מאמר שיטה

מודל פגיעות היפוקסיה-חמצון מחדש בקרדיואידים אנושיים שמרכיבים את עצמם

DOI:

10.3791/70310

⸱

17 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים קרדיאליים אנושיים מתאספים מעצמם (hCOs) הם מערכת מתפתחת למידול התפתחות ומחלות לב אנושיות. כאן, מסופקת מתודולוגיה ליצירת ופגיעה ב-hCOs עם היפוקסיה-חמצון מחדש ופרטים על תוצאות היסטולוגיות ותפקודיות צפויות לאחר הפציעה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ללא ריסקולריזציה מהירה, מחלת לב איסכמית גורמת לאובדן בלתי הפיך של קרדיומיוציטים, להיווצרות צלקות ולירידה בתפקוד הלב. היכולת למודל פגיעות של היפוקסיה-חמצון מחדש ולהעריך התערבויות טיפוליות אפשריות ברקמות אנושיות היא צורך שלא נענה. אורגנואידים לבביים אנושיים (hCOs) הם מערכת מודלים מתפתחת, אך התחלת עבודה עם hCOs עלולה להיות מאתגרת בשל גודלם הקטן, דרישות תרבית השעיה והשונות ביעילות ההבחנה. פרוטוקול זה מציע מדריך ידידותי למשתמש ליצירה ותחזוקה של hCOs שמרכיבים את עצמם שמקורם ב-iPSC אנושי; שיטות לעיבוד וניתוח היסטולוגי של hCO; וגישה לפגיעה ב-hCOs באמצעות היפוקסיה-חמצון מחדש המדמה את הפיברוזיס והאפופטוזיס שנראו באיסכמיה/רפרפווזיה אנושית. פרוטוקול זה מספק הנחיות לשימוש ב-hCOs כהשלמה למודלים של פציעות איסכמיה-רפווזיה בבעלי חיים, ויכול לשמש לזיהוי ובדיקת גורמים שעשויים לקדם התאוששות שריר הלב האנושית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת לב איסכמית היא גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם, ומשפיעה על לפחות 20.5 מיליוןאנשים בארצות הברית בלבד. ללא זרימה מספקת, היפוקסיה ממושכת גורמת למוות קרדיומיוציטים (CM) ולבעיות בתפקוד שריר הלב. איסכמיה של שריר הלב מטופלת בעיקר באמצעות התערבות דרך העור, טיפול טרומבוליטי או השתלת מעקפים בעורקי כליליים. עם זאת, ריסקולריזציה היא חרב פיפיות ויכולה לגרום לפציעה נוספת על ידי שחרור מיני חמצן תגובתי 4,5. בעוד שאסטרטגיות ריפרפוזיה היו מוצלחות מאוד, הגישות להגבלת אובדן CM במהלך פגיעות איסכמיות או לאחר ריפרפוזיה היו חמקמקות יותר. למרות שניסיונות רבים להצלת רקמות מאותמות מוכיחים את עצמם כיעילים במודלים של איסכמיה-רפווזיה בבעלי חיים, אותם טיפולים ברובם לא הצליחו להשיג תועלת משמעותית בניסויים בבני אדם, מה שמעלה את הצורך במודלים אנושיים להעריך טיפולים החוסכים או הממלאים CM 6,7,8,9,10,11,12.

פלטפורמות אנושיות המשמשות למידול פגיעות לב כוללות רקמות ראשוניות ומערכות שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSC) שנגרמו על ידי בני אדם13,14. מכיוון שהרקמות הראשוניות מוגבלות על ידי זמינות הדגימות, מערכות hiPSC הפכו לפלטפורמה האנושית הדומיננטית למידול מחלות לב, עם יתרונות ברורים של ניתנות לטיפול גנטי וניתנות להרחבה 15,16,17,18,19. תרביות קרדיומיוציטים דו-ממדיות מסורתיות שמקורן ב-hiPSC (hiPSC-CM) מוגבלות על ידי חוסר הבשלות של ה-CMs שנוצרים, היעדר ארכיטקטורה רקמתית מורכבת, ואי-יכולת לשחזר את מלוא המגוון התאים הנמצא בלב האדם15,20. כדי להתמודד עם ליקויים אלו, רקמות לב תלת-ממדיות מהונדסות (EHTs) אומצו יותר ויותר ב-20,21,22,23,24,25,26. גישות EHT כוללות ערבוב תאי לב מופרזים מראש לספרואידים24 או זריעה של תאי לב מופרדים לפיגומים או תבניות 21,22,27. למרות ש-EHTs יכולים למודל טוב יותר אינטראקציות תאיות הטרוטיפיות ויש להם בשלות יחסית גבוהה יותר מתרביות דו-ממדיות, הדרישות לפיגומים מותאמים אישית או ביוריאקטורים ליצירת ושימור EHTs מגבילים כיום את יכולת ההרחבה שלהם 21,27,28.

אורגנואידים לבביים (hCOs), או קרדיואידים, הם מערכת מודל אנושית חדשה ועוצמתית במבחנה 20,25,26,29. ל-hCOs יש מספר יתרונות. ראשית, הם יכולים לכלול מספר סוגי תאים, כולל תאי אנדותל, פיברובלסטים ותאי אפיקרדיאל, ללא צורך בפרוטוקולי התמיינות מיוחדיםמרובים 26,29,30. שנית, רוב ההבדלה שלהם מתרחשת בתרבות תלת-ממדית של מתלים, מה שמבטל את הדרישות לתבניות מיוחדות או למטריצת רקמה 25,26,29,30. לבסוף, ל-hCOs יש מורפולוגיה כדורית סטריאוטיפית עם חלל מרכזי, המאפשר ניתוחים מורפולוגיים. לכן, ל-hCOs יש יכולת הרחבה דומה למערכות תרביות דו-ממדיות תוך שמירה על חלק מהמורכבות הרקמתית של EHTs. HCOs שימשו לבדיקות רעילות תרופות, למידול מחלות ספציפיות למטופל, ולמידול היבטים של התפתחות הלב 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. למרות הבטחה, ל-hCOs יש מספר מגבלות בהשוואה ל-EHTs, כולל חוסר יכולת למדוד ישירות את פלט הכוח. יתרה מזאת, אין אוכלוסיית תאי חיסון טבעיים במודלים המתוארים של hCO, אם כי ניתן לאכלס hCOs במאקרופאגים. עם זאת, hCOs הם מערכת מודלים אנושית מתפתחת ומתפתחת במהירות 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

עד כה, מידול פגיעות לב עם hCOs היה מוגבל. תואר מודל פציעות קריו, אך הפציעות משתנות מאוד, והצורך לפגוע ב-hCOs באופן אישי מגביל את יכולת ההרחבה29. מאמר זה מתאר פרוטוקול ידידותי למשתמש ליצירת ופציעה של hCOs שמרכיבים את עצמם עם פגיעות היפוקסיה-חמצון (H/R). בהשוואה לפרוטוקולים אחרים ליצירת hCOs, פרוטוקול זה משתמש במדיום דיפרנציאציה מפושט ומשלב את אסטרטגיית ההתמיינות המזודרמית דו-ממדית-תלת-ממדית שתוארה על ידי הופבאואר ואחרים. הפרוטוקול לפגיעת H/R יכול להתבצע בכל עת לאחר שה-hCOs מתחילים לפעום, דבר שמתרחש בדרך כלל סביב יום ההתמיינות 8 (D8) ל-D11. משך ה-H/R ניתן לכוון בין 6 שעות ל-24 שעות כדי להגיע לרמת הפציעה הרצויה, הנעה מאובדן מינימלי ועד כמעט מלא של ה-CM. בנוסף, hCOs מפתחים באופן סטריאוטיפי ליבה קולגנית עם תאי Vimentin+ לאחר פגיעת H/R, שגם היא משתנה בחומרה עם משך H/R. מודל hCO בעל תפוקה גבוהה וניתנת להרחבה של פגיעות H/R עשוי לענות על הצורך של מודלים אנושיים לפתח ולבדוק דרכים טיפוליות חדשות לקידום התאוששות או התחדשות CM לאחר הפציעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים לטיפול בקווי תאים אנושיים צריכים לעמוד בפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מקומיים. כל הניסויים בוצעו באמצעות קו התאים iPSC DU11, שמקורו בפיברובלסטים זכריים בריאים במתקן הליבה של iPSC באוניברסיטת דיוק.

1. יצירת hCOs

הערה: סעיף זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי ליצירת hCOs מ-iPSCs (איור 1). כל השלבים המפורטים בפרוטוקול זה צריכים להתבצע במכסה זרימה למינרי כדי להבטיח סטריליות. עיין בטבלה 1 למתכונים למדיות דיפרנציאציה.

יוםריכוז מלאיריכוז עבודהגורם דילולמדיה בסיסית
D010 מ"מ CHIR9902110 מיקרומום CHIR990211:1000RPMI-1640, 2% B27 מינוס אינסולין
100 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורביתחומצה אסקורבית 50 מיקרוגרם/מ"ל1:2000
10 מ"ג/מ"ל אקטיבין A60 ng/mL אקטיבין A1:167
D15 mM IWP25 מיקרומום IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 מינוס אינסולין
100 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורביתחומצה אסקורבית 50 מיקרוגרם/מ"ל1:2000
D25 mM IWP25 מיקרומום IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 מינוס אינסולין
100 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורביתחומצה אסקורבית 50 מיקרוגרם/מ"ל1:2000
10 מ"מ תיאזוביבין2 מיקרומום תיאזוביבין1:5000
D35 mM IWP25 מיקרומום IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 מינוס אינסולין
100 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורביתחומצה אסקורבית 50 מיקרוגרם/מ"ל1:2000
D45mM IWP25 מיקרומום IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 מינוס אינסולין
D6+לא זמיןלא זמיןRPMI-1640, 2% B27 בתוספת אינסולין

טבלה 1: טבלת מדיות דיפרנציאציה. ריכוזי המלאי, ריכוזי העבודה ומקדם דילול עבור כל גורם התמיינות בימים 0-6. הכינו את כל הפתרונות הפועלים טריים בזמן האכלה.

figure-protocol-1
איור 1: סכמטית של הבדלת hCO. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

