Bex-Plex מאפשר ויזואליזציה סימולטנית של סמני חלבון ותמלילי חומצות ריבונוקליאית לפרופיל מרחבי עמוק של רקמות שלמות

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב צביעת חלבונים איטרטיבית (IBEX) עם טכנולוגיית היברידיזציה RNAscope במקום , לצורך פנוטיפינג מרחבי עמוק של רקמות קפואות קבועות שלמות ליישומים של פרופיל מרחבי ברזולוציה גבוהה.

Abstract

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר פרופיל מרחבי בו-זמני של סמנים של חלבונים וחומצה ריבונוקלאית (RNA) ברזולוציית תא יחיד ברקמות שלמות. אחת הבעיות המרכזיות סביב סרטן גידול מוצק היא חוסר היכולת לחזות את תגובת המטופלים להתערבות טיפולית. פענוח המורכבויות הללו דורש מדידה כמותית של התנהגויות תאיות, אינטראקציות ופנוטיפים בתוך רקמות שלמות. בפרט, הפרוטאום והטרנסקריפטום מספקים מידע חופף אך לא מיותר, שיכול להיות קריטי לעיצוב אימונותרפיה רציונלית. עם זאת, כיום אין דרך פשוטה וחסכונית לפרופיל לעומק הן את מצב השעתוק והן את המצב התפקודי של כל התאים במיקרו-סביבת הגידול, תוך שמירה על המידע הקריטי על מיקום המרחב שלהם. לשם כך, הצלחנו לשלב בהצלחה את פלטפורמת IBEX (הלבנה איטרטיבית מאריכה רב-פלקסיות) עם HiPlex RNAscope, כדי להמחיש בו-זמנית סמנים של חלבונים בעלי פלקס גבוה ותמלולים של חומצה ריבונוקלאית (RNA) עם רזולוציית תא יחיד. גישה זו משלבת שלב שדרוג שונה לשליפת מטרות RNA כדי לשמר את המורפולוגיה הגרעינית ולאפשר יישור תמונה מדויק בין מחזורים. "Bex-Plex" מאפשר לנו לבצע פרוטוקול IBEX לא מותאם על רקמות קפואות קבועות, ואחריו פרוטוקול HiPlex RNAscope, שבו אנו משתמשים בשחזור RNA מותאם כדי להבטיח יישור ברמה הגרעינית עם מחזורי IBEX. פרוטוקול זה מותאם לרקמות קפואות קבועות ומאפשר ניתוח מרחבי משולב של מצבים תאי שעתוק ותפקודיים. היכולת לפרופיל ברמת תא יחיד זו לא רק מספקת מאגר מידע עמוק על הרקמה עצמה, אלא גם יכולה לאפשר תחזיות לגבי האינטראקציות התאיות המורכבות שמניעות את התגובה הטיפולית, ולספק מסגרת לחקר ביולוגיה מרחבית במיקרו-סביבות גידול ומערכות קשורות.

Introduction

מאז ההצגתם ב-2011, אימונותרפיות סרטן שמפחיתות את הדיכוי של תאי T ציטוטוקסיים על ידי חסימת מולקולות נקודת ביקורת מעכבות כמו PDL-1 ו-CTLA-4 הפכו לסטנדרט הזהב לטיפול בגידול מוצק¹. עם זאת, למרות שימוש נרחב במטופלים, היעילות הקלינית של תרופות אלו משתנה מאוד, שכן סרטן גידולים מוצק רבים מופיעים באופן פנימי עם טיפולים אלו או בסופו של דבר יוצרים עמידות לטיפולים^{אלו 2}. במקרים רבים זה נובע מהאופי ההטרוגני מאוד של גידולים מוצקים, אפילו בקרב אותו סרטן סוג³. הבנה מעמיקה יותר של הקשרים התאים המתרחשים בגידולים מוצקים היא המפתח לשיפור שיטות הטיפול. לכן, זיהוי המנגנונים והאינטראקציות המדויקים שמרכיבים ומחזיקים את ההתנגדות הזו נמצא בחזית מחקר הסרטן. כאן, אנו שואפים לפתח שיטה המאפשרת ניתוח מרחבי משולב של ביטוי חלבונים ו-RNA ברקמות שלמות, כדי לאפיין טוב יותר את האינטראקציות התאיות המורכבות הללו.

מיקרו-סביבת הגידול (TME) מורכבת מהרכיבים התאיים והמבניים הלא-סרטניים שמעצבים את צמיחת הגידול ואת תגובת החיסון, כולל פיברובלסטים הקשורים לסרטן, תאי חיסון חודרים, רכיבים וסקולריים ומטריצה חוץ-תאית⁴. לאחרונה התברר כי הרכב וארגון ה-TME משפיעים מאוד על האם הגידולים מתירים או עמידים לחדירת מערכת חיסונית, אחד הגורמים המרכזיים שקובעים את התגובה לאימונותרפיה. בסרטן רבים, פנוטיפ "מדבר חיסוני", המאופיין במספר נמוך של תאי T ובנוכחות אוכלוסיות מיאלואידים מדכאות חיסון גבוהות, מתאם לתגובה לקויה לטיפולי חסימה בנקודות ביקורת ^6,7. איתות כימוקין שולט ברבים מהדינמיקות הללו. לדוגמה, CXCL1 ו-CCL2 מושכים תאי מיאלואידים מדכאים חיסון, בעוד שציר CXCR3-CXCL9/CXCl10 מגייס גם תאי T ציטוטוקסיים וגם תאי רגולציה לתוך הגידול⁸. כתוצאה מכך, סביבת האיתות הספציפית לנישה יכולה להשפיע באופן משמעותי על פנוטיפ ותפקוד התא. לדוגמה, אצל חולי סרטן המעי הגס, ציר CCL5-CCR5 שולט בתפקוד המדכא של המאקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) וחסימת אות זה מטה את TAM לפנוטיפ אנטי-גידולי ומתאם לתגובות קליניות משופרות^9. יתרה מזאת, אינטראקציות ישירות בין תאי חיסון, פיברובלסטים הקשורים לסרטן ו/או תאי גידול באמצעות ICAM ו-PDL-1 עלולות לגרום לעייפות חיסונית ולפגוע במערכת החיסון האנטי-גידולי¹⁰. יחד, ממצאים אלו מדגישים את חשיבות הניתוחים המפותחים במרחב כדי להבין כיצד ה-TME משפיע על היעילות הטיפולית.

הדמיה אימונופלואורסצנטית (IF) נותרה גישה יסודית להצגת ביטוי חלבונים ואינטראקציות בין תאים לרקמה. התחום התקדם מ-IF קונבנציונלי של 3-4 צבעים לתהליכי דימות בעל תוכן גבוה התלויים בצביעה ודימות איטרטיביים. בשיטות אלו, מערכי נתונים גדולים נוצרים באמצעות מחזורים חוזרים של תיוג נוגדנים, הדמיה וכיבוי או הסרת פלואורופורים, כך שניתן לצבוע ולצבוע סמנים נוספים¹¹. הלבין איטרטיבי Extends Multiplexity (IBEX) הוצגה לאחרונה כפלטפורמת הדמיה איטרטיבית ידידותית למשתמש^{וחסכונית 12}. בהתאם לשימוש בנוגדנים מסחריים ומיקרוסקופים קונבנציונליים, IBEX משתמש בליתיום בורוהידריד (LiBH₄) כדי לכבות את הפלואורסצנציה של הצבעים הנפוצים ביותר מבלי לפגוע באפיטופים ברקמה, ומאפשר רכישת עד 75 פרמטרים לרקמה אחת¹³. התמונות המתקבלות מהצבעה מחזורית זו מיושרות באמצעות תוכנת הקוד הפתוח SimpleITK ליצירת מערכי נתונים מורכבים המתאימים לניתוחים מרחביים במימד גבוה.

משלימים לפנוטיפינג ברמת חלבון, שיטות טרנסקריפטומיה מרחביות יכולות לספק מידע חשוב על מצב השעתוק של התאים בסביבתם הטבעית. ראוי לציין כי היברידיזציה במקום (ISH) היא טכניקה פופולרית לזיהוי מיקום של רצפי DNA או RNA ברקמה מסוימת¹¹. RNAscope הוא גישה מבוססת היטב של ISH המשתמשת בגלאיים עם כימיה ייחודית של Z כדי להגביר תמלילי RNA ברזולוציה של מולקולה בודדת והוא תואם^לסוגי דגימות רבים ושונים. כפלטפורמה שאומצה באופן נרחב וזמינה מסחרית דרך Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope מציעה גלאים מאומתים נגד מגוון רחב של מטרות, ומפשטת את תכנון הניסויים ליישומים מגוונים.

ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של זהות ותפקוד התא על ידי שילוב זיהוי חלבון ו-RNA באותה רקמה. חלבונים מופרשים קצרי מועד, כמו ציטוקינים וכמוקינים, בדרך כלל חסרים צביעת נוגדנים אמינה על ידי IHC, אך ניתן לקבל מידע על ביטוי באמצעות כימות תמלילי ה-mRNA שלהם. ניסיונות קודמים לזהות יחד RNA וחלבון, כגון IHC כרוגני קונבנציונלי או TSA-OPAL, הוגבלו על ידי הגברת אותות לא ליניארית ופרוטוקולי שליפת אנטיגנים שגוזלי זמן¹⁵. בהשוואה לגישות אלו, שיטת Bex-Plex מאפשרת גילוי סימולטני של חלבון ו-RNA ב-high-plex תוך שמירה על הקשר מרחבי ומורפולוגיה גרעינית לרישום תמונה מדויק.

כאן אנו מציגים את "Bex-Plex", פרוטוקול המשלב את פלטפורמות IBEX ו-RNAscope לצורך אפיון סימולטני וכמותי של מצבי השעתוק והתרגום של תאים ברקמות הטבעיות שלהם. ב-Bex-Plex, רקמות מוטמעות, OCT קבועות, עוברות את פרוטוקול IBEX הסטנדרטי ואחריו תהליך עבודה של RNAscope HiPlex שונה במקצת, שבו שליפת המטרה מתבצעת בטמפרטורה של 60°C עם זמן דגירה של שעה, לעומת דגירה מקורית של 99°C למשך 5 דקות. דבר זה שומר על ארכיטקטורת הגרעין, ומאפשר יישור מדויק של הסמנים הפידוציאליים בעת רישום התמונות הנפרדות ממחזורי IF ו-ISH לאחד. פרוטוקול זה מתאים במיוחד למחקרים הדורשים ניתוח מרחבי סימולטני של ביטוי חלבונים ו-RNA ברקמות שלמות, במיוחד כאשר זמינות הרקמה מוגבלת או כאשר שימור הארכיטקטורה המרחבית הוא קריטי, כמו בניתוח מיקרו-סביבה של גידולים או במחקרי פרופיל חיסוני.

באמצעות מגיבים זמינים באופן נרחב ותואמים לרוב פלטפורמות ההדמיה, ניתן לבצע Bex-Plex על ידי כל צוות מחקר מיומן טכנית המכיר את הדמיית פלואורסצנט ועם גישה למיקרוסקופ קונבנציונלי. הפרוטוקול המוצג כאן מותאם לדגימות קפואות קבועות. נכון להיום, הפרוטוקול אומת ברקמות קפואות קבועות, וייתכן שיידרש אופטימיזציה נוספת ליישום על סוגי דגימות אחרים כגון FFPE או דגימות קליניות אנושיות.

תהליך עבודה זה יהיה יקר ערך לכל הקשר שבו הרקמה מוגבלת או יקרה, כמו ביופסיות רקמה או ניסויים בבעלי חיים עם מדגם מוגבל, וכן לפנוטיפינג של תאים שקשה להפיק באמצעות טכניקות דיסוציאטיביות. Bex-Plex מספק מידע סימולטני וכמותי על הפרופילים השעתוקיים והתרגומיים של תאים בודדים, תוך שמירה על ההקשר המרחבי שלהם, נתונים הייחודיים לענות על שאלות על הקשרים והדיבור בין התאים בסביבתם המקורית.

Protocol

הנהלים המפורטים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו (מספר פרוטוקול S24049). עכברים זכרים ונקבות בגילאי 7-12 שבועות עם רקע גנטי C57BL/6 ומאוחסנים בתנאים מסוימים ללא פתוגנים שימשו לניסויים אלה.

1. הכנת רקמות

1. הורד עכברים ניסיוניים באמצעות אמצעים ראשוניים ומשניים מאושרים (למשל, המתת חסד_CO2 והפרעת צוואר הרחם) וקוצר רקמות מעניינות למדיות מושלמות.
2. הכינו מלאי חדש של קיבוע רקמות על ידי דילול תמיסת מלאי של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) ל-0.5% או 1% PFA ב-1X PBS. השתמש ב-0.5% PFA לרקמות בנפח נמוך יותר כמו בלוטות לימפה ו-1% PFA לרקמות בנפח גבוה יותר כמו גידולים...
   אזהרה: פאראפורמלדהיד דליק ורעיל אם נבלע או נצרך. התמודדו עם ציוד מגן מתאים והימנעו ממגע עם העור או העיניים.
3. העבר רקמות ללוח של 24 בארות עם 2 מ"ל קיבוע לכל באר ודגור ללילה בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: זמני דגירה מעל 16 שעות עלולות לגרום לבעיות קיבוע יתר.
4. מלאו את הבארות של צלחת 24 בארות חדשה ב-1X PBS והעבירו רקמות מהצלחת הקיבוע.
   נקודת הפסקה: במידת הצורך, ניתן לאחסן רקמות ב-1X PBS בטמפרטורה של 4°C למשך עד 7 ימים.
5. גזמו שומן/פסולת מיותר מהרקמות אחד אחרי השני באמצעות כוונת דיסקציה וכלים. הוסיפו נפח קטן של 1X PBS ישירות לרקמה כדי למנוע התייבשות בזמן הגזירה.
6. הכינו תמיסה של 30% ללא סוכרוז על ידי דילול אבקת סוכרוז ב-1X PBS.
7. העבר את הרקמות ללוח של 24 בארות עם 2 מ"ל סוכרוז 30% לכל באר ודגר אותו לילה בטמפרטורה של 4°C להתייבשות. הרקמות מיובשות כראוי כאשר הן שוקעות לתחתית הבארות.
8. מלאו את הקריומולד המסומן ב-OCT והניחו את הרקמות אחת אחת בתבניות. כיוון הרקמה תלוי במקור, אך ההמלצה הסטנדרטית שלנו היא ששטח הפנים הגדול ביותר יהיה מקביל לתחתית הקריומולד. ודא שהרקמות שקועות לחלוטין ב-OCT.
9. הנח על קרח יבש למשך 10 דקות להקפיאה ואחסון בטמפרטורה של -80°C.

2. חתך רקמות

הערה: כל החומרים וחומרי המעבדה המשמשים לפרוטוקול זה חייבים להיות נטולי RNase. היזהרו למנוע זיהום בעת טיפול במגלשות.

1. המיקרוסקופ החופשי מ-RNase ב-15 מיקרולטר דבק אלום כרום ומודגר במשך שעה בטמפרטורה של 60°C בתנור. ניתן לאחסן שקופיות מצופות כרום בטמפרטורת החדר (RT) עד חודש לפני השימוש.
2. הוציאו את הרקמות המוטמעות ב-OCT מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והניחו בקריוסטט/קריוטום -20°C כדי להתאזן לפחות 20 דקות.
3. רקמות חתך על שקופיות מצופות אלום כרום בעובי של 10–15 מיקרון.
4. אחסן שקופיות עם חתכים חתוכים בטמפרטורה של 4°C או, אם צובעים באותו יום, תן להן להתאזן ל-RT. ניתן לאחסן שקופיות מחולקות בטמפרטורה של 4°C עד 5 ימים לפני השימוש.

3. צביעת חלבון

1. במיכל הטבעה, השרו את המחסנית כדי לצבוע אותה ב-PBS 1X ללא RNase למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי OCT מהרקמות.
2. השתמשו בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר קופסאות סביב הרקמות על הסלייד ולתת להם להתייבש במשך 2 דקות.
3. הכינו תמיסת חסימה של בלוק ^קולטני FC אנטי-עכבר בגודל 10 מיקרוג·מיליטר ל-1 ב-PBS 1X ללא RNase. הוסיפו את בופר החסימה לדגימות על השקופית, תוך שימוש בכמות מספקת ליצירת בועה שמכסה לחלוטין את הרקמה (100–150 מיקרו-ליטר^·חת-1).
   הערה: לעיתים נדרשת הוספת FBS או BSA (בדרך כלל 1–2%) לבופר החסימה עבור רקמות ו/או סמנים קשים.
4. דגור את המחסניות ב-RT בקופסת צביעה לחה למשך שעה, ואז שטוף אותן לחלוטין במיכל טבילה מלא ב-1X PBS ללא RNase למשך 5 דקות.
5. הכינו את תמיסת הצביעה הראשונית של נוגדנים ב-PBS 1X ללא RNase, עם תכנון של 100-200 מיקרוליטר לכל חתך רקמה. דילול נוגדנים סטנדרטי נע בין 1:50 ל-1:200, אך מומלץ לבצע טיטרציות צביעה בודדות כדי לזהות את גורם הדילול הטוב ביותר עבור נוגדן ו/או סוג רקמה מסוים. מערבולת ופולס מסובבים את הנוגדנים לפני הפיפט כדי למנוע הצטברות פלואורסצנטית.
6. הסר את השקופיות מהשטיפה וספוג בעדינות את הנוזל העודף מפינת קופסאות הדגימה באמצעות מגבון סופג כדי למנוע דילול תמיסת הנוגדנים.
7. מרחו את תמיסת הנוגדנים באותו אופן כמו תמיסת החסימה, ויוצרים בועה מעל הרקמה.
8. הנח את המגלשות אופקית בתנור של 37°C ודגרה במשך שעה. חלופה נוספת היא Incubate Slides ב-RT למשך 3–4 שעות בקופסה לחה. ניתן להשתמש בפרוטוקולי IF סטנדרטיים שכבר מותאמים לרקמה הרצויה. שמרו על מגלשות בסביבה לחה במהלך הדגירה כדי למנוע התייבשות. (למשל, השתמש במגבת נייר רטובה בתחתית מגש הצביעה).
9. שטוף את השקופיות על ידי טבילה ב-PBS 1X ללא RNase למשך 2 דקות. חזור על זה פעמיים לסך הכל שלוש שטיפות. במידת הצורך עבור לוח הצביעה שלך, הכין תמיסת צביעה משני לצביעת נוגדנים ב-PBS 1X ללא RNase במהלך תקופה זו. דילול נוגדנים סטנדרטי נע בין 1:500 ל-1:1000, אך מומלץ לבצע טיטרציות צביעה בודדות כדי לזהות את גורם הדילול הטוב ביותר עבור נוגדן ו/או סוג רקמה מסוים.
10. סחוט כל עודף PBS מהשקופיות באמצעות ניגוב סופג והוסף 100–200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים משנית לכל חתך רקמה. הנח את המחסניות אופקית בטמפרטורה של 37°C בתנור ודוגר למשך 30 דקות. לחילופין, ניתן לצבוע את הסליידס ב-RT למשך 1–2 שעות בקופסה לחה.
11. שטוף את השקופיות על ידי טבילה ב-1X PBS ללא RNase למשך 2 דקות. חזור על זה פעמיים לסך הכל שלוש שטיפות.
12. מדלל צבע גרעיני DAPI לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם·מיליטר⁻¹ ב-1X PBS ללא RNase והוסף 100–200 מיקרוליטר לכל חתך רקמה.
13. הדגרה להחלקות ל-10 דקות ב-RT בקופסה לחה, ואז שטוף פעם אחת על ידי טבילה ב-1X PBS ללא RNase וטבילה קצרה למעלה ולמטה.
14. ספוג את הנוזל העודף מהשקופיות באמצעות מגב סופג ומוסיפים 20–30 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם בסיס מימי נגד פייד לכל חלק. מניחים בזהירות כיסוי על המחסנית, תוך הקפדה למזער בועות, ותנו למדיום ההרכבה להתייבש במשך 15–30 דקות.
15. דמיינו את השקופיות המוכתמות. להסבר מפורט יותר על שיקולי עיצוב פאנלים ורכישת תמונות עבור IBEX, ראו את פרוטוקולי IBEX המקוריים^{שפורסמו 12,13}.
    נקודת הפסקה: מחסן מחסניות מותקנות בחושך בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 ימים, אך אנו ממליצים לפעול מיד כדי להבטיח מינימום התדרדרות RNA.

4. הלבנת פלואורופור וצביעה איטרטיבית של חלבונים

1. טבלו את הסליידס ב-PBS 1X ללא RNase עד שהכיסוי מחליק בקלות ללא הפעלת כוח. תלוי כמה זמן הכיסוי מותקן, זה יכול לקחת עד 16 שעות.
2. בזמן שהשקופיות מושרות, הכינו תמיסה של 1 מ"ג·מ"ל ל-1 LiBH₄ ב-DI H₂O ללא RNase על ידי ערבוב עדין עד להמסה מלאה והמתינו 10 דקות לפעולה. ההפעלה מתרחשת כאשר בועות קיימות בתמיסה והפעילות נמשכת עד 4 שעות.
   זהירות: LiBH₄ הוא פעיל למים, הימנע מחשיפה מופרזת של אבקת אבקה ללחות ויש לפנות את הפסולת בצורה נכונה בהתאם.
3. שטפו את הסליידסים פעם אחת במשך 2 דקות ב-PBS 1X ללא RNase להסרת שאריות מדיום ההתקנה, ואז פיפטו 100–150 מיקרוליטר של תמיסת LiBH₄ על כל רקמה. לדגר בקופסה לחה למשך 15 דקות.
   הערה: בהתאם לפלואורופורים המשמשים לצביעה, ייתכן שיהיה צורך להאריך את זמן הדגירה (נדון בהרחבה במאמרי שיטות IBEX)^12,13.
4. שטפו את השקופיות פעם אחת על ידי טבילה ב-PBS 1X ללא RNase וטבילה קצרה למעלה ולמטה.
5. המשך לצבוע את השקופיות בסמנים חלבונים נוספים על ידי שלבים 3.5-3.15. אין צורך לצבוע מחדש את הצבע הגרעיני כי הוא לא מלבין ב-LiBH₄. חזרו על צביעת חלבון במידת הצורך.
   נקודת הפסקה: ניתן לאחסן את המחסניות המותקנות בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה לפני הלבנת מחזור החלבון/IBEX האחרון וממשיכים ל-RNA.
6. מיד לעבור ל-RNAscope HiPlex לאחר הלבנת הפלואורופורים מהמחזור האחרון. למרות שבוצעו עד שישה מחזורים של IBEX סטנדרטי ללא אובדן רקמה או אפיטופה, איננו ממליצים לעבור שלושה מחזורי צביעת חלבון עבור פרוטוקול זה, בשל האפשרות שאיכות תמלול ה-RNA תרד לאורך זמן.

5. הכנת שקופית ל-RNAscope HiPlex

1. טבלו את הסליידס לחלוטין ב-PBS 1X ללא RNase עד שהכיסוי מחליק בקלות ללא כל כוח. תלוי כמה זמן הכיסוי מותקן, זה יכול לקחת עד 16 שעות. שטפו פעם אחת במשך 2 דקות ב-PBS 1X PBS ללא RNase כדי להסיר שאריות בינוניות מתקנת.
2. הכינו 200 מ"ל של 50% אתנול, 200 מ"ל של 70% אתנול, ו-400 מ"ל של 100% אתנול.
3. הדליקו תנור היברידיזציה ומכוונים ל-60°C. מדלל את ה-10X Target Retrieval Regain למלאי עבודה של 1X ב-DI_H2O ללא RNase וחמם מראש על ידי הכנסתו לתנור עד שלב 5.8.
   הערה: אי חימום מוקדם של תגובת שחזור המטרה ל-60°C תשפיע על רישום תמונות במחזורים נפרדים. מגיב השליפה של המטרה חייב להישאר בטמפרטורה של 60°C לאורך כל שלב השחזור.
4. טבלו את השקופיות ב-50% אתנול. תדגר ל-5 דקות ב-RT.
5. הזיזו את השקופיות מ-50% אתנול וטבלו ב-70% אתנול. תדגר ל-5 דקות ב-RT.
6. הסר את השקופיות מה-70% אתנול וטבול ב-100% אתנול. דגר במשך 5 דקות ב-RT וחזור על זה עם אתנול טרי 100%.
7. הסר את המחסניות מהאתנול של 100% ותן להתייבש ב-RT למשך 5 דקות.
8. הוסיפו 100–150 מיקרוליטר מ-60°C 1X Reactor Reactor Reactor Reactation לכל חתך רקמה והניחו את השקופיות בתנור ההיברידיזציה. דגרו בטמפרטורה של 60°C למשך שעה.
9. הסר את המחסניות ושטוף על ידי טבילה ב-DI H2O ללא RNase למשך 15 שניות. בשלב זה, שנו את הטמפרטורה שנקבעה בתנור ל-40°C.
10. העבר את המחסניות ל-100% אתנול ודגר במשך 5 דקות, ואז מייבש ב-RT לפחות 5 דקות.
11. מרחו פרוטאז III על השקופיות, 1–2 טיפות לכל חתך רקמה. הניחו את המחסניות בתנור ההיברידיזציה ודגרו בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות.
12. טבלו את הסליידס ב-DI H₂O ללא RNase ושטפו על ידי טבילה קצרה למעלה ולמטה. חזור על הפעולה עם מים מזוקקים טריים לסך הכל 2 שטיפות (שטיפות).

6. הכנת תגובת RNAscope והיברידיזציה של גלאי

1. הכינו את מלאי ה-RNAscope HiPlex ואת חומר הדילול של ה-HiPlex על ידי חימום ל-40°C למשך 10 דקות בתנור או באמבט מים.
2. לרגע ספין פולס למטה בכל 50X מניות הגשושים. הכינו תערובת גלאי עבודה על ידי דילול כל גלאי יעד ייחודי ל-1X באמצעות מדלל גלאי RNAscope. תכנן להשתמש ב-50–100 מיקרוליטר של תערובת פרוב לכל רקמה ולערבב היטב על ידי מערבולת לפני השימוש. פרוטוקול RNAscope HiPlex יכול להכיל עד 3 מחזורים של 4 פרובים (12 גשושים בסך הכל המסומנים T1-12). לקבלת הנחיות לעיצוב הגשושים, יש להתייעץ עם פרוטוקול RNAscope¹⁴ שפורסם במקור.
3. הניחו את מגברי ה-RNAscope HiPlex 1–3 ו-HiPlex Fluoro T1-T4 ב-RT כדי להתאזן.
4. קחו את השקופיות המטופלות בפרוטאז III ופיפטות של 50–100 מיקרוליטר מתערובת הגשוש על כל חתך רקמה. הניחו אופקית בתנור ההיברידיזציה ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 40°C.
5. שטוף את המחסניות על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה עם בופר טרי לסך הכל 2 שטיפות (2 שטיחות).
   נקודת הפסקה: ניתן לאחסן שקופיות במאגר SSC 5X ב-RT במהלך הלילה, כפי שמתואר בפרוטוקול RNAscope מ-ACD. אם משתמשים בנקודת ההפסקה הזו, שימו לב שיידרשו שתי שטיפות של 2 דקות ב-1X wash buffer בבוקר שלמחרת.

7. הגברת גשוש

הערה: ודא שכל המגבים מאוזנים ל-RT לפני יישום על שקופיות.

1. הוסף 1–2 טיפות של תגובת HiPlex Amp1 לסליידס ודחף בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
2. הוסיפו 1–2 טיפות של תגובת HiPlex Amp2 לשקופיות ודחפו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
3. הוסיפו 1–2 טיפות של מגיב HiPlex Amp3 לסליידס ודגרו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 30 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
4. הוסיפו 1–2 טיפות של תגובת HiPlex Fluoro T1-T4 למקופיות ודחפו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 15 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
5. הוסף 3–4 טיפות של תגובת HiPlex DAPI לכל חתך רקמה ודגר למשך דקה אחת ב-RT.
6. הסר את ה-DAPI על ידי ספיקת הנוזל מהשקופיות באמצעות ניקוי סופג משימות. מיד הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם בסיס מימי (יכול להיות זהה לזה שמשמש בשלבי הצביעה של IBEX) לכל חלק. מניחים בזהירות כיסוי על המחסנית, תוך הקפדה למזער בועות, ותנו למדיום ההרכבה להתייבש במשך 15–30 דקות.
7. המשך להדמיה.
   נקודת עצירה: ניתן לאחסן את המחסניות המותקנות בחושך בטמפרטורה של 4°C עד 3 ימים, אך אנו ממליצים לפעול במהירות כדי להבטיח מינימום התדרדרות RNA.

8. חיתוך הפלואורופורים והיברידיזציה איטרטיבית של RNA

1. כדי להסיר את הכיסוי מהשקופיות, השרה ב-4X SSC buffer לפחות 30 דקות ב-RT. שטוף פעם אחת על ידי טבילה מלאה של המחסניות בבופר SSC חדש של 4X וטבילה קצרה למעלה ולמטה.
2. פתח אמפולה חדשה של תמיסת חיתוך ויצר 10% חומר עבודה על ידי דילול עם 4X SSC.
3. הניחו את המחסניות בקופסה לחה והוסיפו 3–4 טיפות מתמיסת החיתוך של 10%. תדגר ב-RT ל-15 דקות, ואז תשטוף את השקופיות על ידי טבילה מלאה ב-0.5% PBST למשך 2 דקות. חזור על זה עם PBST טרי לסך הכל 2 שטיפות.
4. כדי להמשיך במחזור הדמיה 2 של לוח RNAscope, יש לאזן את המגיב HiPlex Fluoro T5-T8 ל-RT.
5. הפעל את תנור ההיברידיזציה ומכוון את הטמפרטורה ל-40°C.
6. הוסיפו את המגיב HiPlex Fluoro T5-T8 לשקופיות ודוגרו בתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה של 40°C למשך 15 דקות. שטוף את הסליידס על ידי טבילה מלאה בבופר 1X Wash למשך 2 דקות. חזור על זה לסך הכל 2 שטיפות (washs).
7. ספוג בזהירות את הנוזל העודף מהשקופיות. מיד הוסיפו 100 מיקרו ליטר של מדיום התקנה לכל חלק והניחו בזהירות כיסוי על המחסנית. תן למדיום ההרכבה להתייבש 15–30 דקות ואז המשך להדמיה.
8. חזור על שלבים 8.1–8.7 עם תגובת HiPlex Fluoro T9-T12 לסך של 3 מחזורי RNAscope אם זה מתאים. יש לשים לב שלמרות ש-3 מחזורים אפשריים עם פרוטוקול RNAscope HiPlex, הזמן הנוסף הנדרש לצביעה של חלבונים בפרוטוקול זה עשוי להשפיע על איכות ה-RNA. לכן, ייתכן ש-3 מחזורים לא תמיד יהיו ישימים, בהתאם לתמלילים הספציפיים שאליהם ממוקדים.

9. עיבוד תמונה

1. עבד בנפרד את הקבצים הגולמיים מכל סבב ובצע עיבוד תמונה באמצעות פרמטרים עקביים, כולל הגדרות חיסור ברקע, מסנני החלקה וסוג טרנספורמציה של רישום... הערוצים צריכים לקבל שם עם תו מפריד עקבי (למשל מחזור 1: CD45 AF532, שבו ":" מבחין בין מחזור לבין סמן/פלור).
2. הפעל את תוכנת SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) ולחץ על הרחבות Imaris > SimpleITK > רישום אפיני של z-stack באמצעות ערוץ משותף.
3. העלה קובץ תמונה אחד מכל אחד ממחזורי המולטיפלקס והזן את תו המפריד לכל הערוצים עם שמות (למשל ":").
4. בחר את הערוץ שישמש לרישום התמונה ואת התמונה הקבועה שאליה כל שאר התמונות ייושרו. מומלץ להשתמש ב-DAPI כסמן פידוציאלי, אם כי ניתן להשתמש בכל ערוץ משותף בשם בין כל המחזורים.
5. לחץ על "רשם" ואז "דגימה מחדש ושמור תמונה משולבת".
6. המשך למחקר בהמשך עם התוכנה שבחרת. למידע נוסף על עיבוד ורישום תמונה, יש לעיין בפרוטוקול IBEX^{המקורי 12,13}.

