מודלים של בעלי חיים עכברושים להערכת השפעות גירוי עצבי הסקרלי וההיקפי על תפקוד שלפוחית השתן

סיכום

פרוטוקול זה מתאר טכניקות כירורגיות מפורטות לגירוי העצבים הסקרליים, הטיביאלי והפרונאליים בעכברים מורדים. מודלים אלו מאפשרים חקירת השפעות נוירומודולציה על תפקוד שלפוחית השתן, מסייעים בקביעת פרמטרי גירוי מיטביים, ומאפשרים חקר מנגנוני הפעולה של טיפולי גירוי עצבים סקרליים ופריפריים.

תקציר

נוירומודולציה, גישה טיפולית לתפקוד לקוי של איברים שונים, הוכיחה את עצמה כיעילה בטיפול בתפקודים לקויים בדרכי השתן התחתונות. למרות הצלחתו הקלינית, המנגנונים שמאחורי הנוירומודולציה נותרו בלתי מובנים לחלוטין, מה שמדגיש את הצורך במודלים בעלי חיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור. מודלים פרה-קליניים של נוירומודולציה של שלפוחית השתן באמצעות גירוי עצבי סקרלי והיקפי הוקמו כבר למעלה משני עשורים; עם זאת, הספרות הקיימת מספקת פרטים מתודולוגיים מוגבלים לגבי ההליכים הכירורגיים. מאמר זה מציע תיאור מפורט וייצוג חזותי של טכניקות מבוססות היטב לגירוי עצב סקרלי. הוא גם מתאר גישה מותאמת לגירוי עצב השוקה ומציג שיטה חדשה למודולציה עצבית של שלפוחית השתן באמצעות גירוי עצב פרונאלי במודל חולדה. הגישה המותאמת לגירוי עצב הטיביאלי כוללת חשיפת וגירוי עצב הטיביאלי במקומו, כענף של העצב הסיאטי, ולא בקרסול המדיאלי, כפי שתואר במחקרים קודמים. בהתחשב בהכנסת גירוי עצב פרונאלי למודולציה עצבית של שלפוחית השתן בפרקטיקה הקלינית, מאמר זה מציע מודל עכברוש ייחודי לחקירת המנגנונים שלו בשליטה בתפקוד דרכי השתן התחתונות. הנחיות שלב אחר שלב לכל שלוש שיטות הנורומודולציה מפורטות לחשיפה לעצבים, מיקום האלקטרודות ואימות מיקום מוצלח של האלקטרודות בהתבסס על תגובות מוטוריות אופייניות. דוגמה מייצגת להשפעת גירוי עצבי פרונאלי על תפקוד שלפוחית השתן במודל עכברוש של פעילות יתר של שלפוחית השתן הנגרמת על ידי חומצה אצטית נכללת כדי להדגים את יישומם. מאמר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי ונגיש טכנית לחקר מנגנוני נוירומודולציה, כולל שינויים באיתות החישה של שלפוחית השתן, מסלולי ויסות בעמוד השדרה והעל-שדרתי, אופטימיזציה של פרמטרי גירוי, והשוואת היעילות של מטרות גירוי שונות.

מבוא

נוירומודולציה משתמשת בגירוי חשמלי בעוצמה נמוכה כדי לשנות את תפקוד האיבר הסופי¹. בהקשר של תפקוד לקוי בדרכי השתן התחתונות, כגון תסמונת שלפוחית השתן הפעילה יתר (OAB), אגירת שתן לא חסימתית, שלפוחית השתן הנוירוגנית ותסמונת כאב בשלפוחית השתן, נוירומודולציה משמשת כטיפול קו שלישי למטופלים שנכשלו בטיפול התנהגותי ובטיפול תרופתי². למודולציה עצבית אצל חולים עם OAB, גירוי עצב השוקה האחורי וגירוי עצב הסקרלי (SNS) שימשו רבות בפרקטיקה קלינית. גישות נוירומודולציה ניסיוניות המיועדות לעצבים היקפיים נוספים, כולל עצבי הפודנדל והעצבים הפרונאליים, נחקרות 3,4,5,6.

למרות שנוירומודולציה משמשת לטיפול במחלות שלפוחית השתן והמעי במשך כמה עשורים, מנגנון הפעולה שלה אינו מובן במלואו. כפי שנאמר בסקירת קבוצת המומחים הרב-תחומית, פרמטרי הגירוי הנוכחיים נבחרו בעיקר על ידי יצרנים על בסיס גישה של ניסוי וטעייה⁷. לכן חשוב להמשיך להשתמש במודלים של בעלי חיים כדי להבהיר מסלולים בסיסיים ולמקסם את פרמטרי הגירוי לשיפור ההשפעה הטיפולית. בוצעו מספר ניסויים פרה-קליניים, בהם השתמשו בבעלי חיים ערים ומורדמים, כולל עכברים, חולדות, כבשים, כלבים וחתולים⁴. עם הנחיות אתיות ומדיניות מחקר ברחבי העולם המעודדות שימוש במינים קטנים ופחות מורכבים, מודלים של מכרסמים שימשו בתדירות גבוהה ביותר בשנים האחרונות.

SNS במודלים של חולדות של תפקוד לקוי של שלפוחית השתן השתמש בעיקר בשתי גישות מתודולוגיות. הראשון, שתואר על ידי זווארה ואחרים, כולל השתלת אלקטרודה מעוררת בפורמן הסקרלי באמצעות אנגיוקטטר או מחט עמוד שדרה^. הגישה השנייה דורשת חשיפת שורש עצב L6 ומיקום אלקטרודות מגרה מתחת לעצבי L6, עם דבק סיליקון המשמש לאבטחת המגע בין האלקטרודה לעצב⁹. הטכניקה הכוללת הצבת אלקטרודות בחור הסקרלי משקפת את הגישה הקלינית. השיטה באמצעות חשיפה לשורש L6, למרות שהיא מאתגרת מבחינה טכנית, מספקת מיקום מדויק וגישה עקבית יותר לעצב.

מודלים של בעלי חיים חולדותיים המדמים את גירוי עצב השוקה האחורי תוארו בספרות. השיטה הנפוצה ביותר כוללת חשיפה כירורגית של עצב השוקה בצד המדיאלי של הגפה האחורית מעל הקרסול 10,11,12,13,14,15,16. שיטה נוספת כוללת החדרה דרך העור של אלקטרודות מחט סמוך לעצב השוקה¹⁷. מאמר זה שואף לספק תיאור מפורט של גירוי עצב הטיביאלי במקומו, בין שרירי הישבן המקסימוס ושרירי הבייספס פמוריס, שם העצב הסיאטי מתפצל לשלושה ענפים: עצב השוקה, הפרוניאלי הנפוץ והסורל. בנוסף, מחקר זה מציג את גירוי העצבים הפרונאליים כמודל חדש לבעלי חיים לחקר שיטת נוירומודולציה חדשה. הרלוונטיות התרגומית של מודל העכברים הזה נתמכת על ידי ההכנסה הקלינית האחרונה של גירוי עצב פרונאלי לנוירומודולציה של שלפוחית^18,19.

פרוטוקול

החיות אוחסנו במתקן הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת דרום דנמרק בהתאם להנחיות מוסדיות. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. ועדת האתיקה של המפקח על ניסויים בבעלי חיים הדני אישרה את נהלי המחקר (פרוטוקול מס' 2022-15-0201-01158). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת האלקטרודות

הערה: לגירוי עצב טיביאל, פרוניאלי ו-L6, השתמשו באלקטרודות בצורת וו דו-קוטבי²⁰. השלבים הבאים מספקים תיאור קצר של תכנון ובניית האלקטרודות.

1. חתכו שני חוטי כסף מצופים פוליטטראפלואורואתילן (PTFE) באורך שווה באורך 125 מיקרון וסובבו אותם יחד.
2. הסר 4–5 מ"מ של PTFE מקצה אחד של החוטים, גזם את הקצוות החשופים באופן שווה, וכופף את הקצוות כלפי מעלה מעל מחט של 23 G ליצירת שני ווים מקבילים במרווחים של 2 מ"מ.
3. מקבע את האלקטרודה לפלטה וממקם את הוו כלפי מעלה וממשיך מעבר לשפת הפלטה.
4. מערבבים את דבק הסיליקון הדו-רכיבי למשך 5 שניות. מרחו טיפה במרחק 1–2 מ"מ מהווים ותנו לה להתייבש כ-5 דקות.
5. הסר קטע באורך 1–2 ס"מ של ציפוי PTFE מהקצה הנגדי של האלקטרודה כדי לאפשר חיבור למגרים.

2. הכנת בעלי חיים

הערה: בתנאים סטריליים, קטטרי PE-50, עם קצה שהתרחב מהחום, הושתלו בכיפת שלפוחית השתן של נקבות חולדות ספרג-דולי (250–300 גרם) והוחזקו בתפר מיתר תיק (ארנק). הקצה המרוחק של הצינור הוצא החוצה בגב החיה והתלפף בכיס תת-עורי²¹. הורשו חמישה ימים להחלמת השלפוחית לאחר הניתוח.

1. הרדמו את בעל החיים באמצעות אוריתן (1.5 גרם לק"ג, תוך-פריטוני) (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). נתנו אוריתן בשלוש מנות מחולקות במרווחים של 15 דקות, כשעתיים לפני תחילת הניסוי.
2. העבר את החיה לכרית חימום והנח אותה בשכיבה.
3. לגירוי עצבי טיביאלית ופרונאלית, יש לגלח את הגפה האחורית של העכברוש סביב אזור הירך וכן את החלק התחתון של הגב. הנח את הזנב ומזרק של 5 מ"ל מתחת לגפה האחורית השמאלית של העכברוש וקבע את הזנב והרגל כפי שמוצג באיור 1A.
4. ל-SNS, יש לגלח את גב העכברוש מהזנב אל עמוד השדרה החזי ולהכניס צינור צנטריפוגה בקוטר 50 מ"ל מתחת לבטן כדי להרים את אזור המותן והסקראל.
   הערה: כל ניסויי הגירוי הנוירולוגי מייצגים פרוצדורות שאינן הישרדות. השתמש בטכניקות ניתוח נקיות.

3. ניתוח עצב הפרונאלי והטיביאלי והשתלת האלקטרודות

1. השתמשו בסקלפל כדי ליצור חתך בגודל 3–3.5 ס"מ במרכז בין מפרק הברך לשחצונית האיסכיאלית (איור 1B).
2. הפרדו את העור מהשריר על ידי החלקת המספריים מתחת לעור וחיתוך רקמת החיבור.
3. פתחו את העור באמצעות רטרקטורים וחשפו את הפאשיה שמחברת את הישבן מקסימוס לשרירי הבייספס פמוריס (איור 1C).
4. השתמשו במספריים ישרים כדי לחתוך את הפאשיה ולנתח את המרווח בין הישבן המקסימוס לבין הבייספס פמוריס עד שנראה לעצב הסיאטי (איור 1D,E).
5. מיקום מחדש של הרטרקטרים על הבייספס פמוריס כדי להשיג חשיפה טובה של העצב הסיאטי וענפיו - עצבי השוקה, הפרונאלי והסורל (איור 2A). בהקשר זה, "עצב פרונאלי" מתייחס לעצב הפרונאלי הנפוץ לפני חלוקתו לעצבים פרונאליים עמוקים ושטחיים. עצב השוקה הוא הענף הגדול ביותר; עצב הסורל הוא הקטן ביותר והעצב הפרונאלי בקוטר ביניים.
6. הפרד את העצב הפרונאלי מרקמת החיבור הסובבת באמצעות מלקחיים מעוקלים ומספריים מיקרו. לאחר מכן השתמשו במיקרופוספס כדי לפזר בזהירות את הרקמה משני הצדדים ומתחתיה כדי לבודד קטע באורך 5 מ"מ של העצב. חזור על אותו הליך עם עצב השוקה לגירוי עצב הטיביה (איור 2B).
   הערה: הימנעו מלחיצה על העצב על ידי הרמת המלקחיים והפחתת את המשיכה בעצב למינימום.
7. בצע חתך באורך 5 מ"מ בחלק התחתון של הגב באמצעות סכין מנתח והחליק המיסטט מתחת לעור דרך החתך ליצירת תעלה תת-עורית. קדם את המוסטט בזהירות עד שהקצה יוצא מהחתך של הגפה האחורית (איור 2C).
8. באמצעות ההמוסטט, אוחז בקצה הלא מחובר של האלקטרודה ושוך את המכשיר באיטיות דרך החתך בחלק התחתון של הגב. באמצעות שני מלקחיים, כופף את הקצה השני של האלקטרודה (הקצה המחובר) לזווית של 90° ביחס למישור התת-עורי ווודא שוורים של האלקטרודה ממוקמים סמוכים וניצבים לעצב (פרונאלי או טיביאלי) (איור 2D).
   הערה: מיקום נכון של האלקטרודה חשוב כדי למנוע מתיחה של העצב.
9. השתמש במיקרו-מלקחיים מעוקלים כדי להרים את העצב ולהחליק את הווים של האלקטרודה מתחת לעצב. מערבבים את דבק הסיליקון הדו-רכיבי למשך 5 שניות, השתמשו במקלון אוזניים לייבוש העצב, ומרחו מספיק דבק כדי לכסות את הווים והאזור הסמוך לעצב (איור 2E–G).
   הערה: לפני מריחת הדבק, חבר את האלקטרודות למגרה ומגרה את העצב ברמת סף המנוע כדי לאשר את מיקום האלקטרודה. סף המנוע נקבע כמתח המינימלי הנדרש ליצירת תנועת רגל פאזית עקבית. גירוי העצב הפרונאלי יוצר כיפוף גבי פאזי של כף הרגל, בעוד שגירוי עצב השוקה יוצר כיפוף כף הרגל. בהיעדר תגובה מוטורית לגירוי, בדוק את הקשר בין המגרה לאלקטרודה.
10. הניחו תפר ניילון 5-0 ברקמת החיבור בחתך האחורי, והשאירו את שני קצות התפר ארוכים מספיק. קצוות אלו משמשים לקביעת האלקטרודה, מה שמבטיח מיקום יציב.
11. סגור את העור בחתך של הגפה האחורית באמצעות תפר ויקריל 4-0.

4. חשיפת עצב L6 והשתלת האלקטרודה

1. השתמשו בסקלפל כדי ליצור חתך בקו האמצע של 4–5 ס"מ מעל אזור המותן והעצם. הנח רטרקטורים כדי לפתוח את החתך, לחשוף את שרירי הגב התחתונים ואת קצות התהליכים הקוצניים של החוליות (איור 3A).
2. מישוש את הרכס האיליאקי והשתמש בו כנקודת ציון לאיתור תהליכי הקוצים של L6. ניתן לזהות אותו כתהליך הקוצני הראשון שממוקם ממש מתחת לקצה האיליאק (איור 3B).
3. השתמש במספריים כדי להסיר את הפאסיה מעל החוליות מ-L5 עד S2. לאחר מכן מבודדים ומנתקים בזהירות את השרירים הפרה-חולייניים דו-צדדיים כדי לחשוף את התהליכים הקוצניים, הלמינות והתהליכים המפרקיים. הסר את רקמת החיבור והשריר שנותרו באמצעות מספריים מיקרו עד שמבני העצמות נראים בבירור (איור 4A,B).
   הערה: זה יוצר חלון אנטומי שחושף נקודות ציון ומספק גישה לגזע העצב L6. זיהוי מפרק הפאה האחורי של L6; גזע העצב L6 רץ בזנב למפרק זה. כמו כן, זהה את הסקרום ואת מפרקי הסקרואיליאק. גזע העצב L6 עובר בזנב ובמדיאל למפרק זה (איור 4B).
4. השתמשו ברונג'ור כדי להסיר בזהירות את התהליך הקוציני של S1 ולשבור בהדרגה שברים קטנים של עצם הסקרל באזור שבין חוליות S1 ל-S2 כדי לחשוף את גזע העצב L6 (איור 4C).
5. הפרדו את עצב L6 מהרקמה הסובבת באמצעות מלקחיים מעוקלים ומספריים מיקרו. חבר את העצב לאלקטרודת חוט כסף מצופה PTFE דו-קוטבית ומבודד אותו מהרקמה הסובבת באמצעות דבק סיליקון ביוקומיטיבי, כפי שמתואר בשלב 3.9 (איור 4D).
   הערה: גירוי של עצב L6 גורם לכיווץ שרירי רצפת האגן ולהתכווצות בזנב.
6. חזור על אותו הליך בצד הנגדי לגירוי עצבי דו-צדדי.
7. סגור את העור עם תפר ויקריל 4-0.

5. הכנסת אלקטרודה מגרה לפורמן הסקרלי

1. השתמש בסכין כדי ליצור חתך בקו אמצעי מעל הסקרום והשתמש ברטרקטרים כדי לפתוח את החתך ולחשוף את שרירי הגב שמתחת.
   הערה: מישוש את הרכס האיליאקי כפי שצוין בשלב 4.2 כדי לאתר את סימני הדרך L6/S1.
2. הפריד את שרירי הפרה-חוליה מהתהליכים הקוצניים באמצעות דיסקציה קהה. ממקמים מחדש את הרטרקטרים על השרירים כדי לקבל חשיפה לתהליכים הקוצניים ולהקל על הגישה לפורמן הסקרלי S1 (איור 5A).
3. זהה את מיקום הפורמן S1, שנמצא בזנב וברוחב של התהליך הקוצני S1. בדקו את הפורמן הסקרלי S1 עם מחט 18 גייג' הטעונה מראש באלקטרודה מונופולרית (איור 5B).
   הערה: נעשה שימוש בחוט נירוסטה מצופה PTFE בנפח 180 מיקרון, עם בידוד של 5 מ"מ משני הצדדים.
4. מקם את קצה המחט בפתח S1, תוך שמירה על מקביל לעמוד השדרה וזווית של כ-30° יחסית לגב בעל החיים. התקדמו בעדינות את החוט לאורך מסלול העצב תוך משיכת המחט לאט. חזור על ההליך על הפורמן S1 הנגדי לגירוי דו-צדדי.
   הערה: כדי לאשר את המיקום הנכון של האלקטרודה, חבר את הקצה המרוחק של החוט למגרה. גירוי חשמלי יוצר רעד בזנב.
5. אבטח את החוטים לתהליך הספיניוס הסמוך (L6) באמצעות תפר ויקריל 5-0 (איור 5C).
6. בצע חתך של 1 ס"מ בחלק האחורי של הצוואר באמצעות סכין מנתח ויצר מנהרה תת-עורית באמצעות המוסטט מהחתך מאחורי הצוואר אל החתך בגובה הסקרל.
7. העבר את הקצה המרוחק של החוט דרך המנהרה והפך אותו החוצה מאחורי הצוואר (איור 5D).
8. סגור את הפאשיה והעור ברמת הסקרל, כמו גם את העור בחלק האחורי של הצוואר, באמצעות תפר ויקריל 4-0.

6. הקלטת ציסטומטריה

1. לאחר 5 ימים, לפני ביצוע ניסויי הגירוי, יש להוציא את צינור ה-PE-50 החוצה ולחבר אותו לממיר הלחץ ולמשאבת ההזלפות.
2. הזרקו את שלפוחית השתן בקצב רציף של 3 מ"ל לשעה למשך 2 שעות כדי לאפשר ייצוב פרמטרי השלפוחית.
3. הערכת פרמטרים של ציסטומטריה, כולל לחץ בסיסי, לחץ סף, עמידה בשלפוחית השתן, לחץ מיקטוריציה וקיבולת שלפוחית לפני, במהלך ואחרי גירוי עצבי באמצעות עירוי תוך-כלי במחזור מיקטוריציה יחיד²¹.
4. בסיום כל ניסוי, בהתאם לסטנדרטים אתיים, יש להמתים בעלי חיים באמצעות מנת יתר של הרדמה.

תוצאות

כדי להדגים את עיצוב הניסוי להערכת השפעת הנוירומודולציה על תפקוד דרכי השתן התחתונה, הוצג מחקר שבו יושם גירוי עצב פרונאלי במודל עכברוש של פעילות יתר של שלפוחית השתן שנגרמה על ידי עירוי תוך-כלי של 0.5% חומצה אצטית. תפקוד שלפוחית השתן נרשם באמצעות ציסטומטריה של מחזור מיקטוריציה יחיד לפני, במהלך ואחרי גירוי (איור 6 A,B). המערכת הניסויית כללה שתי משכי גירוי עצבים פרונאליים שונים באמצעות גל גירוי דו-פאזי, תדר 10 הרץ, משך פולס 0.2 מילישניות, ועוצמת גירוי פי 3 מהסף המוטורי (1.2–3 וול...

דיון

מאמר זה מספק תיאור מפורט של שיטות הכירורגיות להשתלת אלקטרודות לגירוי עצבי סקרל, טיביאלי ופרונאלי בעכברוש שהורדם.

השתלת אלקטרודת עופרת בפורמן הסקרלי לגירוי מתמשך של עצב S3 בעושר נמוך היא טיפול מקובל באופן רחב לתפקוד לקוי של דרכי השתן התחתונות (LUT) ואי-שליטה בצואה. אצל המטופלים, האלקטרודה ממוקמת בדרך כלל בפורמן S3 ומכוונת לתערובת של אקסונים מיאליניים ולא מיאליניים²². מיקום זה תואם למקטע L6–S1 של חוט השדרה בעכברים. מיקום מדויק של עצבי המט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
18 G disposable injection needle	KRUUSE	121282
Dumont forceps style 5TM	DUMONT	1708-5TM-PO	Curved
Dumont forceps style 7XL	DUMONT	0508-7XL-PO	Curved
Grass SD9 square pulse stimulator	Somatco	1077/183
Hemostat	Fine Science Tools/Teleflex	13018-14/PO181059	≥ 14 cm, fine tip
Iris scissors	World Precision Instruments	14218	Straight scissors
Kwik-Sil silicone Elastomer	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Two-component glue
Micro Adson forceps	World Precision Instruments	501245
Microscissors	S&T	SAC-15 R-8	curved tip ≤ 10mm long
NaCl 0.9% 100 mL	B.Braun	N/A
PE-50 tubing	Instech	BTPE-50
Prolene 5-0 suture	Ethicon	EH7257
Rongeur	George Tiemann & Co	160-424-08	Fine curved tip
Surgical Scalpel	Swann-Morton	0505
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500
Vicryl 4-0 suture	Ethicon	V451
Vicryl 5-0 suture	Ethicon	V303
Wire Silver Teflon-coated 0.125 mm	World Precision Instruments	AGT0525
Wire Stainless Steel Teflon-coated 0.18 mm	World Precision Instruments	SST30407-50