  1. תחזוקת iPSC
    1. כיסו במלואם את תחתית כל באר של פלטת 12 בארות עם מטריצת ממברנה בסיסית ביחס 1:100, מדולל במדיה קרה DMEM/F12. דגרו לוחות מטופלים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת כדי לאפשר פולימריזציה. אם לא משתמשים מיד, ניתן לאטום את הלוחות עם סרט ולשמור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים, ולדגור אותם לפחות 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות לפני השימוש.
  2. יום התמיינות -3 (D-3): ציפוי iPSCs לצורך התמיינות נוספת
    1. הכינו לוחות מצופים מטריצת ממברנת בסיס כפי שמתואר בשלב 1.1.1.
    2. שאיבת מדיום תחזוקה מתרבות iPSC והוספת מספיק תמיסת ניתוק תאים כדי לכסות תאים כולו (~500 מיקרוליטר לבאר של פלטת 12 בארות או 1 מ"ל לבאר של לוח 6 בארות). דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הוסיפו נפח שווה של מדיום תחזוקת iPSC לכל באר וטפחו בעדינות על הפלטה כדי לעזור לנתק תאים. הטה את הפלטה לכיוון עצמך והפיפט בעדינות למעלה ולמטה לאורך תחתית הבאר כדי לנתק עוד יותר את התאים הדביקים, לא יותר משלוש פעמים. השתמש בפיפטה כדי להעביר את מתלה התא לצינור קוני של 15 מ"ל.
    4. תאי פלט בצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה דלי מתנדנדת. שואף סופרנטנט ומשלים בעדינות תאים ב-1 מ"ל של מדיה תחזוקה של iPSC.
    5. העבר 10 מיקרו-ליטר של מתלה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. הוסיפו 10 מיקרול של Trypan Blue ופיפטה לערבוב. הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת iPSC/Trypan Blue להמוסציטומטר וספר תאים חיים.
    6. מדלל את תליית התא לריכוז סופי של 100,000-200,000 תאים/מ"ל במדיה תחזוקה iPSC עם מעכב ROCK (ROCKi). הוסף 1 מ"ל/באר של תליית התא לכל באר של לוח 12 בארות מצופה במטריצת ממברנה בסיסית.
      הערה: צפיפות הציפוי לפני התמיינות תלויה בקצב הגדילה של קו תאים מסוים. ייתכן שיהיה צורך להתאים את צפיפות הציפוי לכל קו iPSC. ייתכן שיהיה צורך בשינוי ריכוז ROCKi בהתאם למותג/הנוסחה שבה משתמשים.
  3. הבחנה D-2: החלפת מדיה להסרת ROCKi
    1. החלף מדיה ב-1 מ"ל של מדיה חדשה לתחזוקת iPSC, ללא ROCKi. תאים צריכים להתחיל ליצור מושבות קטנות. המושבות צריכות להיראות שטוחות (איור 2A). אם תאים נראים כאילו הם נראים כמו אבנים, דקים או מוארכים, זהו סימן להתמיינות ספונטנית, ויעילות ההתמיינות עלולה להיפגע.
  4. התמיינות D-1: המשך דגירה של תאים ללא טיפול.
  5. דיפרנציאציה D0: התחלת הגזרה והשראת מזודרם
    1. באמצעות מיקרוסקופ, בדקו את צפיפות התאים כדי להבטיח חיבור של 70%-90% (איור 2B) בזמן ההתמיינות. אם זה תת-מתכופף, הזן תאים במדיה תחזוקה של iPSC והמתין 24 שעות. אם התאים מחוברים מדי, פצלו אותם כפי שבשלב 1.2
    2. הכינו 12 מ"ל לכל פלטת 12 בארות של מדיום השראת מזודרם D0 (10 מיקרומום CHIR99021, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית, 60 ננוגרם/מ"ל אקטיבין A ב-RPMI-1640 עם 2% תוסף B27 פחות אינסולין (RB-)).
    3. הסר את המדיה הקיימת והחלף במדיית השראת מזודרם D0 של 1 מ"ל/באר. שימו לב לזמן חילופי התקשורת.
  6. דיפרנציאציה D1: מפרט מזודרם לבבי
    1. בדיוק 24 שעות לאחר הוספת מדיום השראת מזודרם D0, מדיום החלפה עבור מדיום מפרט מזודרם לב D1 (5 מיקרומום IWP2, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ב-RB).
  7. דיפרנציאציה D2: היווצרות hCO
    1. הוסיפו מספיק תגובת ניתוק תאים כדי לכסות את התאים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (איור 2C). הוסיפו נפח שווה של מדיום המזודרם הקרדי D2 לכל באר והפיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לשחרר תאים דביקים למים. העבר את מתלה התא לצינור קוני בגודל 15 מ"ל.
    2. תאי פלט בצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השעיה מחדש ב-1 מ"ל של מדיום מפרט מזודרם לב D2 (5 מיקרומום IWP2, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ב-RB).
    3. קח 10 מיקרו-ליטר מתלה התא והוסיף לו 10 מיקרוליטר של Trypan Blue. ספירת תאים בכל שיטה מועדפת. דילל תאים לריכוז של 100,000 תאים/מ"ל במדיות המזודרם הלבביות D2, עם 2 מיקרומול תיזוביין. השתמש ב-10 מ"ל של מתלה תא לכל פלטת חיבור נמוכה במיוחד עם 96 בארים.
    4. העבר את תליית התא למאגר תגובת בגודל מתאים והשתמש בפיפטה רב-ערוצית להעברת 100 מיקרוליטר לכל באר עם לוח 96 בארות עם חיבור נמוך במיוחד, לריכוז סופי של 10,000 תאים לבאר.
    5. כדי לגרום להיווצרות hCO בתרבות תלוי, לוחות צנטריפוגה בעוצמה של 500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יהיה כדור גדול של תאים (איור 2D) - אם הכדור אינו מוגבל, יש לחזור על הצנטריפוגה.
      הערה: לא כל התאים ישלבו ב-hCO, שייראה ככדור תא מוגבל, כאשר תאים בודדים נראים במיקרוסקופיית שדה בהיר. חלק מהפסולת החד-תאית בלוח שמקיפה את ה-hCO היא תקינה.
  8. דיפרנציאציה D3: הוספת מדיה לדילול ROCKi
    1. הכינו 10 מ"ל מדיום D3 (5 מיקרומום IWP2, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ב-RB) לכל לוח. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה D3 לכל באר, מבלי להסיר מדיה.
      הערה: בשלב זה, hCOs יתעבו לספרואיד כהה ומוקף היטב. תאים בודדים לא יהיו נראים (איור 2E).
  9. הבדל D4: החלפה למדיה D4
    1. הסר 100 מיקרוליטר של מדיום D3 והחלף ב-100 מיקרוליטר של מדיה D4 (5 מיקרומולר IWP2 ב-RB-). כדי להפחית את הסיכון לשאיפה, הטה את הפלטה לכיוונך בזווית של כ-45° והחזק פיפטה רב-ערוצית בזווית של כ-90° יחסית לדופן הצדדית של הלוח. הניחו את הפיפטה הרב-ערוצית היטב על דופן הצד של הבאר ושאבו לאט 100 מיקרו-ליטר של מדיום, תוך בדיקה לסירוגין של קצות הפיפטה לאיתור hCOs שאפורי.
      הערה: hCOs נמצאים בתרבות תלוי, ושאיפת hCOs במהלך הסרת המדיה היא דבר נפוץ. כדי להפחית את הסיכון לשאיפה, הטה את הלוח כלפי עצמך בזווית של כ-45° והחזק פיפטה רב-ערוצית בזווית של כ-90° יחסית לדופן הצדדית של הפלטה. הניחו את הפיפטה הרב-ערוצית היטב על קיר הצד של הבאר ושאבו לאט 100 מיקרו ליטר של מדיום, תוך בדיקה לסירוגין של קצות הפיפטה לאיתור hCOs שאיבר.
    2. החליפו ב-100 מיקרוליטר של מדיה D4.
  10. דיפרנציאציה D6: מדיה לתחזוקת hCO
    1. הסר 100 מיקרוליטר ממדיה D4 והחלף ב-100 מיקרוליטר של מדיה D6+ (RPMI-1640 עם תוספת B27 של 2% (RB+)).
  11. דיפרנציאציה D8
    1. המשך להחליף מדיה כל יומיים על ידי הסרת 100 מיקרוליטר והחלפה ב-100 מיקרוליטר של מדיה טרייה D6+. ה-hCOs אמורים לגדול יותר, לשמור על קצוות חלקים, ולהתחיל לפעול סביב D6-11 אם הם מופרדים בהצלחה (איור 2F). hCOs עדיין יופיעו כספירואידים כהים ומוגבלים היטב, ותאים בודדים לא יהיו נראים.

figure-protocol-2
איור 2: ציר זמן של הבדלת hCO. ציר זמן של התמיינות אורגנואידית. (א) מושבות iPSC ביום אחד לפני תחילת התמיינות (D-1). שימו לב למושבות מובחנות ושטוחות למראה. (B) iPSCs ביום תחילת ההתמיינות (D0) בנקודת חיבור ~90%. (C) אורגנואיד בהתמיינות D2 מיד לאחר היווצרות אורגנואיד בלוח חיבור נמוך במיוחד עם 96 בארים. החץ מציין דוגמה לגבישי IWP2 בצורת מחט. (D) אורגנואידים בהתמיינות D3. שימו לב לדחיסה משמעותית של אורגנואיד הנובעת מהיווצרות צומת תאים-תאים; חלק מהפסולת של תאים לא משולבים היא תקינה בשלב זה. (ה) אורגנואידים בהתמיינות D10. (F) החץ מציין מושבה iPSC עם תאים מוארכים ודקים עם מראה של אבנים, מה שמעיד על התמיינות ספונטנית אפשרית. פס קנה מידה = 1000 מיקרון לפאנלים A-E, פס קנה מידה = 400 מיקרון ללוח F. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. איסוף ותיקון hCOs לצביעת חיסון

  1. באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר עם קצה חתוך, העבירו hCOs לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מ"ל. לאחר שכל ה-hCOs מועברים, המתן שה-hCOs ישקעו לתחתית הצינור והסיר בעדינות את עודפי המדיה. שטוף hCOs פעם אחת עם PBS, המתין כמה שניות עד שה-hCOs יגיע לתחתית הצינור, והסר בעדינות עודפי PBS.
  2. תקן hCOs עם 4% PFA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: חלק מהנוגדנים עשויים לדרוש קיבוע אצטון או מתנול לביצועים מיטביים. עיין בהנחיות היצרן.

3. צביעת חיסון שלמה

  1. העבר את מספר ה-hCOs הקבוע הרצוי לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מ"ל. הסר את התמיסה המקבעת ושטוף עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBS-T).
    1. כדי לשטוף את ה-hCO, הסר כמה שיותר מעודף הקיבע. היזהר לא להפריע ל-hCOs בתחתית הצינור. הוסיפו ~1 מ"ל PBS-T וחכו כמה שניות עד שה-hCOs ישקעו לתחתית הצינור לפני שממשיכים לשלב הבא.
  2. דיללו את הנוגדן הראשי לריכוז הרצוי בתמיסת הצביעה (10% סרום עגל יילודה, 1% DMSO ב-0.1% PBS-T). הוסף 50-100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל צינור מיקרוצנטריפוגה (או מספיק נפח לכסות את כל ה-hCOs בכל צינור).
  3. דגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 4°C על שייקר/רוקר. הסר עודף נוגדן ראשוני ואז בצע שלוש שטיפות של שעה אחת ב-PBS-T בטמפרטורת החדר. בצע שטיפה סופית בלילה ב-PBS-T בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לוודא שכל נוגדן עודף מוסר ממנו.
  4. דילל נוגדן משני לריכוז הרצוי בתמיסת צביעה והוסף 50-100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה (או מספיק נפח לכסות את כל ה-hCOs בכל צינור).
  5. דגרו hCOs עם הנוגדן המשני למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על פלטפורמת רעידה. הסר נוגדנים משניים עודפים ואז בצע שלוש שטיפות של שעה אחת ב-PBS-T בטמפרטורת החדר. בצע שטיפה סופית ללילה ב-PBS-T בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לוודא שכל הנוגדנים העודפים מוסרים.
  6. להדמיה מלאה, העבירו hCOs באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר עם הקצה המנותק לסלייד זכוכית טעונה חיובית. הסר עודפי PBS-T והוסף כמה טיפות של מדיה להרכבה כדי לכסות את ה-hCO. הנח בזהירות כיסוי כדי לשטח את ה-hCO.
    הערה: כדי לשמר את הארכיטקטורה התלת-ממדית של ה-hCO, יש להשתמש באטם גומי או סרט דו-צדדי סביב קצוות הסלייד כדי להעלות את גובה הכיסוי. שימוש במדיום הרכבה פתוח יכול לעזור לשיפור ההדמיה דרך ה-hCO, במיוחד אם ה-hCOs אינם שטוחים.

4. חתך והטמעה

  1. לאחר הקיבוע יש לכסות hCOs בסוכרוז של 30% במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C להגנה מקריאה. באמצעות פיפטה בנפח 1000 מיקרוליטר עם קצה חתוך, העבר את מספר ה-hCOs הרצוי לתבנית פלסטיק בגודל 12 מ"מ על 12 מ"מ. הסר בזהירות תמיסת סוכרוז עודפה, תוך היזהרות שלא לשאוף hCO.
    הערה: מומלץ לפיפט 30% סוכרוז למעלה ולמטה בקצה הפיפטה לפני ההעברה כדי למנוע hCOs להידבק לצד הקצה.
  2. הוסף טיפה קטנה של OCT, בדיוק מספיק כדי לכסות את ה-hCO. באמצעות פינצטה עדינה או קצה פיפטה, מקם בעדינות את hCOs ב-OCT כך שה-hCOs לא יהיו מגושמים יחד ואין hCOs קרובים לקצוות התבנית. ודאו שכל ה-hCOs קרובים ככל האפשר לתחתית התבנית במטרה למקסם את מספר ה-hCOs הנמצאים בחתך קריואקטיבי אחד.
  3. הקפיאו את השכבה הראשונית של OCT על ידי הנחת התבנית במקרר קלקר עם שכבת קרח יבש בתחתית. חכו כמה דקות עד שה-OCT יתקשה ואז העבירו את התבנית מקרח יבש למשטח השולחן. הוסיפו OCT נוסף עד שהתבנית מתמלאת. חכה שהשכבה הראשונה של ה-OCT תימס לגמרי לפני שתחזור לקרח יבש.
  4. אחסון hCOs קפוא ומוטמע בטמפרטורה של -80°C עד למוכן לקריוסיקה.
  5. כשאתה מוכן לחתך, יישר את בלוק ה-hCO הכי טוב שאפשר והתחל לגזור את הבלוק. הנח מדי פעם קטע על מגלף טעון ובדק כל חלק ויזואלית לאיתור hCO. כאשר hCOs מוצגים בהמחשה, יש לעבור ל-6 מיקרון.
    הערה: שיעור השחיקה של hCOs במהלך הטמעה וחתך הוא לפחות 10%. תכנן בהתאם.

5. מקטעי רקמה של TUNEL וצביעת חיסון

  1. השתמשו בעט פאפ כדי לצייר גבול הידרופובי סביב חלקי רקמה שצריך לצבוע. שטיפו את הסליידס פעם אחת ב-PBS 0.1% טווין (PBS-T) כדי להמיס את ה-OCT.
  2. הוסיפו בופר חסימה (10% סרום עגל יילודה, 1% DMSO, ב-PBS-T) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית. התחילו בריכוז המומלץ על ידי היצרן לאימונופלואורסצנציה, אך ייתכן שיהיה צורך לעבור טיטרציה אמפירית.
    הערה: לחילופין, ניתן לבצע צביעת TUNEL בשלב זה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  4. הסר את הבופר החוסם מהסלייד. הוסיפו מספיק תמיסת נוגדנים ראשונית כדי לכסות מקטעי hCO. דגרו נוגדן ראשוני בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטיפה 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS-T בטמפרטורת החדר.
  5. הכינו תמיסת צביעת נוגדנים משנית בבופר חסימה, כולל DAPI או סמן פאן-גרעיני אחר. הוסיפו מספיק תמיסת צביעת נוגדנים משנית כדי לכסות מקטעי hCO. דגירה מוגנת מאור למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  6. שטיפה 3 פעמים במשך 5 דקות בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS-T בטמפרטורת החדר. הרכבה עם כיסוי עם מדיום ההרכבה הרצוי.

6. כימות הקולוקליזציה הגרעינית באמצעות CardioCount

הערה: CardioCount היא שיטה מבוססת למידה עמוקה לניקוד גרעיני CM מתמונות מיקרוסקופיה40. פותחה במקור להערכת מחזור CM, CardioCount מתפקדת היטב עבור צביעות גרעיניות מרובות, כולל TUNEL40.

