מאמר שיטה

ניתוח סטריאוטקסי בתינוקות עכברים וטיפול לאחר ניתוח

547 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70335

⸱

31 במרץ 2026

 , 
1Neurobiology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Research Triangle Park

במאמר זה

סיכום

היכולת לבטא וקטורים ויראליים במוח לפני גיל ההתבגרות היא יסודית לחקר המנגנונים התאיים והמעגליים להתפתחות המוח. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לביצוע ניתוח ויראלי סטריאוטקסי בתינוק עכבר בימים 11 או 12 לאחר הלידה (P11-P12) ומספקים הנחיות לטיפול לאחר הניתוח.

תקציר

הבנת התהליכים ההתפתחותיים, התאיים והמעגליים לאורך התקופה שלאחר הלידה היא קריטית להבהרת המורכבויות של התפתחות המוח והשפעתה על הבגרות ההתנהגותית והחברתית. המעבר מתינוקות לבגרות כרוך בשינויים נוירוביולוגיים משמעותיים, כולל גיזום סינפטי ומיאלינציה, שהם חיוניים ליכולות קוגניטיביות, ויסות רגשי ואינטראקציות חברתיות. חקר התפתחות המוח בעכברים טרום-גיל ההתבגרות מאפשר לחוקרים לזהות תקופות קריטיות התומכות בצמיחה בריאה של המוח ולקבוע התערבויות בזמן להפרעות נוירו-התפתחותיות. כדי לנתח במדויק את תפקוד המוח, ניתוח סטריאוטקסי היה טכניקה מרכזית במחקר מדעי המוח, והציעה דיוק שאין שני לו במיקוד באזורים בעלי עניין במוח ומאפשרת העברת חומרים ויראליים. למרות שניתוחי סטריאוטקס בעכברים בוגרים מיושמים באופן נרחב במעבדות נוירוביולוגיה, קיימות הנחיות מוגבלות מאוד לביצוע ניתוחים סטריאוטקסיים בעכברים טרום-גיל ההתבגרות, וכן טיפול חיוני לאחר הניתוח כדי להבטיח שהתינוק יוכל להיות מוחזר בהצלחה לאמו ולגוריו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח סטריאוטקסי והזרקה ויראלית בעכברים תינוקות (P11-P12), תוך הדגשת מתן הרדמה והקלה לכאבים, שיקולים לטיפול לאחר הניתוח, והבדלים מניתוח סטריאוטקסי במבוגרים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בכל אזור מוחי מעניין על ידי עדכון קואורדינטות המטרה הרצויות, וניתן להתאים אותו למיקוד מוחי בשלבים מאוחרים יותר בהתפתחות לאחר הלידה, למשל בתקופת הנוער (P15-P30). בסך הכול, פרוטוקול זה מהווה נקודת כניסה לחקר התפתחות ותפקוד המוח לאחר הלידה.

מבוא

התינוקות והנעורים הם תקופות קריטיות לאחר הלידה להתפתחות המוח, המאופיינות במיאלינציה, סינפטוגנזה וגיזום סינפטי, המסייעים לשיפור המעגלים 1,2. הופעת התנהגויות חברתיות, כולל הזדווגות, תוקפנות ומשחק חברתי, מתרחשת בתקופת ההתבגרות (P28-40)3, ומוסדרת בקפדנות על ידי הורמוני סטרואידים במחזור 4,5. למרות התקדמות משמעותית בכלים לניתוח היסודות התאיים של התנהגויות חברתיות במבוגרים, ידוע מעט על המנגנונים העצביים שמאחורי הופעת התנהגויות חברתיות בהתפתחות לאחר הלידה. הסיבות לחוסר הבנה בפיתוח מעגלים חברתיים כוללות 1) אתגרים הקשורים לביצוע ניתוחים בעכברים צעירים, כולל מתקנים סטריאוטקסיים שלא מותאמים לעכברים צעירים, 2) איזון בין בטיחות ויעילות של הרדמה ומשכך כאבים במהלך ניתוח6, ו-3) קבלת תינוקות על ידי האם לאחר הניתוח. יתרה מזאת, השיטות הנוכחיות המשמשות להעברת מבנים גנטיים בנקודות זמן מוקדמות לאחר הלידה, כגון באלקטרופורציהברחם 7, הזרקת וירוס תוך-חצי-חצי-תוך-תוך-חציית מוח עכבר נאונאטלי (P0-P10)8, או חצייתים גנטיים של דרייבר רקומבינאז וקווי תגובה9, אינן אידיאליות, שכן הן חסרות מיקוד מדויק ומיקוד במיקוד עוברי או P0.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול פשוט לניתוח סטריאוטקסי בתינוקות עכברים (P11-P12) וטיפול לאחר ניתוח לתמיכה בשילוב מוצלח עם האם ובני הזוג. פרוטוקול זה מנצל את הפרוטוקול הסטריוטקסי הנוכחי לעכברים בוגרים10 ודורש רק שינויים קלים במערכת הסטריאוטקסית. אנו מספקים גם הנחיות מפורטות על טיפול לאחר ניתוח ועל הרדמה ומשכך כאבים מוצלח בעכברים תינוקות. בחרנו את נקודת הזמן P11-12 לניתוח, שכן יש תקופת דגירה של שבועיים לביטוי ויראלי, כך שניתן לבדוק עכברים ב-vivo החל מ-P24, לפני תקופת הפריבוברטל (P28-40). עם זאת, אותו פרוטוקול יכול לשמש גם לניתוחים סטריאוטקסיים בנקודות זמן מאוחרות יותר. אנו מתמקדים באמיגדלה המדיאלית המתפתחת (MeA), תת-חלוקה של אמיגדלה המתאפיינת בתפקידה במגוון רחב של התנהגויות חברתיות11,12. אנו חוקרים במיוחד את תת-האוכלוסייה של MeA המבטאת את Foxp2 (MeAFoxp2)13, גורם שעתוק קופת forkhead, כפי שגילינו בעבר שתאים אלו מתוכנתים באופן ייחודי לעיבוד Invivo של רמזים חושיים זכריים בעכברים זכרים לאורך התפתחות לאחר הלידה14. בנוסף, תת-האוכלוסייהMeA Foxp2 נדרשת לווסת דו-כיווני תוקפנות טריטוריאלית אצל זכרים14. בסך הכול, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר לנוירולוגים להעביר במדויק סוכנים ויראליים לאזורים ממוקדים במוח בשלבים מרכזיים לאחר הלידה של התפתחות המוח, כדי לחקור את הבסיס התאית והמעגלי של התנהגויות חברתיות ושייכות לאורך גיל ההתבגרות והבגרות.

פרוטוקול

הליך זה אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIEHS והיה בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות לשימוש וטיפול בבעלי חיים. ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מסכת פנים, חלוק חד-פעמי, רשת לשיער וכיסויי נעליים, שימשו לאורך כל הניתוח ובנוכחות בעלי חיים.

1. הכנה והתאמות למכשיר סטריאוטקסי עכבר (איור 1)

  1. הכינו את המכשיר הסטריאוטקסי עם אביזרים סטריאוטקסיים לעכברים תינוקות, כולל זוג מוטות אוזניים שאינם חטיפה, מחזיק ראש עם הרדמה גזית מותאם, ומוט חיך לתינוקות P12.
  2. חטא את כל כלי הניתוח עם חיטוי חרוזי זכוכית (250 מעלות צלזיוס, 30 שניות לכלים קטנים ודקה אחת לכלים גדולים). הנח כלים סטריליים על וילון סטרילי לאחר החיטוי. כלים סטריליים צריכים להישאר בשדה הסטרילי לאורך כל הניתוח.
  3. הניחו וילון סטרילי נוסף מעל כרית חימום בטמפרטורה של ~37 מעלותצלזיוס על מתקן הסטריוטקסי כדי לשמור על התינוק בטמפרטורה מבוקרת לאורך כל ההליך. עקבו אחר טמפרטורת כרית החימום לאורך כל ההליך.

2. הכנה לניתוח עכברים, מיקום סטריאוטקסי, איזון וקרניוטומיה

  1. מדדו את משקל הגוף כדי לספק מינון מתאים של משכך כאבים.
  2. הניחו את העכבר בתא השראה מלא ב-3% איזופלורן עם קצב זרימת חמצן של 0.9 ליטר לדקה. בדוק שהנשימה של העכבר ירדה ל-~1 נשימה לשנייה ואין תגובה לאחר בדיקת רפלקס גמילה מהפדל. העבר את זרימת האיזופלורן/חמצן למסגרת הסטריוטקסית והפחית את ריכוז האיזופלורן ל-2%.
    הערה: יש לאמת הרדמה מספקת על ידי היעדר תגובה לרפלקס המשיכה של הדוושה כל 5 דקות לאורך כל ההליך. התבונן בקפידה בדפוס הנשימה של העכבר לאורך כל הניתוח. כוונו את ריכוז האיזופלורן לאורך כל הניתוח כך שהאחוז הנמוך ביותר ישמש לשמירה על הרדמה עמוקה ולמנוע מנת יתר של הרדמה.
  3. התקן את העכבר על מכשיר סטריאוטקסי מותאם עם אביזרים סטריאוטקסיים לעכברים תינוקות. הניחו מוטות אוזניים שאינם מנוקבים בצד ראש העכבר ויישר את סרגל מוט האוזן כך שיהיה במרחק שווה משני הצדדים ביחס לסרגל המסגרת הסטריאוטקסית. לתינוקות P11, כוון את הסרגל הסטריוטקסי ל-5 מ"מ.
    הערה: תינוקות ב-P11 בדרך כלל עדיין לא פתוחים עיניים, ולכן אין צורך בחומר סיכה לעיניים. עד P12, חלק מהתינוקות כבר עם עיניים פקוחות. אם עיני התינוק פתוחות, יש למרוח משחה עינית ולהחלה מחדש לפי הצורך לאורך כל הניתוח.
  4. הזרקו 5 מ"ג/ק"ג מלוקסיקאם דרך המסלול התוך-עורי (s.c.) תוך שימוש במזרק של 1 מ"ל עם מחט של 27 גרם.
  5. לדלל 0.5% בופיבאקאין (5 מ"ג/מ"ל) עם תמלח ל-0.5 מ"ג/מ"ל (1:10) ולהזריק S.C. מתחת לעור הראש (כלומר, 0.05 מ"ל לתינוק במשקל 5 גרם).
    הערה: שלבים 2.6 עד 3.15 צריכים להתבצע עם כפפות סטריליות.
  6. בצע חתך של 1.5 ס"מ עם מספריים קטנים לאורך קו האמצע של הראש.
  7. השתמש במקלון כותנה סטרילי כדי להסיר בזהירות את הרקמה הרכה מפני השטח של הגולגולת באמצעות בטדין.
  8. מניחים נימי זכוכית נמשכים (~0.8 מ"מ באורך) במחזיק פיפטות מזכוכית. התקן את המחזיק על הזרוע הסטריאוטקסית האנכית.
    הערה: שלבים 2.9 עד 3.10 צריכים להתבצע תחת מיקרוסקופ ניתוח.
  9. יישר את הזווית הקדמית-אחורית של פני הגולגולת:
    1. העבר את הנימים לנקודת המפגש הרוסטרלית של הסינוסים הדורסליים (RCS) (איור 2) כפי שמתואר ב-Chan ואחרים.
    2. במיקרוסקופ עם הגדלה כפולה, מאפס את קואורדינטות X (מדיאלי-לטרלי), Y (קדמי-אחורית) ו-Z (דורסלי-וונטרלי) כאשר הנימים נוגעים מעט בגולגולת בנקודת RCS באמצעות קונסולת התצוגה הדיגיטלית של המכשיר הסטריאוטקסי.
    3. העבר את הנמים ללמדה (ב-Y = -7.30 מ"מ) והנמיך את הנמים כך שיגע מעט בגולגולת (איור 2).
    4. בדוק את ערך קואורדינטות ה-Z ויישר את הזווית הקדמית-אחורית במערכת הסטריאוטקסית כדי לשנות את זווית ההטיה של הראש. חזור על שלבים 2.9.1 עד 2.9.3 עד שההבדל בערך של קואורדינטת Z בין RCS ל-lambda הוא <0.02 מ"מ.
  10. יישר את הזווית המדיאלית-לטרלית של פני הגולגולת:
    1. הזז את הנימים לנקודת ה-RCS.
    2. אפס את ה-X (מדיאלי-לטרלי) ו-Y (קדמיים-אחוריים) מתואמים כאשר הקפילריה נוגעת מעט בגולגולת בנקודת ה-RCS.
    3. כדי ליישר את הראש באמצעות קואורדינטות MeA (MeApd) הפוסטודורסליות, הזיזו את הנימים ל-X = +2.50 מ"מ, Y = -4.20 מ"מ, ואפס Z (דורסל-ונטרלי) כאשר הנימים נוגעים מעט בגולגולת.
    4. מזיזים את הנמים ל-X = -2.50 מ"מ, Y = -4.20 מ"מ בחצי הכדור השני ומורדים מעט את הנימים כדי לגעת בגולגולת.
    5. בדוק את ערך ה-Z והתאם את ציר המדיאל-לטרלי במערכת הסטריאוטאקסית כדי לשנות את זווית ההטיה של הראש. חזרו על השלבים 2.10.1 עד 2.10.4 עד שההפרש בערך Z בין חצי הכדור הימני והשמאלי הוא <0.03 מ"מ.
  11. הסר את מחזיק הקפילרי והתקן מקדח מיקרו עם מקדח #75 לתוך מחזיק סטריוטקסי של מקדחה על הזרוע הסטריוטקסית האנכית.
  12. מקם את קצה מקדח מעל נקודת ה-RCS, אפס את קואורדינטות X (מדיאלי-לטרלי) ו-Y (קדמי-אחורית). עבור ל-X = ±2.03 מ"מ, Y = -4.20 מ"מ כדי למקד את ה-MeAPD של תינוקות P11.
  13. קדח קרניוטומיה בקוטר 0.5 מ"מ דרך הגולגולת.
  14. נקה בזהירות את פני הגולגולת עם מלח סטרילי באמצעות מגבונים עדינים ומטליות כותנה.
    הערה: מרחו תמיסת מלח סטרילית באופן קבוע כדי לשמור על לחות פני הגולגולת.

3. הזרקה ויראלית

  1. מלאו נימים חדשים בשמן מינרלי באמצעות מחט גמישה מיקרופיל.
  2. חבר והדק את הנימים למזרק הננוליטרים.
  3. הסר את המקדחה המיקרו והתקן את מזרק הננוליטר על הזרוע הסטריוטקסית האנכית.
  4. למשוך לפחות פי שניים מהכמות הנדרשת לניתוח (כאן, 400 ננוליטר) בקצב של 10 ננוליטר לשנייה.
    הערה: כל וירוס AAV שמעניין יכול לשמש להזרקת וירוס לאחר אישור מוסדי. בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-AAV2-DIO-mCherry (BSL-1, 2.5 E+13 vg/mL, 3 מיקרוליטר/צינור, מאוחסן ב-80°C- ואז הועבר לקרח לניתוח).
  5. הזז את הקפילריה לנקודת ה-RCS ואפס את קואורדינטות X ו-Y.
  6. העבר את הנימים לאזור המוח היעד, כאן MeApd (קואורדינטות: X = ±2.03 מ"מ, Y = -4.20 מ"מ, Z= -5.08 מ"מ מ-RCS).
  7. הורידו את הנימים לפני השטח של הגולגולת, ואז אפסו את קואורדינטת Z.
  8. סלול מסלול על ידי הורדת הנימים לעומק הרצוי והחזרת הנימים החוצה מהמוח.
  9. הזריק ~8 ננוליטר של וירוס כדי לוודא שהנימים לא נסתמים לפני החזרה למוח. אם הסתום, הוסיפו סליין סטרילי למגב המשימה ונגב בעדינות את הצדדים והתחתית של הנימים כדי לפנות את החסימה.
  10. הורידו את הנימים פעם נוספת לעומק הרצוי והזרקו את כמות הווירוס הרצויה (במקרה זה, 150 ננוליטר של וירוס) בקצב של 20 ננוליטר לדקה.
  11. כשסיימתי, המתין 5 דקות לפני שמושכים את הנימים בהדרגה.
  12. במידת הצורך, חזור על שלבים 3.4-3.11 כדי להזריק את הנגיף להמיספרה הנגדית.
  13. הסר את הנימים ממזרק הננוליטרים. להשליך נימים משומשים וצינורות ויראליים בצינור קוני של 50 מ"ל עם 10% אקונומיקה.
    הערה: מעבדות בודדות צריכות לעמוד בכל הנחיות הטיפול בפסולת, ניהול דליפות ועמידה בדרישות בטיחות ביולוגית של ענף הביולוגיה והבטיחות הביולוגית המוסדית שלהן.
  14. תפרו את העור עם תפר 7-0 שאינו נספג. נסה להרים את השיער בזמן התפירה כדי שהתפרים יישארו מוסתרים.
    הערה: בדרך כלל 3-4 תפרים יספיקו. אצלנו, תפר 7-0 עובד הכי טוב כדי למנוע מהסכר לקרוע את התפרים ברגע שהתינוק מוחזר לכלוב הבית.
  15. נגב את אזור התפר ב-3% מי חמצן, ואז במי מלח עם מטליות כותנה סטריליות.
    הערה: הניתוח בדרך כלל נמשך בין שעתיים לשעתיים, בהתאם למספר הווירוסים שהוזרקו. וירוסים בדרך כלל דורשים מינימום של שבועיים לביטוי מלא.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. הוציאו את התינוק מהמסגרת הסטריוטקסית והניחו אותו בכלוב נקי מעל כרית חימום. כדי למנוע התייבשות, מומלץ להזריק תמיסת מלח סטרילית.
  2. תעקבו אחרי התינוק עד שהוא יהיה נייד.
  3. ברגע שהתינוק יכול לנוע בכלוב, שים את הסכר בכלוב נקי חדש למשך ~2 דקות.
  4. הניחו את התינוק בכלוב הבית המקורי שלו לצד בני משפחתו. נגב בזהירות את כל התינוקות עם קן וחומרי מיטה מהכלוב הביתי שלהם, ואז החזירו אותם לתוך הקן. המשיכו להחזיר את הסכר לכלוב.
  5. עקבו מקרוב אחרי הסכר והתינוקות. אשר שהסכר חוזר לקן ומטפח את התינוק הכירורגי אך לא מושך את התפרים.
  6. אם אחרי שעה, האם לא מקבלת את התינוק הכירורגי, השתמשו בסאם אומנה. אם אם אם כבר הוכיחה שהיא מקבלת גורים, השתמשו בסכר זה ללידה הבאה (הקבלה לאחר קבלת תינוקות במלטה הראשונה הייתה 100%).
  7. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח, יש לבדוק את אתר החתך ולתת מלוקסיקאם (5 מ"ג/ק"ג, s.c.).
  8. לאחר טיפול מוצלח לאחר הניתוח, השאירו את העכבר הכירורגי עם האם והאחים עד לגמילה ב-P21. הסר כל תפר נראה לעין בתוך 10-14 ימים לאחר הניתוח.
    הערה: לא צפויים הבדלים משמעותיים בצריכת המזון, במשקל הגוף או בהתנהגות התנועה בעכברים כירורגיים בהשוואה לבקרת בני משפחה.
    התינוקות ייבדקו מדי יום לפחות יומיים לאחר הניתוח ואז לפחות פעמיים בשבוע. קריטריונים לנקודת סיום הומנית: אם התינוק אינו זכור להליכה לאחר שעתיים לאחר הניתוח, התינוק יעבור המתת חסד הומאנית. אם התינוק מראה ירידה במשקל הגוף ו/או בתנועה לאחר הניתוח, התינוק יומת באופן הומני.

תוצאות

בטיחות השילוב של איזופלורן, בופיבאקאין ומלוקסיקאם לניתוחי תינוקות
הבטיחות בשימוש בהרדמה ומשכך כאבים אצל עכברים צעירים נותרה לא ברורה6. לכן, בדקנו את השימוש בשילוב של הרדמה ומשכך כאבים אצל עכברים צעירים כדי לקבוע את שיעור ההישרדות. עכברים תינוקות במשקל P11 (משקל גוף = 6.09 ± 0.90 גרם, משקל הגוף הנמוך ביותר היה 3.9 גרם; n=13) הוכנסו לתא ההשראה להרדמה ראשונית עם 3% איזופלוראן ב-0.9 ליטר לדקה. לאחר שהתינוקות הורדמו ולא הגיבו לרפלקס הגמילה של הדוושות, הם הועברו למכשיר הסטריאוטקסי, וההרדמה האיזופלורנית הופחתה ל-1.5-2% איזופלוראן ב-0.9 ליטר חמצן לדקה עם כרית חימום (41.23 ± 2.28 מעלות צלזיוס). לאחר הכנסת התינוקות למכשיר הסטריאוטקסי, ניתנה הרדמה ביני-סקיפולרית (5 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם) וכן הרדמה מקומית שסופקה מתחת לעור הראש (0.05 מ"ג/מ"ל בופיבקאין). שלושים דקות לאחר מכן, הוצאנו את התינוקות מהמערכת הסטריוטקסית והנחנו אותם בכלוב נקי. ראינו שיעור הישרדות של 100% (13 מתוך 13) 30 דקות לאחר מתן משכך כאבים. יתרה מזאת, לא ראינו סיבוכים ב-24 ו-72 שעות לאחר הניתוח, ולא עד לבגרות. תוצאות אלו מראות ששילוב של הרדמה מקומית עם תרופה אנטי-דלקתית שאינה סטרואידית בטוח לעכברים תינוקות ומפחית כאב ומצוקה.

העברת וירוס מדויקת ומדויקת ל-MeA
כדי לאשר את הדיוק והדיוק של העברת הווירוס במהלך ניתוחי סטריאוטקס תינוקות, סיפקנו AAV2-hSyn-DIO-mCherry דו-צדדית ל-MeApd של עכברי זכר Foxp2cre+/- ב-P11 (איור 3A). העכברים גמלו לאחר מכן ב-P21. ב-P45, מוחות העכברים נאספו לאימונוהיסטוכימיה וניתוח תמונה כפי שתוארו קודם בקבוצה14 שלנו ואחרים16 (איור 3B,C). העכברים הורדמו וקיבלו פיוז של 30 מ"ל של 1× PBS, ואחריהם 30 מ"ל של 4% PFA ב-10 מ"ל לדקה. המוחות עברו לאחר קיבוע במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C ב-4% PFA, הוגנו ב-30% סוכרוז, הוטמעו ב-O.C.T., ונחתכו ב-50 מיקרומטר על קריוסטט. כל חלק שלישי עבר עיבוד לאימונוהיסטוכימיה כפי שתואר קודם14. מקטעים צפים בחופשיות נחסמו בסרום חמור רגיל של 10%, דגרו עם הנוגדן הראשי במהלך הלילה, נשטפו, דגרו עם הנוגדן המשני במשך 4 שעות, נשטפו שוב, והותקנו במדיום המכיל DAPI לפני ההחלקה בכיסוי. חלקי המוח צוברו בנוגדן Foxp2 וב-Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L).

כדי לאשר את יעילות היעד, קבענו את הביטוי המשותף של תאי mCherry+ ו-Foxp2+ ב-MeA וראינו חפיפה של 90.2% ± 2.1 בין אוכלוסיות, מה שמעיד כי ביטוי mCherry מוגבל לתאי Foxp2+ באופן תלוי ב-cre (איור 3D). תוצאה זו מדגישה את היעילות הגבוהה של הזרקת הווירוס באמצעות פרוטוקול זה. בנוסף, בדקנו את דיוק ההזרקות הוויראליות על ידי ניתוח אחוז תאי mCherry+ ב-MeApd ביחס לאחוז הכולל של mCherry בכל האזורים. שמנו לב ש-93.7% ±-1.4 תאי mCherry+ היו ממוקמים בתוך ה-MeApd, מה שמעיד שהביטוי המרחבי של הנגיף מוגבל לאזור העניין שלנו (איור 3E).

איור 1
איור 1: הכנה לניתוח סטריאוטקסי לתינוקות. (א) מערכת סטריאוטקסיה. (ב) מוטות אוזניים ללא קרע. (ג) מחזיק ראש ומוט חיך בהרדמה גזית לתינוקות P12. (ד) חומר חיטוי חרוזים. (ה) בקר פד חימום. (F) זרוע סטריאוטקסית. (G) מזרק ננו-ליטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2: נקודות ציון מרכזיות בגולגולת העכבר P11. (א) איור סכמטי של נקודות ציון מרכזיות בגולגולת התינוק. (ב) ראש התינוק מאובטח על ידי אביזרים סטריאוטקסיים מיוחדים הכוללים מוטות אוזניים נגד קריעה, מחזיק ראש גז מותאם ומוט פלט לעכברי P12. קיצור: RCS = מפגש רוסטרלי של הסינוסים, SSS = סינוס סגיטל עליון, RRV = ורידים רוסטרליים-רינליים, SOS = סינוס ריח עליון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: ביטוי ויראלי דו-צדדי ממוקד ב-MeApd לאחר ניתוח סטריאוטקסי לתינוקות. (א) איור סכמטי של ה-MeApd (מבט קורונלי). (B) תמונה היסטולוגית מייצגת של ביטוי דו-צדדי של תאי נוגדן Foxp2 (ירוק) ותאי mCherry+ (מג'נטה) בעכברים זכרים בוגרים מסוג Foxp2cre+/. (ג) תצוגה מורחבת של משרד החוץ משני הערוצים הממוזגים והפרטניים. חצים לבנים מסמנים נוגדן Foxp2 מתויגים יחד ותאי mCherry+ . (ד) יעילות הזרקה. (ה) דיוק הזרקה. (D,E) n=3 עכברים, חצאי כדור/עכבר שמאלי וימני. קיצורים: MeApd = אמיגדלה מדיאלית פוסטודורסלית; MeApv = אמיגדלה מדיאלית פוסטורונטרלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

שיטותיתרונותחסרונותמקור
באלקטרופורציה ברחםטרנספקציה גדולה יותר של פלסמידחוסר מיקוד מדויק, רעילות, צריך להיות מיומן מאודWang ואחרים, Methods Mol Biol. (2013).
הזרקה ויראלית תוך-חדריתמהיר, קל, חסכוניחוסר מיקוד מדויק, סיכון לרצח תינוקותקים ואחרים, J Vis Exp. (2014).
מיקרוהזרקה סטריאוטקטית ב-P0מיקוד מדויק, סיכון נמוך יותר לדחייה מצד האםרעילות תאית עקב וירוס, לא אידיאלית לחקר נקודות זמן לאחר גיל ההתבגרותצ'ן ואחרים, J Vis Exp. (2018).
הכלאה גנטית של קו רקומבינאזלא פולשניחוסר מיקוד מדויק, יקררוברטסון ואח', Nat Neurosci. (2013).

טבלה 1: סיכום שיטות קודמות ששימשו לחקר התפתחות עוברית ופוסט-לידה תאית ומעגלית בקרב מכרסמים.

דיון

חקר המנגנונים העצביים שמאחורי התנהגויות חברתיות לאורך ההתפתחות הפוסט-לידתית הוא חיוני להבנת לא רק הופעתן אלא גם כיצד מנגנונים אלו יכולים להיות מופרעים על ידי גורמים סביבתיים או בהפרעות נוירו-התפתחותיות. המחקר שלנו מתאר פרוטוקול מפורט לניתוח סטריאוטקסי להעברת הווירוס בדיוק ויעילות למוחם של עכברים תינוקות P11-12. לכן, פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה, הקלטה וחקר מעגלים של תת-אוכלוסיות נוירונים מוגדרות מולקולרית לפני ואחרי גיל ההתבגרות באמצעות אסטרטגיה ויראלית. אנו מדגישים שינויים וטיפול לפני ואחרי הניתוח, וכן שילוב בטוח של תרופות הרדמה ומשככי כאבים שנסבלים היטב על ידי תינוקות עכברים.

מרכיב מרכזי ומאתגר בניתוח סטריאוטקסי לתינוקות הוא החזרת התינוק בהצלחה לכלוב הבית שלו עם אמו ובני משפחתו. כדי להבטיח טיפול מתאים לתינוק בעת החזרתו לכלוב, על הסאם להוציא ולטפח את התינוק (ללא טיפוח יתר), ויש לעקוב מקרוב אחר סימני הזנחה פוטנציאליים. עקב החתך והתפרים של התינוק, הסכר עלול לטפח יתר על המידה את אזור הראש, מה שעלול לגרום לקריעה והסרת התפרים. זה יהיה מזיק, ולכן מעקב אחר התנהגות הסכר כלפי התינוק לאחר הניתוח הוא קריטי להבטחת הישרדות. כדי להגדיל את קבלת התינוק לאחר הניתוח, אנו ממליצים להשתמש במי חמצן ומי מלח לאחר התפירה לניקוי שאריות דם שנותרו מהעור והפרווה, ולהשתמש בתפרים דקים יותר (7-0) מאשר במבוגרים (5-0). שתי האסטרטגיות הללו הובילו לאימוץ העכברים התינוקים לאחר הניתוח על ידי הסם.

בנוסף, המחקר שלנו מספק הנחיות לשימוש בטוח בהרדמה ומשכי כאבים בניתוחי תינוקות. זה קריטי, שכן תינוקות עכברים ותינוקות אינם עומדים במינונים של הרדמה וכאבים כמו מבוגרים, מה שעלול לגרום לתופעות לוואי מזיקות בדרכי הנשימה והלב6. הבחינו כי איזופלורן, הרדמה דרך הפה, והשילוב של מלוקסיקאם ומשכך כאבים בופיבאקאין, שניתנו תת-עורית (תוך-גוף ומתחת לעור הראש, בהתאמה), נסבלו היטב על ידי התינוקות והוביל להישרדות ארוכת טווח. יתרה מזאת, הראינו בעבר כי ההליך הכירורגי הסטריאוטקסי בתינוקות עכברים הוביל לזמני מחקר דומים לעכברים צעירים שבועיים לאחר הניתוח, בהשוואה לקבוצת הביקורת המותאמת גיל שלא עברה ניתוח14. לכן, תוצאות אלו מצביעות על החלמה מספקת וללא ליקויים מוטוריים גלויים לאחר הניתוח בתינוקות עכברים. ראוי לציין שלא מדדנו את חמצון הדם לאורך כל הניתוח. יש לעקוב אחרי רמות החמצן בדם באמצעות מד דופק כדי למנוע היפוקסיה17.

רכיב קריטי נוסף בפרוטוקול זה הוא השימוש במערכת קואורדינטות סטריאוטקסית המבוססת על הלמדה וה-RCS בקו האמצע הסגיטלי15. RCS הוא נקודת ציון המוגדרת על ידי המפגש בין הסינוס הסגיטלי העליון לצומת הסינוס הריח העליון לאורך קו האמצע הסגיטלית. הוכח כי סימן זה מציג שונות מיקום נמוכה יותר באופן עקבי מאשר נקודות ציון גביות אחרות לאחר יישור גלובלי של הראש. זה המצב שכן המרחק המוגבר בין RCS/lambda, בהשוואה לברגמה/למבדה, משפר את היציבות והשחזוריות של הזווית האופקית הבין-חיותית15.

שיטות קודמות לחקר התפתחות נוירונים התמקדו באסטרטגיות ויראליות בנקודות זמן עובריות ו-P0, או בהכלאות גנטיות למיפוי גורל של תאים מעניינים (טבלה 1). טכניקות כמו אלקטרופורציה ברחם והזרקות ויראליות תוך-חדריות חסרות מיקוד מדויק. ביצוע הזרקות ויראליות ממוקדות ב-P018 מתגבר על הבעיה הזו על ידי הזרקת מבנה ויראלי מדויק לאזור עניין. עם זאת, מבנים ויראליים עלולים להפוך לציטטוקסיים לאחר מספר שבועות, מה שמוביל למוות תאי. לכן, הזרקת מבנה ויראלי למוחו של התינוק למחקרי גיל ההתבגרות לאורך זמן שיכולים להימשך גם לבגרות עשויה שלא להיות אידיאלית. לכן, הגישה שלנו, שבה ההזרקה הוויראלית מתבצעת שבוע וחצי לאחר הלידה, מפחיתה את הסיכון לרעילות תאים במהלך גיל ההתבגרות.

למרות היתרונות של הגישה שלנו, נותרו מספר שיקולים. ראשית, יש לשנות את קואורדינטות המוח המשמשות בעכברים תינוקות לעומת אלו שבמבוגרים. לדוגמה, בעכברים צעירים מסוג P11, אנו משתמשים בקואורדינטות הבאות כדי למקד את ה-MeApd: X= +2.03 מ"מ, Y= -4.20 מ"מ, Z= -5.08 מ"מ; בעוד שהקואורדינטות המשמשות במבוגרים הן X= +2.15 מ"מ, Y= -5.00 מ"מ, Z= -5.10 מ"מ. למרבה הצער, יש פחות הפניות לאטלס מוחי לעכברים טרום-גיל ההתבגרות19 מאשר אלו של עכברים בוגרים (Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org ו-atlas.brain-map.org)20,21. לכן, כדי להשיג מיקוד וירוסי נכון באזורים אחרים מחוץ ל-MeA, החוקרים יצטרכו לקבל הערכה מושכלת של הקואורדינטות ולבצע בדיקות קואורדינטות. שנית, יש לקחת בחשבון את זמן הדגירה של AAVs. זמן הדגירה האופטימלי לביטוי AAV ב-vivo הוא לפחות 2-3 שבועות. בהתחשב בכך שבפרוטוקול שלנו, ניתוח סטריאוטקסי מתבצע בתינוקות עכברים ב-P11, החוקרים יוכלו להתחיל לבדוק עכברים רק לאחר הניתוח ב-P25, לאחר תקופת הדגירה האופטימלית של AAV.

בסך הכול, פרוטוקול זה מספק הנחיות מפורטות לחוקרים למקד בדיוק רב לאזורי מוח בעלי עניין אצל עכברים צעירים באמצעות וקטורים ויראליים. גישה זו מועילה מאוד, שכן היא גמישה מאוד: ניתן להזריק כל מבנה AAV מסחרי או מותאם אישית. לכן, היא מאפשרת חקר תת-אוכלוסיות תאיות מוגדרות מולקולרית המעניינות והמעגלים האנטומיים שלהן, הדינמיקה הנוירונית ותפקידן התאית לפני ואחרי גיל ההתבגרות, במהלך חלון זמן קריטי התואם להתפתחות התנהגויות חברתיות. בנוסף, גישה זו מצליחה למיקוד לא רק באמיגדלה, כפי שמוצג כאן, אלא גם במבנים תת-קורטיקליים אחרים, כגון ההיפותלמוס והאזורים הקורטיקליים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לד"ר אנדרו גורמן, ד"ר דונה ווב ודיוויד גולדינג מהסניף לרפואה השוואתית (CMB) במכון הלאומי למדעי הבריאות הסביבתית (NIEHS/NIH) על דיונים חשובים על שיטות עבודה מומלצות בהרדמה ומשכך כאבים בניתוחי מכרסמים. אנו מודים גם לכל חברי CMB ב-NIEHS על הטיפול המרבי בנבדקים בעלי החיים ולכל חברי קבוצת המעגלים הנוירו-התנהגותיים. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הפנימית של המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, המכונים הלאומיים לבריאות (NIEHS/NIH) (ZIA ES103403) (J.E.L.). התרומות של מחברי ה-NIH נחשבות ליצירות ממשלת ארצות הברית. הממצאים והמסקנות המוצגים במאמר זה הם של המחברים ואינם משקפים בהכרח את עמדות ה-NIH או משרד הבריאות ושירותי האנוש של ארה"ב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מקדח #75עיר מקדח10WS75-850FL
מחט 27 Gקובטרוס60757
3% מי חמצןברבורNDC 0809-0871-43
32% פאראפורמלדהידמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15714
AAV2-hSyn-DIO-mCherryאדג'ין50459-AAV2
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey (1:1000) אנטי-ארנב IgG (H+L)מחקר החיסון של ג'קסון711-545-152
איזון אנליטיסארטוריוס1102--15
בטדיןבית המרקחת אבריוNDC 67618-155-15
בופיבאקאיןהוספירהNDC 0409-1163-18
קריוסטטלייקהCM1950
מיקרוסקופ ניתוחצייס2149-629
משחת עינייםוטרינריה דקרהפורלובה
מדיה להרכבה פלואורומונט עם DAPIתרמו פישר סיינטיפיק00-4959-52
נוגדן Foxp2 (1:1000)אטלס נוגדן/קוסמו ביולוגיהHPA000382
עכברי Foxp2cre+/-מעבדת ג'קסון30541
מחזיק ראש ובר חיך בהרדמה גזית לגורים P12דיוויד קופף אינסטרומנטס1934-C
חיטוי חרוזי זכוכיתפישר סיינטיפיק10-000-632
נימי זכוכיתוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטס504949
מחזיק פיפטות זכוכיתדיוויד קופף אינסטרומנטס1975-1.2-A
משטח חוםקנט סיינטיפיק  תאגידRT-0520
איזופלוראןטיפול נמרץ פירמלNDC 66794-017-10
מלוקסיקאםאספקת וטרינריה פיבטליתNDC 46066-937-13
מקדח מיקרודיוויד קופף אינסטרומנטסמקדחת דגם 1911
מחט גמישה מיקרופילוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסMF28G67-5
שקופיות מיקרוסקופתרמו פישר סיינטיפיק12-550-15
שמן מינרליסיגמא-אלדריץ'M5904-500ML
מזרק ננוליטרוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסNANOLITER2020
תפר לא נספגניתוח ADS-N718SP13
מוטות אוזניים שאינם רפצ'רדיוויד קופף אינסטרומנטס1921-א
סרום חמור רגילJackson ImmunoResearch017-000-121
O.C.T. קומפאונדסאקורה4583
מערכת סטריאוטקסיתדיוויד קופף אינסטרומנטס1900
מטלית כותנה סטריליתULINES-21102
וילון סטריליציוד חד-פעמי בבית החולים בוס696
סליין סטריליהוספירהNDC 0409-1966-02
מים סטרילייםהוספירהNDC 0409-4887-24
סוקרוזהפישר כימיקלS5-500
מזרקפישר סיינטיפיק50-252-2568

מקורות

  1. Andersen, S. L. Trajectories of brain development: Point of vulnerability or window of opportunity. Neurosci Biobehav Rev. 27 (1-2), 3-18 (2003).
  2. Zeiss, C. J. Comparative milestones in rodent and human postnatal central nervous system development. Toxicol Pathol. 49 (8), 1368-1373 (2021).
  3. Bell, M. R. Comparing postnatal development of gonadal hormones and associated social behaviors in rats, mice, and humans. Endocrinology. 159 (7), 2596-2613 (2018).
  4. Auger, A. P., Olesen, K. M. Brain sex differences and the organisation of juvenile social play behaviour. J Neuroendocrinol. 21 (6), 519-525 (2009).
  5. Barkley, M. S., Goldman, B. D. A quantitative study of serum testosterone, sex accessory organ growth, and the development of intermale aggression in the mouse. Horm Behav. 8 (2), 208-218 (1977).
  6. National Research Council (US) Committee on Guidelines for the Use of Animals in Neuroscience and Behavioral Research. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. , The National Academies Press. (2003).
  7. Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods Mol Biol. 1018, 151-163 (2013).
  8. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863(2014).
  9. Robertson, S. D., Plummer, N. W., De Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nat Neurosci. 16 (8), 1016-1023 (2013).
  10. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
  11. Prakash, N., Abu Irqeba, A., Corbin, J. G. Development and function of the medial amygdala. Trends Neurosci. 48 (1), 22-32 (2025).
  12. Raam, T., Hong, W. Organization of neural circuits underlying social behavior: A consideration of the medial amygdala. Curr Opin Neurobiol. 68, 124-136 (2021).
  13. Lischinsky, J. E., et al. Embryonic transcription factor expression in mice predicts medial amygdala neuronal identity and sex-specific responses to innate behavioral cues. Elife. 6, e21012(2017).
  14. Lischinsky, J. E., et al. Transcriptionally defined amygdala subpopulations play distinct roles in innate social behaviors. Nat Neurosci. 26 (12), 2131-2146 (2023).
  15. Chan, E., Kovacević, N., Ho, S. K., Henkelman, R. M., Henderson, J. T. Development of a high resolution three-dimensional surgical atlas of the murine head for strains 129s1/svimj and c57bl/6j using magnetic resonance imaging and micro-computed tomography. Neuroscience. 144 (2), 604-615 (2007).
  16. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Methods Mol Biol. 176, 1-12 (2021).
  17. Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO during surgical anesthesia in mice. J Neurosci Methods. 159 (2), 261-267 (2007).
  18. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. J Vis Exp. (137), e57270(2018).
  19. Kronman, F. N., et al. Developmental mouse brain common coordinate framework. Nat Commun. 15 (1), 9072(2024).
  20. Dong, H. W. The Allen reference atlas: A digital color brain atlas of the C57BL/6J male mouse. , John Wiley & Sons. (2008).
  21. Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

התפתחות המוחהזרקה ויראליתהפרעות נוירו-התפתחותיותגיזום סינפטיתהליך המיאלינציהמתן הרדמהעכברים צעירים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.