מאמר מחקר

בדיקת ציטומטריית זרימה רב-חרוזית מבוססת חרוזים לפרופילינג פונקציונלי של תאי CAR T

DOI:

10.3791/70344

⸱

10 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec, 2Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 3Außenstelle Zelluläre Immuntherapie, Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI), 4IRCCS Bambino Gesù Children's Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג מבחן ציטומטריה זרימה מבוססת חרוזים במולטיפלקס, למדידת עד 12 ציטוקינים ומולקולות אפקטור מסופרנטנטים שמקורם בתאי האנטיגן הכימריים (CAR)-T, ומאפשר ניתוח מהיר וניתן לשחזור של תפקוד תאי T מהונדסים עם נפחי דגימות קטנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל תאי CAR T מציב אתגרים בשל ההטרוגניות שלהם, תגובות חיסוניות מורכבות וזמינות דגימה מוגבלת. בדיקות מולטיפלקס מאפשרות הערכה פונקציונלית על ידי גילוי בו-זמני של מגוון רחב של מולקולות אפקטור, כולל ציטוקינים, כימוקינים ומתווכים ציטוטוקסיים. כאן, אנו מתארים מבחן מולטיפלקס מבוסס חרוזים התואם לציטומטריית זרימה לניתוח הפרשת מולקולות אפקטור על ידי תאי CAR-T של קולטני אנטיגן כימרי אנושי. סופרנטנטים של תאי CAR T מודגרים בתערובת של חרוזי לכידה המורכבים מאוכלוסיות מקודדות פלואורסצנציה מרובות בשילוב נוגדנים ספציפיים לאנליט. חרוזים אלו נקשרים מטרות מסיסות בדגימה, ויוצרים קומפלקסים של אנליטי חרוזים שמזוהים לאחר מכן באמצעות נוגדנים לזיהוי מסומנים. הבדיקה כוללת פאנל של מתווכים חיסוניים כגון אינטרפרון (IFN)-γ, אינטרלוקין (IL)-2, פקטור נמק גידולי (TNF)-α, IL-6, IL-10, גורם מגרה מושבות גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) וגרנזים B. השימוש בתקנים מוגדרים מראש מאפשר מדידה כמותית של מספר אנליטים מדגימה אחת. איסוף וניתוח נתונים יכולים להתבצע באמצעות גישות שער אוטומטיות המסופקות על ידי כלים מקושרים למכשירים או מבוססי רשת, ומאפשרות עיבוד נתונים. לסיכום, מבחן המולטיפלקס שהוצגה מאפשר ניתוח רב-פרמטרי של פונקציונליות תאי CAR T וניתן ליישמו בהקשרים כמו מחקר, בדיקות בקרת איכות, מחקרים מכניים ואפיון פונקציונלי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון תפקודי חיוני בבדיקות תאי T של קולטני אנטיגן כימרי (CAR), שכן הוא מספק תובנות לגבי העוצמה, הבטיחות ומנגנוני הפעולה של טיפולים אלו. הבנת חתימות המתווכים של ציטוקינים וציטוטוקסים מסייעת בהערכת יעילות טיפולית ותופעות לוואי פוטנציאליות, ומבטיחה פיתוח טיפולים בטוחים ויעילים. בדיקות סינגל-פלקס מסורתיות כמו בדיקות אימונוסורבנט מקושרות באנזים (ELISA) כוללות מגבלות, כגון דרישה לנפחי דגימות גבוהים, זמני עיבוד ארוכים ורצות נפרדות לכל אנליט, תוך מתן טווח דינמי מוגבל בתוך דגימותבודדות 1,2. לעומת זאת, בדיקות מבוססות חרוזים במולטיפלקס מאפשרות זיהוי סימולטני של מספר מתווכים מסיסים, מקצרות את זמן העיבוד ודרישות הדגימה תוך הגדלת טווח הדינמישל 1,2. יעילות ועומק הניתוח הללו הופכים את מבחני המולטיפלקס לכלים חשובים לקידום מחקר ופיתוח תאי CAR T 3,4,5.

הבדיקה המולטי-פלקסית המוצגת במחקר זה משתמשת בחרוזי לכידה, המציגים פרופילי פלואורסצנציה מוגדרים בערוצי הפלואורסציין איזותיוציאנאט (FITC) ופיקואריתרין (PE) ומצופים בנוגדנים ספציפיים נגד אנליטים מסיסים. במהלך דגירה עם דגימה, חרוזים אלו נקשרים באופן סלקטיבי את האנליטים המטרה שלהם מהתמיסה. לאחר לכידת האנליט, מוסיפים נוגדני זיהוי ליצירת קומפלקסים ספציפיים לאנליט. נוגדנים אלו מקושרים ישירות לאלופיקוציאנין (APC) (גילוי ישיר) או לביוטין (גילוי עקיף). לצורך גילוי עקיף, נדרשת דגירה נוספת עם נוגדן אנטי-ביוטין מצומד ל-APC (איור 1). הקומפלקסים המתקבלים – הכוללים חרוזי לכידה, אנליטים ונוגדנים לזיהוי – מנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לכמת את ריכוזי האנליטים. מבחן המולטיפלקס הוא טכנולוגיה מבוססת לוח, הכוללת תקנים מוגדרים מראש המשמשים ליצירת עקומות תקן ספציפיות לאנליט 1,2.

figure-introduction-1
איור 1: עקרון טכנולוגיית הציטוקינים וזרימת העבודה של הבדיקה. הבדיקה מבוססת על 12 אוכלוסיות Capture bead מקודדות פלואורסצנציה, המשולבות לנוגדנים ספציפיים לאנליט. בעת דגירה של הדגימה, נוצרים קומפלקסים של אנליטים חרוזים שניתן לזהות באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים ספציפיים לגילוי. תהליך הבדיקה כולל 1) הכנת תקני אנליט ודגימות רלוונטיות על פלטת סינון, 2) דגירה עם חרוזי לכידה, 3) דגירה עם נוגדנים אנטי-אנליטיים מסומנים בביוטין ליצירת קומפלקסים של סנדוויצ'ים, 4) דגירה עם נוגדני אנטי-ביוטין מסומנים על ידי APC, 5) השעיה מחדש בבופר למדידה, ו-6) רכישת דגימות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מבחן המולטיפלקס המתוארת במחקר זה תואם לציטומוטרי זרימה סטנדרטיים המצוידים בכחול (למשל, 488 ננומטר; ערוצי FITC ו-PE) ולייזר אדום (למשל, 635 ננומטר; ערוץ APC). מכיוון שציטומטרי זרימה זמינים באופן נרחב במעבדות מחקר, בסביבות קליניות ובסביבות בקרת איכות, תאימות זו מאפשרת יישום מבלי לדרוש מכשור מיוחדנוסף. בהקשר של בדיקות פונקציונליות תאי CAR T, גישה זו מאפשרת הערכה רב-פרמטרית של תגובות פונקציונליות בתוך תהליכי עבודה אנליטיים נפוצים6. הבדיקה מציעה יתרונות משמעותיים למחקר תאי CAR T בכך שהיא מאפשרת כימות סימולטני של אנליטים מרכזיים, כולל GM-CSF, גרנזים B, אינטרפרון (IFN)-γ, אינטרלוקין (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, חלבון כימואטרטנט מונוציטים-1 (MCP-1), פרפורין, ופקטור נמק גידול (TNF)-α (פאנל ציטוטוקסיות אנושי). מתווכים אלו חיוניים להבנת הפעלת תאי T של CAR, תפקוד אפקטור ושחרור ציטוקינים הקשור לבטיחות 4,5,7,8.

תהליך הבדיקה כולל אפשרויות לשער אוטומטי וניתוח נתונים באמצעות תוכנות הקשורות למכשירים, וכן כלי ניתוח מבוססי רשת ובלתי תלויים במכשירים5. תכונות אלו תומכות בעיבוד יעיל של נתוני פרופיל מולקולות אפקטור של תאי CAR T על ידי הפחתת היקף ההתערבות הידנית. שימוש בניתוח אוטומטי עשוי לתרום לעקביות טובה יותר בטיפול בנתונים ולהקל על הערכה יעילה יותר של קריאות פונקציונליות8.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת מולטיפלקס ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה לפרופיל מתווך חיסון של תאי CAR T. על ידי מדידת 12 אנליטים שונים במדגם אחד, הגישה רלוונטית במיוחד לחקירות מכניות, מחקר בשלבים מוקדמים ומחקרים נלווים. בשלבים מאוחרים יותר של טיפול בתאי CAR T, ייתכן שיהיה מועיל להפחית את מספר הציטוקינים הנמדדים, במיוחד בסביבת בקרת איכות (QC) רגועה ורגועה לזמן לצורך בדיקות שחרור תרופות. למטרה זו, ניתן להרכיב בין 1 ל-7 ציטוקינים מהפאנל המוצג לעיצוב מבחן ציטוקינים מותאם אישית שניתן לאמת לניתוח תאי T מהונדס. דבר זה הופך את הפרוטוקול המתואר למתאים במיוחד ליישומים מגוונים הן במחקר והן בסביבות בקרת איכות בשלבים מוקדמים ומאוחרים של טיפול בתאי CART 3,4,5,9.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הדגימות האנושיות נאספו ממתנדבים בריאים ואנונימיים לאחר שהתקבלה הסכמה מדעת בכתב. כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של Ärztekammer Nordrhein (#2020272) ובוצעו בהתאם לתקנות האתיות והבטיחות הביולוגית הנדרשות.

1. קו-קולטורציה של תאי CAR T

  1. הכינו תרבית תאים של תאי CAR T אנושיים מהונדסים בהיעדר ובנוכחות אנטיגן קוגניט, לדוגמה תאי גידול מציגים אנטיגן, ביחס של 2.5:1 (אפקטור: תאי מטרה).
  2. הגדר נקודת זמן אחת או כמה לאיסוף סופרנטנטים כדי לנתח ציטוקינים מופרשים פעם אחת, או קינטיקה של ציטוקינים לאורך מסגרת זמן מוגדרת, לדוגמה, בשעות 4, 8, 16, 24 ו-48 שעות.
    הערה: סופרנטנטים עשויים לשמש ישירות או להקפיא אותם לשימוש מאוחר יותר.

2. הכנה סטנדרטית ודגימה

  1. שחזר את תקן האנליט על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של חומר בופר או תרבית תאים לפלט וערבבו בעדינות. הכינו שישה שפופרות ריאגנט ומבצעים סדרת דילול 1:5 של התקן המחודש, עד 3.2 pg/mL או 0.6p/mL (תלוי באנליט), והכינו תפוצה ריקה.
  2. אוספים סופרנטנטים של תרבות CAR T, לדוגמה, 16 שעות או 24 שעות לאחר קו-קולטורה. באופן אופציונלי, יש לאסוף תאי CAR T לפנוטיפינג מקבילי באמצעות ציטומטריית זרימה.
  3. צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השתמש בסופרנטנטים בצורה מסודרת או מדלל אותם כך שיתאימו לטווח הקימור הסטנדרטי.

3. תהליך הבדיקה

  1. תפעיל את תערובת חרוזי הלכידה כדי להחזיר אותה לתלייה יסודית. הוסף 50 מיקרוליטר מהתקן או הדגימה, יחד עם 20 מיקרוליטר של חרוזים מדוללים מראש, לבארות של לוח סינון עם 96 בארות.
  2. דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, רועדים ב-450 סל"ד, בחושך. שטוף את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר באמצעות מניפולד ואקום או צנטריפוגה.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב גילוי מדולל מראש 1:50 (בבופר). לדגר במשך שעה בטמפרטורת החדר, לנער ב-450 סל"ד, בחושך. תשטוף פעמיים.
  4. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מגיב גילוי מדולל מראש 1:50 (בבופר). דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם ניעור ב-450 סל"ד, בחושך. תשטוף פעם אחת.
  5. לרכישה, החזירו את הדגימות ל-200 מיקרוליטר של בופר. סקירה של זרימת העבודה של הבדיקה מוצגת באיור 1.

