Method Article

תהליך עבודה להמחשת דינמיקת קונפורמציה של חלבונים ממפות קריו-EM באמצעות סינתטאז אספרגין אנושי

DOI:

10.3791/70312

⸱

March 20th, 2026

1Department of Biochemistry, Molecular Biology and Pharmacology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט כיצד לבצע ניתוח שונות תלת-ממדית (3DVA) ב-CryoSPARC ושיפור שונות ב-Phenix לניתוח הטרוגניות קונפורמציה בנתוני קריו-EM. באמצעות סינתטאז אספרגין אנושי כדוגמה, הוא מפרט כיצד ליצור מפות שונות, להמחיש רכיבים עיקריים ולחדד מודלים אטומיים מתאימים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג תהליך מקיף לניתוח הטרוגניות קונפורמציה בנתוני מיקרוסקופיית קריו-אלקטרון חד-חלקיקית (קריו-EM) באמצעות ניתוח שונות תלת-ממדית (3DVA) ב-CryoSPARC ושיפור שונות ב-Phenix. הפרוטוקול מתאר כיצד לחשב מפות שונות לאורך רכיבים עיקריים שמקורם בתמונות חלקיקים, להמחיש מצבי שונות מבניים עיקריים, ולחדד את האנסמבלים המתאימים של מודלים אטומיים מול מסגרות שונות בודדות. התוצרים המתקבלים כוללים סדרת מפות שונות תלת-ממדיות, מבנים אטומיים מרובי מודלים משופרים המייצגים מצבים קונפורמציה בדידים, וקבצי ויזואליזציה המתאימים לניתוח מבני השוואתי ויצירת סרטים. תהליך עבודה זה רלוונטי באופן רחב לשחזורי קריו-EM בטווח הרזולוציה (בדרך כלל ~2.0-6.0 Å) שבהם ניתן לפרש באופן משמעותי הטרוגניות קונפורמציה ברמות עמוד השדרה והשרשרת הצדדית. הוא מתאים במיוחד ללכידת תנועות תחום רציפות, תנועות כיפוף צירים, וסידורים מקומיים מתואמים שאינם ניתנים לפתרון בקלות על ידי סיווג בדיד בלבד. השימוש המשולב במפות שונות ובאנסמבלים מעודנים של מודלים מאפשר השוואה מבנית ישירה של קיצוניות קונפורמציה, תומך בניתוחים כמותיים כגון חישובי תנודות ממוצע-ריבוע שורש (RMSF), ומספק מסגרת לקישור תכונות מבניות דינמיות להשערות ביוכימיות או פונקציונליות. סינתטאז אספרגין אנושי (ASNS) משמש כדוגמה להדגמת היישום המעשי של תהליך העבודה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון הטרוגניות קונפורמציה במבנים מקרומולקולריים הוא היבט חשוב יותר ויותר בניתוח מיקרוסקופ קריו-אלקטרון חד-חלקיקי (קריו-EM). מטרת הפרוטוקול היא לספק זרימת עבודה מעשית לחילוץ, המחשה ושיפור מצבי שונות מבנית דומיננטיים ישירות ממאגרי נתונים קריו-EM באמצעות ניתוח שונות תלת-ממדי (3DVA) ב-CryoSPARC1 בשילוב עם שיפור שונות ב-Phenix2. מאמר זה נועד להנחות את הקוראים בקביעת האם גישה חישובית זו מתאימה לנתונים שלהם ולהבין את סוגי הפלטים שנוצרים על ידי תהליך העבודה.

טכניקות ניסוי מסורתיות (למשל, החלפת מימן-דויטריום, ספקטרוסקופיית NMR, ספקטרומטריית מסה) מספקות מידע חשוב על תנועות חלבונים 3,4,5 אך לעיתים מוגבלות על ידי גודל מולקולרי, דרישות דגימה או מורכבות ניסויית. התקדמות בקריו-EM אפשרה קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה עבור מערכות גדולות והטרוגניות, ואפשרה ניתוח שונות קונפורמציה בתוך אוכלוסיות חלקיקים. ניתוח שונות תלת-ממדית (3DVA), שמיושם ב-CryoSPARC1, מפרק מאגרי חלקיקים קריו-EM לרכיבים עיקריים המתארים מצבים דומיננטיים ורציפים של שונות מבנית. בשילוב עם שיפור השונות בפניקס2, גישה זו יוצרת מודלים אטומיים התואמים למיקומים נפרדים לאורך כל רכיב עיקרי, ומאפשרים ויזואליזציה והשוואה של קונפורמציות חלופיות שמקורן בנתונים ניסיוניים.

פרוטוקול זה מתאים במיוחד למערכי נתונים קריו-EM המשוחזרים ברזולוציה קרובה אטומית עד בינונית (בדרך כלל ~2-6 Å). ברזולוציות גבוהות יותר, זרימת העבודה יכולה ללכוד סידורי עמוד שדרה מחדש ושונות מוגבלת בשרשרת הצדדים6, בעוד שברזולוציות נמוכות יותר היא מתאימה יותר לזיהוי תנועות ברמת תחום או מבנה משני 2,7. השיטה מתאימה ללכוד מצבי תנועה דומיננטיים ורציפים המאוכלסים באופן רחב במאגר הנתונים, כגון תנועות צירים, נשימת תחום, או סידורים מתואמים בין תחומים או תת-יחידות. מספרי חלקיקים מספקים וכיסוי זוויתי הם חיוניים, והפרשנות עשויה להיות מוגבלת באזורים גמישים או חלשים שבהם מיקומי שרשרת הצדדים נשארים עמומים. בהשוואה לסיווגממוקד 8 או אסטרטגיות סיווג משנה נרחבות, תהליך שיפור השונות התלת-ממדית מייצג הטרוגניות קונפורמציה כמסלולים רציפים ולא כמחלקות נפרדות. דבר זה הופך את השיטה לשימושית במיוחד לניתוח חקרני של אנזימים, מכונות מולקולריות ומורכבים רב-תחומיים שצפויים לדגום קונפורמציות מרובות.

סינתטאז אספרגין אנושי (ASNS) משמש כדוגמה להמחשה ליישום הפרוטוקול. ASNS הוא אמידוטרנספראז התלוי בגלוטמין המורכב משני תחומים פונקציונליים המחוברים במנהרת אמוניה תוך-מולקולרית 9,10. מחקרים קודמים הציעו כי שינויים קונפורמציונליים הקשורים לשאריות כמו Arg-142 תורמים למודולציה של מנהרהזו 6. במאמר זה, ASNS משמש אך ורק כמערכת מייצגת להדגמת האופן שבו 3DVA ושיפור שונות מייצרים מפות שונות, אנסמבלים של מודלים אטומיים משוכללים והדמיות. פרשנות מכנית מפורטת מועברת למדורי התוצאות והדיון. למרות שסימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) משמשות לעיתים קרובות כגישה משלימה לחקר נופים קונפורמציונליים11,12, MD אינו נדרש לפרוטוקול זה. השוואות לסימולציות MD עשויות להתבצע כניתוח אופציונלי במורד הזרם, אך זרימת העבודה המתוארת כאן (איור 1) מתמקדת אך ורק בחילוץ והדגשת הטרוגניות קונפורמציה מנתוני קריו-EM.

איור 1
איור 1. סקירה כללית של תהליך העבודה. מפת קריו-EM קונצנזוס משוחזרת מנתוני חלקיק יחיד ועוברת ניתוח שונות תלת-ממדי (3DVA) ליצירת מפות שונות לאורך הרכיבים העיקריים. שיפור השונות (Phenix.varref) משתמש במודל האטומי הקונצנזוס ליצירת מודלים אטומיים תואמים לוויזואליזציה והשוואה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת נתונים

  1. יצירת מפת EM קונצנזוס
    1. השתמש במיקרוסקופיית קריו-אלקטרון חד-חלקיקית (קריו-EM) כדי לקבוע את המבנה התלת-ממדי הקונצנזוס של הקומפלקס המקרומולקולרי.
    2. דגימות ויטריפיי על רשתות קריו ותמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת מתח גבוה המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר.
    3. לעבד את הסרטים שנאספו כדי לתקן תנועה שנגרמה על ידי קרן, להעריך פרמטרי הדמיה ולבחירת תמונות חלקיקים.
    4. לבצע סיווג ושיפור איטרטיבי של החלקיקים כדי ליצור מפת EM קונצנזוסוס.
    5. בצע עיבוד נתונים באמצעות CryoSPARC (גרסה 4 ומעלה), שכן ניתוח שונות תלת-ממדית (3DVA) ייושם.
  2. יצירת מודל קונצנזוס
    1. בנה מודל אטומי וחדד אותו מול מפת הקונצנזוס. אימות איכות המודל המשופרת באמצעות קריטריונים סטנדרטיים
      הערה: עבור ASNS, המבנה נקבע באמצעות אסטרטגיית בחירת חלקיקים מבוססת תבנית. תבנית שמקורה במבנה הרנטגן של ASNS אנושי מותאם DON (PDB 6GQ3)9שימשה לבחירת חלקיקים איכותיים ביעילות ב-CryoSPARC13. חלקיקים אלו עברו סבבים איטרטיביים של סיווג דו-ממדי, שחזור Ab initio, ועידון הטרוגני ולא אחיד עם סימטריית C2 שהוטלה, מה שהניב מפת קונצנזוס של 3.5 Å. המודל האטומי נוצר על ידי שימוש במבנה הגביש9 במפת ה-EM, ואחריו שיפור במרחב אמיתי בפניקס14,15 והתאמה ידנית ב-Coot16, מה שיצר את מבנה ASNS הקונצנזוס הסופי כפי שתואר6.

2. ביצוע ניתוח שונות תלת-ממדית (3DVA)

  1. השתמש בערימת החלקיקים ובמסכה (לא מפה משופרת סופית) לשיפור סופי
    הערה: לעיתים קרובות, התוצאות של עבודה לא אחידה משמשות ל-3DVA.
  2. צור משימת שונות תלת-ממדית ב-CryoSPARC. ערימת חלקיקי קלט ומסכה ממשימת השיפור הלא אחידה.
  3. הגדר את מספר המצבים לפתרון: מספר הרכיבים הראשיים (PCs) ל-5.
    הערה: מכיוון שמבנים מקרומולקולריים קיימים במרחב תלת-ממדי, נדרשים בדרך כלל לפחות שלושה מחשבים אישיים כדי לתאר את מצבי התנועה המרחביים העיקריים שלהם. כדי להבטיח שלא יישכחו וריאציות קונפורמציות נוספות, שיכולות להיות קטנות יותר אך רלוונטיות פונקציונלית, נכללו שני מחשבים נוספים.
  4. הגדר את רזולוציית המסנן ל-4.0 Å, ואת רזולוציית Highpass ל-20. השאר את כל הפרמטרים כברירת מחדל. תתחיל את העבודה.
    הערה: "רזולוציית פילטר" של 4.0 Å הוגדרה כך שתתאים לאיכות הכוללת של מערך הנתונים תוך הימנעות מהתאמת יתר לרעש בתדר גבוה. מכיוון שמפת הקונצנזוס הסופית נקבעה ברזולוציה של 3.5 Å, יישום רזולוציית מסנן מעט נמוכה יותר (4.0 Å) הבטיח שניתוח השונות יתמקד בתנועות מבניות אמיתיות ולא ברעש סמוך לגבול הרזולוציה.
  5. השגת קבוצת נפחי שונות כפלט (איור 2A)

3. ביצוע תצוגת שונות תלת-ממדית

  1. צור משימת תצוגת שונות תלת-ממדית ב-CryoSPARC כדי להמחיש את השינויים הקונספורמציה המתמשכים שזוהו על ידי ה-3DVA.
  2. הזן את מחסנית החלקיקים ואת נפחי השונות שנוצרים מהעבודה של 3DVA.
  3. בחר פשוט כמצב פלט (ראו להלן).
  4. הגדר את רזולוציית המסנן ל-4.0 וקבע רזולוציית Highpass ל-20. השאירו את כל שאר הפרמטרים בערכי ברירת המחדל שלהם. תתחיל את העבודה.
  5. קבל 20 מפות שונות כתוצאה (מסגרת 0 עד 19) המתאימות ל-5 רכיבים עיקריים (PC) מ-0 עד 4 (איור 2B)
    הערה: ה"מצב הפשוט" בתוכנית תצוגת השונות התלת-ממדית מספק המחשה פשוטה של שינויים קונפורמציה לאורך כל רכיב עיקרי. מצב זה יוצר מסלולים ליניאריים בין המצבים הקיצוניים שזוהו על ידי 3DVA, ומאפשר פרשנות ברורה וישירה של התנועות בתוך אוכלוסיית החלקיקים.

4. הכנת נתונים לסרטים ושיפור משתנים תלת-ממדי של Phenix

  1. הורד מפות שונות 3DVA: הורידו את קבצי ה-zip המכילים מפות שונות למחשבים 0-4 (חמישה zips בסך הכל) מ-CryoSPARC.
  2. ארגן תיקיות: צור תיקיית אב (למשל, 3DVA/). בפנים, צור תת-תיקיה אחת לכל רכיב ראשי (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
  3. העבר כל zip לתיקייה המתאימה לו ופתח את התוכן.
  4. ודאו שכל תיקייה מכילה 20 מפות שונות (פריימים 0-19) וחזרו על הפעולה עבור comp1-comp4.
    הערה: שמור תיקיות נפרדות לכל רכיב עיקרי כדי למנוע ערבוב פריימים בין מחשבים אישיים.

5. להכין סרטים מהירים ב-UCSF Chimera (אופציונלי) 17

  1. פתח את כלי סדרת הנפח: השיק את Chimera, ואז נווט לכלים → נתוני נפח → סדרת נפחים. חלון סדרת כרכים חדש ייפתח.
  2. טעין את המפות: לחץ על פתיחה ובחר את 20 המפות המתאימות לרכיב עיקרי אחד (למשל, comp0).
  3. כוונן פרמטרי ויזואליזציה: פתח את Volume Viewer, קבע את סף הצפיפות המתאים, והקצה צבע למפה.
    הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש בכחול שמיים (איור 3).
  4. תנועת תצוגה מקדימה: בחלון סדרת הווליום , הגדר את כיוון ההפעלה ל-Oscillate, ואז לחץ על Play כדי להציג מעבר רציף מפריים 0 → 19 → 0.
  5. חזור על זה עבור רכיבים נוספים: חזור על שלבים 5.2-5.4 עבור רכיבים עיקריים אחרים לפי הצורך.
  6. יצירת קובץ סרט באמצעות קלט שורת הפקודה: ייצוא סרט על ידי פתיחת שורת הפקודה של Chimera והרצת קובץ קידוד משלים 1.
    הערה: סדרת MRC בת 20 הפריימים לכל רכיב (למשל, compX_frame000-019.mrc) היא הקלטים לשיפור משתנים תלת-ממדי של Phenix. שמרו תיקיות קומפונטנט נפרדות (comp0-comp4) כדי למנוע ערבוב פריימים בין מחשבים.

6. יצירת מודלים על ידי שיפור שונות בפניקס

הערה: ניתן להריץ את Phenix.varref מכל תיקייה כל עוד מסלולים מלאים למפות הקלט ולמודל מוגדרים. עם זאת, למען בהירות ארגונית, מומלץ לבצע את השיפור בתיקיית משנה ייעודית לכל מחשב.

  1. העתק את קובץ מודל הקונצנזוס הסופי לתיקיית המשנה המתאימה לכל מחשב.
  2. מתוך כל תת-תיקיה, הרץ את Phenix.varref משורת הפקודה באמצעות התחביר הבא:
    phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
  3. הגדר את הרזולוציה ל-4.0 Å כדי להתאים לרזולוציה האפקטיבית של מפות 3DVA
  4. הגדר את nproc למספר המעבדים הזמינים (20 בדוגמה זו, אך זה יכול להשתנות בהתאם למשאבים החישוביים הזמינים)
  5. הגדר models_per_map ל-50 דגמים (ברירת מחדל).
    הערה: לכל מפה נוצרים 50 מודלים עם מגבלות מותאמות לרזולוציה של נתוני 3DVA. המודל המתאים ביותר לכל מפה נשמר אוטומטית. קובץ הפלט המתקבל מכיל 20 מודלים משופרים התואמים ל-20 מפות השנות. הפלט מורכב מחבילת PDB הכוללת 20 מודלים משופרים, יחד עם קבצי מפה בודדים.
  6. אל תפעיל חידוד נוסף למפה במהלך שיפור השונות. השתמש במפות השונות שנוצרות על ידי CryoSPARC (מסוננות ב-4.0 Å) ישירות כקלט ל-phenix.varref.

7. ויזואליזציה

  1. פתח את חבילת ה-PDB ב-ChimeraX18 כדי לטעון את כל 20 הדגמים המשופרים בו זמנית.
  2. השתמש בפאנל המודלים כדי להציג באופן סלקטיבי מסגרות בודדות או מודלים ספציפיים לצורך השוואה וניתוח (איור 4). חלופה נוספת היא שכל דגם משופר יכול להיפתח בנפרד ב-ChimeraX או Chimera.

8. הכנת נתונים לניתוח

הערה: הרצת התחביר למעלה יוצרת חבילת PDB הכוללת 20 מודלים משתנים וכל מפה נפרדת. ברוב הניתוחים, נדרשים רק שני מודלים – התואמים למסגרת 0 ולפריים 19, שכן הם מייצגים את שני מצבי הקונפורמציה הקיצוניים לאורך הרכיב הראשי (PC) הנבחר.

  1. פתח את חבילת ה-PDB ב-ChimeraX, בחר דגם 1.1 (פריים 0) ודגם 1.20 (פריים 19), ושמור כל דגם כקובץ PDB נפרד (איור 4).
  2. ערוך את קבצי ה-PDB שנוצרו כדי לבודד שאריות מעניינות. ניתן לעשות זאת ידנית או באמצעות Phenix.pdb.tools.
  3. השווה את שני קבצי ה-PDB המותאמים כדי לזהות שינויים קונפורמציה בעמוד השדרה או בשרשראות הצדדיות.
  4. כדי להשוות בין שני מודלי ה-PDB, יש להניח את המבנים המותאמים באמצעות פונקציית MatchMaker ב-Chimera.
    הערה: ליישור אמין, MatchMaker בדרך כלל דורש לפחות 10-15 שאריות חופפות. במקרה שלנו, נותחו רק 6 שאריות; עם זאת, סופרפוזיציה מוצלחת הושגה על ידי ניצול האופי ההומודימרי של ASNS – בעוד שרק 6 שאריות נותרו בשרשרת A, שרשרת B נשארה שלמה ושימשה כנקודת ייחוס ליישור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה מציג פלטים מייצגים שנוצרים על ידי תהליך ניתוח השונות התלת-ממדית (3DVA) ותהליך שיפור השונות ומספק הנחיות לפרשנם. סינתטאז אספרגין אנושי (ASNS) משמש כמאגר נתונים להמחשה להדגמת תוצאות מוצלחות, ארטיפקטים נפוצים וניתוחים השוואתיים המאפשרים הפרוטוקול. הסט המלא של מפות שונות שמקורן ב-3DVA והמודלים המשופרים המתאימים שנוצרו ממאגרי הנתונים של ASNS הופקדו במאגר הציבורי של זנודו. מידע מפורט על גישה מסופק בטבלה המשלימים 1.

מפות שונות של 3DVA וסרטי שונות.
הפלט העי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול ונקודות החלטה
שימוש יעיל בפרוטוקול זה תלוי במספר שלבים מרכזיים בזרימת העבודה. איכות ערימת החלקיקים והמסכה המשמשות לשיפור הקריו-EM הסופי היא קריטית, שכן ניתוח שונות תלת-ממדית (3DVA) פועל ישירות על קלטים אלה ולא על מפה שעובדה לאחר מכן. בחירת מספר הרכיבים הראשיים (PCs) צריכה לשקף את גודל מערך הנתונים ואת המורכבות הצפויה; מעט מדי רכיבים עלולים לייצג פחות את השונות, בעוד שיותר מדי עשויים להכניס מצבים הנשלטים על ידי רעש. פרמטרי הרזולוציה המשמשים הן ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחבר אין ניגוד עניינים להצהיר עליו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אני מודה לחברי מעבדות טאקאגי, ג'ו, ווס, צ'פטל, אלקרו וריצ'רדס על תרומתם לפרסום שעליו מבוסס מאמר זה. המחבר מודה בהכרת תודה למתקן מיקרוסקופיה אלקטרונית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה ול-NIH/NIGMS (S10 OD028723) על תמיכתם בעבודה זו. מימון נוסף סופק על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה (Y.T.), בחלקו על ידי NIGMS (R01GM111695 ל-Y.T.), והאגודה האמריקאית לסרטן (DBG-23-1038947-01-IBCD to Y.T.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARC v4.4+Structura Biotechnologyhttps://cryosparc.comתוכנה לעיבוד קריו-EM
פניקס v1.24+קונסורציום פניקסhttps://phenix-online.orgתוכנה לשיפור שונות
UCSF כימרהמשאב למחשוב ביולוגי, ויזואליזציה ואינפורמטיקה, UCSFhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/תוכנה להדמיה מולקולרית
UCSF ChimeraXמשאב למחשוב ביולוגי, ויזואליזציה ואינפורמטיקה, UCSFhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/תוכנה להדמיה מולקולרית
CPPTRAJחבילת תוכנות AMBER לדינמיקה מולקולריתhttps://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/כלים בפייתון לחישוב RMSF
Linux Workstation (מערכת מבוססת GPU מורכבת פנימית)
מקרה תחנת עבודהסופרמיקרוhttps://www.supermicro.comמארז תחנת עבודה: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassis 
מעבדIntel https://www.intel.comמעבד: XEON E5-2690V3 x2
מועצת האםסופרמיקרוhttps://www.supermicro.comלוח אם: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 לוח אם X10DAI-O
זיכרוןקריטיhttps://www.crucial.comזיכרון: ערכת קריטית בנפח 64GB (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC רשומה. זיכרון שרת עם 288 פינים CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
כונן קשיחWestern Digitalhttps://www.westerndigital.comכונן קשיח קשיח ארגוני בנפח 4TB WD RE RE
בקר RAIDלוגיקת LSIhttps://www.broadcom.comבקר RAID: ערכת LSI Logic MegaRAID SAS 9271-8i
GPUNVIDIA https://www.nvidia.comכרטיס גרפי Quadro M6000 עם זיכרון GDDR5 של 24GB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  2. Afonine, P. V., et al. Conformational space exploration of cryo-EM structures by variability refinement. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1865 (4), 184133(2023).
  3. Schwartz, S. D. Protein Dynamics and Enzymatic Catalysis. J Phys Chem B. 127 (12), 2649-2660 (2023).
  4. Xu, D., Meisburger, S. P., Ando, N. Correlated Motions in Structural Biology. Biochemistry. 60 (30), 2331-2340 (2021).
  5. Gao, S., Klinman, J. P. Functional roles of enzyme dynamics in accelerating active site chemistry: Emerging techniques and changing concepts. Curr Opin Struct Biol. 75, 102434(2022).
  6. Coricello, A., et al. 3D variability analysis reveals a hidden conformational change controlling ammonia transport in human asparagine synthetase. Nat Commun. 15 (1), 10538(2024).
  7. Gobet, A., et al. Rhodamine6G and Hoechst33342 narrow BmrA conformational spectrum for a more efficient use of ATP. Nat Commun. 16 (1), 1745(2025).
  8. Barchet, C., et al. Focused classifications and refinements in high-resolution single particle cryo-EM analysis. J Struct Biol. 215 (4), 108015(2023).
  9. Zhu, W., et al. High-resolution crystal structure of human asparagine synthetase enables analysis of inhibitor binding and selectivity. Commun Biol. 2, 345(2019).
  10. Richards, N. G., Schuster, S. M. Mechanistic issues in asparagine synthetase catalysis. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 72, 145-198 (1998).
  11. Matsumoto, S., Ishida, S., Terayama, K., Okuno, Y. Quantitative analysis of protein dynamics using a deep learning technique combined with experimental cryo-EM density data and MD simulations. Biophys Physicobiol. 20 (2), e200022(2023).
  12. Vant, J. W., et al. Exploring cryo-electron microscopy with molecular dynamics. Biochem Soc Trans. 50 (1), 569-581 (2022).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Adams, P., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  15. Afonine, P. V., et al. New tools for the analysis and validation of cryo-EM maps and atomic models. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 9), 814-840 (2018).
  16. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004).
  17. Pettersen, E., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  19. Roe, D. R., Cheatham, T. E. 3rd PTRAJ and CPPTRAJ: Software for Processing and Analysis of Molecular Dynamics Trajectory Data. J Chem Theory Comput. 9 (7), 3084-3095 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Conformational DynamicsCryo EM Maps3D Variability AnalysisCryoSPARC WorkflowVariability RefinementPhenix SoftwareConformational HeterogeneityAtomic Model EnsemblesStructural ComparisonHuman Asparagine Synthetase
Video Coming Soon

Related Articles