בדיקת ציטומטריית זרימה סטנדרטית באמצעות פאנלים מיובשים של נוגדנים רקומביננטיים לאפיון תאי CAR T

סיכום

פרוטוקול זה מדגים כיצד פאנלים נוגדנים רקומביננטיים מיובשים מייעלים את אפיון תאי קולטני האנטיגן T של הכימרי (CAR T) על ידי הפחתת שונות ופישוט תהליכי עבודה. הוא מאפשר הערכה שכפולה של תכונות איכות קריטיות, כולל כימות מוחלט של תאי T קולטני אנטיגן כימרי, והוא תואם בין פלטפורמות ציטומטריית זרימה שונות.

תקציר

ציטומטריית זרימה משמשת לעיתים קרובות להערכת תכונות קריטיות של תאי קולטני אנטיגן כימרי (CAR T), כולל כדאיות, פנוטיפ ויעילות הטרנסדוקציה. זרימות עבודה קונבנציונליות של מגיב נוזלי דורשות שלבי הכנה מרובים, שיכולים לגרום לשונות והבדלים בטיפול התלוי במפעיל. פאנלים נוגדנים רקומביננטיים מיובשים מראש מספקים פורמט חלופי המשלב טכנולוגיית נוגדנים רקומביננטיים עם תצורה מוכנה לשימוש. נוגדנים רקומביננטיים מציעים ספציפיות מוגדרת והפחתת שונות בין מנות, בעוד שהפורמט היבש מפחית את שלבי ההכנה ומפשט את הטיפול בתגובה. כאן, אנו מציגים תהליך עבודה שלב אחר שלב לניתוח תאי CAR T באמצעות פאנלים נוגדנים רקומביננטיים יבשים. הפרוטוקול כולל צביעת דגימות, איסוף נתונים וניתוח, ומלווה בסקירה סכמטית של תהליך העבודה. תוצאות צביעה מייצגות מדגימות את יישום הפאנלים, ומודגשים הבדלים בזמן הפעולה בהשוואה לתהליך תגובת נוזלים קונבנציונלית. הדוגמאות המוצגות מראות כיצד ניתן להשתמש בלוחות אלו לייעול האפיון הרב-פרמטרי של תאי CAR T. בסך הכול, עבודה זו מספקת מסגרת מעשית ליישום פאנלים נוגדנים רקומביננטיים יבשים בניתוח תאי CAR T מבוסס ציטומטריית זרימה.

מבוא

טיפולי תאי CAR T הפכו להתקדמות משמעותית בטיפול בסרטן, במיוחד במלאירות המטולוגית. גישה זו משתמשת במערכת החיסון של המטופל על ידי שינוי תאי T כדי לבטא קולטני אנטיגן כימריים (CARs) שמזהים ומכוונים לתאי סרטן¹. עם זאת, התשתיות המורכבות מאוד ותהליכי הייצור עתירי העבודה הנדרשים לייצור תאי CAR T הופכים את האפיון הקפדני והסטנדרטי לחיוני להבטחת איכות המוצר ובטיחות המטופל. חלק משמעותי מהעלות הכוללת של טיפול CAR T נובע מעבודת מעבדה נרחבת ונהלי בקרת איכות (QC), שרבים מהם כוללים תהליכים ידניים ורב-שלבים. בהקשר זה, פרמטרי אפיון מרכזיים — כגון יעילות הטרנסדוקציה ובדיקות זהות — הם קריטיים להערכת הפוטנציאל הטיפולי של התאים שעברו שינויים². שיטות צביעת נוזל מסורתיות בציטומטריית זרימה, המשמשות בדרך כלל להערכות אלו, מציבות מספר אתגרים. שונות בפיפטינג, בעיות יציבות ריאגנט והטיית אופרטור עלולות להוביל לאי-עקביות ואי-דיוקים בנתונים, שעלולות לפגוע באמינות התוצאות³.

ציטומטריית זרימה היא טכנולוגיה אבן יסוד לאפיון ובקרת איכות של תאי CAR T המאפשרת ניתוח מפורט של פרמטרים רבים של תאים. עם זאת, השימוש הקונבנציונלי בתגובות נוזליות בתהליך זה מלא במלכודות פוטנציאליות ^4,5. שונות בפיפטינג עלולה לגרום לשגיאות משמעותיות, במיוחד כאשר מדובר בנפחים קטנים וריאגנטים מרובים. יתרה מזאת, מגיבים נוזליים רגישים להתדרדרות לאורך זמן, מה שעלול לפגוע ביציבותם ולגרום לתוצאות צביעה לא עקביות⁶. הטיית המפעיל, הנובעת מהכנה וטיפול ידניים, מחמירה עוד יותר את הבעיות הללו, ועלולה להוביל לשונות בתוצאות בין מעבדות ואפילו במהלך ריצות באותה מעבדה. תכונות קריטיות באיכות כמו חיוניות התא, תדירות המרה, ספירת CD3⁺ וזהות הן חיוניות לשחרור בטוח של מוצרי CAR T. הבטחת דיוק ועקביות של מדידות אלו היא חיונית, שכן הן משפיעות ישירות על היעילות והבטיחות הטיפולית של תאי CAR T¹. לדוגמה, הערכה מדויקת של תדירות הטרנסדוקציה היא קריטית לקביעת אחוז תאי ה-T ששונו בהצלחה כדי לבטא את ה-CAR, בעוד שספירת ^CD3+ ואחוזי ה-CD3 מספקים תובנות לגבי הרכב וטוהר כלל של אוכלוסיית תאי T.

פאנלים מיובשים של נוגדנים מציעים פתרון מבטיח לאתגרים אלה על ידי מתן אספקה עקבית של תגובות והפחתת זמן ההתקנה וסיכון לטעות. פאנלים אלו מורכבים ממספר נוגדנים שיובשו מקוקטיילים מעורבים מראש. לאחר הייבוש, הפאנלים הללו יציבים ומוכנים לשימוש, מה שמבטל את הצורך בשלבי הכנה מורכבים ומפחית את הסיכון לטעות אנוש ^6,7. חשוב לציין שאין צורך לשקם את הפאנלים היבשים לפני השימוש — ניתן להוסיף תליות תאים ישירות לתערובת הנוגדנים המיובשים. שילוב נוגדנים רקומביננטיים בפורמטים מיובשים אלו מציע מספר יתרונות לעומת תגובות פוליקלונליות או היברידיות קונבנציונליות. המבנה המולקולרית המולקולרי שלהם מבטיח עקביות גבוהה ושחזור בין חלקות, ומפחית שונות בין ניסויים ומעבדות. אזור Fp מהונדס המבוסס על IgG1 אנושי ממזער תגובתיות צולבת וצביעת רקע. כתוצאה מכך, חסימת Fc אינה נדרשת, מה שמקצר עוד יותר את הזמן הנדרש לביצוע בדיקת הזרימה הציטומטרית. הפורמט היבש מגן על החומרים מפני התפרקות, ושמר על יעילותם לאורך זמן ובין האצוות. עקביות זו חיונית להשגת תוצאות אמינות וניתנות לשחזור במבחני ציטומטריית זרימה⁸.

היישום של פורמטים של תגובת יבשה משתרע על פני שלבים שונים של פיתוח ומעקב אחר טיפול בתאי T ב-CAR. בבקרת איכות בייצור, מגיבים מיובשים מאפשרים דגימה במערכת סגורה, ומבטיחים סטריליות ועקביות. זה חשוב במיוחד בסביבה קלינית, שבה שמירה על שלמות הדגימה^היא בראש סדר העדיפויות. לצורך אפיון מוצרים, תגובות מיובשות מאפשרות הערכה מדויקת של ספירות מוחלטות ותת-קבוצות חיסוניות, חיוניות לקביעת האיכות הטיפולית של תאי CAR T. יתרה מזאת, בהקשרים מחקריים, תגובות מיובשות הן יקרות ערך למעקב ארוך טווח של מטופלים, ומאפשרת מעקב עקבי אחר התמדה של תאי CAR T לאורך זמן, דבר קריטי להבנת היעילות והבטיחות ארוכת הטווח של הטיפול.

היתרונות של שימוש בפאנלים מיובשים בנוגדנים בציטומטריית זרימה הם רבים, כאשר אחד החשובים שבהם הוא היכולת שלהם להפחית שגיאות פיפטינג על ידי מתן פאנל מוגדר מראש לחלוטין, במקום לדרוש ריאגנטים בודדים להיות מושלים ומשולבים ידנית. בניגוד לנוגדנים מיובשים בודדים — שעדיין צריכים לעבור שיקום ופיפט ולכן מציעים בעיקר חיי מדף ארוכים — פאנלים מיובשים מורכבים מראש מבטלים שלבי הכנה ידניים מרובים. זה מייעל את זרימת העבודה, ומפחית משמעותית את ההזדמנויות לשונות תלויה במפעיל. כתוצאה מכך, התהליך הכולל הופך לפחות רגיש לטעויות, פחות גוזל זמן ופחות תלוי בהכשרה טכנית נרחבת, מה שהופך אותו לנגיש למגוון רחב יותר של מעבדות^. יתרה מזאת, הפורמט היציב והמוכן לשימוש של פאנלים נוגדנים רקומביננטיים מיובשים מבטיח ביצועי בדיקה עקביים ואמינים בין מפעילים ומיקומים⁹.

כדי לממש במלואו את הפוטנציאל של טכנולוגיית המגיב היבש בציטומטריית זרימה, חשוב לפתח פרוטוקול שלב אחר שלב לשימוש בה. זה כולל הנחיות לצביעת לוחות יבשים, רכישה וניתוח אוטומטי, כדי להבטיח שכל היבטי התהליך יהיו סטנדרטיים ומותאמים לדיוק ויעילות. על ידי מתן פרוטוקול ברור ומקיף, המעבדות יכולות להשיג תוצאות עקביות ואמינות, ולסייע בשחרור בטוח ויעיל של מוצרי תאי CAR^{T 2}. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שמנצל את יתרונות פאנלי נוגדנים מיובשים כדי להתמודד עם מגבלות של שיטות צביעה נוזליות מסורתיות, ובכך לשפר את האמינות, היעילות והשחזור — תכונות מרכזיות להבטחת טיפולים בטוחים ויעילים לתאי CAR T (איור 1).

פרוטוקול

כל הדגימות האנושיות נאספו ממתנדבים בריאים ואנונימיים לאחר שהתקבלה הסכמה מדעת בכתב. כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של Ärztekammer Nordrhein (#2020272) ובוצעו בהתאם לתקנות האתיות והבטיחות הביולוגית הנדרשות.

1. איסוף והכנת דגימות

1. איסוף דגימות אספטיות של תאי קולטני אנטיגן כימרי T (CAR T) מתוך שקיות העיבוד לצורך בקרת איכות ייצור.
2. עבדו את הדגימות במהירות כדי לשמור על חיוניות התאים. שמרו את הדגימות בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס, מוגנות מאור, עד לצביעה.
3. קבע את מספר התאים של כל דגימה לפני הצביעה.
4. כוונן כל דגימה לריכוז של עד 10⁶ תאים גרעיניים לכל 100 מיקרוליטר באמצעות מי מלח מפופר פוספט (PBS)/2 mM EDTA/0.5% בופר BSA, pH 7.2.
   1. אם צריך, צנטריפוגה את הדגימות ב-300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
   2. להחזיר את התאים לריכוז המתאים.

2. צביעת לוחות יבשים

הערה: שני פאנלים נוגדנים מיובשים מנוסחים מראש משמשים לצביעת דגימות: קוקטייל Immune Cell Component (ICC) המיובש, אדם, ו-CAR T Transduction Cocktail המיובש CAR T הרקומביננטי האנושי. צביעת רכב בלוח ההעברה של CAR T היא קריטית. נדרש הפרדה אמינה בין תאים CAR-שליליים ל-CAR-חיוביים לקביעה מדויקת של תדירות הטרנסדוקציה. שטיפה עשויה להפחית את התאוששות התאים עקב אובדן תאים במהלך הצנטריפוגה והשאיפה. לכן, בדרך כלל מועדפים פרוטוקולי אי-שטיפה כאשר נדרש ריכוז תאים מדויק.

1. קוקטייל ICC (פרוטוקול ללא שטיפה)
   1. הוסיפו 100 מיקרוליטר מהמתלה של התא המוכן ישירות לצינור הנוגדן היבש של ICC. ערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ו/או מערבולת קצרה כדי להמיס את הכדור במלואו. דגרו 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (19–25 מעלות צלזיוס).
   2. ודאו שהכדור הנוגדני היבש מומס לחלוטין. המשיכו ישירות לרכישה בלי לשטות.
2. קוקטייל טרנסדוקציה CAR T (פרוטוקול שטיפה)
   1. הוסיפו 100 מיקרוליטר מתלה התא המוכן לצינור ההעברה היבש של CAR T.
   2. הוסף את נפח התגובה לגילוי CAR המתאים (למשל, 2 מיקרוליטר). ערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ו/או מערבולת קצרה כדי להמיס את הכדור במלואו. דגרו 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (19–25 מעלות צלזיוס). ודאו שהכדור הנוגדני היבש מומס לחלוטין.
   3. שטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט לחלוטין.
3. צביעה משנית (אם נדרש)
   1. בצע שטיפה שנייה (ראו שלב 2.2.3) עבור מגבי זיהוי CAR המסומנים בביוטין להסרת תגובת ביוטין חופשית והפחתת צביעת רקע.
   2. החזירו את התאים ל-98 מיקרוליטר של בופר. הוסף 2 מיקרוליטר של נוגדן משני המסומן על ידי פיקואריתרין (PE). מערבולת לרגע לערבב. דגרו 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (19–25 מעלות צלזיוס).
   3. שטוף את התאים כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים (ראו שלב 2.2.3).
4. ההכנות הסופיות לרכישה
   1. כוונן את נפח כל הדגימות המוצבעות (CAR T Transduction Cocktail ו-ICC Cocktail) ל-300–500 מיקרוליטר עם בופר. הגן על דגימות מאור ושמור על טמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס.
   2. לבצע רכישה תוך שעה אחת כדי לשמור על יציבות הפלואורופור ולשמור על חיוניות התא.

3. רכישת ציטומטריית זרימה וניתוח נתונים

1. הכינו והכינו את ציטומטר הזרימה, כדי להבטיח שהכיול והגדרות המכשירים יהיו אופטימליות.
2. הפעל את הלייזרים ושוטף את מערכת הנוזלים. תן לפחות 30 דקות לספסל האופטי להתחמם.
3. במהלך החימום, הפעל תוכנית ניקוי עם תמיסה של 1% היפוכלוריט.
4. השתמש בחרוזי כיול כדי לכוון את הגדרות הלייזר.
5. הכינו בקרים עם צביעה בודדת לפיצוי באמצעות ערכות נוגדנים תואמות.
   1. לגבי חרוזים: הוסף נפח מתאים של חרוזי שליטה חיוביים ושליליים.
   2. לתאים: הוסף 100 מיקרוליטר של תלייה תא.
   3. עבור תגובות מצומדות בביוטין: כללו צינור עם 98 מיקרוליטר של בופר ועוד 2 מיקרוליטר של נוגדן משני מסומן ב-PE.
   4. בדוק שמגבי הפיצוי תואמים לקוקטייל הנוגדנים (מספרי אצויות).
6. דגירה לבקרות למשך 10–20 שניות, מערבולת ל-5 שניות, ואז דגירה של 10 דקות בחושך בטמפרטורה של 19–25 מעלות צלזיוס.
7. מדלל דגימות עם 600 מיקרוליטר של בופר וערבב היטב.
8. הגדר פיצוי באמצעות בקרות צביעה בודדות.
9. כוון מתחי FSC ו-SSC והגדר ספים כדי למנוע פסולת.
10. לרכוש לפחות 50,000–100,000 לימפוציטים חיים לכל דגימה.
11. בצע שער כדי להעריך את היתכנות, ביטוי CD3 וביטוי CAR.
12. לכימות מוחלט, קבעו את החלק של תאי T חיוביים ל-CAR (f₍CAR T₎).
13. הגדר לויקוציטים כוללים (N₍total₎) כ-CD45⁺, תאים בודדים ברי קיימא לאחר הוצאת פסולת.
14. מדדו את ספירת הלויקוציטים הכוללת על ידי ספירה ישירה מדגימות מוכתמות ICC אם נתמכות על ידי המכשיר או באמצעות חרוזי ספירה או מנתח המטולוגיה.
15. חישוב ריכוז תאי CAR T:
    
    הערה: דוגמת חישוב עם ערכים מאיור 2 ואיור 3
    ​
    
16. יישם שיטה זו לכימות תאי CAR T בין מכשירים ותהליכים שונים.

תוצאות

פאנלים מיובשים של נוגדנים רקומביננטיים הוחלו על דגימות תאי T מסוג CAR⁺ כדי להדגים תהליכי עבודה של צביעת ציטומטריית זרימה. כפי שמודגם באיור 1, החלפת תהליכי עבודה קונבנציונליים של ריאגנטים נוזליים בפאנלים מיובשים מראש מבטלת מספר שלבי הכנה — כולל תיוג צינורות (לציון הרכב הנוגדנים של הפאנל; כל צינור עדיין דורש את מזהה הדגימה המתאים), שילוב תגובות וערבוב ידני — ובכך מפשט את תהליך הצביעה. הצינורות כוללים תווית שניתן לסרוק באמצעות ציטומטרים תואמים או לקרוא ידנית, מה שמספק אפשרויות גמישות לזיהוי דגימה.

דוגמאות מייצגות מראות כי פאנל הרכב תאי החיסון היבשים מאפשר זיהוי תת-קבוצות מפתח של לויקוציטים (איור 2), בעוד שלוח ההעברה היבש של CAR T מאפשר הדמיה של תאי T המבטאים CAR והערכת הטרנסדוקציה (איור 3). חסימת Fc אינה נדרשת בפאנלים אלו, ונדרש רק בקרה איזוטיפית אחת לכל הנוגדנים בפאנל. דוגמאות אלו מדגישות את השימוש בפאנלים מיובשים לניתוח רב-פרמטרי של תאי CAR T ומדגימו כיצד ניתן לבצע את זרימת העבודה ביעילות עם שלבים מעשיים מצומצמים. הרכב פאנלי הנוגדן היבשים ששימשו במחקר זה מופיע בטבלה 1.

איור 4 ממחיש את קיצור זמן ההכנה לניסוי מייצג כאשר משתמשים בלוחות מיובשים עבור משתמשים פחות מנוסים ופחות מנוסים. הפורמט היבש מייעל את הליכי הצביעה, מפחית טיפול ידני ומספק הדרכה מעשית ליישום תהליך העבודה והדרכה. חשוב לציין כי השימוש בקוקטיילי נוגדנים מיובשים הניב תדירויות תת-קבוצה של תאי מערכת החיסון הדומות לאלו שמתקבלות בקוקטיילים נוזליים קונבנציונליים (איור 5). בנוסף, פאנלים מיובשים של נוגדנים יציבים בטמפרטורת החדר וניתן לאחסן אותם בתנאים סביבתיים לאורך כל שנות חיי המדף שלהם, בניגוד לנוגדנים נוזליים קונבנציונליים, שלרוב דורשים אחסון קר. יציבות זו תומכת בשימוש חוזר, מחקרים ארוכי טווח וניהול מלאי פשוט יותר.

לסיכום, הדוגמאות המוצגות מראות כיצד ניתן להשתמש בפאנלים של נוגדנים רקומביננטיים יבשים לייעול את האפיון הרב-פרמטרי של תאי CAR T. בסך הכול, עבודה זו מספקת גישה מעשית ליישום פאנלים מיובשים בניתוח תאי CAR T מבוסס ציטומטריית זרימה, עם טיפול פשוט יותר, הפחתת שלבי ההכנה ותצורות פאנלים גמישות.

איור 1: השוואה בין תהליך צביעה ידני לבין פאנלים מיובשים של נוגדנים רקומביננטיים. זרימת העבודה הידנית המסורתית (טופ) כוללת שלבי הכנה מרובים, כולל תיוג שפופרות, שילוב וערבוב של מגבים, והוספת דגימות, מה שיכול להגדיל את המאמץ המעשי. לעומת זאת, תהליך הפאנל הנוגדנים הרקומביננטי היבש (התחתון) משתמש בפאנלים מיובשים ומעורבים מראש שדורשים רק הוספת הדגימה. גישה יעילה זו מפחיתה את השלבים הידניים ומפשטת את תהליך הצביעה, וממחישה יעילות זרימת עבודה ויישום מעשי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: ניתוח ציטומטרי זרימה של דגימת לוקפרזיס המוכתבת בפאנל נוגדנים רקומביננטי יבש "קוקטייל הרכב תאי החיסון". (א) פסולת הוצאה על ידי גייטינג ב-FSC לעומת SSC לכלול את כל התאים. (B) הכפילים הוסרו באמצעות שער FSC-A לעומת FSC-H. (C) לויקוציטים זוהו על ידי גייטינג על תאי CD45⁺ , מה שאפשר הוצאה של אריתרוציטים שאריתיים. (D) תאים מתים הוצאו באמצעות צביעת 7-AAD. (E,F) תאי ^CD3+ זוהו וסווגו ל-(E) תאי T ו-(F) תאי NKT בהתבסס על ביטוי CD56. (G) תאי T הופרדו לאחר מכן לתת-קבוצות CD4⁺ ו-CD8⁺ . (H) בתוך אוכלוסיית CD3^– הוגדרו מונוציטים לפי ביטוי CD14 ותאי B לפי ביטוי CD19. (I) תאי CD14^–/CD19^– הנותרים חולקו לאאוזינופילים של SSC high/CD16^, נויטרופילים SSC high/CD16⁺ , ותאי SSC נמוכים/CD56⁺/CD16⁺ . אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: ניתוח זרימה ציטומטרית של תאי CD19 CAR T (FMC63) שנצבעו בפאנל נוגדנים רקומביננטי יבש "CAR T Transduction Cocktail". (א) פסולת הוצאה על ידי שער על FSC לעומת SSC לכלול את כל התאים. (B) הכפילים הוסרו באמצעות שער FSC-A לעומת FSC-H. (C) לויקוציטים זוהו באמצעות גייטינג על תאי CD45⁺. (D) תאים מתים הוצאו על בסיס צביעת 7-AAD⁻. (E,F) תאי ^CD3+ זוהו והופרדו לאחר מכן לאוכלוסיות CAR⁺ ו-CAR⁻. תאי CAR⁺ (G) ו-(H) CAR⁻ חולקו עוד לתת-קבוצות תאי T של CD4⁺ ו-CD8⁺. (I) בתוך אוכלוסיית CD3⁻, מונוציטים שאריתיים הוגדרו על ידי ביטוי CD14. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: חיסכון בזמן שהושג באמצעות פאנלים מיובשים של נוגדנים ברמות ניסיון. למשתמשים לא מנוסים (משמאל) ולמשתמשים מנוסים (מימין), הוערך הזמן להקמת ניסוי ציטומטרי זרימה (פאנל נוגדנים רקומביננטי יבש "קוקטייל הרכב תאי חיסון", משולשים טכניים) מתחילת הניסוי ועד תחילת הדגירה, כולל טיפול בתגובה, פיפטינג ותיעוד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: ניתוח ציטומטריית זרימה של דם מלא מפורק, שכבת דגימה מוכתמת בפאנל נוגדנים רקומביננטי יבש "קוקטייל הרכב תאי חיסון" (כחול) ודגימה שמוצבעת באותם נוגדנים בפורמט נוזלי (כתום). (א) פסולת הוצאה על ידי שער ב-FSC לעומת SSC לכלול את כל התאים. (B) הכפילים הוסרו באמצעות שער FSC-A לעומת FSC-H. (C) לויקוציטים זוהו על ידי גייטינג על תאי CD45⁺ , ובכך הוצאו אריתרוציטים שנותרו. (D) תאים מתים הוצאו באמצעות צביעת 7-AAD. (E) תאים CD3⁺ זוהו. (F) תאים אלו סווגו לאחר מכן לתאי T ותאי NKT בהתבסס על ביטוי CD56. (G) תאי T הופרדו לאחר מכן לתת-קבוצות CD4⁺ ו-CD8⁺ . (H) בתוך אוכלוסיית CD3^– הוגדרו מונוציטים לפי ביטוי CD14 ותאי B לפי ביטוי CD19. (I) תאי CD14^–/CD19^– הנותרים חולקו לאאוזינופילים של SSC high/CD16^, נויטרופילים SSC high/CD16⁺ , ותאי SSC נמוכים/CD56⁺/CD16⁺ . (J) הושוו תדרים שהושגו באמצעות נוגדנים נוזליים ופאנלים מיובשים של תגובה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מטרה	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 נגמ"ש	R2 APC-Vio770
קביעת חיוניות התאים והרכב תאי החיסון	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
קביעת יעילות הטרנסדוקציה של תאי CAR T	CD45	CD4	CD3	תגובת גילוי CAR	7-AAD	/	CD14	CD8

טבלה 1: הרכב פאנלי נוגדנים רקומביננטיים יבשים המשמשים לניתוח תאי T של CAR. טבלה זו מפרטת את הנוגדנים הכלולים בכל פאנל מיובש, ומפרטת את האנטיגן היעד, השיבוט, הפלואורוכרום והכמות הטיפוסית לכל צינור. מוצגים שני פאנלים: פאנל "הרכב תאי חיסון" לזיהוי תת-קבוצות עיקריות של לויקוציטים, ופאנל "CAR T Transduction" לזיהוי ביטוי CAR ואפיון תת-קבוצה של תאי T. המידע מספק הפניה ליישום זרימת עבודה והתאמה אופציונלית עם נוגדנים נוספים מצומדים בנוזל.

דיון

פאנלים נוגדנים רקומביננטיים מיובשים מספקים תהליך עבודה מעשי ויעיל לאפיון תאי CAR T במעבדה. הפורמט המנוסח מראש מפחית את שלבי ההכנה ומפשט את הטיפול, מסייע להגביל שונות תלויה באופרטור ותומך בביצוע עקבי של נהלי ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית⁸. דוגמאות מייצגות ממחישות את השימוש בפאנלים אלו לזיהוי תת-קבוצות של לויקוציטים, זיהוי ביטוי CAR והערכת תת-קבוצות תאי T. לוחות יכולים גם להיות מוסיפים בנוגדנים מוצמדים בנוזל לכלול סמנים נוספים או תת-מערכות חיסוניות, מה שמאפשר התאמה גמישה לצרכים ניסיוניים ספציפיים או ניתוחים בפרמטרים גבוהים.

זיהוי CAR מדויק הוא קריטי לקביעת תדירות ההעברה^{האמינה 1}. הפרדה ברורה בין אוכלוסיות CAR-שליליות ל-CAR-חיוביות תלויה בתנאי צביעה אופטימליים כראוי, במיוחד כאשר רמות הביטוי של CAR משתנות. בקרות כמו דגימות פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) יכולות לתמוך בגייטינג מדויק. במקרים מסוימים, שלבי הכביסה עשויים לשפר את ההבחנה על ידי הסרת נוגדנים לא קשורים; עם זאת, צעדים אלו יכולים להפחית את התאוששות התאים עקב אובדן תאים במהלך הצנטריפוגציה והשאיפה. לכן, ייתכן שיעדיפו תהליכי עבודה ללא שטיפה כאשר נדרש כימות תאים מדויק.

בעוד שהגישה אידיאלית משתמשת בריאגנט גילוי ייחודי ל-CAR שמזהה את התחום החוץ-תאי של ה-CAR המהונדס, ניתן גם להשתמש בריאגנטים חלופיים, כגון נוגדנים המיועדים לאזורי קישור שמורים בין תחומי הקישור לאנטיגן ולדומיין-איתות. חלופות אלו מאפשרות זיהוי תאים המבטאים את CAR וניתן לשלב אותן בתהליכי עבודה שבהם לא זמינים תגובות ספציפיות ל-CAR, עם אופטימיזציה מתאימה.

אינטגרציה עם מערכות רכישה וניתוח אוטומטיות, כולל Express Mode, יכולה לייעל עוד יותר את איסוף וניתוח הנתונים, להפחית את זמן העבודה ולבצע תהליכי עבודה עקביים בין המפעילים.

בעוד שעבודה זו ממחישה את השיטה, לא בוצעה אימות בדיקה פורמלית לייצור מוסדר או בדיקות שחרור. אימות רב-מרכזי טרם בוצע, ולכן השחזוריות בין המעבדות^{טרם אושרה}. הגישה מתבססת על פאנלים מנוסחים מראש, מה שעשוי להגביל את הגמישות ביישומים מתמחים מאוד. עם זאת, ניתן לעצב אפשרויות פנלים מיובשים בהתאמה אישית לכלול סימנים או שילובים ספציפיים, מה שיאפשר תהליכי עבודה מותאמים אישית ולהתגבר על המגבלות של פאנלים סטנדרטיים. שיקולי העלות מאוזנים בעיקר על ידי הפחתת זמן העבודה והליכים פשוטים, שעשויים להיות מועילים במיוחד בתהליכי עבודה עם תפוקה גבוהה.

העבודה העתידית עשויה להתמקד בהערכות ביצועים כמותיות, אימות פורמלי לשימוש מפוקח, והרחבה למחקרים רב-מרכזיים להערכת עקביות זרימת עבודה בין מעבדות. עיצוב פאנלים מותאם אישית מהווה דרך מעשית להרחבת כיסוי הסמנים, לטיפול בשאלות ניסיוניות ייחודיות או להסתגל למחקרי ניטור חיסון לאורך זמן.

לסיכום, פאנלים נוגדנים רקומביננטיים מיובשים מספקים פלטפורמה גמישה ומעשית לציטומטריית זרימת תאי CAR T. הם מפחיתים שלבי הכנה, מפשטים תהליכי עבודה ותומכים בעיצוב ניסוי גמיש, כולל תצורות פאנלים מותאמות אישית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(אופציונלי) נוגדן ביוטין, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	נדרש רק אם נעשה שימוש בחומר זיהוי CAR צמוד ביוטין.
(אופציונלי) חבילת מצב הבעת CAR T	Miltenyi Biotec	160-002-376	תוסף תוכנה עבור מנתחי MACSQuant; מאפשר פתיחה אוטומטית וניתוח נתונים, אם כי ניתוח ידני אפשרי גם כן.
חומר זיהוי CAR לפי בחירה שניתן לגילויו בערוץ PE, לדוגמה, חומר זיהוי CAR CD19, אדם, ביוטין	Miltenyi Biotec	130-129- 550	אפשרויות חלופיות: נוגדן אידיאוטיפ CD19 CAR FMC63, PE, REAfinity (130-127-342); חומר זיהוי CAR CD22, אדם, ביוטין (130-126-727); חומר זיהוי CAR BCMA, אדם, PE (130-133-888)
ציטומטר זרימה, למשל, מנתח MACSQuant 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	צינורות StainExpress תואמים לכל ציטומטרי הזרימה הסטנדרטיים.
תערובת תרכובת StainExpress CAR T Transduction, אדם	Miltenyi Biotec	130-127-638	ניתן לבקש תצורות פאנל נוגדנים מיובשות מותאמות אישית דרך נציג Miltenyi Biotec המקומי שלך או צוות התמיכה הטכנית.
תערובת תרכובת StainExpress להרכבת תאי חיסון, אדם	Miltenyi Biotec	130-127-637	ניתן לבקש תצורות פאנל נוגדנים מיובשות מותאמות אישית דרך נציג Miltenyi Biotec המקומי שלך או צוות התמיכה הטכנית.