  1. כדי להשתמש ב-CardioCount, הורידו את חבילת CardioCount מ-GitHub או ייבאו אותה ל-Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount גרסה 1 פועלת על סביבת Python 3.
  2. יצא תמונות לכימות כקבצי .tif בודדים בגודל 512 x 512 פיקסלים עם ערוצים אדומים, כחולים וירוקים מאוחדים, כאשר הערוץ האדום הוא סמן גרעיני CM, כחול הוא סמן גרעיני כללי, וירוק הוא סמן גרעיני מחזורי (כלומר, Ki67) או סמן אפופטוטי (למשל TUNEL). צור תיקיית אב ב-Google Drive עבור הניסוי הזה והעלה קבצי tiff ממוזגים כתיקיית משנה.
    הערה: CardioCount עברה הכשרה על כתמים גרעיניים שממלאים את הגרעין. סימוני מחזור שהם יותר מנוקדים, כמו Aurora B או PH3, עשויים שלא להתאים ל-CardioCount.
  3. פתח את מחברת CardioCount ב-Google CoLab. הרץ את Cell 1.1 כדי לבדוק גישה ליחידת עיבוד גרפית (GPU). הרץ את Cell 1.2 כדי לחבר את המחשב הנייד של CoLab ל-Google Drive.
  4. הרץ את Cell 1.3 כדי לטעון את CardioCount ותלויות ב-Google Colab. ערוך kfile כדי לקרוא את שם הנתיב למקום שבו תיקיית PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries נשמרה כשהורדה.
  5. ב-Cell 2.0, ערוך base_folder כדי לקרוא את pathname לתיקיית ההורה שמכילה את תת-התיקייה של התמונות לניתוח. הרץ את Cell 2.0 כדי לקשר את התיקייה הזו ל-CoLab.
  6. בתא 2.1.1, ערוך orig_image_folder כדי להתאים לשם התיקייה המכילה תמונות לניתוח. ערוך channel_to_remove לקרוא ירוק וערוך new_image_folder לקרוא לתיקיית המשנה תחת base_folder שבה כל התמונות עם הערוץ הירוק מוסר (אדום/כחול) יישמרו. חזור על השלב הזה כדי להסיר את הערוץ האדום, וודא שאתה עורך new_image_folder כדי להבחין בתיקיית המשנה שמכילה תמונות עם הערוץ האדום שהוסר (ירוק/כחול).
  7. ב-Cell 2.1.2, חותכים תמונות ל-512 על 512 תמונות עבור התמונות האדומות/כחולות. ודא שה uncropped_image_folder תואם לשם new_image_folder שנוצר בשלב 6.6. לתמונות אדומות/כחולות. שם destination_image_folder כדי לציין את התיקייה שבה יישמרו תמונות אדומות/כחולות. חזור על השלב הזה כדי לחתוך את התמונות הירוק/כחולות. לבסוף, חזור על השלב הזה כדי לחתוך את ה-tiffs המקוריים עם 3 ערוצים, ממוזגים שמאוחסנים ב-base_folder.
  8. הרץ את Cell 2.2 כדי ליצור מפות הסתברות. השם data_specific_folder השם של התמונות האדומות/כחולות והירוקות/כחולות שנוצרו ב-destination_image_folder מתא 2.1.2. עבור model_dir, הזן נתיב קובץ לתיקייה שמכילה מודלים של סגמנטציה. כדי לסגמנט גרעיני אדום, השתמש במודל erg_rb_opt והזן 200 עבור אפוק. שנה את שם probmap_directory_name כדי לסמן את התיקייה שבה יישמרו מפות הסתברות אדומות/כחולות. חזור על השלב הזה עבור תמונות ירוקות/כחולות. כדי לחלק גרעינים ירוקים, השתמש במודל edu_mouse_bg_opt והזן 100 עבור אפוק.
  9. ב-Cell 2.3.1, ייוצרו מפות אובייקטים בהתבסס על מפות ההסתברות שנוצרו בשלב 6.8. ה-input_folder ייקרא על שם destination_image_folder מ-Cell 2.1.2 שמכיל תמונות מפת הסתברות אדומות/כחולות שנוצרות ב-Cell 2.1.2. ציינו את output_folder שבו יישמרו תמונות אדומות/כחולות עם סף. קבע סף לרמת ביטחון לסגמנטציה גרעינית (טווח של 0.0-1.0). הרץ את Cell 2.3.1. חזור על השלב הזה עבור תמונות ירוקות/כחולות.
    הערה: הספים לרמת הביטחון לגבי גרעינים יהיו תלויים במערך הנתונים. התחל עם סף של 0.9 והתאם גבוה יותר אם זה גמיש מדי, ונמוך יותר אם מחמיר מדי, בהתבסס על בדיקה אקראית של מפות הסתברות.
  10. ב-Cell 2.3.2, מספר התאים במפות אובייקטים שנוצרו בשלב 6.10 ייספר וייוצא לקובץ .csv. ה-count_folder ייקרא על שם output_folder מתא 2.3.1 שבו נשמרות תמונות אדום/כחול עם סף. כדי להוציא אובייקטים שנוגעים בגבול התמונה, ודא ignore_border_cells קורא True. שנה את שם csv_path לשם הנתיב של base_folder שבו נשמרות כל התיקיות המשניות. ערוך את שם ה-csv כדי לשקף את המספרים של אובייקטים אדומים/כחולים. חזור על השלב הזה עבור תמונות כחולות/ירוקות.
  11. בתא 2.4, גרעינים כפולים חיוביים ירוק/אדומים ייספרו. שנה את שם img_folder לשם התיקייה המשנה שנוצרה בשלב 6.8 ומכילה תמונות חתוכות בשלושה ערוצים. שינוי שם childcell_folder ל-output_folder מתא 2.3.1 שבו נשמרות תמונות אדום/כחול עם סף. שינוי שם parentcell_folder ל-output_folder מתא 2.3.1 שבו נשמרות תמונות ירוק/כחול עם סף. שנה את שם dest_folder כדי לסמן את התיקייה שבה יישמרו מפות אובייקטים חיוביים כפולים. שינוי שם csv_path כדי לסמן את שם הנתיב ושם הקובץ ל base_folder שבו מאוחסנים כל התיקיות המשנה וערוך את שם ה-csv כדי לשקף את המספרים של אובייקטים כפולים.
  12. אמת סגמנטציה מדויקת על ידי השוואת הספירות החיוביות האדומות, הירוקות והכפולות שנוצרו לכל תמונה לתמונה הגולמית.
    1. אם CardioCount מעריך באופן עקבי יתר על המידה את מספר הגרעינים בתמונה ביחס למה שסוקר עיוור היה סופר, חזור על שלב 6.9 עם סף ביטחון גבוה יותר, וחזור על השלבים 6.10-6.11. אם CardioCount מעריך פחות מדי את מספר הגרעינים בתמונה ביחס למה שסוקר עיוור היה סופר, חזור על שלב 6.9 עם סף ביטחון נמוך יותר, וחזור על השלבים 6.10-6.11.
  13. סכם את כל הספירות עבור כל hCO עבור גרעינים אדומים, גרעינים ירוקים וגרעינים חיוביים כפולים. חשב אחוז גרעינים מחזוריים כ-(גרעינים כפולים חיוביים / גרעיני CM אדומים כוללים) x 100 לכל אורגנואיד.

7. פגיעת היפוקסיה-חמצון מחדש

  1. הכינו מדיום היפוקסיה (119 מ"מ NaCl, 12 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ NaH2PO4, 1.3 מ"מ MgSO4, 0.5 מ"מ MgCl2, 0.9 מ"מ קאל-2, 20 מ"מ לקטט נתרן ו-5 מ"מ HEPES, pH = 6.4)5.
  2. לבקבוק תרבית תאים, העבר 5 מ"ל מדיום היפוקסיה לכל פלטת hCO עם 96 בארים. שים את בקבוק תרבית התאים בתוך תא ההיפוקסיה, ושטוף עם גז אנוקסי (5%CO2, 95%N2) למשך 3 דקות. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות שעה לפני תחילת היפוקסיה.
  3. הסר את כל המדיה מ-hCO. התחל בהסרת ~150 מיקרוליטר עם פיפטה רב-ערוצית מכל הבארות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בזהירות את שאר המדיה מבארות בודדות, מבלי להפריע ל-hCO.
    הערה: הסרת כל המדיה מכל הבארות היא קריטית להשגת פציעה שניתנת לשחזור.
  4. הוסף 50 מיקרו-ליטר של חומר היפוקסיה לכל באר. שים את צלחת ה-hCO בתא ההיפוקסיה ושטף עם גז אנוקסי (5%CO2, 95%N2) למשך 3 דקות. הניחו את תא ההיפוקסיה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
  5. כדי להתחיל חמצון מחדש, הסרת hCOs מתא ההיפוקסיה והזנה עם 150 מיקרוליטר של מדיום RB+ מחומם מראש. יש לאפשר לפחות 3 שעות של חמצון מחדש ב-37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע בדיקות במורד הזרם.

8. בדיקת שחרור לקטט דה-הידרוגנאז

  1. איסוף 20 מיקרו ליטר של מדיה מבארות של hCOs פצועים ולא פצועים בנקודת הזמן הרצויה לאחר תחילת ההחזרה. דילל 1:10 ל-180 מיקרוליטר של בופר אחסון LDH (200 מ"מ טריס-HCl (pH 7.3), 10% גליצרול, 1% BSA). אחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C עד שתהיה מוכנה לביצוע הבדיקה. פיפט למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב מדיה לפני האיסוף
  2. להפשיר מדיה קפואה. הוסף 45 מיקרוליטר של בופר אחסון LDH לבאר אחת של לוח 96 בארות עם קיר שחור, תחתית שקופה, עבור כל דגימת מדיה שיש לבדוק. הוסף 5 מיקרוליטר של מדיה מדוללת ביחס 1:10 לכל באר לדילול סופי של 1:100. הכינו תגובת גילוי LDH על ידי ערבוב של 50 מיקרוליטר של תערובת אנזימי גילוי LDH ו-0.25 מיקרוליטר של סובסטרט רדוקטאז לכל דגימה שיש לבדיקה.
  3. הוסף 50 מיקרוליטר של תגובת גילוי LDH לכל באר המכילה מדיום מדולל ביחס 1:100. דגרו בטמפרטורת החדר, מוגנים מאור, למשך 60 דקות. בדיקה לאות ביולומינצנטי על קורא לוחות תואם.

9. הדמיית סידן

  1. הכינו תמיסת צביעת סידן עם פנול ללא אדום RPMI-1640, 0.04% פלורוני, ו-5 מיקרומום Cal520-AM. להגן על דגימות מאור.
  2. הסר 100 מיקרוליטר מדיה מכל באר המיועדת להדמיית סידן. הוסיפו 100 מיקרוליטר תמיסת צביעת סידן ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מוגנים מאור, למשך 30 דקות.
  3. הסר 100 מיקרוליטר מדיה מכל באר עם צבע סידן והחלף ב-100 מיקרוליטר של פנולים אדומים RPMI-1640. דגרו במשך 30 דקות עד שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר שטיפת צבע.
  4. באמצעות מיקרוסקופ עם יכולות הדמיה/סטרימינג רציפים, הצב את לוח ההתקנה הנמוך ביותר 96 בארות במצב עבודה. עם מטרה של 10x, זהה את בסיס ה-hCO ושים לב לטרנזיינטים של Cal520.
  5. לכוד הקלטות של 30 שניות של סידן חולף בטמפרטורת החדר. אם משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי, לא ניתן יהיה לצלם את כל ה-hCO. בחרו מישור מוקד קרוב לבסיס ה-hCO, שבו קווי המתאר של התאים נראים במהלך תנועות סידן.

10. ניתוח סידן חולף (איור 3)

  1. ניתוח חולפים של סידן ניתן לבצע באמצעות מגוון תוכנות ניתוח פיק. להלן הוראות לניתוח באמצעות תוסף Spiky ImageJ41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. הוסף חמישה אזורי עניין של 2 על 2 פיקסלים (ROIs) למנהל ה-ROI בין תאים גלויים בכל hCO. יש להיזהר לא לחפוף את תשואה עם גרעיני תאים או גבולות תאים, שכן תנועת ה-hCO עלולה להשפיע על ניתוח חולף.
  3. תחת ניתוח מדידות > סט, בחר עוצמת אפור ממוצעת. במנהל ROI, בחר ב-Multi-Measure כדי ללכוד את עוצמת האפור הממוצעת בכל ה-ROI ובכל הפריימים של ההקלטה.
  4. שמור קובץ .csv המכיל את עוצמת האפור הממוצעת לכל ה-ROIs. שמור את כל מיקומי ה-ROI לכל תמונה לעיון מאוחר יותר.
  5. בגיליון אלקטרוני חדש, הוסף עמודה עבור זמן(ים). מחשבים את הזמן בכל פריים על ידי חלוקת 30 שניות במספר הכולל של הפריימים, ואז הכפלה במספר הפריימים. שמור את זה כ-.csv ערוך.
  6. פתח את קובץ .csv הערוך בפיג'י ופתח את תוסף Spiky. תחת אפשרויות ניתוח, בחר את פרמטרי הניתוח הרצויים.
  7. זמן גרף על ציר X, ועוצמת אפור ממוצעת עבור ROI #1 בציר Y. בחר לנתח פיקים, ולאשר את ההערה הנכונה של קו הבסיס, התחלה/סיום השיא והמשרעת השיא. אם זוהה מספר שגוי של שיאומים, שנה פרמטרים באפשרויות ניתוח, כולל משרעת שיא מינימלית מהבסיס, והתחל את סף השיא עד שהזיהוי מוצלח.
  8. שמור את כל הקבצים הביניים. ניתן לחשב פעימות לדקה (bpm) על ידי חלוקת 60 בממוצע של מרווח השיא לשיא לכל ROI.
  9. חזור על הניתוח לעיל עבור כל התשואה לכל hCO.

figure-protocol-3
איור 3: ניתוח סידן חולף. (A) התיבה האדומה מציינת את הכפתור שפותח את תפריט הנפתח לבחירת פרמטרי ניתוח. (B) התיבה האדומה מציינת את הכפתור להצגת זמן (ים) לעומת עוצמת אפור ממוצעת מתוך תשואה בתוך hCO לא נפגע מייצוג. (C) התיבה האדומה מציינת את הכפתור לבחירת ניתוח שיא. (D) ניתוח עקבות ושיאים של סידן חולף מייצג מ-hCO לא פגוע. משולשים אדומים מציינים את מקסימום השיא, ריבועים ורודים מייצגים את השיפוע המקסימלי לשיאים למעלה ולמטה, תיבה ירוקה מציינת תחילת השיא, ותיבה כחולה מציינת קו בסיס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצוע הפרוטוקול לעיל אמור להניב hCOs מעוצבים היטב שמתחילים לפעול בין ימי ההתמיינות 7-12 (D7-12). ככל שה-hCOs מתבגרים מעבר ליום 25, ייתכן שהתכווצויות ספונטניות כבר לא נראות ללא קצב חשמלי. פציעת H/R יכולה להתבצע בכל זמן לאחר שה-hCOs מתחילים להשפיע - בדרך כלל אנו מבצעים פציעה על hCOs בני 15 יום (D15) או מאוחר יותר.

אישור הפציעה
בדומה לאוטם שריר הלב האנושי, פגיעת H/R של hCOs גורמת למוות תאים. קלינית, ניתן להעריך את היקף הנזק לשריר הלב על ידי מד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצג פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת ופציעה של hCOs מתאספים מעצמם עם H/R. מחלות לב איסכמיות מאופיינות בשיפוץ פתופיזיולוגי, כולל מוות קרדיומיוציטים, שיקום פיברוטי, תפקוד לקוי ותפקוד תפקודי. הפרעות אלו נצפות במערכת מודל hCO, כולל עלייה ב-CMs של TUNEL+ , עלייה בשחרור LDH, עלייה בשטח הרקמה של וימנטין+ , ושינויים בטיפול בסידן המובילים לאובדן סינכרון פונקציונלי. חשוב לציין כי hCOs אינם מראים עדות להתחדשות רקמות, למרות חוסר הבגרות היחסית של hCOs. לכן, מודל H/R זה יכול לשמש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP), ותוכנית הכשרת מדענים רפואיים של אוניברסיטת דיוק T32 5T32GM145449-03 (LP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת אקוטאזסיגמא-אלדריץ'A6964-500ML
נוגדן טרופונין T אנטי-קרדיאקיאבקאםEPR20266
תוסף B-27 (50X), ללא סרוםגיבקו17504044
תוסף B-27, בלי אינסוליןגיבקוA1895602
קורא לוחות BioTek Synergy Neo2ביו-טק
Cal-520, AMAAT ביוקווסט21131
CardioCount V1מעבדת קארהPMID: 38984052
קו תאים (Homo sapiens, זכר) - קו iPSC DU11ליבת תאי הגזע של אוניברסיטת דיוק
שקופיות מיקרוסקופ טעון, זכוכית לבנהVWR89500-496
CHIR 99021טוקריס4423
CloneRטכנולוגיות STEMCELL5888
לוחות מיקרו שקופים 96 באר עם חיבור אולטרה-נמוךפישר7007
מאגרי צנרת חד-פעמייםVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESגיבקו11330057
מיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOSEVOS
מטריצת בסיס ממברנה מופחתת של ג'לטרקס, ללא LDEV, מוסמך לתאי גזעגיבקוA1413302
אנוש אקטיבין - חלבון רקומביננטיPEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2טכנולוגיות STEMCELL72124
חומצה אסקורבית L-(ACS גבישית/מוסמכת)פישר סיינטיפיקA61-100
עכבר אנטי-וימנטיןDSHBAMF-17b
mTeSR Plusטכנולוגיות STEMCELL100-0276
לוחות תרבית תאים מולטיוול – 12 בארותVWR10062-894
פלורוניק F-127סיגמא-אלדריץ'P2443
ReLeSRטכנולוגיות STEMCELL100-0483
RPMI 1640 בינוניגיבקו11875119
RPMI 1640 בינוני, ללא פנולים אדוםגיבקו11835-030
תיאזוביביןטכנולוגיות STEMCELL72254
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתסאקורה פינטק ארה"ב בע"מ (VWR)25608-930
מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב של זייסצייס

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

מאמרים קשורים