Method Article

טרנסקריפטומיה מרחבית של מורפוגנזה מוקדמת של שן ברקמה עוברית מוטמעת בפרפין בפורמלין

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שימוש בחתכים מוטמעים בפורמלין, מוטמעים בפרפין, מאזורים קרניופציאליים של E13.5 ו-E15.5 בעוברי עכברים לניתוח פרופילי הבעה גנים שונים באמצעות טרנסקריפטומיקה מרחבית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השן המתפתחת מורכבת מאוכלוסיות תאים מגוונות ומתמחות מאוד הפועלות יחד לשמירה על צורה ותפקוד נכונים. הבהרת האינטראקציות בין התאים הללו לבין המיקרו-סביבה הסובבת אותם היא קריטית להבנת המנגנונים הרגולטוריים העומדים בבסיס התפתחות שיניים תקינה. הפרעות בתהליכים אלו עלולות לגרום להפרעות מולדות כגון אגנזת שן, דנטינוגנזה אימפרפקטה ואמלוגנזה אימפרפקטה. למרות ההתקדמות המשמעותית שאפשרה ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) בחשיפת הטרוגניות תאית, הוא אינו שומר על ההקשר המרחבי של תאים ברקמות, מה שמגביל את היכולת לקשר ביטוי גנים לארכיטקטורת הרקמות. טכנולוגיות טרנסקריפטומיה מרחבית מתמודדות עם מגבלה זו על ידי שילוב פרופיל ביטוי גנים ברזולוציה גבוהה עם שימור ארכיטקטורת רקמות טבעיות, ומאפשרים מיקום מקומי של חתימות מולקולריות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לאיסופ, קיבוע והטמעת פרפין של רקמת הקרניופציאל העוברית בעכבר, המתאימה ליישומים טרנסקריפטומיים מרחביים במורד הזרם. תהליך העבודה מפרט את החתך והטיפול האופטימיזים של רקמה מקובעת בפורמלין, מוטמעת בפרפין, כדי לשמור על שלמות ה-RNA ומורפולוגיית הרקמה לניתוח מרחבי ברזולוציה גבוהה. שיטה זו תואמת לפלטפורמות ריצוף וטרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת תמונה, ומאפשרת פרופיל טרנסקריפטומי מרחבי לשחזור של מורפוגנזה מוקדמת של שיניים בעוברי עכברים. גישה זו מציעה תובנות עוצמתיות לגבי הארגון המרחבי והדינמיקה התפקודית של מבני גולגולת ופנים הן במצבים התפתחותיים והן במצבים פתולוגיים, ומספקת מסגרת קריטית לקישור מנגנונים מולקולריים למורפולוגיית הרקמות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות השיניים נשענת על רצף מתואם מאוד של תהליכים מורפוגנטיים במהלך הצמיחה העוברית המוקדמת 1,2,3,4. למרות שמספר רב של גנים מרכזיים ומסלולי איתות זוהו באמצעות מחקרים גנטיים והתפתחותיים, ההבנה שלנו כיצד גורמים אלה פועלים לעיצוב מבני הגולגולת האישית הבודדים נותרה מוגבלת. ראוי לציין שגם עם התקדמות משמעותית בקישור וריאנטים גנטיים ספציפיים להפרעות שיניים סינדרומיות ולא-סינדרומיות, המנגנונים המולקולריים המפורטים שמאחורי מורפוגנזה ספציפית למבנה עדיין אינם מוגדרים במלואם 1,2,3,4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הילד ופיתוח האדם וועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC), במסגרת פרוטוקול מחקר בעלי חיים #21-031.

1. הכנת בעלי חיים ניסיוניים ואיסוף רקמות

  1. זוג את Mus musculus הזכר והנקבה הבריאים והפוריים להזדווגות בזמן. זהה עכברים בהריון לפי נוכחות פקק נרתיקי, המסומן כיום עוברי (E) 0.5.
  2. המית עכברים בהריון באמצעות שאיפת CO₂ ואחריה ניתוק צוואר הרחם. מקם את שכיבת החיה על משטח ניתוחי סטרילי סופג וחטא את אזור הבטן ב-70% אתנול לאורך אתר החתך המיועד.
  3. בצע חתך בטן בקו אמצעי באמצעות מספריים כירורגי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו מתארת את עיבוד ראשי העבר העבריים שנפרקו זה עתה ליצירת דגימות FFPE של רקמות קרניופציאליות, כולל השן המתפתחת, שניתן לחתך בקלות על ידי מיקרוטום תוך שמירה על שלמות ה-RNA (איור 1). פרוטוקול זה יושם בהצלחה על ראשי עוברים של E13.5 (יום עוברי 13.5), E15.5 ו-E16.5 עבור אזורים מבוססי תמונה ברזולוציה גבוהה (איור 2) וטרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת ריצוף (איור 3). במאגרי נתונים של טרנסקריפטומיקה מרחבית מבו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת בלוקי FFPE של ראשי עוברים בעכברים, מותאמים לשימוש בפלטפורמות הדמיית RNA מרחביות ברזולוציה גבוהה, כולל טרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת ריצוף ודימות. מטרה מרכזית של פרוטוקול זה היא לשמור על מורפולוגיית הרקמות ושלמות חומצות הגרעין לאורך כל חלקי הראש, עם דגש מיוחד על אזור הקרניופציאלי המתפתח. הבטחת רמת שימור זו חיונית לפתרון מדויק של דפוסי ביטוי גנים מרחביים בסביבות מורכבות ורב-רקמתיות, כגון מבני החיך והשיניים המתפתחים.

מחקרי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בכנות לד"ר סרגיי ל. לייקין, לד"ר אלנה מקריבה (מדור לביוכימיה פיזיקלית, NICHD/NIH), ולד"ר ג'רמי אוליבר פינה (מחלקת ביולוגיה מולקולרית של עצמות ושיניים, NIDCR/NIH) על ייעוץ בתכנון הניסויים והסיוע הטכני. אנו מודים לד"ר איבן ג'יימס, ד"ר ויבק מהאדבן (ליבת גנומיקה מולקולרית, NICHD/NIH) על הסיוע הטכני לריצת טרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת ריצוף. אנו מודים לד"ר גוסטף ויגרבלד (סניף אוטואימוניות מערכתית, המכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שריר-שלד ועור, NIAMS/NIH) על הסיוע הטכני בטרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת תמונה. אנו מודים לד"ר מייקל קלי ולד"ר ג'טינדר סינג (CCR Single Cell Analysis Facility (SCAF), NCI/NIH) על הסיוע הטכני להפעלת הטרנסקרי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSתרמו פישר10010023שימוש  לבצע שטיפות במהלך תהליך העבודה
צינורות חרוטיים של 50 מ"ל (Ambion) ללא RNAseתרמו פישרAM12502להשתמש באחסון דגימות בתמיסות שונות
מזעזע מסלול מתקדםVWR6683-470להשתמש בו לנער רקמות בתמיסת קיבוע במהלך הדגירה
אלכוהול, 70%, פישרברנד, היסטופרפפישר סיינטיפיקHC-1000-1GLלהשתמש בו לניקוי וחיטוי כל שטח העבודה
מעבד רקמות ואקום אוטומטיLeica BiosystemsASP300Sשימוש לניקוי, ייבוש, הידרציה מחדש וחדירת שעווה של דגימות
עובי זכוכית כיסוי 1.5, 25 מ"מ x 25 מ"מ;קורנינג2850-25שימוש בהרכבת סלייד בתהליך עבודה של Visium HD
בופר בלוינג של דקו, מוכן לשימושAgilant TechnologiesCS70230-2שימוש ב-H& צביעת E
אאוסין-Y עם פלוקסיןפישר סיינטיפיק22050198שימוש ב-H& צביעת E
המטוקסילין, מאייר'ס, תמיסה מימית מוכנה לשימושAgilant TechnologiesS330930-2שימוש ב-H& צביעת E
אמבט מים HistoCore & nbsp;Leica BiosystemsHIS2326משתמשים בציפה של הקטעים ב-40-43 ו-°ג; C להסרת קמטים מחלקי FFPE  
דפדפן לופ  9.0.010X Genomics, Inc. השתמש לניתוח נתוני Visium HD 
להבים חד-פעמיים בפרופיל נמוך DB80LXLeica Biosystems14035843496השתמש בבלוקים של FFPE  
פורמלין ניטרלי עם בופר 10%אזר סיינטיפיקNBF-4-Gשימוש לתיקון הרקמות
תמיסת ניקוי זיהום RNaseZap RNaseתרמו פישרAM9782שימוש לניקוי והסרה של RNase
מיקרוטום סיבובי חצי-אוטומטיLeica BiosystemsRM2245השתמשו במסגרת חסימות FFPE כפי שמדווח בהנחיות.
מחמם סלייד עם כיסויבכורה  XH2004שימוש בדגירת מגלשות בטמפרטורות שונות
מגלשות סופרפרוסט פלוס פישר סיינטיפיק12-550-15 שימוש לחיבור מקטעים ל-Vsium HD
להב ניתוחי מס' 11אינטגרה מילטקס4-311שימוש לניקוד רקמות FFPE
הפרפלסט של הניתוחLeica Biosystems39601006שימוש לביצוע חדירת רקמות והטמעה של רקמות
TISsue CULTURE DISH 100X20MM 500/CSפישר סיינטיפיק877222שימוש לאיסוף וניתוח דגימות ב-1x PBS
גליצרול אולטרה-פיורתרמו פישר15514011שימוש בהרכבה של זכוכית כיסוי ב-Visium HD לפני CytAssist
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442שימוש בניסויים בזרימת עבודה ב-Visium HD
ריצוף RNA מרחבי של Visium HD10X Genomics, Inc. 1000676שימוש לביצוע ניסויים טרנסקריפטומיים מרחביים
לוקליזציה של Xenium 5K ב-RNA במקום 10X Genomics, Inc. PN-1000724שימוש לביצוע ניסויים טרנסקריפטומיים מרחביים
אנלייזר זניום10X Genomics, Inc. PN-1000481בצע הדמיית RNA 5K של Xenium ו-Xenium  
Xenium Explorer 410X Genomics, Inc. השתמש לניתוח נתוני Xenium  
לוקליזציה של RNA בזיטניום במקום10X Genomics, Inc. 1000672שימוש לביצוע ניסויים טרנסקריפטומיים מרחביים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles