מודלים של גידולי עכברים מהווים כלי חיוני במחקר הסרטן. במודל עכבר אופטימלי, ניתן היה לשרות גידולים המדמים במידה רבה גידולים אנושיים הן ברמות גנטיות והן ברמות מורפולוגיות1. דבר זה מאפשר הערכה ויעילות של גישות טיפוליות חדשניות בתחומים שונים, כולל אימונותרפיה תוך-גידולית (ITIT). ITIT הוא תחום מתפתח בטיפול בסרטן, הכולל מתן תרופות מגרות חיסון ישירות למיקרו-סביבת הגידול (TME). אספקה מקומית זו יכולה לשפר את ההפעלה החיסונית המקומית, להפוך את המיקרו-סביבה המדכאת של הגידול החיסוני ולהפעיל תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות מערכתיות, הידועות כאפקט אבסקופלי2. עם זאת, היעילות, הדיוק והעקביות של מתן תוך-גידולי תלויים ביכולת לזהות ולשלוט בפרמטרי ההזרקה במודלים שונים של גידול.
רוב מחקרי הסרטן הפרה-קליניים משתמשים בהשתלת גידול תת-עורי. עם זאת, לגישה זו יש מגבלות לטיפולים תוך-גידוליים, שכן לא ניתן לראות את הגידול ישירות במהלך ההזרקה אלא אם מתבצע ניתוח. רבות מהאסטרטגיות האימונותרפיות התוך-גידוליות דורשות אספקה מדויקת של תגובות לגידולים קטנים בעכברים ולעיתים כוללות ביצוע משימה זו מספר פעמים. ללא אישור חזותי, דיוק ההזרקה ושימור התגובות בתוך גידולים תת-עוריים הופכים למשתנים שמקבלים שליטה לקויה. זה עלול לגרום לפרשנות שגויה/וריאציה של נתוני הניסוי3.
השתלת גידול תוך-עורי מספקת אלטרנטיבה ישירה, נגישה, ניתנת לראייה וניתנת לשחזור לתצפית, מדידה והזרקה תוך-גידולית, ובכך משפרת את העקביות. יתרה מזאת, מחקרים הראו שגידולים שהושתלו בעור, בניגוד להזרקות תת-עוריות, משפרים את האימונוגניות ומדכאים את הרגישות הגידולית של תאי הגידול4. גידולים שהוזרקו לתוך העור גרמו לתנועת תאי דנדריט מהירה וחזקה לבלוטות הלימפה, מה שהוביל להפעלה מוקדמת וחזקהיותר של תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים לגידול. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור לקביעת גידולי מלנומה תוך-עורית B16F10 בעכברים C57BL/6 ולביצוע טיפולים תוך-גידולי נוספים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בוצעו באישור ובהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC)5. כל ההליכים לבעלי חיים בוצעו במתקן החיות של דארטמות'. עכברים נקבות C57BL/6, בגילאי 6–8 שבועות, אוחסנו בתנאים סטנדרטיים על מדפים מאווררים עם אוכל ומים. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.
1. גילוח עכברים
הערה: כל הצוות חייב לעבור הכשרה מוסדית בטיפול בבעלי חיים והרדמה לפני ביצוע הליכים אלו.
- לפני ההזרקה הפנימית, יש לגלח את צדי כל עכבר כפי שמתואר להלן; הצד הימני שימש להזרקות ולפרוצדורות המתוארות. גלח את העכברים יום לפני הזרקת תאי הגידול.
- מקם את העכבר על משטח יציב. לטפו את העכבר בעור העורף עם האגודל השמאלי והאצבע המורה, ודחפו בעדינות את הצד השמאלי של הגוף לכף היד כדי לחשוף את הצד הימני. השתמשו בטבעת ו/או באצבע הקטנה כדי להחזיק את הרגל והזנב השמאליים, כדי לוודא שהצד הימני חשוף לחלוטין.
- גלח את הפרווה מהרגל האחורית ועד הצלעות התחתונות כדי ליצור אזור נקי להזרקה.
- ניתן לגלח את שני הצדדים אם נדרש מקום אימונים נוסף.
הערה: מתחילים יכולים להרדים עכברים כאשר הם לומדים לגלח ולסדר את העורף בצורה נכונה.
2. תרגול על הזרקות עם צבע
הערה: ניתן לבצע תרגול הן על עכברים חיים (מורדמים) והן על עכברים שהורדו, ועל שני המינים. עכברים זכרים בדרך כלל בעלי עור עבה ופחות גמיש לעומת נקבות, מה שהופך את התהליך למאתגר יותר מבחינה טכנית. לכן, תרגול על גברים מועיל לפיתוח מיומנות.
- מערבבים צבע מאכל עם תמיסת מלח מפופרת-פוספט (PBS) בצינור אפנדורף בנפח 1.5 מ"ל עד שהתמיסה נראית כהה (במחקר זה נעשה שימוש בצבע מאכל כחול).
- קבלו עכברי תרגול והרדימו אותם בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים המוסדיים.
- הניחו את העכבר המורדם מתחת לקונוס אף והטי את הגוף כדי לחשוף את הצד הימני. ודאו הרדמה מספקת על ידי צביטה עדינה על כרית הרגליים וצפייה בחוסר תגובה.
- טעין 30 מיקרוליטר של תמיסת צבע למזרק אינסולין בנפח 0.3 מ"ל עם מחט של 29 גרם וחצי אינץ'. הסר את כל בועות האוויר.
- בעזרת היד הלא דומיננטית, צבוט ומתח בעדינות את הרגל/העור כדי ליצור משטח חלק ומתוח (הימנע מהרמת העור כלפי מעלה). הכנס את המחט עם הקצה העליון לתוך הדרמיס בזווית מקבילה רדודה לעור. שמור על המחט גלויה מתחת לפני השטח כדי לאשר את מיקום העור.
הערה: במהלך האימון, בדוק תנוחות אחיזה שונות ביד כדי לשמור על מתח עור יציב תוך שמירה על האצבעות מחוץ למסלול המחט. הכנס את המחט ~2 מ"מ לתוך העור. כדי להפחית זרימה חוזרת, מכניסים את המחט ~3 מ"מ, ואז משכו מעט כדי ליצור "כיס" לפני ההזרקה. זה עוזר לשמור על הצבע במקום ההזרקה. - מזריקים לאט את כל 30 מיקרולטר תמיסת הצבע עד שנוצרת "בועה" קטנה ומובחנת מתחת לפני השטח של העור
הערה: היעדר בועות נראות לעין מרמז שההזרקה ניתנה תת-עורית ולא דרך העור. שמירה על השפעה כלפי מעלה מסייעת להבטיח מיקום מדויק של העור ומונעת הזרקה עמוקה מדי. - המשך לתרגל עד שנוצר בועות תוך-עוריות באופן עקבי. ניתן לבצע עד שש עד שמונה זריקות בכל צד.
- לאחר השלמת הזרקות תרגול, יש להמתים את העכברים בהתאם לפרוטוקולים המאושרים של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים (IACUC)5.
3. הכנת תאי גידול להזרקה
הערה: בצע את כל השלבים הקשורים לתאים במכסה סטרילי. שים לב שקווי גידול שונים של עכברים גדלים בצורה שונה.
- הפשרה של תאי גידול (B16F10 ששימשו במחקר זה) מספר ימים לפני ההזרקות לתוך-עור.
- תאי תרבית ל-70%–80% מפגש תוך שמירה על מדיה טרייה מספקת
הערה: יש להימנע ממפגש של 100%, שעוצר התרבות ופוגע בצמיחת הגידול. - קציר והכין תאים בגודל 7 x 106 תאים למ"ל ב-1x PBS, RPMI ללא סרום, או מדיום אחר המשמש לגידול התאים.
הערה: מודל הגידול B16F10 המשמש במעבדה משתמש ב-2 x 10תאים 5 ב-30 מיקרוליטר. נפח ההזרקה של 30 מיקרוליטר מתאים, אך ניתן להתאים את מספר התאים לפי הצורך כדי לקבוע את מודל הגידול הרצוי. התאים יתיישבו ויתאספו בתחתית הצינור, ולכן כדי להבטיח ריכוז התאים קבוע, ערבבו אותם בעדינות מדי פעם כדי לשמור אותם תלויים. - השאירו את התאים על הקרח לאחר העיבוד והתקדמו במהירות להזרקה. אחסון ממושך על קרח מפחית את חיוניות התאים, מה שעלול להפחית את מספר התאים החיים המועברים ולהשפיע לרעה על הקמת הגידול6.
הערה: תאים נקצרים ומשמשים מיד במעבדה. ההזרקות מתבצעות תוך 20–60 דקות מעיבוד התאים והנחתם על הקרח. השתמש בשותף כשאתה עובד עם קבוצות גדולות כדי למזער את הזמן על הקרח.
4. הזרקות לתוך העור
- הרדמו עכברים ניסיוניים.
הערה: המעבדה משתמשת בהרדמה עם גז איזופלורן, אך ניתן להשתמש בהרדמה בהזרקה. - לאחר השראת ההרדמה, מניחים את העכבר מתחת לקונוס אף וממקמים את הגוף כך שיחשוף במלואו את הצד הימני.
- הפוך בעדינות את מתלי התא כדי להבטיח ערבוב אחיד.
- משוך 30 מיקרוליטר של תליית תא למזרק של 0.3 מ"ל עם מחט 29 G, 1/2". הסר בועות אוויר.
- בעזרת היד הלא דומיננטית, מתח בעדינות את הרגל/העור לצד כדי להפוך אותו לחלק ומהודק (אל תרים אותו כלפי מעלה). הכנס את המחט בזווית מקבילה רדודה לתוך הדרמיס. המחט צריכה להישאר גלויה מתחת לעור, מה שמראה שהיא לא עמוקה מדי.
הערה: עומק המחט צריך להיות ~2 מ"מ לתוך העור. כדי למנוע זרימה לאחור של התאים, הכניסו את המחט ~3 מ"מ לעור, משכו את המחט מעט לאחור כדי ליצור "כיס" שבו יש להזריק את התאים. זה מפחית משמעותית את הזרימה החוזרת. - הזריקו לאט מאוד את כל 30 המיקרוליטר של תליית התא עד שנוצר "בועה" קטנה ונראית מתחת לעור. המתינו 5–10 שניות לפני הסרת המחט.
הערה: הסרת המחט מהר מדי עלולה לגרום לתמיסה לצאת מהעור בגלל הלחץ. - חזור על זה עבור כל עכבר. החלף מזרקים לאחר כל כלוב (4–5 עכברים) כדי למנוע קהות מחטים.
- עקוב אחרי כל העכברים עד שיתאוששו לחלוטין מההרדמה.
- עקבו אחרי עכברים לאיתור התבססות גידולים.
5. הזרקות תוך-גידוליות
הערה: הגידולים בדרך כלל מוכנים לטיפול 7–10 ימים לאחר ההשתלה, כאשר הם מגיעים לגודל המתאים. הגודל המתאים במעבדה הוא ~50 מ"מ 3 ומעלה לפי הנוסחה: נפח = (אורך/2) * (רוחב*רוחב)7,8.
- הכינו מראש את כל פתרונות הטיפול (למשל, במחקר זה נעשה שימוש ב-1x PBS). השאירו תמיסות על קרח או בטמפרטורת החדר בהתאם לטיפול הספציפי.
- השרה הרדמה לפי הנחיות מוסדיות.
- הניחו את העכבר מתחת לקונוס אף לשמירה על ההרדמה, ומקמו אותו כך שהגידול יהיה חשוף.
- משוך את הנפח הנדרש (למשל, 30 מיקרוליטר בשימוש כאן) לתוך מזרק אינסולין של 0.3 מ"ל עם מחט של 29 G, 1/2". הסר בועות אוויר.
הערה: הנפח ישתנה בהתאם לטיפול המועדף ולתנאים האופטימליים. - הכנס את המחט אופקית לגידול והתקדמו לעבר מרכז גוש הגידול.
הערה: הימנעו מהחדרה מלמעלה או בזווית תלולה, שכן הדבר עלול לגרום להזרקה להיכנס עמוק מדי או לרקמה הסובבת. הטיפול המתואר ניתן כהזרקה אחת. המינונים והתדירות תלויים בטיפול המועדף ובתנאים האופטימליים. בגידולים קטנים, מנה אחת מספקת להפצת הטיפול, אך בגידולים גדולים יותר, ייתכן שיהיה צורך במספר זריקות כדי לחלק את הטיפול באופן שווה דרך גוש הגידול. - הזריק את הטיפול לאט ובעקביות. עצרו 10 שניות לפני שמושכים לאט את המחט כדי למזער זרימה חוזרת או דליפה. חלק מהגידולים בעלי לחץ פנימי גבוה, ויש להיזהר שהזריקה לא דולפת דרך חור המחט.
- חזור על התהליך עבור כל עכבר. החלפת מזרקים לאחר כל כלוב של 4–5 עכברים ובעת החלפת קבוצות טיפול כדי למנוע זיהום צולב.
- עקוב אחרי עכברים לאחר ההרדמה עד שישבו לניידות ולנשימה תקינה. המשך במעקב יומי אחר תגובת הטיפול והבריאות הכללית.
הערה: שימו לב שקווי תאים שונים עלולים לגרום לגידולים להיווצר בזמנים שונים. לכל ניסוי ולכל פרוטוקול של IACUC יש נקודות קצה וקריטריונים ברורים להוצאה. במעבדה, נקודות הקצה לניסויים בעכברים הן 1500 מ"מ מעוקב וכיבים שמתרחשים מתקבלים ואינם מודרים מהמחקר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעת תרגול הזרקות עם צבע, ניתן לאמת מתן מוצלח לתוך-עור ללא המתת חסד לעכבר על ידי צפייה ביצירת "בועה" נראית לעין באתר ההזרקה. הזרקה תוך-עורית מבוצעת כראוי יוצרת "בועה" גדולה, מוגדרת היטב ומורמת (איור 1A–F). בועות קטנות או שטוחות מרמזות שהזריקה עשויה להיות חלקית תת-עורית. אם לא נוצרת "בועה" והצבע או התאים מתפשטים מתחת לעור, ההזרקה ככל הנראה הייתה תת-עורית (איור 1G–J). אם בעלי החיים עוברים המתת חסד ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הצלחת הפרוטוקול הזה (איור 4) תלויה בשמירה על עומק הזרקה תוך-עורי עקבי ומיקום מדויק של המחטים, כדי להבטיח את ההעברה לתוך הדרמיס ולא לשכבה התת-עורית. אם זווית המחט תלולה מדי או לחץ ההזרקה גבוה מדי, תאי הצבע או הגידול עלולים להיזרם דרך העור אל החלל התת-עורי. לאחר ההזרקה, הפסקה קצרה לפני משיכת המחט באיטיות מסייעת במניעת דליפה או היווצרות גידולים כפולים (מראה "איש שלג") בצד. בעת תרגול הזרקות וטיפול בעכברים, תמיד שמרו על אחיזה בטוחה שממזערת את הסיכון לדקירה מקרית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
AS מכירה במענק ההכשרה לאימונולוגיה, T32 AI007363. KSK מודה בהכרת תודה לקרן שלומברגר על תמיכתה בה דרך תוכנית הסגל לעתיד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | איזופלוראן |
| Food Coloring | Durkee | לתרגול | |
| Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | גוזזים לגילוח העכברים |
| PBS, 1X w/o calcium & magnesium | Corning | 06325002 | pH 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | מכשיר הרדמה |
מקורות
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