Results

איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה ב-Bex-Plex.
רקמות קפואות קבועות שנחתכות על שקופיות מצופות אלום כרום עוברות עד 3 מחזורים של IBEX סטנדרטי, ואחריהם עד שלושה מחזורי RNAScope HiPlex שבהם שלב שליפת המטרה הראשוני מתבצע בטמפרטורה של 60°C למשך שעה. תמונות ממחזורים נפרדים נרשמות ומיושרות באמצעות סימון פידוציאלי (למשל, DAPI) ליצירת מאגר נתונים מולטיפלקס לניתוח במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

השתמשנו בפרוטוקול שתואר לעיל כדי לפרופיל את מיקרו-סביבת הגידול (TME) של מודל אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) בעכברים (איור 1). קו גידול מבודד ^{מ-Kras LSL-G12D/+}; Trp53^L/+; Pdx1-Cre; עכברי Rosa26^YFP/YFP (KPCY), שמפתחים באופן ספונטני סרטן לבלב ומחזירים תכונות מרכזיות רבות של PDAC אנושי, הוזרק תת-עורית לצד העכברים C57BL/6⁷. עכברים נושאי גידול טופלו לאחר מכן באימונותרפיה משולבת שכללה אנטי-פרקינסון-1 (i.p. 200 מיקרוגרם•עכבר-1, RMP1-14) ואנטי-CTLA-4 (i.p., 200 מיקרוגרם•עכבר-1, 9H10) שניתנו ביום העשירי לאחר ההשתלה, והמשיכה כל 3 ימים עד סיום הניסוי. אנטי-CD40 אגוניסטי (i.p., 100 מיקרוג•^עכבר-1, FGK45) ניתן במינון יחיד ביום ה-13 לאחר ההשתלה. ביחד, אנו מכנים זאת "FPC", כפי שפורסם בעבר7,16. שלושה גידולים מכל קבוצת ניסוי נאספו 16 ימים לאחר ההשתלה, וחתכים קבועים-קפואים הותקנו על שקופיות מצופות אלום כרום עבור Bex-Plex.

איור 2: תוצאות ייצוגיות של IBEX + RNAscope (Bex-Plex).
(א) צביעת IBEX ו-RNAscope משולבת בחתכי גידול אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) מדגימה זיהוי משותף של מטרות חלבון ו-RNA ויישור תעלות פלואורסצנציה. מוט סולם, 10 מיקרון. (B) כימות של תא T (CD3+ CD11b-), מקרופאגים (CD11b+ CD68+) ומיאלואידים (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) בהתבסס על עוצמות ערוצי סמן חלבון. הגרפים מראים את צפיפות התא הממוצעת לכל סוג תא לפי קבוצת הטיפול, n=3 גידולים. (ג) כימות של תאים מבטאים תמלול Pdl1 ו-Il10 באזורי החיסון שזוהו קודם על ידי חלבון. גרפים מראים את צפיפות התאים הממוצעת לפי קבוצת הטיפול, n=3 גידולים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מחזור אחד של צביעת חלבון בוצע על שלושה גידולים שטופלו ב-FPC ושלושה גידולים שטופלו באיזוטיפ, כדי להעריך את ההשפעות על תאי שושלת מיאלואידים בין קבוצות הטיפול. נרכשו שבעה פרמטרים, אם כי אנו מתמקדים כאן בשלושה סמנים מעניינים: CD11b, Ly6G, ו-CD68 (איור 2A). לאחר קבלת התמונה, הפלואורופורים מצביעת החלבון הולבנו וסבב אחד של RNAscope בוצע באמצעות גלאים נגד Il10 ו-Pdl1 (איור 2A). התמונות הנפרדות יושרו לאחר מכן באמצעות DAPI כפידוציאל (איור 2A). עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת הכמותית של CD11b, CD68, Ly6G ו-CD3 חשפה מגמה של פחות מאקרופאגים ותאי מיאלואידים בגידולים שטופלו ב-FPC בהשוואה לביקורת (איור 2B). בוצעו השוואות כמותיות בכל המדגמים, והנתונים מוצגים כערכים ממוצעים. יתרה מזאת, מספר התאים שהביעו Pdl1, Il10, או שילוב של שני התמלולים בשני המחלקות של המקרופאגים והמיאלואידים הראה מגמת ירידה בטיפול ב-FPC בהשוואה לביקורת (איור 2C). תוצאות אלו מצביעות על ירידה פוטנציאלית באוכלוסיות תאים מדכאות חיסון לאחר הטיפול, בהתאם לתגובות ביולוגיות צפויות.

איור 3: אופטימיזציה של תנאי שחזור מטרות לשימור גרעיני.
(א) תמונה מייצגת של רקמה לאחר שליפת מטרות RT המציגה נפיחות גרעינית ומורפולוגיה לא ברורה. דוגמאות לגדלים גרעיניים מסומנות על ידי קווי מתאר צהובים. פס סולם, 40 מיקרון. (B) תמונה מייצגת של רקמה לאחר שליפת מטרה מותאמת, המראה שיפור במורפולוגיה גרעינית עם תנאי טמפרטורה מותאמים. דוגמאות לגודל גרעיני מסומנות על ידי קווי מתאר צהובים. פס סולם, 40 מיקרון. (C) נפח גרעיני ממוצע שנקבע על ידי סגמנטציה מבוססת DAPI על רקמות שעברו שליפת מטרות RT (לא מחוממות מראש), שאיבת מטרות חימום מוקדם ב-60°C, או בתנאי IF סטנדרטיים ללא שליפת מטרה. פסי הגרף מציינים ממוצע ופסי שגיאה מראים סטיית תקן. P < 0.0001 לפי ANOVA חד-כיווני רגיל (כוכבית מציינות סף מובהקות סטטיסטי); n = 1639 תאים לכל תנאי. (D) מפות חום המייצגות את ציוני המתאם בין שלוש תמונות לפני ואחרי יישור התמונה. ציוני קורלציה מוצגים עבור רישום מוצלח ורישום שלא התאים עקב הבדלים ברמה גרעינית.

חשוב לציין שכאשר בקס-פלקס בוצע ללא השליפה המותאמת של המטרה שתוארה, הגרעינים נראו מוגדלים עם קצוות לא ברורים לעומת הגרעינים מרקמה שבה בוצעה השליפה המותאמת של המטרה (איור 3A ו-B). שימוש במשחזר מטרות בטמפרטורת החדר הוביל לעלייה של 33% בנפח הגרעין הממוצע בהתבסס על צביעת DAPI בהשוואה לשליפת המטרה שבוצעה באמצעות תגובת חימום מוקדמת ל-60°C (איור 3C). מדידות נפח גרעיני התקבלו משדות מייצגים בין דגימות באמצעות סגמנטציה מבוססת DAPI. יתרה מזאת, כאשר שלב זה בוצע בטמפרטורה של 60°C באמצעות תגובת שליפה מחוממת מראש, הנפח הממוצע של הגרעין לא היה שונה משמעותית מהנפח הגרעיני הממוצע לאחר צביעת IF סטנדרטית (איור 3C). מכיוון ש-DAPI הוא הפרמטר היעיל ביותר לשימוש כהפניה ליישור תמונה, השוואה זו (איור 3) מדגישה את החשיבות הקריטית של פרמטרי השליפה המותאמים לשימור מורפולוגיית גרעין. רישום תמונה נכון מסומן על ידי ציון קורלציה של יישור הקרוב ל-1, המצביע על דמיון בין תמונות של מחזורים שונים (איור 3D, לפני לעומת הצלחה).

יישום מוצלח של הפרוטוקול מתבטא במורפולוגיה גרעינית משומרת, אות RNA חזק וספציפי, ויישור מדויק של תעלות חלבון ו-RNA. לעומת זאת, תוצאות לא אופטימליות עשויות לכלול עיוות גרעיני, אות RNA חלש או מפוזר, וחוסר יישור בין מחזורי הדמיה (איור 3D, לפני מול כישלון). כפי שמוצג באיור 3C, יש לשמור את המורפולוגיה הגרעינית לאורך כל הפרוטוקול, ותהיה ברורה הן מבחינה איכותית והן כמותית. לפני יישום Bex-Plex, המשתמשים צריכים לברר את האמת הקרקעית לרקמות המעניינות שלהם באמצעות צביעת חלבון ו-RNA נפרדים . לא רק שזה מבטיח צביעת חלבון ו-RNA אופטימלית לרקמות היעד, אלא גם מספק דפוסים מרחביים רלוונטיים שיש לשמר כאשר הם משולבים עבור Bex-Plex. לדוגמה, CD11b מתמקד עם CD68 ו-Ly6G ומציג צביעה ממוקלת בממברנת התא (איור 2A). זה צפוי, שכן CD11b הוא סמן תאי מיאלואיד פאן-מיאלואידי ו-CD68 ו-Ly6G הם סמנים לתת-קבוצות המיאלואידים של המקרופאגים והנויטרופילים. זיהוי RNA מוצלח מאופיין באותות מנוקבים מובחנים הממוקמים בתאים בודדים, בעוד שתוצאות לא אופטימליות עשויות להופיע כצביעה חלשה או מפוזרת. אות גלאי ה-RNA אמור להראות מיקום בתוך הגרעין וסביבתו, בהתאם לפונקציית התמלול. סמנים מבניים של חלבון כמו וימנטין יכולים להיכלל לשיפור הרזולוציה התאית של מיקום התמלול על ידי חשיפת ממברנות תאים ברקמות מורכבות. דגימות שליליות או ביקורתיות צפויות להראות צביעת רקע מינימלית וללא אות גלאי לא ספציפי, מה שמאשר את הספציפיות של זיהוי חלבונים ו-RNA.

Discussion

תהליך העבודה של Bex-Plex משלב את פלטפורמת צביעת החלבונים האיטרטיבית, IBEX, עם RNAscope hybridization in situ כדי לאפשר זיהוי סימולטני של חלבונים ותמלילי RNA ברזולוציה של תא יחיד. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק שיטה ניתנת לשחזור לניתוח מרחבי משולב של ביטוי חלבונים ו-RNA ברקמות שלמות. היכולת למדוד ביטוי חלבון ו-RNA באותה רקמה הציבה בעבר אתגרים טכניים: עלויות גבוהות, שלבי שליפה מורכבים של אנטיגן, קיבולת מולטיפלקס מוגבלת, מגבלות רזולוציה (לא תא יחיד), הגברת אות לא ליניארית, וצינורות ביואינפורמטיקה נרחבים לעיבוד במעלה הזרם ^17,18,19. בהשוואה לגישות קיימות כמו אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס, צביעת OPAL/TSA, ופלטפורמות טרנסקריפטומיקה מרחבית, Bex-Plex מאפשרת זיהוי בו-זמני שניתן לשחזר, כמותי וגבוה ב-plex תוך שמירה על הקשר מרחבי ומורפולוגיה גרעינית ליישור מדויק של תמונה. בנוסף, ניתן לבצע Bex-Plex בסביבת מעבדה סטנדרטית ומייצר נתונים ברזולוציית תא יחיד שקל לעיבוד. ניצול פרוטוקול זה להבנה מקיפה של אינטראקציות תא-תא בהקשרים רקמתיים מגוונים, כמו בסביבת המיקרו-סביבה של הגידול, יהיה חיוני לפיתוח אימונותרפיות יעילות יותר ולשיפור תוצאות המטופלים במצבים שונים של מחלה.

השיטה שלנו מתבצעת על רקמות קבועות המוטמעות ב-OCT ועוקבת אחר זרימת העבודה הסטנדרטית של IBEX ללא שינוי, ואחריה פרוטוקול HiPlex RNAscope עם שינוי קל. הבדל מרכזי הוא שלב שליפה-יעד בתחילת תהליך ההיברידיזציה של ה-RNA: במקום 99°C של היצרן למשך 5 דקות, השליפה מתבצעת ב-60°C למשך שעה. התאמה זו שומרת על ארכיטקטורת גרעינית, שהיא חיונית ליישור תמונה מדויק בין מחזורי חלבון ו-RNA. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים שמירה על טמפרטורת שחזור מטרות עקבית, הלבנת פלואורופור יעילה באמצעות LiBH₄, ומזעור התדרדרות RNA באמצעות עיבוד מהיר ושימוש בתגובות חופשיים מ-RNase. החשוב ביותר הוא להבטיח שימוש בתגובות שחרור מטרות מחוממות מראש בטמפרטורה של 60°C; אי עמידה בכך עלולה לגרום לנפיחות גרעינית גם עם שלב הדגירה המשונה.

למרות שהוכח כי 15 דקות של דגירה עם LiBH₄ מספיקות כדי להשבית פלואורופורים נפוצים רבים, מומלץ לאמת תהליך זה באופן אישי לכל מחזור חלבון לפני הפעלת כל פרוטוקול Bex-Plex. בפרסומים הראשוניים של IBEX מתואר היטב שלא כל הפלורופורים התואמים ל-IBEX ניתנים להלבנה באותה מידה¹². בנוסף, המעבדה שלנו הבחינה שחלק מהסמנים המבניים בעלי שפע גבוה כמו וימנטין עשויים לדרוש זמן הלבנה ארוך יותר. אישור ששילובי הפלואורופור והסמנים שישמשו יכלו להלבין כראוי אמור למנוע דליפה שאריתית של אותות למחזורי חלבון ו-RNA נוספים. דף הקהילה של IBEX מציע משאבים מצוינים לעיצוב פאנלים תואמי IBEX ומיועד במיוחד להפחית את העומס על משתמשים חדשים על ידי הצגת יעילות נוגדנים והלבנת פלואורופור פי²⁰. יתרה מזאת, צביעה והלבנה איטרטיבית לא אמורים להשפיע על איכות תמלול ה-RNA, אך חשוב להשלים את מחזורי החלבון במהירות האפשרית ולהשתמש במגבים ללא RNAse כדי למזער כל התדרדרות RNA שעלולה להתרחש לאורך זמן. אי עמידה בכך תשפיע על היברידיזציה של הפרוב ותוביל לירידה באות בכל מחזורי RNAscope שבוצעו, במיוחד בתמלולים בעלי שפע נמוך. בעיות נפוצות במהלך הפרוטוקול כוללות אות RNA חלש, הלבנת פלואורופורים לא שלמה, וחוסר יישור בין מחזורי ההדמיה, שניתן להקל עליהם באמצעות אופטימיזציה של תנאי צביעה ופרמטרי הדמיה.

חשוב להגביל את הזמן בין צביעת חלבונים להיברידיזציה של RNA לפחות מ-5 ימים. כאשר מבצעים Bex-Plex על מספר שקופיות, מומלץ מאוד לעבד שקופית אחת בכל פעם כדי להפחית שונות בהתדרדרות ה-RNA. באופן דומה, מגביל את הזמן בין היברידיזציה של הגשוש להדמיה. למרות שהצלחנו לצלם בהצלחה עד 3 ימים לאחר ההגברה, אחסון ארוך יותר אינו מומלץ. אם יש אות מופחת לאחר מספר מחזורי צביעה או היברידיזציה, ייתכן שיהיה צורך להאיץ את המהירות לאורך כל הפרוטוקול. באופן אידיאלי, אנו ממליצים לעבוד במהירות המרבית, שכן עיכובים מפחיתים את שלמות ה-RNA ועלולים להפחית את ההגברה. גישות נוספות כוללות הפחתת מספר מחזורי החלבון שבוצעו כדי להתאים בקלות יותר למגבלות לוח הזמן של הפרוטוקול או שינוי עיצוב פאנל גשושי RNA לכלול יעדים בעלי שפע גבוה יותר. לפני שילוב IBEX ו-RNAscope, יש לאמת את לוחות הנוגדן והבדיקה לכל מחזור בנפרד כדי לקבוע את איכות האות הצפויה לכל מחזור. במקרה של נפיחות גרעינית לאחר שליפת המטרה, ייתכן שמגיב שאיבת המטרה לא התחמם כראוי. ודא שמגיב השליפה לא יתקרר לאחר דילול וחימום מוקדם ל-60^°C, ושהטמפרטורה נשארת עקבית במהלך האינקובציה של שעה על הסלייד. לבסוף, אם רישום התמונה ויישור התמונה נכשלים בהיעדר התנפחות גרעינית, משמעות הדבר היא שהיה חוסר התאמה בפרמטרי רכישת התמונה כגון עומק ביט, גודל ווקסלים או מיקום Z בין מחזורים. במקרה של טעויות כאלה, ייתכן שיהיה צורך לחזור על הפרוטוקול עם התאמות להגדרות אלו כדי שיהיו עקביות. אסטרטגיות פתרון תקלות אלו חיוניות להבטחת שחזוריות ועקביות בין ניסויים.

הנתונים שנוצרים על ידי Bex-Plex מאפשרים מבט מעמיק על הנוף המרחבי של הרקמות ברמה שלא הייתה מושגת קודם לכן. עם זאת, מגבלה מרכזית של פרוטוקול זה היא העובדה שמספר מחזורי החלבון האיטרטיביים הכולל האפשריים נמוך יותר מאשר עם IBEX בלבד, בשל התדרדרות הדרגתית של ה-RNA לאורך זמן. למרות שבוצעו עד 6 מחזורים של IBEX סטנדרטי, איננו ממליצים לעבור 3 מחזורי צביעת חלבון עבור Bex-Plex. למרות זאת, הפרוטוקול מתאים למספר המרבי של מחזורי RNAscope ורמת עומק מולטיפלקס זו מספיקה לרוב היישומים.

מגבלות נוספות כוללות שונות בין סוגי רקמות וארטיפקטים פוטנציאליים של אוטופלואורסצנציה או צביעה שעלולים להשפיע על פרשנות האותות. רקמות עדינות יותר יכולות להחזיק פחות מחזורים וסוגי רקמות שונים יכולים להיות בעלי תכונות ייחודיות המשפיעות על הכתמים. מגבלות אלו ניתנות להערכה באמצעות צביעות חלבון או RNA במחזור אחד ולטפל בהן לפני הפעלת Bex-Plex. חתך על שקופיות מצופות אלום כרום ישפר משמעותית את ההיצמדות של הרקמה ואת שלמות המבנה, אך אוטופלואורסצנציה מהווה שיקול לכל הטכניקות המבוססות על אימונופלואורסנציה. בנוסף, נכון לעכשיו הפרוטוקול לא אומת בדגימות קליניות של FFPE או בבני אדם וידרוש אופטימיזציה נוספת ליישומים אלו. עם זאת, בהתחשב בכך ש-IBEX ו-RNAscope מתבצעים בעיקר על רקמות מוטמעות, פרפין מקובע בפורמלין (FFPE), ייתכן שבקס-פלקס יוכל להתרחב לסוגי דגימות אלו. יישום מוצלח ידרוש אופטימיזציה נוספת לשליפת אנטיגנים ואולי גם שלבי שליפת מטרות לשמירת איכות ה-RNA.

בסך הכול, Bex-Plex מציעה שיטה פשוטה, חסכונית ונגישה לניתוחים מרחביים ב-high-plex. שיטה זו מתאימה במיוחד ליישומים כגון ניתוח מיקרו-סביבה של גידול, פרופיל תאי חיסון ומיפוי מרחבי של אינטראקציות איתות. תפיסה משולבת זו משפרת את היכולת לבחון מנגנוני ויסות חיסוני, הטרוגניות של הגידול ותגובתיות טיפולית במגוון רחב של מודלים ניסיוניים. Bex-Plex יהיה יקר ערך בהקשרים שבהם יש צורך לחקור את הדיבור המשולב המתרחש בין תאים ברקמה שלמה, כמו בסביבת הגידול או ברקמות אחרות במהלך דלקת והומאוסטזיס. במיוחד, היכולת לפתור דינמיקה מרחבית של איתות ציטוקינים על ידי חקירה אחר תמלולי מולקולות קצרות ימים בשילוב עם סמנים חלבונים פנוטיפיים תספק הבנה עמוקה יותר של אינטראקציות תאיות בין מצבי מחלה. שיפורים עתידיים עשויים לכלול הגדלת קיבולת המולטיפלקס, אינטגרציה עם צינורות ניתוח תמונות אוטומטיים, והתאמה לדגימות ביופסיה קליניות על ידי הרחבת זרימת העבודה לכלול רקמות FFPE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023