מאמר שיטה

Bex-Plex מאפשר ויזואליזציה סימולטנית של סמני חלבון ותמלילי חומצות ריבונוקליאית לפרופיל מרחבי עמוק של רקמות שלמות

DOI:

10.3791/70303

⸱

3 ביולי 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Allergy, Immunology, and Rheumatology, University of California San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב צביעת חלבונים איטרטיבית (IBEX) עם טכנולוגיית היברידיזציה RNAscope במקום , לצורך פנוטיפינג מרחבי עמוק של רקמות קפואות קבועות שלמות ליישומים של פרופיל מרחבי ברזולוציה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר פרופיל מרחבי בו-זמני של סמנים של חלבונים וחומצה ריבונוקלאית (RNA) ברזולוציית תא יחיד ברקמות שלמות. אחת הבעיות המרכזיות סביב סרטן גידול מוצק היא חוסר היכולת לחזות את תגובת המטופלים להתערבות טיפולית. פענוח המורכבויות הללו דורש מדידה כמותית של התנהגויות תאיות, אינטראקציות ופנוטיפים בתוך רקמות שלמות. בפרט, הפרוטאום והטרנסקריפטום מספקים מידע חופף אך לא מיותר, שיכול להיות קריטי לעיצוב אימונותרפיה רציונלית. עם זאת, כיום אין דרך פשוטה וחסכונית לפרופיל לעומק הן את מצב השעתוק והן את המצב התפקודי של כל התאים במיקרו-סביבת הגידול, תוך שמירה על המידע הקריטי על מיקום המרחב שלהם. לשם כך, הצלחנו לשלב בהצלחה את פלטפורמת IBEX (הלבנה איטרטיבית מאריכה רב-פלקסיות) עם HiPlex RNAscope, כדי להמחיש בו-זמנית סמנים של חלבונים בעלי פלקס גבוה ותמלולים של חומצה ריבונוקלאית (RNA) עם רזולוציית תא יחיד. גישה זו משלבת שלב שדרוג שונה לשליפת מטרות RNA כדי לשמר את המורפולוגיה הגרעינית ולאפשר יישור תמונה מדויק בין מחזורים. "Bex-Plex" מאפשר לנו לבצע פרוטוקול IBEX לא מותאם על רקמות קפואות קבועות, ואחריו פרוטוקול HiPlex RNAscope, שבו אנו משתמשים בשחזור RNA מותאם כדי להבטיח יישור ברמה הגרעינית עם מחזורי IBEX. פרוטוקול זה מותאם לרקמות קפואות קבועות ומאפשר ניתוח מרחבי משולב של מצבים תאי שעתוק ותפקודיים. היכולת לפרופיל ברמת תא יחיד זו לא רק מספקת מאגר מידע עמוק על הרקמה עצמה, אלא גם יכולה לאפשר תחזיות לגבי האינטראקציות התאיות המורכבות שמניעות את התגובה הטיפולית, ולספק מסגרת לחקר ביולוגיה מרחבית במיקרו-סביבות גידול ומערכות קשורות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז ההצגתם ב-2011, אימונותרפיות סרטן שמפחיתות את הדיכוי של תאי T ציטוטוקסיים על ידי חסימת מולקולות נקודת ביקורת מעכבות כמו PDL-1 ו-CTLA-4 הפכו לסטנדרט הזהב לטיפול בגידול מוצק1. עם זאת, למרות שימוש נרחב במטופלים, היעילות הקלינית של תרופות אלו משתנה מאוד, שכן סרטן גידולים מוצק רבים מופיעים באופן פנימי עם טיפולים אלו או בסופו של דבר יוצרים עמידות לטיפוליםאלו 2. במקרים רבים זה נובע מהאופי ההטרוגני מאוד של גידולים מוצקים, אפילו בקרב אותו סרטן סוג3. הבנה מעמיקה יותר של הקשרים התאים המתרחשים בגידולים מוצקים היא המפתח לשיפור שיטות הטיפול. לכן, זיהוי המנגנונים והאינטראקציות המדויקים שמרכיבים ומחזיקים את ההתנגדות הזו נמצא בחזית מחקר הסרטן. כאן, אנו שואפים לפתח שיטה המאפשרת ניתוח מרחבי משולב של ביטוי חלבונים ו-RNA ברקמות שלמות, כדי לאפיין טוב יותר את האינטראקציות התאיות המורכבות הללו.

מיקרו-סביבת הגידול (TME) מורכבת מהרכיבים התאיים והמבניים הלא-סרטניים שמעצבים את צמיחת הגידול ואת תגובת החיסון, כולל פיברובלסטים הקשורים לסרטן, תאי חיסון חודרים, רכיבים וסקולריים ומטריצה חוץ-תאית4. לאחרונה התברר כי הרכב וארגון ה-TME משפיעים מאוד על האם הגידולים מתירים או עמידים לחדירת מערכת חיסונית, אחד הגורמים המרכזיים שקובעים את התגובה לאימונותרפיה. בסרטן רבים, פנוטיפ "מדבר חיסוני", המאופיין במספר נמוך של תאי T ובנוכחות אוכלוסיות מיאלואידים מדכאות חיסון גבוהות, מתאם לתגובה לקויה לטיפולי חסימה בנקודות ביקורת 6,7. איתות כימוקין שולט ברבים מהדינמיקות הללו. לדוגמה, CXCL1 ו-CCL2 מושכים תאי מיאלואידים מדכאים חיסון, בעוד שציר CXCR3-CXCL9/CXCl10 מגייס גם תאי T ציטוטוקסיים וגם תאי רגולציה לתוך הגידול8. כתוצאה מכך, סביבת האיתות הספציפית לנישה יכולה להשפיע באופן משמעותי על פנוטיפ ותפקוד התא. לדוגמה, אצל חולי סרטן המעי הגס, ציר CCL5-CCR5 שולט בתפקוד המדכא של המאקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) וחסימת אות זה מטה את TAM לפנוטיפ אנטי-גידולי ומתאם לתגובות קליניות משופרות9. יתרה מזאת, אינטראקציות ישירות בין תאי חיסון, פיברובלסטים הקשורים לסרטן ו/או תאי גידול באמצעות ICAM ו-PDL-1 עלולות לגרום לעייפות חיסונית ולפגוע במערכת החיסון האנטי-גידולי10. יחד, ממצאים אלו מדגישים את חשיבות הניתוחים המפותחים במרחב כדי להבין כיצד ה-TME משפיע על היעילות הטיפולית.

הדמיה אימונופלואורסצנטית (IF) נותרה גישה יסודית להצגת ביטוי חלבונים ואינטראקציות בין תאים לרקמה. התחום התקדם מ-IF קונבנציונלי של 3-4 צבעים לתהליכי דימות בעל תוכן גבוה התלויים בצביעה ודימות איטרטיביים. בשיטות אלו, מערכי נתונים גדולים נוצרים באמצעות מחזורים חוזרים של תיוג נוגדנים, הדמיה וכיבוי או הסרת פלואורופורים, כך שניתן לצבוע ולצבוע סמנים נוספים11. הלבין איטרטיבי Extends Multiplexity (IBEX) הוצגה לאחרונה כפלטפורמת הדמיה איטרטיבית ידידותית למשתמשוחסכונית 12. בהתאם לשימוש בנוגדנים מסחריים ומיקרוסקופים קונבנציונליים, IBEX משתמש בליתיום בורוהידריד (LiBH4) כדי לכבות את הפלואורסצנציה של הצבעים הנפוצים ביותר מבלי לפגוע באפיטופים ברקמה, ומאפשר רכישת עד 75 פרמטרים לרקמה אחת13. התמונות המתקבלות מהצבעה מחזורית זו מיושרות באמצעות תוכנת הקוד הפתוח SimpleITK ליצירת מערכי נתונים מורכבים המתאימים לניתוחים מרחביים במימד גבוה.

משלימים לפנוטיפינג ברמת חלבון, שיטות טרנסקריפטומיה מרחביות יכולות לספק מידע חשוב על מצב השעתוק של התאים בסביבתם הטבעית. ראוי לציין כי היברידיזציה במקום (ISH) היא טכניקה פופולרית לזיהוי מיקום של רצפי DNA או RNA ברקמה מסוימת11. RNAscope הוא גישה מבוססת היטב של ISH המשתמשת בגלאיים עם כימיה ייחודית של Z כדי להגביר תמלילי RNA ברזולוציה של מולקולה בודדת והוא תואםלסוגי דגימות רבים ושונים. כפלטפורמה שאומצה באופן נרחב וזמינה מסחרית דרך Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope מציעה גלאים מאומתים נגד מגוון רחב של מטרות, ומפשטת את תכנון הניסויים ליישומים מגוונים.

ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של זהות ותפקוד התא על ידי שילוב זיהוי חלבון ו-RNA באותה רקמה. חלבונים מופרשים קצרי מועד, כמו ציטוקינים וכמוקינים, בדרך כלל חסרים צביעת נוגדנים אמינה על ידי IHC, אך ניתן לקבל מידע על ביטוי באמצעות כימות תמלילי ה-mRNA שלהם. ניסיונות קודמים לזהות יחד RNA וחלבון, כגון IHC כרוגני קונבנציונלי או TSA-OPAL, הוגבלו על ידי הגברת אותות לא ליניארית ופרוטוקולי שליפת אנטיגנים שגוזלי זמן15. בהשוואה לגישות אלו, שיטת Bex-Plex מאפשרת גילוי סימולטני של חלבון ו-RNA ב-high-plex תוך שמירה על הקשר מרחבי ומורפולוגיה גרעינית לרישום תמונה מדויק.

כאן אנו מציגים את "Bex-Plex", פרוטוקול המשלב את פלטפורמות IBEX ו-RNAscope לצורך אפיון סימולטני וכמותי של מצבי השעתוק והתרגום של תאים ברקמות הטבעיות שלהם. ב-Bex-Plex, רקמות מוטמעות, OCT קבועות, עוברות את פרוטוקול IBEX הסטנדרטי ואחריו תהליך עבודה של RNAscope HiPlex שונה במקצת, שבו שליפת המטרה מתבצעת בטמפרטורה של 60°C עם זמן דגירה של שעה, לעומת דגירה מקורית של 99°C למשך 5 דקות. דבר זה שומר על ארכיטקטורת הגרעין, ומאפשר יישור מדויק של הסמנים הפידוציאליים בעת רישום התמונות הנפרדות ממחזורי IF ו-ISH לאחד. פרוטוקול זה מתאים במיוחד למחקרים הדורשים ניתוח מרחבי סימולטני של ביטוי חלבונים ו-RNA ברקמות שלמות, במיוחד כאשר זמינות הרקמה מוגבלת או כאשר שימור הארכיטקטורה המרחבית הוא קריטי, כמו בניתוח מיקרו-סביבה של גידולים או במחקרי פרופיל חיסוני.

באמצעות מגיבים זמינים באופן נרחב ותואמים לרוב פלטפורמות ההדמיה, ניתן לבצע Bex-Plex על ידי כל צוות מחקר מיומן טכנית המכיר את הדמיית פלואורסצנט ועם גישה למיקרוסקופ קונבנציונלי. הפרוטוקול המוצג כאן מותאם לדגימות קפואות קבועות. נכון להיום, הפרוטוקול אומת ברקמות קפואות קבועות, וייתכן שיידרש אופטימיזציה נוספת ליישום על סוגי דגימות אחרים כגון FFPE או דגימות קליניות אנושיות.

תהליך עבודה זה יהיה יקר ערך לכל הקשר שבו הרקמה מוגבלת או יקרה, כמו ביופסיות רקמה או ניסויים בבעלי חיים עם מדגם מוגבל, וכן לפנוטיפינג של תאים שקשה להפיק באמצעות טכניקות דיסוציאטיביות. Bex-Plex מספק מידע סימולטני וכמותי על הפרופילים השעתוקיים והתרגומיים של תאים בודדים, תוך שמירה על ההקשר המרחבי שלהם, נתונים הייחודיים לענות על שאלות על הקשרים והדיבור בין התאים בסביבתם המקורית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים המפורטים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו (מספר פרוטוקול S24049). עכברים זכרים ונקבות בגילאי 7-12 שבועות עם רקע גנטי C57BL/6 ומאוחסנים בתנאים מסוימים ללא פתוגנים שימשו לניסויים אלה.

1. הכנת רקמות

  1. הורד עכברים ניסיוניים באמצעות אמצעים ראשוניים ומשניים מאושרים (למשל, המתת חסדCO2 והפרעת צוואר הרחם) וקוצר רקמות מעניינות למדיות מושלמות.
  2. הכינו מלאי חדש של קיבוע רקמות על ידי דילול תמיסת מלאי של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) ל-0.5% או 1% PFA ב-1X PBS. השתמש ב-0.5% PFA לרקמות בנפח נמוך יותר כמו בלוטות לימפה ו-1% PFA לרקמות בנפח גבוה יותר כמו גידולים...
    אזהרה: פאראפורמלדהיד דליק ורעיל אם נבלע או נצרך. התמודדו עם ציוד מגן מתאים והימנעו ממגע עם העור או העיניים.
  3. העבר רקמות ללוח של 24 בארות עם 2 מ"ל קיבוע לכל באר ודגור ללילה בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: זמני דגירה מעל 16 שעות עלולות לגרום לבעיות קיבוע יתר.
  4. מלאו את הבארות של צלחת 24 בארות חדשה ב-1X PBS והעבירו רקמות מהצלחת הקיבוע.
    נקודת הפסקה: במידת הצורך, ניתן לאחסן רקמות ב-1X PBS בטמפרטורה של 4°C למשך עד 7 ימים.
  5. גזמו שומן/פסולת מיותר מהרקמות אחד אחרי השני באמצעות כוונת דיסקציה וכלים. הוסיפו נפח קטן של 1X PBS ישירות לרקמה כדי למנוע התייבשות בזמן הגזירה.
  6. הכינו תמיסה של 30% ללא סוכרוז על ידי דילול אבקת סוכרוז ב-1X PBS.
  7. העבר את הרקמות ללוח של 24 בארות עם 2 מ"ל סוכרוז 30% לכל באר ודגר אותו לילה בטמפרטורה של 4°C להתייבשות. הרקמות מיובשות כראוי כאשר הן שוקעות לתחתית הבארות.
  8. מלאו את הקריומולד המסומן ב-OCT והניחו את הרקמות אחת אחת בתבניות. כיוון הרקמה תלוי במקור, אך ההמלצה הסטנדרטית שלנו היא ששטח הפנים הגדול ביותר יהיה מקביל לתחתית הקריומולד. ודא שהרקמות שקועות לחלוטין ב-OCT.
  9. הנח על קרח יבש למשך 10 דקות להקפיאה ואחסון בטמפרטורה של -80°C.

2. חתך רקמות

הערה: כל החומרים וחומרי המעבדה המשמשים לפרוטוקול זה חייבים להיות נטולי RNase. היזהרו למנוע זיהום בעת טיפול במגלשות.

  1. המיקרוסקופ החופשי מ-RNase ב-15 מיקרולטר דבק אלום כרום ומודגר במשך שעה בטמפרטורה של 60°C בתנור. ניתן לאחסן שקופיות מצופות כרום בטמפרטורת החדר (RT) עד חודש לפני השימוש.
  2. הוציאו את הרקמות המוטמעות ב-OCT מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והניחו בקריוסטט/קריוטום -20°C כדי להתאזן לפחות 20 דקות.
  3. רקמות חתך על שקופיות מצופות אלום כרום בעובי של 10–15 מיקרון.
  4. אחסן שקופיות עם חתכים חתוכים בטמפרטורה של 4°C או, אם צובעים באותו יום, תן להן להתאזן ל-RT. ניתן לאחסן שקופיות מחולקות בטמפרטורה של 4°C עד 5 ימים לפני השימוש.

3. צביעת חלבון

  1. במיכל הטבעה, השרו את המחסנית כדי לצבוע אותה ב-PBS 1X ללא RNase למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי OCT מהרקמות.
  2. השתמשו בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר קופסאות סביב הרקמות על הסלייד ולתת להם להתייבש במשך 2 דקות.
  3. הכינו תמיסת חסימה של בלוק קולטני FC אנטי-עכבר בגודל 10 מיקרוג·מיליטר ל-1 ב-PBS 1X ללא RNase. הוסיפו את בופר החסימה לדגימות על השקופית, תוך שימוש בכמות מספקת ליצירת בועה שמכסה לחלוטין את הרקמה (100–150 מיקרו-ליטר·חת-1).
    הערה: לעיתים נדרשת הוספת FBS או BSA (בדרך כלל 1–2%) לבופר החסימה עבור רקמות ו/או סמנים קשים.
  4. דגור את המחסניות ב-RT בקופסת צביעה לחה למשך שעה, ואז שטוף אותן לחלוטין במיכל טבילה מלא ב-1X PBS ללא RNase למשך 5 דקות.
  5. הכינו את תמיסת הצביעה הראשונית של נוגדנים ב-PBS 1X ללא RNase, עם תכנון של 100-200 מיקרוליטר לכל חתך רקמה. דילול נוגדנים סטנדרטי נע בין 1:50 ל-1:200, אך מומלץ לבצע טיטרציות צביעה בודדות כדי לזהות את גורם הדילול הטוב ביותר עבור נוגדן ו/או סוג רקמה מסוים. מערבולת ופולס מסובבים את הנוגדנים לפני הפיפט כדי למנוע הצטברות פלואורסצנטית.
  6. הסר את השקופיות מהשטיפה וספוג בעדינות את הנוזל העודף מפינת קופסאות הדגימה באמצעות מגבון סופג כדי למנוע דילול תמיסת הנוגדנים.
  7. מרחו את תמיסת הנוגדנים באותו אופן כמו תמיסת החסימה, ויוצרים בועה מעל הרקמה.
  8. הנח את המגלשות אופקית בתנור של 37°C ודגרה במשך שעה. חלופה נוספת היא Incubate Slides ב-RT למשך 3–4 שעות בקופסה לחה. ניתן להשתמש בפרוטוקולי IF סטנדרטיים שכבר מותאמים לרקמה הרצויה. שמרו על מגלשות בסביבה לחה במהלך הדגירה כדי למנוע התייבשות. (למשל, השתמש במגבת נייר רטובה בתחתית מגש הצביעה).
  9. שטוף את השקופיות על ידי טבילה ב-PBS 1X ללא RNase למשך 2 דקות. חזור על זה פעמיים לסך הכל שלוש שטיפות. במידת הצורך עבור לוח הצביעה שלך, הכין תמיסת צביעה משני לצביעת נוגדנים ב-PBS 1X ללא RNase במהלך תקופה זו. דילול נוגדנים סטנדרטי נע בין 1:500 ל-1:1000, אך מומלץ לבצע טיטרציות צביעה בודדות כדי לזהות את גורם הדילול הטוב ביותר עבור נוגדן ו/או סוג רקמה מסוים.
  10. סחוט כל עודף PBS מהשקופיות באמצעות ניגוב סופג והוסף 100–200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים משנית לכל חתך רקמה. הנח את המחסניות אופקית בטמפרטורה של 37°C בתנור ודוגר למשך 30 דקות. לחילופין, ניתן לצבוע את הסליידס ב-RT למשך 1–2 שעות בקופסה לחה.
  11. שטוף את השקופיות על ידי טבילה ב-1X PBS ללא RNase למשך 2 דקות. חזור על זה פעמיים לסך הכל שלוש שטיפות.
  12. מדלל צבע גרעיני DAPI לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם·מיליטר⁻1 ב-1X PBS ללא RNase והוסף 100–200 מיקרוליטר לכל חתך רקמה.
  13. הדגרה להחלקות ל-10 דקות ב-RT בקופסה לחה, ואז שטוף פעם אחת על ידי טבילה ב-1X PBS ללא RNase וטבילה קצרה למעלה ולמטה.
  14. ספוג את הנוזל העודף מהשקופיות באמצעות מגב סופג ומוסיפים 20–30 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם בסיס מימי נגד פייד לכל חלק. מניחים בזהירות כיסוי על המחסנית, תוך הקפדה למזער בועות, ותנו למדיום ההרכבה להתייבש במשך 15–30 דקות.
  15. דמיינו את השקופיות המוכתמות. להסבר מפורט יותר על שיקולי עיצוב פאנלים ורכישת תמונות עבור IBEX, ראו את פרוטוקולי IBEX המקורייםשפורסמו 12,13.
    נקודת הפסקה: מחסן מחסניות מותקנות בחושך בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 ימים, אך אנו ממליצים לפעול מיד כדי להבטיח מינימום התדרדרות RNA.

4. הלבנת פלואורופור וצביעה איטרטיבית של חלבונים

  1. טבלו את הסליידס ב-PBS 1X ללא RNase עד שהכיסוי מחליק בקלות ללא הפעלת כוח. תלוי כמה זמן הכיסוי מותקן, זה יכול לקחת עד 16 שעות.
  2. בזמן שהשקופיות מושרות, הכינו תמיסה של 1 מ"ג·מ"ל ל-1 LiBH₄ ב-DI H₂O ללא RNase על ידי ערבוב עדין עד להמסה מלאה והמתינו 10 דקות לפעולה. ההפעלה מתרחשת כאשר בועות קיימות בתמיסה והפעילות נמשכת עד 4 שעות.
    זהירות: LiBH4 הוא פעיל למים, הימנע מחשיפה מופרזת של אבקת אבקה ללחות ויש לפנות את הפסולת בצורה נכונה בהתאם.
  3. שטפו את הסליידסים פעם אחת במשך 2 דקות ב-PBS 1X ללא RNase להסרת שאריות מדיום ההתקנה, ואז פיפטו 100–150 מיקרוליטר של תמיסת LiBH4 על כל רקמה. לדגר בקופסה לחה למשך 15 דקות.
    הערה: בהתאם לפלואורופורים המשמשים לצביעה, ייתכן שיהיה צורך להאריך את זמן הדגירה (נדון בהרחבה במאמרי שיטות IBEX)12,13.
  4. שטפו את השקופיות פעם אחת על ידי טבילה ב-PBS 1X ללא RNase וטבילה קצרה למעלה ולמטה.
  5. המשך לצבוע את השקופיות בסמנים חלבונים נוספים על ידי שלבים 3.5-3.15. אין צורך לצבוע מחדש את הצבע הגרעיני כי הוא לא מלבין ב-LiBH4. חזרו על צביעת חלבון במידת הצורך.
    נקודת הפסקה: ניתן לאחסן את המחסניות המותקנות בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה לפני הלבנת מחזור החלבון/IBEX האחרון וממשיכים ל-RNA.
  6. מיד לעבור ל-RNAscope HiPlex לאחר הלבנת הפלואורופורים מהמחזור האחרון. למרות שבוצעו עד שישה מחזורים של IBEX סטנדרטי ללא אובדן רקמה או אפיטופה, איננו ממליצים לעבור שלושה מחזורי צביעת חלבון עבור פרוטוקול זה, בשל האפשרות שאיכות תמלול ה-RNA תרד לאורך זמן.

5. הכנת שקופית ל-RNAscope HiPlex

  1. טבלו את הסליידס לחלוטין ב-PBS 1X ללא RNase עד שהכיסוי מחליק בקלות ללא כל כוח. תלוי כמה זמן הכיסוי מותקן, זה יכול לקחת עד 16 שעות. שטפו פעם אחת במשך 2 דקות ב-PBS 1X PBS ללא RNase כדי להסיר שאריות בינוניות מתקנת.
  2. הכינו 200 מ"ל של 50% אתנול, 200 מ"ל של 70% אתנול, ו-400 מ"ל של 100% אתנול.
  3. הדליקו תנור היברידיזציה ומכוונים ל-60°C. מדלל את ה-10X Target Retrieval Regain למלאי עבודה של 1X ב-DIH2O ללא RNase וחמם מראש על ידי הכנסתו לתנור עד שלב 5.8.
    הערה: אי חימום מוקדם של תגובת שחזור המטרה ל-60°C תשפיע על רישום תמונות במחזורים נפרדים. מגיב השליפה של המטרה חייב להישאר בטמפרטורה של 60°C לאורך כל שלב השחזור.
  4. טבלו את השקופיות ב-50% אתנול. תדגר ל-5 דקות ב-RT.
  5. הזיזו את השקופיות מ-50% אתנול וטבלו ב-70% אתנול. תדגר ל-5 דקות ב-RT.
  6. הסר את השקופיות מה-70% אתנול וטבול ב-100% אתנול. דגר במשך 5 דקות ב-RT וחזור על זה עם אתנול טרי 100%.
  7. הסר את המחסניות מהאתנול של 100% ותן להתייבש ב-RT למשך 5 דקות.
  8. הוסיפו 100–150 מיקרוליטר מ-60°C 1X Reactor Reactor Reactor Reactation לכל חתך רקמה והניחו את השקופיות בתנור ההיברידיזציה. דגרו בטמפרטורה של 60°C למשך שעה.
  9. הסר את המחסניות ושטוף על ידי טבילה ב-DI H2O ללא RNase למשך 15 שניות. בשלב זה, שנו את הטמפרטורה שנקבעה בתנור ל-40°C.
  10. העבר את המחסניות ל-100% אתנול ודגר במשך 5 דקות, ואז מייבש ב-RT לפחות 5 דקות.
  11. מרחו פרוטאז III על השקופיות, 1–2 טיפות לכל חתך רקמה. הניחו את המחסניות בתנור ההיברידיזציה ודגרו בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות.
  12. טבלו את הסליידס ב-DI H2O ללא RNase ושטפו על ידי טבילה קצרה למעלה ולמטה. חזור על הפעולה עם מים מזוקקים טריים לסך הכל 2 שטיפות (שטיפות).

6. הכנת תגובת RNAscope והיברידיזציה של גלאי

  1. הכינו את מלאי ה-RNAscope HiPlex ואת חומר הדילול של ה-HiPlex על ידי חימום ל-40°C למשך 10 דקות בתנור או באמבט מים.
  2. לרגע ספין פולס למטה בכל 50X מניות הגשושים. הכינו תערובת גלאי עבודה על ידי דילול כל גלאי יעד ייחודי ל-1X באמצעות מדלל גלאי RNAscope. תכנן להשתמש ב-50–100 מיקרוליטר של תערובת פרוב לכל רקמה ולערבב היטב על ידי מערבולת לפני השימוש. פרוטוקול RNAscope HiPlex יכול להכיל עד 3 מחזורים של 4 פרובים (12 גשושים בסך הכל המסומנים T1-12). לקבלת הנחיות לעיצוב הגשושים, יש להתייעץ עם פרוטוקול RNAscope14 שפורסם במקור.
  3. הניחו את מגברי ה-RNAscope HiPlex 1–3 ו-HiPlex Fluoro T1-T4 ב-RT כדי להתאזן.
  4. קחו את השקופיות המטופלות בפרוטאז III ופיפטות של 50–100 מיקרוליטר מתערובת הגשוש על כל חתך רקמה. הניחו אופקית בתנור ההיברידיזציה ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 40°C.
  5. שטוף את המחסניות על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה עם בופר טרי לסך הכל 2 שטיפות (2 שטיחות).
    נקודת הפסקה: ניתן לאחסן שקופיות במאגר SSC 5X ב-RT במהלך הלילה, כפי שמתואר בפרוטוקול RNAscope מ-ACD. אם משתמשים בנקודת ההפסקה הזו, שימו לב שיידרשו שתי שטיפות של 2 דקות ב-1X wash buffer בבוקר שלמחרת.

7. הגברת גשוש

הערה: ודא שכל המגבים מאוזנים ל-RT לפני יישום על שקופיות.

  1. הוסף 1–2 טיפות של תגובת HiPlex Amp1 לסליידס ודחף בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
  2. הוסיפו 1–2 טיפות של תגובת HiPlex Amp2 לשקופיות ודחפו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
  3. הוסיפו 1–2 טיפות של מגיב HiPlex Amp3 לסליידס ודגרו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
  4. הוסיפו 1–2 טיפות של תגובת HiPlex Fluoro T1-T4 למקופיות ודחפו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 15 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
  5. הוסף 3–4 טיפות של תגובת HiPlex DAPI לכל חתך רקמה ודגר למשך דקה אחת ב-RT.
  6. הסר את ה-DAPI על ידי ספיקת הנוזל מהשקופיות באמצעות ניקוי סופג משימות. מיד הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם בסיס מימי (יכול להיות זהה לזה שמשמש בשלבי הצביעה של IBEX) לכל חלק. מניחים בזהירות כיסוי על המחסנית, תוך הקפדה למזער בועות, ותנו למדיום ההרכבה להתייבש במשך 15–30 דקות.
  7. המשך להדמיה.
    נקודת עצירה: ניתן לאחסן את המחסניות המותקנות בחושך בטמפרטורה של 4°C עד 3 ימים, אך אנו ממליצים לפעול במהירות כדי להבטיח מינימום התדרדרות RNA.

8. חיתוך הפלואורופורים והיברידיזציה איטרטיבית של RNA

  1. כדי להסיר את הכיסוי מהשקופיות, השרה ב-4X SSC buffer לפחות 30 דקות ב-RT. שטוף פעם אחת על ידי טבילה מלאה של המחסניות בבופר SSC חדש של 4X וטבילה קצרה למעלה ולמטה.
  2. פתח אמפולה חדשה של תמיסת חיתוך ויצר 10% חומר עבודה על ידי דילול עם 4X SSC.
  3. הניחו את המחסניות בקופסה לחה והוסיפו 3–4 טיפות מתמיסת החיתוך של 10%. תדגר ב-RT ל-15 דקות, ואז תשטוף את השקופיות על ידי טבילה מלאה ב-0.5% PBST למשך 2 דקות. חזור על זה עם PBST טרי לסך הכל 2 שטיפות.
  4. כדי להמשיך במחזור הדמיה 2 של לוח RNAscope, יש לאזן את המגיב HiPlex Fluoro T5-T8 ל-RT.
  5. הפעל את תנור ההיברידיזציה ומכוון את הטמפרטורה ל-40°C.
  6. הוסיפו את המגיב HiPlex Fluoro T5-T8 לשקופיות ודוגרו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 15 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
  7. ספוג בזהירות את הנוזל העודף מהשקופיות. מיד הוסיפו 100 מיקרו ליטר של מדיום התקנה לכל חלק והניחו בזהירות כיסוי על המחסנית. תן למדיום ההרכבה להתייבש 15–30 דקות ואז המשך להדמיה.
  8. חזור על שלבים 8.1–8.7 עם תגובת HiPlex Fluoro T9-T12 לסך של 3 מחזורי RNAscope אם זה מתאים. יש לשים לב שלמרות ש-3 מחזורים אפשריים עם פרוטוקול RNAscope HiPlex, הזמן הנוסף הנדרש לצביעה של חלבונים בפרוטוקול זה עשוי להשפיע על איכות ה-RNA. לכן, ייתכן ש-3 מחזורים לא תמיד יהיו ישימים, בהתאם לתמלילים הספציפיים שאליהם ממוקדים.

9. עיבוד תמונה

  1. עבד בנפרד את הקבצים הגולמיים מכל סבב ובצע עיבוד תמונה באמצעות פרמטרים עקביים, כולל הגדרות חיסור ברקע, מסנני החלקה וסוג טרנספורמציה של רישום... הערוצים צריכים לקבל שם עם תו מפריד עקבי (למשל מחזור 1: CD45 AF532, שבו ":" מבחין בין מחזור לבין סמן/פלור).
  2. הפעל את תוכנת SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) ולחץ על הרחבות Imaris > SimpleITK > רישום אפיני של z-stack באמצעות ערוץ משותף.
  3. העלה קובץ תמונה אחד מכל אחד ממחזורי המולטיפלקס והזן את תו המפריד לכל הערוצים עם שמות (למשל ":").
  4. בחר את הערוץ שישמש לרישום התמונה ואת התמונה הקבועה שאליה כל שאר התמונות ייושרו. מומלץ להשתמש ב-DAPI כסמן פידוציאלי, אם כי ניתן להשתמש בכל ערוץ משותף בשם בין כל המחזורים.
  5. לחץ על "רשם" ואז "דגימה מחדש ושמור תמונה משולבת".
  6. המשך למחקר בהמשך עם התוכנה שבחרת. למידע נוסף על עיבוד ורישום תמונה, יש לעיין בפרוטוקול IBEXהמקורי 12,13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה ב-Bex-Plex.
רקמות קפואות קבועות שנחתכות על שקופיות מצופות אלום כרום עוברות עד 3 מחזורים של IBEX סטנדרטי, ואחריהם עד שלושה מחזורי RNAScope HiPlex שבהם שלב שליפת המטרה הראשוני מתבצע בטמפרטורה של 60°C למשך שעה. תמונות ממחזורים נפרדים נרשמות ומיושרות באמצעות סימון פידוציאלי (למשל, DAPI) ליצירת מאגר נתונים מולטיפלקס לניתוח במורד הזרם. 

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך העבודה של Bex-Plex משלב את פלטפורמת צביעת החלבונים האיטרטיבית, IBEX, עם RNAscope hybridization in situ כדי לאפשר זיהוי סימולטני של חלבונים ותמלילי RNA ברזולוציה של תא יחיד. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק שיטה ניתנת לשחזור לניתוח מרחבי משולב של ביטוי חלבונים ו-RNA ברקמות שלמות. היכולת למדוד ביטוי חלבון ו-RNA באותה רקמה הציבה בעבר אתגרים טכניים: עלויות גבוהות, שלבי שליפה מורכבים של אנטיגן, קיבולת מולטיפלקס מוגבלת, מגבלות רזולוציה (לא תא יחיד), הגברת אות לא ליניארית, ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. לא נעשה שימוש בכלים מבוססי בינה מלאכותית בהכנת כתב היד הזה.

תרומות מחברים:

SK תרמה לאצירת נתונים, ניתוח נתונים, חקירה וכתיבה. CM תרם לאצירת נתונים. PH תרם לניתוח נתונים. AV תרם לאצירת נתונים. VM תרם לקונספטואליזציה, אוצרות נתונים, ניתוח נתונים, פיקוח וכתיבה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת הילדים של אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו, מחלקת אלרגיה, אימונולוגיה וראומטולוגיה, ומענק NIH NIGMS R00GM147841 (MOSAIC K99/R00) ו-NCI U54CA272220 (מענק FIRST של UC San Diego). המחברים רוצים גם להודות לאנדראה רדטקה על הקמת שיטת IBEX המקורית, בלעדיה לא היינו יכולים ליצור את Bex-Plex.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לBiopioneerMCNT-1.5F
EtOH 200 הוכחהFisher ScientificBP28184
20X SSC מאגרInvitrogenAM9765
צלחות 24 באר
נוגדן Alexa Fluor 488 נגד CD11b עכברBiolegend101217
נוגדן Alexa Fluor 523 נגד CD3e עכברInvitrogen58-0032-82
נוגדן Alexa Fluor 647 נגד Ly6G עכברBiolegend127610
נוגדן Alexa Fluor 700 נגד CD68 עכברBiolegend137025
פתרון BD Cytofix/Cytoperm לקיבוע והחדרהBD554722
Chrome alum gelatinFisherNC1692262
מיקרוסקופ קונפוקלי (למשל Leica Stellaris)
תבניות קריומו]לדVWR25608-922
קריוזט (למשל CryoStar NX50 Cryostat)Thermofisher Scientific957100
להבי קריוזט (למשל Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)Leica Biosystems14035843496
DAPIThermofisher Scientific62248
מיקרוסקופ ניתוח (למשל Zeiss SteREO Discovery.V8)
כלי ניתוח
קרח יבש
מיכל מבול להכתמת שקופיות (למשל Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)Fisher Scientific 22-038-489
Fluoromount-GFisherOB10001
אמבט מים מחומם
מברשות היסטולוגיה (למשל Ted Pella Camel Hair Brushes)Fisher ScientificNC2023341
תנור הכלאה (למשל HybEZ II Hybridization System)ACD321710
תוכנת ניתוח תמונות לבחירה
עט PAP ImmEdge Hydrophobic BarrierVector LaboratoriesH-4000
Kimwipes VWR21905-026
ליתיום בורוהיידרידSTREM Chemicals93-0397
מיקרופיפטות (P-10, P-20, P-200, P-1000)
מיקרוצנטריפוגה מיני (למשל Corning LSE Mini Microcentrifuge)Corning6770
Mouse BD Fc BlockBD553142
זכוכית כיסוי מס' 1.5VWR48393-241
קצות פיפטה (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7ACD420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6ACD317261-T6
ערכת ריאגנטים RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (כולל ערכת זיהוי, תמיסת חיתוך, ריאגנטים של פרוטאז, ריאגנטים להשבת יעד, ותמיסת שטיפה)ACD324409
RNAscope Protease IIIACD322337
RNase ZAPMillipore SigmaR2020-250
תוכנת Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
מגש להכתמת שקופיות/תא לחות
סוכרוז BioxtraSigmaS7903-1KG
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost PlusVWR48311-703
Tissue-Tek OCTVWR25608-930
Tween-20, דרגת מולקולרית לביולוגיהPromegaH5152
מים נטולי DNase/RNase UltraPureFisher Scientific10977023

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  2. Zhao, X., Subramanian, S. Intrinsic resistance of solid tumors to immune checkpoint blockade therapy. Cancer Res. 77 (4), 817-822 (2017).
  3. Bailey, P., et al. Exploiting the neoantigen landscape for immunotherapy of pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Rep. 6 (35848), (2016).
  4. Belli, A., et al. Targeting the microenvironment in solid tumors. Canc Treat Rev. 65 (1), 22-32 (2018).
  5. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautès–Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol. 14 (1), 717-734 (2017).
  6. Bonaventura, P., et al. Cold tumors: A therapeutic challenge for immunotherapy. Front Immunol. 10 (168), (2019).
  7. Li, J., et al. Tumor cell-intrinsic factors underlie heterogeneity of immune cell infiltration and response to immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
  8. Tokunaga, R., et al. CXCL9, CXCL10, CXCL11/CXCR3 axis for immune activation - A target for novel cancer therapy. Cancer Treat Rev. 63 (1), 40-47 (2018).
  9. Halama, N., et al. Tumoral immune cell exploitation in colorectal cancer metastases can be targeted effectively by anti-CCR5 therapy in cancer patients. Cancer Cell. 29 (1), 587-601 (2016).
  10. Kawasaki, K., et al. PD-L1-expressing cancer-associated fibroblasts induce tumor immunosuppression and contribute to poor clinical outcome in esophageal cancer. Cancer Immunol Immunother. 72 (11), 3787-3802 (2023).
  11. Lee, C. Y. C., McCaffrey, J., McGovern, D., Clatworthy, M. R. Profiling immune cell tissue niches in the spatial -omics era. J allergy Clin Immunol. 155 (3), 663-677 (2025).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (1), 378-401 (2022).
  13. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  14. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Maltez, V. I., et al. Agonistic anti-CD40 antibody treatment converts resident regulatory T cells into activated type 1 effectors within the tumor microenvironment. Immunity. , (2026).
  17. Ben-Chetrit, N., et al. Integration of whole transcriptome spatial profiling with protein markers. Nat Biotechnol. 41, 788-793 (2023).
  18. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS ONE. 10 (3), e0120120(2015).
  19. Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. J. Simultaneous visualization of RNA and protein expression in tissue using a combined RNAscope in situ hybridization and immunofluorescence protocol. Methods Mol Biol. 2148, 301-312 (2025).
  20. Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cancer ResearchAllIBEXCancerImagingTumor MicroenvironmentSpatial Transcriptomics
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים