אפיון אטקסיה הנגרמת על ידי גידול במודל עכבר שוואנומה וסטיבולרי

סיכום

פיתחנו פאנל של בדיקות התנהגותיות לחקר אטקסיה הנגרמת על ידי גידול ולהערכת טיפולים השומרים על תפקוד נוירולוגי במודל עכבר של שוואנומה וסטיבולרית.

תקציר

שוואנומטוזיס הקשור ל-NF2 (NF2-SWN) היא תסמונת נטייה אוטוזומלית דומיננטית לגידול, הנגרמת על ידי מוטציות בקו הנבט בגן מדכא הגידול של NF2. המחלה מאופיינת בהתפתחות שוואנומה דו-וסטיבולרית (VSs), שמתרחבות בהדרגה וגורמות לאובדן שמיעה, חוסר איזון ותסמיני אטקסיה המשפיעים עמוקות על איכות חייהם של המטופלים. כיום אין טיפולים פרמקולוגיים מאושרים על ידי ה-FDA. מבין הליקויים הנוירולוגיים, אטקסיה נותרת ביטוי משתק במיוחד אך לא נחקר, בעיקר בשל היעדר מודלים פרה-קליניים חזקים להערכתה. במחקר זה פיתחנו סט של בדיקות התנהגות להערכת שיטתית של אטקסיה הנגרמת מגידול במודל עכבר אורתוטופי של אובדן שמיעה ואטאקסיה הקשורים ל-VS. בדיקות אלו מאפשרות מדידה כמותית של ליקויי איזון וקואורדינציה מוטורית הנובעים מעומס הגידול. פלטפורמה ניסויית זו מאפשרת מחקרים מכניים של תפקוד לקוי של המוחון הנגרמת על ידי גידול ומספקת כלי חשוב להערכה טרום-קלינית של אסטרטגיות טיפוליות. על ידי שילוב הערכות התנהגותיות עם ביולוגיה של גידול ובדיקות שמיעה, גישה זו מקלה על אפיון השפעות טיפול מדכאות גידול וטיפול נוירופרוטקטיבי. בסופו של דבר, בדיקות אלו מציעות מסגרת גמישה שניתן ליישם גם על הפרעות נוירולוגיות אחרות המאופיינות באטאקסיה, ומרחיבה את השימושיות שלהן מעבר ל-NF2-SWN.

מבוא

שוואנומטוזיס הקשור ל-NF2 (NF2-SWN) היא תסמונת נטייה גידולית נדירה, שנמצאת בתורשה דומיננטית, הנגרמת על ידי מוטציות בגן מדכא הגידול של NF2, שמקודד את חלבון השלד הציטוסקלטלי מרלין¹. אובדן תפקוד מרלין משבש את מסלולי האיתות המווסתים התרבות התאים, ההיצמדות וההישרדות, וגורם לאנשים שנפגעו להתפתחות גידולים שפירים מרובים במערכת העצבים. הסימן הבולט של NF2-SWN הוא היווצרות שוואנומות וסטיבולריות דו-ממאירות (VSs) - גידולים לא ממאירים שמקורם בתאי שוואן המתפתחים לאורך עצבי הווסטיבולוקוכלאר. גידולים אלו מתרחבים בהדרגה, דוחסים מבנים עצביים סמוכים ומובילים לאובדן שמיעה סנסורינורלי, טינטון ותפקוד לקוי של עצב הפנים².

מטופלים עם VS דו-צדדיים סובלים לעיתים קרובות מנזק הדרגתי לעצב הוסטיבולרי ולמערכת הוסטיבולרית של האוזן הפנימית, מה שמוביל לתפקוד וסטיבולרי משתק המתבטא בחוסר איזון כרוני, אטקסיה וחוסר יציבות בהליכה, הפוגעים קשות בניידות ובאיכות החיים³. דרגת הפרעה הוסטיבולרית לעיתים קרובות קשורה לעומס הגידול ולמעורבות עצבית. תסמינים אלו לעיתים נמשכים גם לאחר שליטה בגידול או מאמצי שימור שמיעה, מה שמרמז על מנגנונים נוירוביולוגיים מורכבים מעבר לדחיסה מכנית ^4,5. למרות שכלים קליניים כגון מאגרי סחרחורת, ניתוח הליכה, בדיקת רפלקס וסטיבולו-עיני (VOR) ופוסטוגרפיה משמשים לכימות פגיעה וסטיבולרית, המנגנונים הבסיסיים של אטקסיה הנגרמת על ידי גידול עדיין אינם מובנים היטב³. למרות התקדמות בהבנה מולקולרית והכנסת טיפולים ממוקדים כמו בוואסיזומאב, עדיין אין טיפול מאושר על ידי ה-FDA ששומר באופן אמין הן על תפקוד השמיעה והן את תפקוד שיווי המשקל אצל מטופלים עם NF2-SWN. ניהול התסמינים הווסטיבולריים נותר ברובו תומך, ומדגיש צורך קליני משמעותי שלא נענה.

מכשול מרכזי לשיפור הניהול הקליני של אטקסיה הקשורה ל-VS הוא היעדר מודלים פרה-קליניים המשחזרים בנאמנות את ליקויי הקואורדינציה הוסטיבולרית והמוטורית שנצפו אצל מטופלים. רוב המודלים הקיימים של בעלי חיים VS מתמקדים בצמיחת גידול או באובדן שמיעה, מבלי לשחזר את ליקויי האיזון והקואורדינציה האופייניים. יתרה מזאת, בדיקות התנהגות סטנדרטיות להערכת אטקסיה ותפקוד וסטיבולרי באופן אובייקטיבי בסביבות פרה-קליניות אינן מבוססות היטב. פער זה מונע חקירה מכנית ומגביל את הערכת טיפולים מועמדים שמטרתם לשמור על תפקוד וסטיבולרי.

כאן, אנו מדווחים על פיתוח מודל עכבר VS המציג פנוטיפים מדידים של אטקסיה, יחד עם פאנל של בדיקות התנהגותיות שנועדו במיוחד לכימות אטקסיה הנגרמת על ידי גידול. מודל זה מספק פלטפורמה נחוצה מאוד לחקירת המנגנונים העומדים בבסיס דיספונקציה וסטיבולרית הקשורה ל-VS ולהערכת יעילות ההתערבויות הטיפוליות שמטרתן לשחזר איזון, תיאום ותפקוד נוירולוגי כללי אצל מטופלים עם NF2-SWN.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מסצ'וסטס ג'נרל בריגהם (MGB).

1. מודל חיה

1. תאי Nf2^-/- מחוסנים (תאי שוואן Nf2^-/- תאי שוואן המבטאים את גן Gaussia luciferase reporter, Gluc) לעכברים חיסוני ב-C57/FVB. באמצעות מכשיר הזרקה סטריאוטקטי (איור 1A), הזרקו לכל עכבר 1 מיקרוליטר של 2,500 תאי גידול לאזור ה-CPA של ההמיספרה הימנית ^4,6.
2. השתמשו בעכברים זכרים ונקבות (יחס 1:1) בגילאי 8-12 שבועות כדי להבטיח עוצמה סטטיסטית מספקת ולבחינת הבדלים אפשריים הקשורים למין. עכברי בית בקבוצות של 4 בכל כלוב במחזור אור/חושך של 12 שעות, עם אוכל ומים זמינים בחופשיות.
   הערה: בהינתן ששוואנומה מתפתחות בעצבים הוסטיבולריים של המטופלים, השתמשנו במודל הזווית המוחית (CPA). מודל ה-CPA מסכם את המיקרו-סביבה התוך-גולגולתית של VS.
3. קבוצת שמים: להערכת השפעות ניתוח בעלי חיים והשתלת תאי גידול על אטקסיה, כלול קבוצת ניתוח שאם, שבה עכברים עברו ניתוח מזויף והזרקת מי מלח לאזור CPA.
4. כלול קבוצת עכברים שאינה נושאת גידול כקבוצת ביקורת.
5. כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול, השתמשו בתאי Nf2^-/- המבטאים את גן Gaussia luciferase reporter (Gluc), ומדדו את Gluc בפלזמה כל 3 ימים לאחר ההשתלה.
6. בקצרה, אספו 13 מיקרוליטר דם לצינורות ה-EDTA כדי למנוע קרישה. העבר דגימת דם ללוח עם 96 בארות, ומדד את פעילות הגלוק כפי שתואר^קודם 6,7,8,9.

2. בדיקות אטקסיה

1. בצע את ארבעת הבדיקות ההתנהגותיות ברצף קבוע כדי למזער שונות בין בעלי חיים. בצע את הבדיקות לפי הסדר הבא: (1) בדיקת אחיזת גפה אחורית, (2) בדיקת מדרגות, (3) הערכת הליכה, ו-(4) הערכת קיפוזיס. אפשר מרווח מנוחה מינימלי של 2-5 דקות בין הבדיקות על ידי החזרת העכבר לכלוב הביתי שלו. עקבו אחרי החיה בתקופות המנוחה והמשיכו לבדיקה הבאה רק כאשר ההתנהגות החקרנית הרגילה חוזרת. הפסק את הבדיקות אם נצפו סימני לחץ או עייפות מופרזת. השלימו את כל ארבעת בדיקות האטקסיה לקבוצה של 10 עכברים בתוך כ-45-60 דקות, כולל מרווחי מנוחה בין הבדיקות.
2. מבחן אחיזת גפיים אחוריות
   הערה: מבחן אחיזת הגפיים האחוריות מעריך את הקואורדינציה הנוירומוסקולרית, הטון המוטורי ושליטה ביציבה בעכברים. עכברים עם אטקסיה מציגים נסיגת גפיים אחוריות או אחיזה כלפי הבטן, מה שמשקף קואורדינציה מוטורית לקויה ויסות טונוס שרירים⁵.
   1. אחז בעכבר בעדינות בבסיס הזנב, כדי להבטיח אחיזה בטוחה אך קלה כדי למנוע אי נוחות. תמכו בבעל החיים לזמן קצר על מכסה הכלוב או היד לפני ההרמה כדי להפחית את תגובת ההפתעה.
   2. הרם את העכבר לאט כך שיהיה תלוי באוויר עם גופו מתוח לחלוטין וללא מכשולים. שמור על העכבר לפחות 10 ס"מ מעל הכלוב או משטח הבדיקה.
   3. שמור על מצב תלייה במשך כ-10 שניות וצפה במיקום הגפיים האחוריות והזנב מבלי לסובב או להניף את החיה.
   4. הערך את יציבת הגפה האחורית כפי שמתואר להלן.
      1. זהה יציבה תקינה כאשר שתי הגפיים האחוריות יוצאות החוצה ורחוקה מהבטן.
      2. זהה יציבה לא תקינה כאשר אחת או שתי הגפיים נסוגות לכיוון הבטן או חוצות זו את זו, מה שמעיד על אחיזת גפיים אחוריות הקשורה לאטקסיה או לפגיעה נוירולוגית.
   5. הקלט את ההתנהגות באמצעות מערכת ניקוד מוגדרת מראש או צלם וידאו קצר לניתוח פוסט-הוק עיוור.
      הערה: הגבילו כל בדיקה ל-≤10 שניות כדי למזער לחץ.
3. מבחן מדף
   הערה: מבחן המדף מעריך שיווי משקל, קואורדינציה ושליטה מוטורית עדינה בעכברים. הוא מודד את יכולת החיה ללכת על מדף צר ולרדת בבטחה לכלוב הבית מבלי לאבד שיווי משקל. עכברים עם תפקוד לקוי במוחון או אטקסיה וסטיבולרית בדרך כלל מציגים החלקות, נפילות או יציבה לא יציבה במהלך משימה^זו.
   1. הנח את הכלוב על משטח יציב ושטוח בגובה ספסל (~1 מטר).
   2. חבר קצה אחד של כלוב הבדיקה (איור 1C) למארז הבית (איור 1D), כדי להבטיח שאין רווח אנכי או חסימה בין הכלובים שיאפשר לעכבר לרדת בצורה חלקה וטבעית לתוך כלוב הבית שלו (איור 1B) מבלי לקפוץ או ליפול.
   3. מקם מצלמת וידאו על חצובה הפונה לקצה בזווית של 30°-45° כדי ללכוד גם תנועה צדדית וגם ירידה.
   4. כוון את התאורה כדי למזער סנוור ולהבטיח ראות ברורה של גפיים וזנב העכבר.
   5. הרימו בעדינות את העכבר בבסיס הזנב ותמכו בגופו ביד השנייה. הנח את העכבר במרכז המדף כך שכל ארבע הרגליים יהיו על פני השטח. שחרר את הזנב רק כאשר העכבר נראה מאוזן וערני.
   6. תן לעכבר ללכת בחופשיות לאורך המדף בלי הנחיה חיצונית. הקליטו את העכבר לפחות 10 שניות או עד שהוא יורד לכלוב.
   7. שימו לב ליכולת שלו לאזן את עצמו על המדף מבלי להחליק וללכת לאורך המדף לכיוון הכלוב או הפלטפורמה.
   8. בצע שלושה ניסויים עצמאיים לכל עכבר, עם מרווח מנוחה של ~2 דקות בין הניסיונות. נקה את משטח המדף בין בעלי החיים באמצעות 70% אתנול כדי להסיר את סימני הריח.
   9. בצע את כל הבדיקות בסביבה שקטה עם תאורה עקבית ומינימום רעש רקע או רעידות. הימנע מחזרה מופרזת על המבחן באותו יום, שכן עייפות והשפעות למידה עלולות להשפיע על הביצועים.
4. הערכת הליכה
   הערה: מבחן הערכת ההליכה בוחן קואורדינציה מוטורית, דפוס צעדים ויציבות יציבה בעכברים הנעים בחופשיות. עכברים עם אטקסיה מציגים לעיתים קרובות קיצור אורך צעד, תנועות לא יציבות ומיקום כפות לא סדיר, מה שמעיד על ליקויים בתיאום^{ובשליטה} בשיווי המשקל.
   1. רצו מסלול ישר ושטוח בנייר לבן (8.5 × 11 אינץ'). הניחו את הכלוב הביתי בקצה הנייר כדי לעודד את העכבר ללכת על פני הנייר.
   2. ציפוי בעדינות את כפות הרגליים הקדמיות והאחוריות בשני צבעים מנוגדים (למשל, כחול לכפות הקדמיות, אדום לכפות האחוריות) באמצעות כרית דיו לא רעילה (איור 1E).
   3. הניחו את העכבר בקצה ההתחלה של המסלול, ותנו לו ללכת בחופשיות על פני הנייר ללא דחיפה חיצונית.
   4. התבוננו ומדדו את הפרמטרים הבאים:
      אורך הצעד: המרחק בין מיקומים עוקבים של אותה כף.
      רוחב בסיס: המרחק הצידי בין טביעות רגל אחוריות שמאל לימין.
   5. בצע שתי עד שלוש ריצות בעכבר, ומאפשר מנוחה בין המבחנים.
      הערה: השתמשו בדיו לא רעיל, מתייבש במהירות וודאו שרק כריות הכפות מצופות. החלף את הנייר אחרי כל ניסיון כדי למנוע מריחות. מרחו דיו במתינות כדי למנוע טשטוש טביעות רגל, שכן דיו מופרז מפחית את דיוק מדידות הצעד.
5. הערכת קיפוזיס
   הערה: הערכת הקיפוסיס בוחנת יישור עמוד השדרה והפרעות יציבה במהלך תנועה טבעית. עכברים עם תפקוד נוירולוגי או שרירי לקוי מציגים לעיתים קרובות עקמומיות גבית מתמשכת או כפיפה בעמוד השדרה⁵.
   1. הנח את העכבר על משטח ותן לו ללכת או לחקור בחופשיות למשך כמה שניות. הימנעו מהבהלה של בעל החיים, שכן תנועות פתאומיות עלולות לשנות זמנית את יציבתו.
   2. הקליטו וידאו קצר מהתצוגה הצדדית כדי לתעד את עקמומיות הגזע.
   3. התבוננו ביציבת העכבר במהלך ההליכה, תוך התמקדות ביישור עמוד השדרה ובקימור הגזע כפי שמתואר להלן.
      1. זהה יציבה תקינה כאשר העכבר שומר על גב ישר או מעט קמור עם תנועת גוף חלקה.
      2. זהה יציבה לא תקינה כאשר העכבר מציג קיפוסיס, המאופיין בעמוד השדרה כפוף או מעוקל באופן חריג, גזע נוקשה וגמישות מופחתת במהלך הליכת.

3. ניתוח בדיקת אטקסיה

הערה: בצע את כל הניקוד ההתנהגותי על ידי צופה עיוור להקצאת קבוצות ניסוי כדי למזער הטיית צופה.

1. ניקוד מבחני מדש
   1. הקצה ציון של 3 אם העכבר הולך על המדף בצורה חלקה, שומר על שיווי משקל, ויורד לתוך הכלוב מבלי להחליק.
   2. הקצה ציון של 2 אם העכבר מראה פגיעה קלה, כמו היסוס או החלקה קלה של כף הרגל, אך הוא מתאושש ויורד בבטחה.
   3. הקצה ציון של 1 אם העכבר מציג פגיעה בינונית, כולל החלקות תכופות, יציבה כפופה, שימוש מופרז בזנב לשיווי משקל, או ירידה מאוחרת.
   4. הקצה ציון 0 אם העכבר מראה פגיעה חמורה, אינו מצליח לשיווי משקל, נופל מהקצה או מסרב לזוז.
2. ניקוד מבחן אחיזת גפיים אחוריות
   1. הקצה ניקוד של 3 אם העכבר מציג באופן עקבי גפיים אחוריות פרושות החוצה ללא עדות לאחיזה.
   2. הקצה ציון של 2 אם העכבר מראה פגיעה קלה, כמו משיכה לסירוגין של גפה אחורית אחת.
   3. הקצה ציון של 1 אם העכבר מציג פגיעה בינונית, המאופיינת במשיכה חלקית של שתי הגפיים האחוריות שנשמרות בקרבת הבטן.
   4. הקצה ציון 0 אם העכבר מראה פגיעה חמורה, כאשר שתי הגפיים האחוריות צמודות חזק לבטן במשך רוב תקופת התצפית.
3. צביעת צעידה
   1. הקצה ציון של 3 אם העכבר הולך בהליכה יציבה ומתואמת ונע בקווים ישרים.
   2. הקצה ציון של 2 אם העכבר מראה פגיעה קלה, כמו הליכה איטית עם חוסר יציבות קל או סטייה לטרלית, צליעה לצד אחד, או נסיעה בשבילי עגלה רחבים.
   3. הקצה ציון של 1 אם העכבר מציג פגיעה בינונית, כולל הפרעות ברורות בהליכה, הליכה עם שתי או שלוש כפות בלבד, גרירת חלק מהגוף, או תנועה במעגלים צרים.
   4. הקצה ציון 0 אם העכבר מראה פגיעה חמורה, אינו מסוגל ללכת ביעילות, נשאר במקום או מראה תנועות גלגול לא מבוקרות לצד.
4. ניקוד קיפוזיס
   1. הקצה ציון של 3 אם העכבר נשאר שטוח, ישר אחורה גם במנוחה וגם בהליכה.
   2. הקצה ציון של 2 אם העכבר מראה פגיעה קלה, עם עיקול קל בגב במנוחה שמתיישר במהלך התנועה.
   3. הקצה ציון של 1 אם העכבר מציג פגיעה בינונית, עם גב כפוף בינוני במנוחה שנשאר מעוקל במהלך ההליכה.
   4. הקצה ציון 0 אם העכבר מציג פגיעה חמורה, עם גב כפוף מאוד לאורך תקופת התצפית שמגביל תנועה תקינה.

4. הערכת אמינות בין מעריכים

1. הדרכו צופים באמצעות סרטוני דוגמאות מייצגים לפני הניקוד הרשמי כדי לאחד את פרשנות קריטריוני הניקוד.
2. כדי למזער הטיית צופה, דירגו את כל מבחני ההתנהגות באופן עצמאי על ידי שני צופים מיומנים עיוורים לקבוצת הטיפול ולנקודת הזמן הניסויית.
3. כמת את אמינות המערכים לכל מבחן התנהגותי באמצעות מקדם הקאפה של כהן. פרש ערכי קאפה כך: <0.40, התאמה לקויה; 0.40-0.60, הסכמה מתונה; 0.60-0.80, הסכם מהותי; ו->0.80, הסכמה כמעט מושלמת.
4. לפתור כל פער ניקוד באמצעות סקירה משותפת של הסרטונים המוקלטים ולהגיע לציון^{קונצנזוס 5}.

תוצאות

גידול גידול CPA גורם לאטקסיה במודל העכבר של VS

כדי להעריך אטקסיה הנגרמת על ידי גידול, קבענו שתי קבוצות ניסוי. ראשית, כדי להעריך את השפעות ניתוחי בעלי חיים והשתלת תאי גידול על אטקסיה, עכברים עברו ניתוח מזויף והזרקת מי מלח לאזור ה-CPA. תסמיני אטקסיה בעכברים מקבוצת השמה הושוו לאלו בעכברי ביקורת שלא ניתחו. בקבוצה השנייה, גידולי Nf2^/- הוזרקו לאזור CPA, ותסמיני אטקסיה הושוו לאלו בעכברים רגילים שאינם נושאים גידול.

כדי להעריך אטקסיה, ביצ...

דיון

הבדיקות ההתנהגותיות המתוארות כאן מספקות מסגרת איתנה וכמותית להערכת אטקסיה וליקואורדינציה מוטורית במודלים של עכברים של VS והפרעות וסטיבולריות קשורות. הבדיקות הללו, שהותאמו מפרוטוקולים מבוססים למודלים של מחלות ניווניות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת הנטינגטון ואטקסיה ספינוצרבלרית¹⁰, מתאימים במיוחד לאפיון תפקוד לקוי וסטיבולרי שנגרם על ידי גידול ב-NF2-SWN. באמצעות שילוב מספר קריאות התנהגות, גישה זו מאפשרת הערכה מקיפה של הקואורדינצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום בקר עוברי	תרמופישר	A5670701
לומינומטר מיקרופלט GloMax 96	פרומגה	GM3000
כרית תחתית של פרוצדורה כחולה של מקסון	מקסון	75402
תוסף צמיחת תאי שוואן	ScienCell	1752