פרוטוקול מחקר זה נועד לחקור באופן שיטתי את ההשפעות הקונדרוהגנתיות הפוטנציאליות של תמצית Fructus Xanthii באוסטיאוארתריטיס באמצעות ניתוחים משולבים של מולטי-אומיקס וניסויים ב-in vivo .
מאמר מחקר
* These authors contributed equally
פרוטוקול מחקר זה נועד לחקור באופן שיטתי את ההשפעות הקונדרוהגנתיות הפוטנציאליות של תמצית Fructus Xanthii באוסטיאוארתריטיס באמצעות ניתוחים משולבים של מולטי-אומיקס וניסויים ב-in vivo .
אוסטיאוארתריטיס (OA) היא הפרעה ניוונית מתקדמת במפרקים, שבה התערבויות פרמקולוגיות וכירורגיות קיימות מקלות בעיקר על התסמינים ולא הופכות את השינויים הפתולוגיים הבסיסיים, מה שמדגיש את הצורך הדחוף בתרופות טיפוליות חדשניות. פרוטוקול זה נועד לחקור את ההשפעות הכונדרופרופטריות האפשריות של תמצית Fructus Xanthii נגד OA. ראשית, פרופילינג מטבולומי לא ממוקד בוצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה (UHPLC-HRMS/MS) לאפיון המרכיבים הכימיים של התמצית. אסטרטגיה משולבת שילבה פרמקולוגיה רשתית וכרייה טרנסקריפטומית יושמה לזיהוי רכיבים ביואקטיביים ומטרות משוערות של התמצית, ולאחר מכן ניתוח צולב עם גנים לא מרוסנים הקשורים ל-OA כדי להשיג גנים ליבה של המטרה. אונטולוגיית גנים (GO) וניתוחי העשרה של אנציקלופדיה קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) בוצעו כדי לתאר את התהליכים הביולוגיים המרכזיים ומסלולי האיתות המווסתים על ידי התמצית. לצורך אימות in vivo , נעשה שימוש במודלים של פגיעות סחוס דגי זברה ומודלים של OA בעכברים להערכת ההשפעות הכונדרופרוטקטיביות של התמצית. ריצוף RNA (RNA-seq) אומץ נוסף לניתוח שינויים טרנסקריפטומיים בכונדרוציטים לאחר הטיפול, תוך התמקדות במסלולים הקשורים ל-OA ובפרופילי ביטוי גנים; לאחר מכן בוצעה בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים (ELISA) כדי לאמת את רמות הביטוי של חלבונים/קולטנים מרכזיים שנבדקו על ידי RNA-seq, במטרה לאשר עוד יותר את ההשפעות הרגולטוריות של תמצית Fructus Xanthii על מטרות ליבת OA. פרוטוקול מולטי-אומיקס וניסוי משולב זה מספק גישה שיטתית לחקר הפוטנציאל של תמצית Fructus Xanthii כמועמד בוטני מבטיח להתערבות OA.
אוסטיאוארתריטיס (OA) היא הפרעה ניוונית במפרקים המתאפיינת בהדרדרציה הדרגתית של סחוס המפרקים, טרשת עצם תת-כונדרלית, דלקת סינוביאלית והיווצרות אוסטאופיטים1. לפי מחקר Global Burden of Disease (GBD), שכיחות OA עלתה בהתמדה ב-204 מדינות וטריטוריות בין השנים 1990–2020, כאשר מגמה זו צפויה להאיץ יחד עם הזדקנות דמוגרפית עולמית3. הערכות עדכניות מצביעות על כך שיותר מ-250 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים, מה שיוצר עומס משמעותי על רווחת הפרט, מערכות הבריאות והמבנים הסוציו-אקונומיים4. הטיפולים הנוכחיים מכוונים בעיקר להקלה על תסמינים, כאשר תרופות נוגדות דלק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הניסויים שכללו דגימות קליניות ועכברים בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הסקירה האתית של מרכז המחקר הביוטכנולוגי הרפואי של מחוז שאנדונג. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.
1. בידוד ותרבות של כונדרוציטים מפרקים אנושיים
דגימות סחוס מפרקי אנושי נאספו ממטופלים שעברו ניתוח ארתרוסקופי או ארתרופלסטיה מלאה במפרק בבית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת שאנדונג הרפואית הראשונה. פרוסות סחוס הועברו למעבדה על קרח בתוך 30 דקות מהכריתה הכירורגית. הרקמה נשטפה היטב עם תמיסת מלח דולבקו הקרירה עם בופר הפוספט (DPBS; 3–5 שטיחות), ואז פורקה דק לחל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הערכת איכות ונוף מטבולי של נתוני LC-MS/MS לא ממוקדים
דגימות QC הראו שכפול מצוין, כפי שמעידים כרומטוגרמות TIC חופפות מאוד הן במצב יונים חיובי והן שלילי, כאשר סטיית זמן השמירה נותרה מתחת ל-0.05 דקות לאורך כל האצווה האנליטית. הנתונים הגולמיים עברו עיבוד מקדים מבוסס XCMS, שכלל זיהוי שיא, אינטגרציה ויישור זמן שימור. מטבוליטים משוערים הוסמכו על ידי התאמת מסה מדויקת (≤5 ppm), דפוסי איזוטופים וספקטרום איכותי של MS/MS מול ספריית ספקטרום פנימית. לאחר סינון קפדני ונרמול TIC, נשמרו 2,179 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
OA היא הפרעה ניוונית נפוצה במפרקים ואחת הסיבות המובילות לנכות ברחבי העולם.36. הפתוגנזה שלו מורכבת ורב-גורמית, הכוללת שינויים ביוכימיים, תאיים ומולקולריים ברקמות המפרק. בעבר נחשבה לתופעת "שחיקה ושחיק" פשוטה של סחוס מפרקי, אך כיום ידועה באופן נרחב כמחלה כרונית של כל המפרק המאופיינת בפירוק סחוס, דלקת סינוביאלית, היווצרות אוסטאופיטים ועיצוב מחדש של עצם תת-כונדרלית 37,38,39. ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או מערכות יחסים אישיות שיכולות להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.
מחקר זה נתמך כלכלית על ידי מענק פרויקט פני השטח של קרן הטבע של מחוז שאנדונג (מס' ZR2024MH088), פרויקט טכנולוגיית הרפואה הסינית המסורתית של מחוז שאנדונג (מס' 2020M070), וקרן גידול של בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת הרפואה הראשונה של שאנדונג ובית החולים הפרובינציאלי צ'יאנפושאן של שאנדונג (מענק מס' QYPY2022NSFC0601)".
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp, סין | BL539A | pH 7.4, סטרילי |
| עכברי C57BL/6 | Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, סין | N/A | זכר, בגיל 8-10 שבועות, 20-25 גרם |
| כונדרואיטין סולפט | MCE, אמריקה | HY-B2162 | טוהר ≥98% |
| ClusterProfiler (חבילת R) | Bioconductor | גישה חופשית | משולבת ב-R v4.2.2 |
| קולגנאז, סוג II, אבקה | Gibco, אמריקה | 17101015 | ≥125 U/mg |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | גישה חופשית (https://cytoscape.org/) | גרסה 3.9.1 (עם CytoHubba) |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | גישה חופשית | גרסה 3.9.1 |
| DESeq2 (חבילת R) | Bioconductor | גישה חופשית | משולבת ב-R v4.2.2 |
| DMEM, גלוקוז גבוה | Gibco, אמריקה | 11965092 | מדיום סטרילי |
| אתנול | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, סין | 10009218 | דרגת ניתוח, 95% |
| אתיל אצטט | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, סין | 10009418 | דרגת ניתוח |
| סרום עובר בקר (FBS) | Cellmax, סין | SA102.02 | מופעל בחום |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Nikon, יפן | Eclipse Ti2-U | מצויד במסנן GFP (עירור 488nm) ומצלמה דיגיטלית |
| מאגר GEO | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r | כלי ניתוח GEO2R |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC, אמריקה | מסחרי | גרסה 9.5.1 |
| ערכת צביעת Hematoxylin-Eosin(HE) | Solarbio, סין | G1120 | ערכה מוכנה לשימוש |
| מאגר HERB | האקדמיה הסינית למדעים | http://herb.ac.cn/ | גרסה 2.0 |
| ערכת ELISA ל-MMP-1 אנושי | Yamei Biotechnology, סין | HJ088 | לאדם, צלחת 96 באר |
| ערכת ELISA לרצפטור פרוגסטרון אנושי (PR) | Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., סין | ml05997 | לאדם, צלחת 96 באר |
| ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) | גישה חופשית | גרסה 1.53t |
| מיקרוסקופ אור | Olympus, יפן | BX53 | אובייקטיבים 10×/20× ומצלמה דיגיטלית |
| ליאופיליזר | Christ, גרמניה | Alpha 1-4 LDplus | מערכת ייבוש קר |
| ערכת צביעת Saffron-O ו-Fast Green שונה | Solarbio, סין | G1371 | לצביעת עצם/סחוס |
| בלזם נייטרלי | Solarbio, סין | G8590 | מדיום הרכבה |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco, אמריקה | 15070063 | 100×, סטרילי |
| מלח זרחן מאוזן (PBS) | Sparkjade, סין | CR0013-500ML | pH 7.2-7.4, סטרילי |
| תוכנת R | קרן R לחישוב סטטיסטי | גישה חופשית (https://www.r-project.org/) | גרסה 4.4.1 (עם ggvenn) |
| מדיום הקפאה תאי ללא סרום | Biosharp, סין | BL203B | סטרילי |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 25923 | זן סטנדרטי |
| מאגר STRING | STRING Consortium | https://string-db.org/ | ניתוח אינטראקציה חלבונית |
| מאגר TCMID | Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center | https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php | גרסה 3.0 |
| דג זברה Tg(col2a1a:EGFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | N/A | זחלים (2 dpf), זן AB |
| נוזל TRIzol | Thermo Fisher, אמריקה | 15596018CN | לחילוץ RNA סה"כ |
| טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום | Gibco, אמריקה | 25200056 | תמיסה סטרילית |
| כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC) | Thermo Fisher, אמריקה | Q Exactive Focus | מחובר עם HRMS/MS |
| XCMS-online | מכון המחקר Scripps | גישה חופשית | פלטפורמת אינטרנט |
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה