מאמר מחקר

פרוקטוס קסנתי תמצית מקלה על אוסטאוארתריטיס על ידי שמירה על שלמות הסחוס

DOI:

10.3791/70284

⸱

12 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 2Biomedical Sciences College & Shandong Medicinal Biotechnology Centre, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 3Neck-Shoulder and Lumbocrural Pain Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences, 4Central Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מחקר זה נועד לחקור באופן שיטתי את ההשפעות הקונדרוהגנתיות הפוטנציאליות של תמצית Fructus Xanthii באוסטיאוארתריטיס באמצעות ניתוחים משולבים של מולטי-אומיקס וניסויים ב-in vivo .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא הפרעה ניוונית מתקדמת במפרקים, שבה התערבויות פרמקולוגיות וכירורגיות קיימות מקלות בעיקר על התסמינים ולא הופכות את השינויים הפתולוגיים הבסיסיים, מה שמדגיש את הצורך הדחוף בתרופות טיפוליות חדשניות. פרוטוקול זה נועד לחקור את ההשפעות הכונדרופרופטריות האפשריות של תמצית Fructus Xanthii נגד OA. ראשית, פרופילינג מטבולומי לא ממוקד בוצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה (UHPLC-HRMS/MS) לאפיון המרכיבים הכימיים של התמצית. אסטרטגיה משולבת שילבה פרמקולוגיה רשתית וכרייה טרנסקריפטומית יושמה לזיהוי רכיבים ביואקטיביים ומטרות משוערות של התמצית, ולאחר מכן ניתוח צולב עם גנים לא מרוסנים הקשורים ל-OA כדי להשיג גנים ליבה של המטרה. אונטולוגיית גנים (GO) וניתוחי העשרה של אנציקלופדיה קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) בוצעו כדי לתאר את התהליכים הביולוגיים המרכזיים ומסלולי האיתות המווסתים על ידי התמצית. לצורך אימות in vivo , נעשה שימוש במודלים של פגיעות סחוס דגי זברה ומודלים של OA בעכברים להערכת ההשפעות הכונדרופרוטקטיביות של התמצית. ריצוף RNA (RNA-seq) אומץ נוסף לניתוח שינויים טרנסקריפטומיים בכונדרוציטים לאחר הטיפול, תוך התמקדות במסלולים הקשורים ל-OA ובפרופילי ביטוי גנים; לאחר מכן בוצעה בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים (ELISA) כדי לאמת את רמות הביטוי של חלבונים/קולטנים מרכזיים שנבדקו על ידי RNA-seq, במטרה לאשר עוד יותר את ההשפעות הרגולטוריות של תמצית Fructus Xanthii על מטרות ליבת OA. פרוטוקול מולטי-אומיקס וניסוי משולב זה מספק גישה שיטתית לחקר הפוטנציאל של תמצית Fructus Xanthii כמועמד בוטני מבטיח להתערבות OA.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא הפרעה ניוונית במפרקים המתאפיינת בהדרדרציה הדרגתית של סחוס המפרקים, טרשת עצם תת-כונדרלית, דלקת סינוביאלית והיווצרות אוסטאופיטים1. לפי מחקר Global Burden of Disease (GBD), שכיחות OA עלתה בהתמדה ב-204 מדינות וטריטוריות בין השנים 1990–2020, כאשר מגמה זו צפויה להאיץ יחד עם הזדקנות דמוגרפית עולמית3. הערכות עדכניות מצביעות על כך שיותר מ-250 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים, מה שיוצר עומס משמעותי על רווחת הפרט, מערכות הבריאות והמבנים הסוציו-אקונומיים4. הטיפולים הנוכחיים מכוונים בעיקר להקלה על תסמינים, כאשר תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) ותוספי ויסקופולציה תוך-מפרקיים עם חומצה היאלורונית (HA) הן ההתערבויות הנפוצות ביותר. עם זאת, גישות אלו מציעות תועלת קלינית מוגבלת וקשורות לתופעות לוואי משמעותיות 5,6. דבר זה מדגיש את הצורך הקריטי בתרופות יעילות לשינוי מחלה (DMOADs).

רפואה סינית מסורתית (TCM) משמשת זמן רב בניהול OA, ומבוססת על המושג "bone bi", תת-סוג של "תסמונת bi"7. במסגרת זו, הפתוגנזה של OA מיוחסת בעיקר לחסר בתמצית הכבד והכליה, חוסר צ'י ודם, ופלישה נלווית של רוח, קור ולחות8. בהתאם לכך, האסטרטגיות הטיפוליות מתמקדות בפיזור לחות הרוח, פיזור קור ופתירת החסימה הנלווים9. טיפולי הרפואה הסינית הסינית ידועים בהשפעותיהם הרב-מטריות, פרופילי תופעות לוואי חיוביים ויעילות קלינית משמעותית10. נוסחאות בולטות כמו Buqi Tongluo Capsule (BQTL) ו-Fuzi Decoction (FZD) הראו השפעות ברורות נגד OA בפרקטיקה קלינית, בעוד Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) מקל על תסמיני OA על ידי דיכוי מסלול הדלקתי NLRP3, הנתמך על ידי מאות שנים של שימוש אמפירי. באופן דומה, תערובת Shenjinhuoxue (SHM) מפחיתה כאב וניוון סחוס באמצעות הפחתת ויסות של מתווכים פרו-דלקתיים כמו IL-1β ו-TNF-α 11,12,13. ברמת המונומר, דווח כי תרכובות כמו איקרין (ציאנוזיד A, CyA) ואריאנין, שמקורן בצמחי מרפא, מעודדות התרבות כונדרוציטים, מעכבות שחרור ציטוקינים דלקתיים ושומרות על הומאוסטזיס מפרקי14,15. ביחד, הרפואה הסינית הסינית מציעה גישה טיפולית מקיפה עם תכונות אנטי-דלקתיות, כונדרופרוטיביות ומקלה על תסמינים. עם זאת, המורכבות של המנגנונים והסוגיות הקשורות לסטנדרטיזציה מחייבות מחקר מתמשך ומעמיק.

פירות הבשלים והמיובשים של Fructus Xanthii (קומפוזיטה), הידועים בכינוי "קאנג-אר-זי", תועדו כבעלי מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות, כולל השפעות אנטי-מיקרוביאליות, נוגדות דלקת, נוגדות חמצון, משככי כאבים, אנטי-נאופלסטיים ומודולטוריות חיסוניות. חומצות פנוליות שבודדו מ-Fructus Xanthii מפחיתות ביעילות היפרפלזיה סינוביאלית בדלקת מפרקים שגרונית. מבין אלה, חומצה כלורוגנית (CGA), נגזרת מייצגת של חומצה קפואילקווינית, נמצא כמעודדת התרבות והבדלות של האוסטאובלסטים תוך עיכוב אוסטאוקלסטוגנזה המתווכת על ידי RANKL, ובכך שומרת על הומאוסטזיס שלדי18. חומצות פנוליות נוספות שזוהו באותה תמצית, כגון חומצה ניאוכלורוגנית (5-CQA), חומצה קריפטוכלורוגנית (CCA) וחומצה פרוטוקטכואית, מציגות גם הן תכונות אנטימיקרוביאליות, אנטי-דלקתיות, אנטי-גידוליות וחמצות חמצון 19,20,21. בנוסף לחומצות פנוליות, מגוון מטבוליטים משניים הנמצאים בקאנג-אר-זי תורמים לפעילות הביולוגית 16,20,22,23,24,25. עם זאת, התפקיד המדויק והמנגנונים הבסיסיים של תמצית Fructus Xanthii ב-OA נותרו ברובם לא נחקרים.

כרומטוגרפיה נוזלית לא ממוקדת - ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) מטבולומיקה מאופיינת ביכולות כיסוי גלובלי ללא השערות, במהירות העברה גבוהה. היא מאפשרת זיהוי בו-זמני של אלפי תכונות מטבוליטיות, מספקת תצפית פנורמית על רשתות מטבוליות, ומאפשרת גילוי שיטתי של סמנים ביולוגיים חדשים ונתיבי מטבול חריגים ללא הגדרת יעד מוקדמת26,27. בשילוב עם טכנולוגיית ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה, גישה זו מתאימה לניתוח מקיף של סוגים שונים של דגימות ביולוגיות (למשל, סרום, נוזל סינוביאלי, שתן, רקמת סחוס וכו') והוכיחה יתרונות משמעותיים במחקר אוסטאוארתריטיס (OA). מצד אחד, הוא יכול לסנן באופן מקיף מטבוליטים דיפרנציאליים הקשורים קשר הדוק להתפתחות הפתולוגית של OA (כגון סוגים שונים של מטבוליטים שזוהו בנוזל סינוביאלי וברקמות סינוביאליות) ולמפות אותם למסלולים מרכזיים, כולל מטבוליזם אנרגיה, תיקון סחוס, אוסטאוגנזה ומטבוליזם של שומנים, ובכך להעמיק את ההבנה של פתוגנזה של OA. מצד שני, שילוב נתוני מולטי-אומיקס כגון טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה מסייע לחשוף את תפקיד התכנות מחדש המטבולי בניונות סחוס, תגובות דלקתיות ונזק למבנה המפרקים, ומספק ראיות קריטיות לזיהוי סמנים ביולוגיים אבחנתיים מוקדמים, הערכת התקדמות המחלה ופיתוח אסטרטגיות התערבות מטבולית ממוקדת (למשל, ויסות מטבוליזם של חומצת מרה, טריפטופן או חומצות שומן), תוך הדגשת הפוטנציאל התרגומי שלה ב מחקר על הקלדה מדויקת של OA וטיפול מותאם אישית.

דג הזברה משמש כאורגניזם מודל מצוין בזכות יתרונות רבים: הגנום שלו שמור מאוד עם זה של בני אדם, וחולק הומולוגיה עם כ-70% מהגנים המקודדים לחלבון אנושי28,29. הוא מציג תכונות מרכזיות הכוללות התפתחות מהירה, הפריה חוץ-גופית, עוברים שקופים המאפשרים הדמיה נוחה ב-vivo, פוריות גבוהה ועלויות תחזוקה נמוכות 30,31,32,33. במחקר שלד, דגי זברה מאפשרים הדמיה ברורה של היווצרות עצם, תהליכי מינרליזציה ויכולת התחדשות, וניתן להשתמש בהם לסימולציה של מצבים פתולוגיים כמו אוסטאופורוזיס ונזק לסחוס. עם זאת, במחקר אוסטיאוארתריטיס (OA), הפרעה מורכבת של כל המפרק המאופיינת בנייוון סחוס מפרקי, דלקת סינוביאלית ושינויים בעצם תת-כונדרלית, יישום מודל דג הזברה נותר מוגבל יחסית.

מאמר זה מציג פרוטוקול המשלב מטבולומיקה לא ממוקדת מבוססת UHPLC-HRMS/MS, פרמקולוגיה רשתית, כרייה טרנסקריפטומית ואימות ניסויי in vivo כדי לחקור את הפוטנציאל של תמצית Xanthium sibiricum כמועמדת לצמח יעיל להתערבות OA. המטרה אינה רק לזהות את הרכיבים הביואקטיביים, היעדים הפוטנציאליים והמסלולים הרגולטוריים המרכזיים של תמצית Xanthium sibiricum הקשורים ל-OA באמצעות אינטגרציה מולטי-אומיקס וניתוח חישובי, אלא גם לאמת את השפעתו הכונדרו-מגן על OA באמצעות מודלים in vivo ולהבהיר עוד יותר את מנגנון הרגולציה שלו על טרנסקריפטום כונדרוציטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים שכללו דגימות קליניות ועכברים בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הסקירה האתית של מרכז המחקר הביוטכנולוגי הרפואי של מחוז שאנדונג. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. בידוד ותרבות של כונדרוציטים מפרקים אנושיים

דגימות סחוס מפרקי אנושי נאספו ממטופלים שעברו ניתוח ארתרוסקופי או ארתרופלסטיה מלאה במפרק בבית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת שאנדונג הרפואית הראשונה. פרוסות סחוס הועברו למעבדה על קרח בתוך 30 דקות מהכריתה הכירורגית. הרקמה נשטפה היטב עם תמיסת מלח דולבקו הקרירה עם בופר הפוספט (DPBS; 3–5 שטיחות), ואז פורקה דק לחלקים בגודל של כ-1 מ"מ 3 באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים. בוצעה עיכול אנזימטי רציף, שהחל מעיכול מוקדם באמצעות טריפסין-EDTA של 0.25% למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תהליך העיכול נבדק עד שחלקי הסחוס התקרבו, הצטמצמו והפכו לשקופים, ולאחר מכן נאספו על ידי צנטריפוגה (200 × גרם, 5 דקות) בטמפרטורת החדר. לאחר מכן בוצעה עיכול לילה (8 שעות, 37 מעלות צלזיוס) עם 0.2% קולגנאז מסוג II תחת ערבוב עדין מתמשך. תהליך העיכול נעקב עד שכל שברי הסחוס הנראים במאקרוסקופית נמסו לחלוטין. התאים ששוחררו נאספו בצנטריפוגציה (200 × גרם, 5 דקות) בטמפרטורת החדר, הושעו מחדש ב-DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, והוזרעו לבקבוקי תרבית בגודל 75 ס"מ2 . התאים נשמרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה לחה שמכילה 5%CO2. כונדרוציטים דביקים נותקו באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA, והתאים עברו תת-תרבית ביחס של 1:3 כאשר התאים הדבוקים הגיעו למפגש של 80% משטח בקבוק התרבית.

2. הכנת תמצית Fructus Xanthii

פירות מיובשים בשלים של Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) נאספו מאוכלוסיות טבעיות בצפון סין ואומתו על ידי פרמקוגנוזיס בכיר. הדגימה הונחתה בהרבריום של אוניברסיטת שאנדונג הראשונה לרפואה. 20 גרם של Fructus Xanthii אבקה דק הוכנסו לאצבעון חילוץ, והפקת סוקסלט ממצה בוצעה באמצעות 95% אתנול (כ-250 מ"ל) עד להשלמת שבעה עד שמונה מחזורי סיפון. התמצית האתנולית עברה סינון, והסינון ריכז עד יובש בלחץ מופחת בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס באמצעות אידוי סיבובי. השאריות שנוצרו הושעו מחדש ב-60 מ"ל מים מזוקקים כפול וחולקו ברצף עם 60 מ"ל אתיל אצטט במשפך מפריד. התערובת ניערה בעוצמה ואפשרה לעבור הפרדת פאזה בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות. השכבה המימית נאספה, עברה ליופיליזציה ואוחנה בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

3. זרימת עבודה סטנדרטית למטבולומיקה של LC-MS/MS לא ממוקדת

  1. ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת מבוסס UHPLC-HRMS/MS
    פרופילינג מטבולומי לא ממוקד בוצע על פלטפורמת ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC-HRMS/MS). מטבוליטים נכבדו במהירות והופקו באמצעות מערכת מתנול–מים מקוררת. הפרדה כרומטוגרפית הושגה במערכת UHPLC המצוידת בעמוד כרומטוגרפי C18/T3 (100 × 2.1 מ"מ, 1.8 מיקרומטר) שנשמר בטמפרטורה של 40°C. גרדיאנט בינארי (0–28 דקות) הכולל 0.1% חומצה פורמית במים (A) ו-0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל (B) הוחל בקצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה. זיהוי ספקטרומטרי מסה בוצע על מכשיר היברידי מרובע-קוטבי Orbitrap שהופעל במצב MS/נתונים MS2 (MS/dd-MS2 מלא) עם החלפת קוטביות, עם טווח סריקה מלא של m/z 70–1,050 ורזולוציה של 120,000 (FWHM ב-m/z 200). פיצול התנגשות באנרגיה גבוהה (HCD) בוצע בתדרים של 20, 40 ו-60 eV, כאשר הדרה דינמית מוגדרת ל-10 שניות.
  2. הנתונים הגולמיים הומרו לפורמט mzXML באמצעות ProteoWizard. בחירת שיא, יישור זמן שמירה ודה-איזוטופינג בוצעו ב-XCMS Online באמצעות פרמטרים מותאמים ל-HRMS (ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6). מאפיינים שכללו יותר מ-50% ערכים חסרים בין דגימות הוצאו, ואזורי השיא הנותרים ננורמו לזרם היונים הכולל (TIC). המטבוליטים סומנו על ידי התאמת מסה מדויקת, ספקטרום MS2 וזמן שמירה לספריית ייחוס פנימית באמצעות סבילות לשגיאות מסה של ≤ 5 ppm וסף ציון נקודתי-מכפלה של ≥80.
    הערה: נהלי הפעלה סטנדרטיים מחמירים נשמרו לאורך כל תהליך העבודה. הדגימות הוקפאו מיד לאחר האיסוף, הוקפאו בחנקן נוזלי (−80 מעלות צלזיוס) לאחר האיסוף, הועברו באמצעות שרשרת קרח יבש, ועובדו באמצעות הליכי חילוץ אקראיים, הזרקה ואצאיות. דגימות בקרת איכות (QC) מאוחדות הוכנסו לאחר כל 10 דגימות מחקר כדי לעקוב אחרי נדידת המכשירים.

