הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת ייצור תחמוצת חנקן בתרביות תאי אפיתל של קנה הנשימה בעכברים הממוינים בממשק נוזל האוויר

130 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70311

⸱

3 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות ייצור תחמוצת החנקן (NO) בתרביות אפיתל בדרכי האוויר המובחנות בממשק אוויר-נוזל (ALI) על ידי מדידת ניטריט בהפרשות אפיקליות באמצעות בדיקת כימילומינציה מבוססת טריודיד.

תקציר

תרביות אפיתל בדרכי הנשימה המובחנות בממשק אוויר-נוזל (ALI) מספקות מודל פיזיולוגי רלוונטי לחקר איתות חנקן תחמוצת (NO) בתאים ריסיניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לכימות ייצור NO על ידי מדידת ניטריט (NO₂⁻), תוצר חמצון יציב של NO, בדגימות שנאספו מתאי האפיתל של קנה הנשימה העכברית הממינים ALI. שטיפות אפיקליות, מדיום בסיסי וליזאטים של תאים נאספים ומנותחים באמצעות בדיקת כימילומינסנציה מבוססת טרייודידים המקושרת לאנלייזר תחמוצת חנקן (NOA). בהזרקה לכלי התגובה, ניטריט מופחת כימית ל-NO, אשר מזוהה על ידי כימיליומינציה מבוססת אוזון. עוצמת האות נמדדת ומומרת לפיקומולים של ניטריט באמצעות עקומת כיול סטנדרטית, והערכים מנורמל לתכולת החלבון התאית הכוללת. ביצועי הבדיקה מאומתים באמצעות מודולציה פרמקולוגית של רמות NO. לאחר טיפול ב-NO תורם דיאתילנטריאמין NONOate (DETA-NONOate) ובמעכב NO סינתאז N(ω)-Nitro-L-ארגינין מתיל אסטר (L-NAME), אנו מבחינים בהבדלים משמעותיים ברמות הניטריט בין מצבים. האות החזק והניתן לשחזור ביותר נצפה בשטיפות אפיקליות, התואם לכמות ה-NO שמשתחרר מאפיתל דרכי הנשימה. שיטה זו מזהה באופן אמין NO בדגימות מאפיתל דרכי הנשימה הממוינים על ידי ALI, ומספקת פלטפורמה מדויקת במבחנה לכימות ייצור NO ולמודל מחלות הקשורות למטבוליזם NO לא תקין.

מבוא

סימן היכר של מספר מחלות דרכי הנשימה, כולל אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס (CF) ודיסקינזיה סיליארית ראשונית (PCD), הוא הומאוסטזיס חנקן (NO) משתנה שניתן למדיד באמצעות שינויים ברמות NO בנשיפה, שיכולות להשתנות במידה רבה במחלות אלו, כאשר הן מוגברות ב-COPD ואסתמה 1,2, בעוד שהפחתה הדרסטית ב-CF ו-PCD3, 4. מחלות אלו מציגות לעיתים קרובות חריגות בריסים תנועתיים אפיתל של דרכי האוויר, הגורמים המרכזיים לניקוי רירית5. מכיוון ש-NO ומסלולי האיתות שלו במורד הזרם הם רגולטורים קריטיים של תנועתיות הסיליארית, הבנת האופן שבו ייצור NO והאיתות משתנים בהקשרים אלו חיונית להבהרת מנגנוני תפקוד לקוי רירירי. בהתאם לכך, שיטה המאפשרת זיהוי מדויק של ייצור ושחרור NO באפיתל דרכי הנשימה מספקת כלי חשוב לניתוח הוויסות והתפקיד הפיזיולוגי של מולקולת איתות זו. גישות כאלה שימושיות במיוחד בסביבות ניסוי שבהן מדידה ישירה של NO מאתגרת בשל מחצית החיים הקצרה והריאקטיביות המהירה שלו.

NO מווסת ביוגנזה ותפקוד ריסי דרכי הנשימה על ידי השפעה על קוטביות התאים הריסניים ועל פעימות מתואמות של ריסים ניידים 6,7,8. עם זאת, המנגנונים ששומרים על הומאוסטזיס ללא הומאוסטזיס בדרכי האוויר נותרו מובנים לחלוטין. תרביות אפיתל בדרכי הנשימה המובחנות בממשק אוויר-נוזל (ALI) מספקות מערכת חוץ-גופית חשובה לחקר מנגנונים אלו. כיום, מודל זה משמש באופן נרחב לחקר השפעת פגיעות סביבתיות על אפיתל דרכי הנשימה 9,10,11 ולהבהרת הפתופיזיולוגיה של מחלות דרכי הנשימה12. בהשוואה לתרביות שקועות קונבנציונליות13,14, אפיתל מובחנת עם ALI משחזרת בנאמנות רבה יותר את הארכיטקטורה והתפקוד של דרכי האוויר הטבעיות, כולל קיטוב אפיתליאלי, התמיינות רירית וחילוף ריאלי בין גז לנוזל, מה שהופך אותם למתאימים במיוחד לחקר שחרור NO אפיקלי, איתות ותפקוד סיליארי קשור. לכן, מערכת זו מתאימה במיוחד לניסויים שמטרתם לכמת מטבוליטים שמקורם ב-NO המשתחררים ללומן דרכי הנשימה, במיוחד בתנאי התמיינות אפיתלית או מניפולציה פרמקולוגית.

מדידה מדויקת של ריכוז NO היא חיונית, שכן רמות NO מופרזות וחסרות עלולות לפגוע בתפקוד הסיליארי. נכון להיום, שיטות מבוססות גלאי פלואורסצנטי (כגון דיאמינופלואורסציין, DAFs) הזמינות לגילוי NO הן חצי-כמותיות בלבד ומוגבלות על ידי רגישות ל-pH, תלות בחמצן וחוסר ספציפיות, שכן הן יכולות להגיב עם מחמצנים תאיים ונוגדי חמצון, מה שמוביל למדידות חצי-כמותיות15. בנוסף, חיישנים אלקטרוכימיים (למשל, אלקטרודות אמפרומטריות רגישות ללא רגישות) מאפשרים גילוי בזמן אמת של NO16, אך קשה ליישם אותם במערכות ביולוגיות מורכבות עקב חוסר מחצית חיים קצרה, הפרעות מביוזימה של מינים פעילים ב-Redox על פני השטח של האלקטרודה, ואתגרים בשמירה על כיול יציב17. גישות אלטרנטיביות מבוססות כימילומינסנציה כולל זיהוי ישיר של NO בשלב גז ובדיקות רדוקטיביות המיועדות למינים שונים של תחמוצת חנקן, תוארו גם הן, אך יישומן בתרביות אפיתל בדרכי הנשימה טרם נחקר. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בשיטות רגישות וכמותיות שיכולות לזהות באופן אמין רמות נמוכות של מינים שמקורם ב-NO בדגימות ביולוגיות בנפח קטן. כדי להתגבר על מגבלות אלו, הקמנו פרוטוקול לכימות NO בהפרשות אפיקליות שנאספו מאפיתל דרכי הנשימה הממוינים על ידי ALI באמצעות אנלייזר חנקן תחמוצת (NOA). ה-NOA הוא גלאי רגיש מאוד המבוסס על כימילומינסנציה, המשמש באופן מסורתי למדידת מטבוליטים של NO בדגימות כימיות, ולאחרונה הותאם לניתוח דגימות ביולוגיות, כולל דם, הומוגנטים של רקמות וסופרנטנטים לתרבות תאים 7,18,19. NO היא מולקולת איתות תגובתית מאוד שמחומצנת במהירות לניטריט ברקמות בתנאים של רמות חמצן תקינות, עם מחצית חיים קצרה במיוחד. לכן, ניטריט כתוצר סופי של NO חמצון משמש כאינדיקטור לייצור NO הכולל במערכות ביולוגיות 20,21,22. שיטה רגישה וניתנת לשחזור כימילומינציה זו מאפשרת גילוי ניטריט/NO ברמות פיקומולר23,24, מה שהופך אותה לאידיאלית למדידת שינויים קטנים בדגימות ביולוגיות בנפח נמוך כגון אלו שמקורן בתרביות MTEC ALI. עם זאת, גישה זו מתאימה במיוחד למצבים שבהם הצטברות ניטריטים משקפת ייצור NO עדכני ועלולה להיות מושפעת מגורמים כמו טיפול בדגימה, זיהום ניטריטים ברקע ומצב הבדלה אפיתליאלית. לכן, נדרשים בקרות מתאימות ותכנון ניסויי מדויק כדי להבטיח פרשנות מדויקת של התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל נהלי בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מרילנד (פרוטוקול # AUP–00004632).

הערה: הפרוטוקול דורש כ-2 ימים לבידוד תאי האפיתל של קנה הנהמה בעכברים (MTEC), אחריהם 7–10 ימים להתרחבות, 5–6 ימים להתרבות בתאי טרנסוול, 21 ימים להתמיינות (זמן הדרוש לרכישת תאים מרובי ריסים מספיקים), 24 שעות טיפול תרופתי ויום נוסף לאיסוף דגימות, כיול NOA, הזרקות ורכישת נתונים.

1. הכנת מדיה ופתרונות

הערה: עיינו בטבלה 1 לפרטים על מרכיבי המדיה.

  1. המדיה של Ham's F–12
    1. הכינו את התמיסה בתוך מכסה זרימה למינרי סטרילי. הוסיפו 5 מ"ל של אנטיביוטיקה של 100× פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.5 מ"ל אמפוטרצין B (פונגיזון) ל-500 מ"ל מדיום F12 של Ham's בבקבוק סטרילי.
    2. ערבבו על ידי הפיכת הבקבוק בעדינות 5–10 פעמים כדי להבטיח ערבוב מלא. סנן את התמיסה באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון בתנאים סטריליים, ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      אזהרה: פניצילין/סטרפטומיצין ואמפוטריצין B הם חומרים אנטי-מיקרוביאליים שעלולים לגרום לגירוי או לתגובות אלרגיות. לטפל בציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות וחלוק מעבדה.
  2. פתרון פרונאז
    1. הוסיפו 15 מ"ג פרונאז ל-10 מ"ל של מדיום סטרילי של Ham's F12 בצינור סטרילי כדי לקבל תמיסת פרונאז של 0.15%. ערבבו על ידי היפוך עדין או פיפטינג למעלה ולמטה עד שהפרונזה נמס לחלוטין. הכינו טרי מיד לפני השימוש.
  3. פתרון DNase I
    1. הוסיפו 5 מ"ג DNase גס לבלב I ל-9 מ"ל של מדיום F12 של Ham's ו-1 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) בצינור סטרילי כדי לקבל תמיסת DNase I של 0.5 מ"ג/מ"ל.
    2. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שה-DNase I נמס לחלוטין, תוך הימנעות מהיווצרות בועות. לאחר שהתמיסה מוסה לחלוטין, מחלקים את התמיסה לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים בנפח 1 מ"ל ומאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 20°C.
  4. מדיום F12 של Ham עם סרום בקר עוברי (FBS)
    1. הכינו את התמיסה בטמפרטורת החדר בתוך מכסה זרימה למינרי סטרילי. הוסיפו 10 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) ל-40 מ"ל מדיום F12 של Ham's עם אנטיביוטיקה בצינור קוני סטרילי כדי לקבל 20% FBS במצב F12.
    2. ערבבו בעדינות על ידי הפיכת הצינור 5–10 פעמים עד שהתמיסה הופכת הומוגנית. סנן את התמיסה באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון בתנאים סטריליים, ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. מדיית הרחבה של MTEC
    1. הכינו את מדיום ההרחבה של MTEC בטמפרטורת החדר בתוך מכסה זרימה למינרי סטרילי על ידי שילוב הרכיבים המפורטים בטבלה 1 בבקבוק סטרילי.
    2. ערבבו היטב על ידי סיבוב עדין או הפיכת המיכל עד שכל הרכיבים מתערבבים במלואם. סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.22 מיקרון בתנאי סטריליזציה.
    3. מוסיפים את מעכב ROCK Y–27632 (תמיסת מלאי 5 מ"מ) לריכוז סופי של 10 מיקרומום ואת מעכב נוץ' γ–סקרטאז DAPT (תמיסת מלאי של 10 מ"מ) לריכוז סופי של 5 מיקרומום מיד לפני השימוש, ולערבב בעדינות באמצעות הפיכה.
  6. מדיה של הפצת MTEC
    1. הכינו את מדיום ההתרבות של MTEC בטמפרטורת החדר בתוך מכסה זרימה למינרי סטרילי על ידי שילוב הרכיבים המפורטים בטבלה 1.
    2. ערבבו היטב על ידי היפוך עדין או סיבוב עד שכל המרכיבים מתערבבים במלואם. סנן את המדיום באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון בתנאים סטריליים.
    3. מיד לפני השימוש, יש להוסיף את מעכב הסלע Y–27632 (תמיסת מאגר 5 מ"מ) לריכוז סופי של 10 מיקרומום וחומצה רטינואית (תמיסת מאגר 5 מיקרומון) לריכוז סופי של 0.05 מיקרומון. מערבבים בעדינות באמצעות היפוך לפני השימוש.
  7. מדיה דיפרנציאציה של MTEC
    1. הכינו את מדיום ההתמיינות MTEC בטמפרטורת החדר בתוך מכסה זרימה למינרי סטרילי על ידי שילוב הרכיבים המפורטים בטבלה 1 במיכל סטרילי.
    2. ערבבו היטב על ידי היפוך עדין או סיבוב עד שכל המרכיבים מתערבבים במלואם. סנן את המדיום באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון בתנאים סטריליים.
    3. מיד לפני השימוש מוסיפים חומצה רטינואית לריכוז סופי של 0.05 מיקרומטר ומערבבים בעדינות באמצעות היפוך.

2. בידוד תאי אפיתל קנה הנשימה של העכברים (MTEC)

  1. המית שלושה עכברים בוגרים (8–20 שבועות) באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2) בתא המתת חסד מאושר בהתאם להנחיות ה-IACUC המוסדיות. לאשר את המוות לפני איסוף רקמות.
  2. הנח את החיה בגב (החזה פונה כלפי מעלה) על משטח אספטי. באמצעות מלקחיים נקיים, הרימו בעדינות את העור וחתכו אותו במספריים כירורגיים מהשפה התחתונה ועד הבטן כדי לחשוף את קנה הנשימה.
  3. הזז את בלוטות הרוק הצידה והסר את רקמת החיבור ושריר הטרכאלית כדי לחשוף את טבעות הסחוס. נתח את כל אורך קנה הנשימה והנח אותו בצלחת פטרי המכילה את המדיום הסטרילי של Ham's F12. שלבו שלושה קנה נשימה במנה אחת.
  4. העבר את המנה למכסה זרימה למינרי והנח את קנה הנשימה למנה אחרת עם מדיום F12 טרי של Ham's. הסר כל רקמה חוץ-קנה הנשימה וחתוך את קנה הנשימה לאורך דרך הלומון.
  5. העבר את כל קנה הנשימה לצינור קונוסי ברוחב 50 מ"ל המכיל תמיסת פרונאז סטרילית של 10 מ"ל 0.15%. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 16–18 שעות.

3. בידוד תאים והתרחבות ראשונית

  1. למחרת, הפכו את הצינור המכיל את הרקמות 10–15 פעמים כדי לשחרר את תאי האפיתל ולדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 45 דקות. עצור את תגובת הפרונאז על ידי הוספת 10 מ"ל מדיום של Ham המכיל 20% FBS וערבב על ידי הפיכת 10–15 פעמים.
  2. הוסיפו 10 מ"ל מדיום F12 של Ham עם FBS לשלושה צינורות של 15 מ"ל. באמצעות פיפטת פסטר מעבירים את רקמת קנה הנשימה ברצף מצינור ה-50 מ"ל לצינור הראשון, השני והשלישי בגודל 15 מ"ל ולהפוך 10–15 פעמים בכל צינור כדי להוציא את תאי האפיתל של קנה הנשימה. להשליך את הרקמה לאחר ההעברה הסופית.
  3. משלבים את כל המדיה משלושת הצינורות הקוניים של 15 מ"ל עם המדיום בצינור של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב-360 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנט והוסיף 0.5 מ"ל של תמיסת DNase I של 0.5 מ"ג/מ"ל. דגר על קרח במשך 5 דקות.
  4. צנטריפוגה ב-360 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט והחזירו את כדור התא לתוך 7–10 מ"ל של תווך התפשטות MTEC.

4. הרחבה והבחנה של MTEC

  1. הכינו בקבוקון תרבית תאים מצופה קולגן עם שימוש ב-10 מ"ל קולגן I (זנב עכברוש) ב-50 מיקרוגרם/מ"ל ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16–18 שעות. שאף את תמיסת הקולגן מבקבוק T75 ושטוף את הבקבוקון שלוש פעמים עם PBS (1×). תן לבקבוק להתייבש לגמרי.
  2. זרעו את תליית התא המורכבת מ-7–10 מ"ל של מדיום התרחבות MTEC המכיל את התאים לתוך בקבוק מצופה קולגן. הנח את הבקבוק באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. החלף את מדיום ההתרחבות כל יומיים או שלושה ועקוב אחרי מספר התאים עד ל-70% מההתנגשות.
  3. ב-70% קונפליקציה, הוסיפו 1 מ"ל תמיסת אקוטאז ודגרו במשך 10–15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את שכבת התא. החזירו את התאים לתוך 10 מ"ל של מדיום רבייה של MTEC. צנטריפוגה ב-1057 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. השליכו את הסופרנטנט, החזירו את התאים למדיום רבייה וספורו את התאים.
  5. זרע 2 ×-105 תאים בנפח 0.5 מ"ל לכל תוספת לטרנסוול (קוטר ממברנה 12 מ"מ, 0.4 מיקרון גודל נקבוב ממברנה) מצופה מראש בקולגן. הוסיפו 1.5 מ"ל מדיום לתא הבסיס של כל אינסרט והניחו את הטרנסוול באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. החלפת מדיום הן בתא האפיקלי והן בבסיס ביום השלישי ואפשרה לתאים להגיע ל-100% חיבור אחד, בדרך כלל ביום 5 או 6. כלול תוספה אחת ללא תאים כבקרה.
  7. לאחר המפגש, שטוף את התאים בקצה הקצה עם 0.5 מ"ל של מדיום התמיינות MTEC. התחל ממשק אוויר-נוזל (ALI) על ידי הוספת 0.75 מ"ל של מדיום התמיינות לתא הבסיס בלבד, והשארת התאים בתא האפיקלי חשופים לאוויר.
  8. כל 2–3 ימים, שוטפים תאים במשטח האפיקלי עם מדיום התמיינות והחליפו את המדיום הבסיסי. אפשר לתאים להתמיין ב-ALI למשך 21 ימים.

5. תיוג חיסוני ודימות של תאי אפיתל ריסים

  1. ביום 7, 14 ו-21 ב-ALI, תיקן את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד (PFA).
  2. לבצע סימון חיסוני של תאים עם נוגדן אנטי-FoxJ1 לזיהוי FoxJ1, גורם שעתוק חיוני לציליוגנזה תנועתית25,26, ונוגדן אנטי-אצטילט α–טובולין לזיהוי α–טובולין אצטילט, סמן מבני של ריסים ניידים לפי פרוטוקוליםשפורסמו 27,28,29.
    אזהרה: PFA הוא חומר כימיקל מסוכן, לכן יש ללבוש ציוד מגן מתאים (כפפות ניטריל ומעיל מעבדה לכל הפחות) בעת קיבוע התאים.
  3. רכוש תמונות של התאים המסומנים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מטרה של 40× או 60×. אספו ערימות Z בעומק של 10 מיקרון, כאשר גודל כל שלב הוא 0.5 מיקרון.
  4. הגדר את עוצמת הלייזר, הגבר הגלאי והחשיפה כדי למנוע רוויה באות ולשמור על פרמטרי רכישה דומים בין דגימות שונות.
  5. כמת את התאים החיוביים ל-FoxJ1 – חיוביים או אצטילציה – טובולין – כאחוז של תאים כוללים (DAPI–חיובי) לכל אזור עניין (ROI) באמצעות תוסף מונה התאים בתוכנת הדמיה של FIJI.
  6. בתוכנת GraphPad Prism (גרסה 10.0) יוצרים גרפים ומבצעים ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t סטודנט דו-זנבי לאחר הערכת התפלגות הנתונים לנורמליות באמצעות מבחן Shapiro-Wilk.

6. טיפול תרופתי באפיתל דרכי האוויר הממוינות

  1. ביום ה-21 של ALI הכינו מדיום התמיינות (3 מ"ל לתאים בשלושה אינסרטים) בצינור סטרילי בטמפרטורת החדר.
  2. מוסיפים 7.5 מיקרוליטר של דיאתילן טריאמין–NONOate או DETA/NO מתמיסת מלאי של 100 מ"מ (מוכנה ב-10 מ"מ NaOH) לתווך ההתמיינות, כדי להגיע לריכוז הסופי של 250 מיקרומום ב-3 מ"ל. ערבבו בעדינות באמצעות הפיכה והשתמשו מיד.
  3. הוסיפו 750 מיקרוליטר מהתמיסה הסופית לכל אחד משלושת תאי הבסיס של התאים הממוינים ודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הכינו 1 mM Nω-Nitro-L-ארגינין מתיל אסטר (L–NAME) על ידי הוספת 30 מיקרו-ליטר מתמיסת 100 מ"מ L-name (מוכנה ב-DMSO) למדיית דיפרנציאציה MTEC לנפח כולל של 3 מ"ל.
  5. הוסף 750 מיקרוליטר מהתמיסה הסופית לכל אחד משלושת התאים הבסיסיים ודגר במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. הוסיפו 30 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בלבד (קבוצה לא מטופלת) ל-3 מ"ל מדיום בסיסי (1% v/v).
  7. הוסיפו 750 מיקרוליטר מהתמיסה הסופית בתא הבסיסי של שלוש הכנסות (לא מטופלות).

7. איסוף דגימות

הערה: לניתוח NOA יש צורך לאגד דגימות מדיה, שטיפה אפיקלית ודגימות ליזאט תא משלושה תוספות.

  1. ביום ה-22 של ALI, לאסוף דגימות מאפיתל דרכי הנשימה המבדיל החל מ-750 מיקרוליטר של מדיה בסיסית מכל אחת משלוש ההכנסות לכל קבוצת ניסוי.
  2. איסוף מדיום בסיסי המודגר באינסרטים ללא תאים כדי לשמש כבקרה ריקה, תוך התחשבות בזיהום חיצוני אפשרי של ניטריטים.
  3. אסוף את המדיה הבסיסית משלושה תוספות ואחסן מיד בטמפרטורה של מינוס 20°C עד להזרקה ל-NOA.
  4. כדי לאסוף את הניטריט/NO הנמצא בריר האפיקלי של האפיתל, הוסף 50 מיקרוליטר של בופר PBS (1×) מחומם מראש (סטרילי, מופרז וקפוא) מעל התאים בכל אינסרט ודגר במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: במהלך 30 הדקות של דגירה של תאים עם PBS לאיסוף שטיפה אפיקלית, ניתן להוסיף PBS גם לתא הבסיס לשמירה על הידרציה משני צידי התאים.
  5. אסוף את ה-PBS המכיל את הריר שמעל האפיתל.
  6. בריכת שטיפות PBS משלוש הכנסות כדי לקבל כ-150 מיקרוליטר של ריר/PBS אפיקלי מכל מצב ניסיוני, מה שיספיק לשתי הזרקות NOA.
  7. אחסן את דגימות השטיפה האפיקלית בטמפרטורה של מינוס 20°C עד לשימוש נוסף.
  8. יש לאחסן גם את בופר הכביסה של PBS לשימוש כבקרה ריקה בזמן הזרקות NOA.
  9. שטפו פעמיים את הצדדים האפיקיים והבסיסיים של התאים בשלושה אינספטים עם 500 מיקרוליטר של PBS מחומם מראש.
  10. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת אקוטאז בקצה הקצה ודגר במשך 15–20 דקות עד שהתאים מתנתקים לחלוטין מהממברנות.
  11. לאחר הניתוק המלא, הוסף לתאים מדיה RPMI-1640 ללא סרום (ביחס 3:1 של מדיום לאקוטאז).
  12. אסוף את התאים המנותקים משלושת ההכנסות בצינור אחד.
  13. סובבו את התאים ב-3000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  14. החזירו את כדור התא ל-50 מיקרוליטר של תמיסת פירוק (RIPA buffer + Halt 1× קוקטייל מעכב פרוטאז) ודגרו על קרח למשך 45 דקות.
  15. סובבו את הליזאט ב-14,800 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואספו סופרנאנט.
  16. השתמשו ב-3 מיקרוליטר של ליזאט תא שלם כדי לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA).
  17. דיללו את תמיסת הליזאט שנותרה 1:1 בבופר RIPA כדי ליצור נפח מספיק לשתי הזרקות NOA של 50 מיקרוליטר.
  18. אחסן את הליזאטים ב-80 מעלות צלזיוס עד להזרקה ל-NOA בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.
  19. אחסן את בופר ה-RIPA המשמש להשעיית כדור התא בטמפרטורה של -20°C כדי שישמש כבקרת ריק וזיהום לדגימות ליזאט.

8. כיול NOA והזרקות דגימות

  1. הכינו תגובת טרייודיד על ידי המסה של 400 מ"ג יוד אשלגן ו-250 מ"ג יוד ב-28 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ו-8 מ"ל מים אולטרה-טהורים.
  2. בצע את הכנת המגיב הטרייודידי במכסה אדים כימי באמצעות ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על העיניים).
    זהירות: יוד וחומצה אצטית קרחונית הם מסוכנים ועלולים לגרום לגירוי וקורוזיה בעור ובעיניים.
  3. שמרו בטמפרטורת החדר והשתמשו בהם תוך שבועיים מההכנה.
  4. הכינו תמיסה של 1 מ"מ ניטריט נתרן במים ללא ניטריטים.
  5. שמרו את תמיסת המלאי בטמפרטורה של מינוס 20°C עד לשימוש.
  6. הכינו תקני עבודה חדשים (0.125–4.0 מיקרומטר) ב-PBS מיד לפני ההזרקות.
    הערה: לכיול NOA, השתמשו ב-PBS סטרילי וסגור היטב כדי למזער זיהום ניטריטים.
  7. הפעל את גז הנשא של החנקן (N2) והתחל זרימת גז במערכת.
  8. הרכיבו את כלי ניקוי הזכוכית והוסיפו לתוך הכלי 4 מ"ל תגובת טריודידים עם 20 מיקרוליטר של אנטי-קצף מדולל ביחס 1:10.
  9. סגור היטב את המכסה עם מחיצה שמוחזקת על ידי מכסה הבורג כדי להבטיח אטימה אטומה לאוויר.
  10. שפוך 10 מ"ל נתרן הידרוקסיד (NaOH) למלכודת NaOH.
  11. במסך התצוגה של מכשיר NOA (nCLD 88) בחר מדידה, בחר גז וטווח.
  12. הגדר את המכשיר ל-MR2:50.00, המתאים לטווח מדידה בין 0 ל-50 חלקים למיליארד של NO, ובחר במהירות להגדרת מסנן.
  13. כוון את לחץ גז החנקן עד שלחץ הכור מתייצב בין 27–29 psi (186–200 kPa).
  14. פתח את תוכנת תרשים eDAQ במחשב שמחובר ל-NOA.
  15. הגדר את טווח הרכישה ל-10/שנייה ואת המתח ל-10 וולט.
  16. עבור להגדרה > הגדרות ערוץ, בחר ערוץ 1.
  17. הגדר את סולם התצוגה ל-2:1 בתוכנת NOA.
  18. התחילו את איסוף הנתונים במכשיר NOA ובתוכנה.
  19. תעקוב אחרי קו הבסיס עד שהוא מתייצב.
  20. הזרקו 10 מיקרוליטר PBS דרך המחיצה לכלי הניקוי באמצעות מזרק המילטון לאישור יציבות בסיסית.
  21. הקלט את אות הכימילומינסנטי לכל הזרקה.
  22. הזרקו 10 מיקרוליטר מהתקן של 0.125 מיקרומולר ניטריט לכלי הניקוי.
  23. חזרו פעמיים על כל תקן ניטריט, כדי לקבל מדידות כפולות שייחשבו מאוחר יותר לממוצע.
  24. יש להוסיף הערות לכל הזרקה בלשונית התגובה (למשל, 10 מיקרוליטר 0.5 מיקרומולן ניטריט).
  25. נגבו את המזרק על רקמה ללא סיבים ושוטפים 3–4 פעמים במים סטריליים ללא ניטריט כדי להסיר טריודיד עודף.
  26. חזור על שלב הניקוי הזה אחרי כל הזרקה.
  27. אפשר לאות לחזור לקו הבסיס בין ההזרקות (20–30 שניות).
  28. פתח את חלון ניתוח הזרימה .
  29. בדוק את ערכי גובה השיא והזמן לכל הזרקה בטבלת הניתוח.
  30. סמן כל פסגה והתאם את הבחירה כדי לחשב את השטח מתחת לעקומה (AUC).
  31. החלף את התצוגה מ-S ל-C כדי להפעיל מצב כיול.
  32. הכניסו את כמויות הניטריט הידועות לכל תקן בעמודת הסכום .
  33. לחץ על כפתור עקומת הכיול כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית.
  34. ודאו שעקומת הכיול עומדת בקריטריוני קבלה (R2 ≥ 0.99).
  35. הפשרה של דגימות ביולוגיות שנאספו בעבר מתרביות ALI על קרח.
  36. הזרקו 50 מיקרוליטר של מדיום חופשי מתא ריק לכלי הניקוי.
  37. הזרקו 50 מיקרוליטר מכל דגימת מדיה בסיסית לכלי הניקוי.
  38. הקלט את אות הכימילומינסנציה לכל הזרקה.
  39. בצע הזרקות כפולות (50 מיקרו-ליטר כל אחת) לכל דגימה.
    הערה: הזרקות של 50 מיקרוליטר גורמות להיווצרות בועות תכופות. כדי לצמצם את הבעיה הזו, החליפו את תגובת הטרייודיד באנטי-קצף בכלי הניקוי באופן קבוע.
  40. רשמו הערות לכל דגימה בלשונית התגובה לפני ההזרקה.
  41. הזרקו 50 מיקרו-ליטר של PBS חופשי מתאים (ריק אפיקלי) לכלי הניקוי.
  42. הזרקת דגימות שטיפה אפיקלית (שתי הזרקות של 50 מיקרוליטר לכל דגימה) ותיעד את שיאי האות המתאימים.
  43. הזרקת בופר RIPA פעמיים, לאחר מכן דגימות ליזאט (שתי הזרקות של 50 מיקרוליטר לכל דגימה) ורשום את שיאי האות המתאימים.
    הערה: תמיד אפשר לעקבות הכימילומינסנטיות להגיע חזרה לקו הבסיס ולהתייצב. המתינו 20–30 שניות, ואז מזריקים את הדגימה הבאה.
  44. בסיום הזרקות הדגימה, פתח את חלון ניתוח הזרימה .
  45. סמן כל שיא לדוגמה כדי לחשב את השטח מתחת לעקומה (AUC).
  46. קבעו את ריכוזי הניטריטים לכל דגימה באמצעות עקומת הכיול שנוצרת מתמיסות סטנדרטיות.

9. איסוף נתונים, נרמול וניתוח

  1. ייצא את הנתונים, כולל גובה שיא (V), שטח מתחת לעקומה (V.s) ושטח ממוצע מתחת לעקומה מפונקציית ניתוח הזרימה בתוכנת eDAQ, לקובץ אקסל. הקובץ המייצא יסמן את הגובה (V) לעומת הזמן של עקבות האות לכל ניסוי NOA.
  2. קבעו את כמות הפיקולומים (pmol) של הניטריט שהוזרקו ל-NOA על ידי הכפלת ריכוז הניטריטים (μM) בנפח ההזרקה (μL).
  3. ממוצע הפיקומולים (pmol) של הניטריט שנמדד בביקורת (מדיה ללא תאים, בופר שטיפה PBS או בופר RIPA).
  4. הפחת את ערכי הבקרה המתאימים מה-pmol הנמדד בכל הזרקת דגימה של 50 מיקרוליטר.
  5. קבעו את סך הפיקומולים (pmol) של הניטריט בכל דגימה על ידי הכפלת כמות ה-PMOL הנמדדת בחלק המוזרק של הדגימה בנפח הדגימה הכולל המדויק שנאסף. השתמש ב-750 מיקרוליטר למדיה, 150 מיקרוליטר לשטיפה אפיקלית וכ-90–100 מיקרוליטר לליזאט.
  6. בנוסף, עבור ליזטים בלבד, הכפל את סך הניטריט PMOL ב-2 כדי להתחשב בפקטור הדילול.
  7. נרמול ה-PMOL של ניטריט שהושג עבור כל דגימה על ידי חלוקת ערכים אלו בכמות החלבון הכוללת (μg) הנמצאת בליזאט של הדגימה המתאימה, שהושגה קודם דרך בדיקת BCA.
  8. ממוצע את רמות הניטריטים (pmol/μg) מהזרקות כפולות לכל דגימה.
  9. גרף רמות ניטריטים מנורמלות (pmol/μg של חלבון כולל) לכל דגימה באמצעות תוכנת GraphPad Prism.
  10. העריך את התפלגות הנתונים לנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק.
  11. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t דו-זנבי לסטודנטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את רמות תחמוצת החנקן (NO) בתרביות תאי אפיתל קנה הנשימה (MTEC) של העכברים המבדילים בממשק אוויר-נוזל (ALI). תאים ראשוניים מבודדים ומובחנים לפי פרוטוקולים מבוססים27,28. במהלך 21 ימים ב-ALI, התאים מתמיין לאפיתל דרכי אוויר פסאודוסטרטיפיקציה המכיל תאים ריסים27,28. רמות הריסניות הוערכו באמצעות תיוג חיסוני עבור Foxj1 או אצטילציה של α–tubulin. ככל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תאים מרובי ריסים בתוך אפיתל דרכי הנשימה קריטיים לסינתזת NO ולאיתות, אשר חיוניים לוויסות פעימות ציליאריות, ניקוי רירית והומאוסטזיס דרכי האוויר 6,7,8. NO היא מולקולה תגובתית מאוד ואפילו שינויים קטנים ברמות NO קשורים למחלות דרכי הנשימה 1,2,3,4. לכן, שמירה על רמות NO מכוונ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לד"ר מארק ט. גלדווין (דיקן ופרופסור, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד) על ההכוונה בעיצוב המחקרים. אנו גם מודים לליבת מיקרוסקופיה קונפוקלית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד (בולטימור, מרילנד) על הגישה למשאבי מיקרוסקופיה קונפוקלית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק 5R01HL168775 של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לד"ר פאולה קורטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248מודל 1:2000 להכתמת חיסון
50 מ"ל צינור צנטריפוגה מסנן (0.22 µm)CellTreat229710להכנת פתרונות סטריליים
יחידות מסנן 500 מ"לThermoFisher Scientific566-0020להכנת מדיה סטרילית
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
תמצית יותרת המוח בקרThermoFisher Scientific13028014
אלבומין סרום בקרSigmaA7906
רעלן כולרהSigmaC8052
קולגן IThermoFisher ScientificA1048301
מיקרוסקופ קונפוקליNikonמיקרוסקופ Ti2 הפוך עם צילום sCMOS של Hamamatsu W1
הכנסות Transwell של CorningSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
מדיה DMEM/F-12ThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
סרום בקר עובריSigmaF4135
קוקטייל מעכבי פרוטאז Halt 1XThermoFisher Scientific1860932
תערובת תזונה Ham's F1-12ThermoFisher Scientific11765054
תמיסת אינסוליןSigmaI0516
איזופרטרנול הידרוכלורידSigmaI6504
מדיה חינם מסרום קרטינוציטיםThermoFisher Scientific17005042
גורם גדילה אפידרמיס עכבריSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
פניצילין-סטרפטומיציןSigmaP4333
מלח פוספט חיץ (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
ערכת Pierce BCA Protein AssayThermoFisher Scientific23227
פרוניזSigma10165921001
חומצה רטינואיתSigmaR2625
מעכב רו קינאז (Y-27632 הידרוכלוריד)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
חיץ RIPASigmaR0278
מדיה RPMI-1640ThermoFisher Scientific11875093
נתרן חנקתי SigmaS2252
טרנספריןSigmaT8158
נוגדן צינורית מואצלת אלפא (עכבר)SigmaT6793מודל 1:200 להכתמת חיסון
נוגדן אלפא-FoxJ1 (עכבר)ThermoFisher Scientific14-9965-80מודל 1:200 להכתמת חיסון
נוגדן משני Cy3 עכבר אלפאThermoFisher ScientificA10521מודל 1:1000 להכתמת חיסון
מעכב גמא-סקרטאז IX (DAPT)SigmaD5942

מקורות

  1. Alcázar–Navarrete, B., Ruiz Rodríguez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.
  2. Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1–8.
  3. Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085–9.
  4. Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1–e12 .
  5. Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19–33.
  6. Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175–81.
  7. Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.
  8. Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.
  9. Schamberger, A. C., Staab–Weijnitz, C. A., Mise–Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air–liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.
  10. Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air–liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.
  11. Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.
  12. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.
  13. Bessa, M. J. et al. In vitro toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface versus submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.
  14. Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.
  15. Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44–54.
  16. Jiang S. et al. Real–time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub–nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225. 
  17. Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551–75.
  18. Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538–43.
  19. Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428–37.
  20. Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156–67.
  21. Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.
  22. Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.
  23. MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S–nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1–2):93–105.
  24. Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11–19.
  25. Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45–51.
  26. Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731–9.
  27. Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.
  28. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315–21.
  29. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433–40. 
  30. Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin α in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639–41.
  31. van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683–741. 

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

233233
מדידת ייצור תחמוצת חנקן בתרביות תאי אפיתל של קנה הנשימה בעכברים הממוינים בממשק נוזל האוויר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.