4. ניתוח פרמקולוגיה רשתית

  1. סקר מבוסס פרמקולוגיה רשתית של תרכובות פעילות וחיזוי מטרות
    הרכיבים הפעילים של Fructus Xanthii נאספו ממסד הנתונים TCMID (https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php) וממסד הנתונים HERB (http://herb.ac.cn/). התרכובות שנאספו סוננו לפי סף ADME המומלץ של זמינות ביולוגית דרך הפה ≥30% ודומה לתרופה ≥0.18). היעדים האנושיים החזויים של התרכובות המוסמכות התקבלו משני מאגרי הנתונים. תוצאות הסקר נאספו ונאספו, מה שהוביל לזיהוי 15 תרכובות פעילות ו-151 מטרות חלבון ייחודיות הקשורות ל-Fructus Xanthii.
  2. אינטגרציה של נתוני טרנסקריפטומיה וזיהוי מטרות ליבה הקשורות ל-OA
    גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) ברקמות סחוס בין דגימות תקינות לאוסטיאוארתריטיס (OA) הופקו ממאגרי הנתונים של מסד הנתונים GEO GSE51588 (n = 5 נורמלי, 6 OA) ו-GSE169077 (n = 10 נורמלי, 40 OA) באמצעות כלי האינטרנט GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r). גנים מורחבים ב-OA הוגדרו באמצעות קריטריונים של שינוי קיפול log2 >0.5 וערך p מותאם <0.05. החיתוך בין גנים מוגברים על ידי OA לבין 151 מטרות חלבון הקשורות ל-Fructus Xanthii הוצג באמצעות חבילת R ggvenn. רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) של מטרות החיתוך נבנו באמצעות מאגר הנתונים STRING (https://string-db.org/). נתוני רשת ה-PPI יובאו ל-Cytoscape, ועשרת הגנים המרכזיים של המרכז נבדקו לניתוח העשרה פונקציונלית לאחר מכן באמצעות תוסף CytoHubba עם אלגוריתם MCC.

5. קביעת ריכוז מרבי נסבל (MTC) בדגי זברה

זחלי דג זברה טרנסגניים (Tg col2a1a:EGFP) ביומיים לאחר ההפריה (2 DPF) חולקו באקראי ללוחות בעלי 6 בארות בצפיפות של 30 זחלים בכל באר. כל באר הושלמה ב-3 מ"ל מדיום חשיפה המכיל תמצית Fructus Xanthii מדוללת באופן סדרתי. זחלים מתים או מתים הוסרו מדי יום. הזחלים נחשפו ברציפות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, ולאחר מכן נקבע הריכוז המקסימלי הנסבל (MTC) כרכוז הגבוה ביותר שבו תמותת הזחלים לא עלתה על 10%.

6. הקמת מודל פגיעות עצם דג הזברה

Tg col2a1a:זחלי דגי זברה EGFP לאחר ההפריה (2 dpf) חולקו לארבע קבוצות: ביקורת, מודל, כונדרויטין סולפט (CS) ביקורת חיובית, וטיפול בתמצית Fructus Xanthii . כל הקבוצות למעט קבוצת הביקורת נחשפו לסטפילוקוקוס אוראוס (OD600 = 0.8, 1 ×10 8 CFU/mL) במשך 24 שעות כדי לגרום לפגיעה בעצם. הקמת מודל מוצלחת אושרה על ידי אימות ירידה של לפחות 50% בעוצמת הפלואורסצנציה הירוקה הספציפית לסחוס באזור הגולגולתי-פנים ביחס לקבוצת הביקורת תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

7. הערכה כמותית של פלואורסצנציה ספציפית לסחוס בזחלי דגי זברה

הזחלים נחשפו ברציפות לריכוזים מדורגים של תמצית Fructus Xanthii או 1,000 מיקרוגרם/מ"ל נתרן כונדרויטין סולפט A (שליטה חיובית) בטמפרטורה של 28 °C במשך 72 שעות. לאחר מכן, 10 זחלים נבחרו באקראי מכל שכפול של 6 בארות (n = 30 לכל קבוצה). הזחלים שנבחרו הורדמו באמצעות טריקאין של 0.016% והוצבו לרוחב על כריות אגרוז עם התכה נמוכה של 1%. תמונות פלואורסצנציה צולמו בהגדלה של 2× (עירור 488 ננומטר, פליטה 525/50 ננומטר) באמצעות מיקרוסקופ סטריאופסקופ המצויד במצלמת פלואורסצנציה. עוצמת ה-EGFP הספציפית לסחוס באזור הקרניופציאלי, כולל הסרטוהיל וסחוס מקל, נמדדה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. בוצע תיקון רקע על ערכי הצפיפות המשולבים, והערכים המתוקנים נורמל לקבוצת הביקורת לניתוח סטטיסטי של יעילות כונדרופרוטקיטי.

8. השראה של OA בעכברי C57BL/6J

עכברים זכרים מסוג C57BL/6J (בני 6–8 שבועות, 20–22 גרם) אוחסנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. העכברים הורשו להסתגל לשבוע אחד ואז חולקו באקראי לשלוש קבוצות (n = 8 לכל קבוצה) באמצעות טבלת מספרים אקראית: (1) ביקורת מופעלת על ידי דמה, (2) OA מושרה על ידי ACLT (ACLT), ו-(3) התערבות בתמצית ACLT יחד עם Fructus Xanthii (תמצית ACLT + Fructus Xanthii ). כל ההליכים הכירורגיים בוצעו בתנאים סטריליים בהתאם לפרוטוקול שאושר בעבר.

העכברים הורדמו באמצעות נתרן פנטוברביטל תוך-פריטוניאלי (50 מ"ג/ק"ג) (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד), ובוצעה חתך פרהפטלרי מדיאלי שחשף את קפסולת מפרק הברך הימנית. הרצועה הצולבת הקדמית הועברה תחת מיקרוסקופ הפעלה כדי לגרום לאי-יציבות במפרק, ולאחר מכן קפסולת המפרק והעור נסגרו בשכבות באמצעות תפרים נספגים בקוטר 6-0. עכברים שהופעלו בשמה עברו ניתוחי ארתרוטומיה זהים ללא ניתוח רצועה. הוערכה יציבות המפרק, והקמת המודל המוצלחת אושרה על ידי ביצוע בדיקת המגירה או על ידי הערכת דרגת הפגיעה במפרק בחתכים היסטולוגיים של עכברי קבוצת המודלים.

הקלה לאחר הניתוח עם בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת-עורית) ניתנה במשך שלושה ימים רצופים. תרופות הטיפול ניתנו פעם ביום באמצעות גוואג'. קבוצת תמצית ACLT + Fructus Xanthii קיבלה 100 מיקרוליטר של תמצית Fructus Xanthii של 1,000 מיקרוגרם/מ"ל מדוללת במי מלח רגילים, בעוד ששתי הקבוצות האחרות קיבלו 100 מיקרוליטר של תמיסת מלח רגילה ככלי בקרה. בשבוע שמונה לאחר הניתוח, העכברים הושמתו באמצעות חנקCO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם, ומפרקי הברכיים נקטפו לניתוחים היסטולוגיים.

9. כתמים היסטופתולוגיים

  1. הכנה וצביעה היסטולוגית של רקמת מפרק הברך
    מפרקי הברך שניתחו נכרתו בשבוע 8 לאחר הניתוח וקיבעו ב-4% פאראפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות. החיבורים הקבועים עברו דקאלציפיקציה בחומצה 10% אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA; pH 7.4) למשך 14 ימים, יובשו באמצעות סדרת אתנול מדורגת, והוטמעו בפרפין. הוכנו חתכי סגיטל סדרתיים (5 מיקרון) מהחיבורים המוטבעים, ובוצעו הליכי צביעה היסטולוגיים הבאים.
    1. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
      בוצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) להערכת ארכיטקטורת רקמות כללית, שלמות הסחוס וההיפרפלזיה הסינוביאלית.
    2. צביעת Safranin-O/Fast Green
      בוצעה צביעת Safranin-O/Fast Green לזיהוי פרוטאוגליקנים ברקמת הסחוס. החלקים המוכתמים נבדקו באמצעות מיקרוסקופ אור המצויד במצלמה דיגיטלית, והתמונות צולמו בהגדלות של 10× ו-20× הגדלות.
  2. ניקוד חצי-כמותי מבוסס OARSI של ניוון סחוס
    להערכה חצי-כמותית של ניוון סחוס, החתכים המוכתמים הוערכו מחדש ודורגו בדיעבד לפי מערכת ההערכה ההיסטופתולוגית של הסחוס של החברה הבינלאומית למחקר אוסטיאוארתריטיס, שמעריכה את חומרת הנזק לסחוס בהתבסס על דרגה (0–6; היקף אובדן הסחוס) ושלב (0–4; התפלגות מרחבית של הנזק) של ניוון סחוס המפרקים.
    אומצה אסטרטגיית עיוורון לאחר מכן לכל ההערכות. כל החלקים הוסרו על ידי הסרת תוויות הקבוצה המקוריות וקודדו מחדש באמצעות מספרי סידורי אנונימיים. שני פתולוגים מנוסים דירגו את החלקים באופן עצמאי ללא ידע על הקצאת הקבוצות. בוצעה אימות צולב בין שתי קבוצות תוצאות הניקוד. כאשר ההפרש בציון היה ≥1, החלקים המנוגדים הוערכו מחדש במשותף על ידי שני הפתולוגים כדי לקבוע ציון קונצנזוס. ציוני הקונצנזוס הסופיים שימשו לניתוח סטטיסטי מאוחר יותר כדי להבטיח את האובייקטיביות, החוסן והשחזוריות של התוצאות ההיסטופתולוגיות.

10. ריצוף RNA (RNA-seq)

כונדרוציטים מפרקים ראשוניים של האדם (מעברים 2–3) הוזרעו בלוחות של 6 בארות בצפיפות של 5 ×-10תאים בכל באר. התאים סבלו מרעב לסרום במשך 24 שעות ואז חולקו לשתי קבוצות (n = 3 לכל קבוצה): (1) קבוצת הביקורת: התאים טופלו רק ברכב (0.1% DMSO); (2) קבוצת תמצית Fructus Xanthii : תאים טופלו בתמצית של 1,000 מיקרוגרם/מ"ל Fructus Xanthii מומסת ב-DMSO.
התאים טופלו במשך 24 שעות, ולאחר מכן הופק כל ה-RNA באמצעות תגובת טריזול בהתאם לפרוטוקול היצרן. שלמות ה-RNA (RIN ≥7.0) והריכוז הוערכו באמצעות אנלייזר RNA. ספריות cDNA ספציפיות לחוטים הוכנו באמצעות ערכת הכנת ספריית ריצוף RNA ונרצפו על פלטפורמת ריצוף דור חדש (NGS) בעלת תפוקה גבוהה במצב זווג של 150 bp (PE150). בקרת איכות של קבצי FASTQ הגולמיים בוצעה באמצעות FastQC, ולאחר מכן חיתוך מתאם ואיכות באמצעות Trimmomatic לפני ניתוח במורד הזרם.

11. עיבוד נתוני RNA-seq

גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי המופחתת על ידי תמצית Fructus Xanthii (לעומת קבוצת הביקורת; p < 0.05 ו-logFC < −0.5) הופקו ממאגר הנתונים של RNA-seq ונחתכו עם עשרת יעדי ההאב המובילים. המטרות המרכזיות שנוצרו הקשורות לתמצית Fructus Xanthii ואוסטאוארתריטיס הוצגו באמצעות חבילת ggvenn.

12. אליסה

כונדרוציטים מפרקים ראשוניים בבני אדם במעברים 2–3 נזרעו בלוחות של 6 בארות בצפיפות של 5 ×-105 תאים בכל באר. התאים הוגברו במדיום ללא סרום במשך 24 שעות כדי לגרום לשקט. התאים חולקו לאחר מכן לשלוש הקבוצות הבאות (n = 3 לכל קבוצה):
(1) בקרה ריקה: תאים טופלו רק ב-VEHICLE (0.1% DMSO); (2) ביקורת חיובית: הושרה דלקת תאית באמצעות IL-1β, ואחריה טיפול ב-VEHICLE (0.1% DMSO); (3) קבוצת תמצית Fructus Xanthii : הושרה דלקת תאית באמצעות IL-1β, ואחריה טיפול בתמצית Fructus Xanthii של 1000 מיקרוגרם/מ"ל מומסת ב-0.1% DMSO. סופרנטנטים של תרביות תאים נאספו לאחר 24 שעות דגירה ונשמרו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. רמות MMP1 ו-PGR בסופרנטנטים של התרבית נקבעו באמצעות ערכות ELISA, הזמינות מסחרית לבדיקות אימונוסורבנט קשורות לאנזים (ELISA) המיועדות ל-MMP1 ו-PGR בבני אדם, בהתאמה. הבדיקות בוצעו לפי הוראות היצרנים.

13. ניתוח סטטיסטי

כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנות ניתוח סטטיסטי וגרפים, והנתונים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). נורמליות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן שפירו–וילק, וההומוסקדסטיות הוערכה באמצעות מבחן לוון. השוואות בין-קבוצתיות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני או דו-כיווני (ANOVA), ואחריהם מבחני פוסט-הוק של טוקי או שידאק, לפי הצורך. השוואות זוגיות בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט. נתונים לא פרמטריים נותחו באמצעות מבחן מאן–וויטני U. ערך P דו-צדדי < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת איכות ונוף מטבולי של נתוני LC-MS/MS לא ממוקדים

דגימות QC הראו שכפול מצוין, כפי שמעידים כרומטוגרמות TIC חופפות מאוד הן במצב יונים חיובי והן שלילי, כאשר סטיית זמן השמירה נותרה מתחת ל-0.05 דקות לאורך כל האצווה האנליטית. הנתונים הגולמיים עברו עיבוד מקדים מבוסס XCMS, שכלל זיהוי שיא, אינטגרציה ויישור זמן שימור. מטבוליטים משוערים הוסמכו על ידי התאמת מסה מדויקת (≤5 ppm), דפוסי איזוטופים וספקטרום איכותי של MS/MS מול ספריית ספקטרום פנימית. לאחר סינון קפדני ונרמול TIC, נשמרו 2,179 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OA היא הפרעה ניוונית נפוצה במפרקים ואחת הסיבות המובילות לנכות ברחבי העולם.36. הפתוגנזה שלו מורכבת ורב-גורמית, הכוללת שינויים ביוכימיים, תאיים ומולקולריים ברקמות המפרק. בעבר נחשבה לתופעת "שחיקה ושחיק" פשוטה של סחוס מפרקי, אך כיום ידועה באופן נרחב כמחלה כרונית של כל המפרק המאופיינת בפירוק סחוס, דלקת סינוביאלית, היווצרות אוסטאופיטים ועיצוב מחדש של עצם תת-כונדרלית 37,38,39. ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או מערכות יחסים אישיות שיכולות להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך כלכלית על ידי מענק פרויקט פני השטח של קרן הטבע של מחוז שאנדונג (מס' ZR2024MH088), פרויקט טכנולוגיית הרפואה הסינית המסורתית של מחוז שאנדונג (מס' 2020M070), וקרן גידול של בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת הרפואה הראשונה של שאנדונג ובית החולים הפרובינציאלי צ'יאנפושאן של שאנדונג (מענק מס' QYPY2022NSFC0601)".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% PFABiosharp, סיןBL539ApH 7.4, סטרילי
עכברי C57BL/6Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, סיןN/Aזכר, בגיל 8-10 שבועות, 20-25 גרם
כונדרואיטין סולפטMCE, אמריקהHY-B2162טוהר ≥98%
ClusterProfiler (חבילת R)Bioconductorגישה חופשיתמשולבת ב-R v4.2.2
קולגנאז, סוג II, אבקהGibco, אמריקה17101015≥125 U/mg
CytoscapeCytoscape Consortiumגישה חופשית (https://cytoscape.org/)גרסה 3.9.1 (עם CytoHubba)
CytoscapeCytoscape Consortiumגישה חופשיתגרסה 3.9.1
DESeq2 (חבילת R)Bioconductorגישה חופשיתמשולבת ב-R v4.2.2
DMEM, גלוקוז גבוהGibco, אמריקה11965092מדיום סטרילי
אתנולSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, סין10009218דרגת ניתוח, 95%
אתיל אצטטSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, סין10009418דרגת ניתוח
סרום עובר בקר (FBS)Cellmax, סיןSA102.02מופעל בחום
מיקרוסקופ פלואורסצנטיNikon, יפןEclipse Ti2-Uמצויד במסנן GFP (עירור 488nm) ומצלמה דיגיטלית
מאגר GEONCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2rכלי ניתוח GEO2R
GraphPad PrismGraphPad Software, LLC, אמריקהמסחריגרסה 9.5.1
ערכת צביעת Hematoxylin-Eosin(HE)Solarbio, סיןG1120ערכה מוכנה לשימוש
מאגר HERBהאקדמיה הסינית למדעיםhttp://herb.ac.cn/גרסה 2.0
ערכת ELISA ל-MMP-1 אנושיYamei Biotechnology, סיןHJ088לאדם, צלחת 96 באר
ערכת ELISA לרצפטור פרוגסטרון אנושי (PR)Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., סיןml05997לאדם, צלחת 96 באר
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)גישה חופשיתגרסה 1.53t
מיקרוסקופ אורOlympus, יפןBX53אובייקטיבים 10×/20× ומצלמה דיגיטלית
ליאופיליזרChrist, גרמניהAlpha 1-4 LDplusמערכת ייבוש קר
ערכת צביעת Saffron-O ו-Fast Green שונהSolarbio, סיןG1371לצביעת עצם/סחוס
בלזם נייטרליSolarbio, סיןG8590מדיום הרכבה
פניצילין-סטרפטומיציןGibco, אמריקה15070063100×, סטרילי
מלח זרחן מאוזן (PBS)Sparkjade, סיןCR0013-500MLpH 7.2-7.4, סטרילי
תוכנת Rקרן R לחישוב סטטיסטיגישה חופשית (https://www.r-project.org/)גרסה 4.4.1 (עם ggvenn)
מדיום הקפאה תאי ללא סרוםBiosharp, סיןBL203Bסטרילי
Staphylococcus aureusAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 25923זן סטנדרטי
מאגר STRINGSTRING Consortiumhttps://string-db.org/ניתוח אינטראקציה חלבונית
מאגר TCMIDShaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Centerhttps://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.phpגרסה 3.0
דג זברה Tg(col2a1a:EGFP)Zebrafish International Resource Center (ZIRC)N/Aזחלים (2 dpf), זן AB
נוזל TRIzolThermo Fisher, אמריקה15596018CNלחילוץ RNA סה"כ
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםGibco, אמריקה25200056תמיסה סטרילית
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC)Thermo Fisher, אמריקהQ Exactive Focusמחובר עם HRMS/MS
XCMS-onlineמכון המחקר Scrippsגישה חופשיתפלטפורמת אינטרנט

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAELISA

מאמרים קשורים