4. רכישה וניתוח נתונים

  1. אסוף נתונים על ציטומטר זרימה המצויד בלייזרים כחולים ואדומים (נדרשים ערוצי PE, FITC ו-APC). בעת עבודה עם ציטומטרי זרימה של MACSQuant, השתמשו בתבניות Express Mode לניתוח שערים ונתונים אוטומטיים לחלוטין.
  2. חלופה נוספת היא להעלות קבצי נתונים של FSC או MQD לכלי InspectoR המבוסס ברשת, שמבצע מדידת ציטוקינים כמותית אוטומטית ומספק תוצאות מוכנות לייצוא ללא תלות במכשיר בו משתמשים.
  3. ודא שאתה בודק את ההפרדה הנכונה בין 12 אוכלוסיות חרוזי הלכידה השונות בערוץ FITC לעומת PE.
  4. מיישמים את עקומת הסטנדרט לחישוב ריכוזי ציטוקינים, וייצאו והמחישו את התוצאות.
  5. לרכישת נתונים על ציטומטר זרימת MACSQuant, השתמש בברקוד דו-ממדי של בקבוק חרוזי הלכידה, המכיל את כל הגדרות הרכישה הרלוונטיות.
    1. לאחר ההתחברות לתוכנה, בחר בלוח הסינון של MACSPlex כמדף הדגימה ולחץ על כפתור הברקוד בסרגל הכלים כדי להפעיל את קורא הקודים הדו-ממדי.
    2. הצג את הבקבוקון לקורא, וודא שהקוד פונה לאור המהבהב במרחק אופטימלי של 0.5–2.5 ס"מ.
    3. בלשונית Autolabel , הקצה את חרוזי הלכידה (MPx Cyt T-NK,h) ו-NoLabel. לדילול הסדרתי של תקן תא T/NK הציטוטוקסית, הגדירו את מיקומי הקבוצה ובלשונית ההגדרות בחרו במצב Express עם Type: Analysis ו-Mode: MACSPlex_Standard, תוך יישום ערבוב עדין לפי הצורך.
    4. דגימות לא מוכרות מוקצות באופן דומה, עם מיקומן מוגדר, קיבוץ אופציונלי, ובחירה של מצב אקספרס, סוג: ניתוח ומצב: MACSPlex_Sample בלשונית הגדרות , כולל מזהי דגימה אופציונליים ותיאורים.
    5. אמת שהגדרות המדפים נכונות בטבלת הניסוי , וודא רמות נוזל תקינות בבארות לוח הסינון, ואז התחל במדידה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי אוכלוסיות חרוזי לכידה מייצגות המקודדות עבור 12 אנליטים מסיסים

אוכלוסיות חרוזי לכידה זוהו באמצעות ערוצי FITC ו-PE של ציטומטר הזרימה. אשכולות חרוזים מובחנים המייצגים אנליטים בודדים נפתרו בבירור בגרף הביאקסיאלי, כולל IL-10, Granzyme B, MCP-1, IL-17A, פרפורין, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 ו-GM-CSF (איור 2). כל אוכלוסייה הציגה חתימת פלואורסצנציה ייחודית, המאשרת זיהוי מוצלח במולטיפלקס והבחנה ברורה של הציטוקינים ומולקולות האפקטור שנמדדו.

figure-results-1
איור 2: גילוי אוכלוסיות חרוזי לכידת מולטיפלקס מייצגות. חרוזי לכידה מכילים עוצמות פלואורסצנציה מובנות שניתן להשתמש בהן להבחין בין אוכלוסיות ספציפיות לאנליטים. גרף הפיזור מציג את ההפרדה בין אותות ספציפיים לאנליט בהתבסס על עוצמת פלואורסצנציה בערוצי FITC (B1) ו-PE (B2). התמונה מציגה פרופיל מייצג של 12 אוכלוסיות חרוזי Capture המקודדים עבור GM-CSF, Granzyme B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), פרפורין ו-TNF-α. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרופיל ריכוז ציטוקינים מייצג של תאי CAR T לאחר חקלאות משותפת עם תאי גידול

לאחר תרכזת משותפת של תאי CAR T עם תאי יעד גידול, ריכוזי הציטוקינים נמדדו באמצעות פאנל הציטוטוקסיות האנושית של מבחן המולטיפלקס (איור 3). תאי ה-CAR T הפרישו רמות גבוהות של גרנזים B (49,950.2 pg/mL), IFN-γ (48,367.8 pg/mL), TNF-α (7,055.2 pg/mL) ו-GM-CSF (6,653.5 pg/mL), מה שמעיד על הפעלה חזקה ותפקוד אפקטור ציטוטוקסי בתגובה למעורבות הגידול. רמות IL-2 עלו על מגבלת הגילוי העליונה (>10,000 pg/mL), בהתאם לאיתות מתפשט חזק. המדגם לא דולל או נמדד מחדש. לעומת זאת, ציטוקינים הקשורים לתגובות תאי T רגולטוריות או חלופיות, כולל IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 ו-MCP-1, היו נוכחים ברמות נמוכות או כמעט בלתי ניתנות לזיהוי. תוצאות אלו מצביעות על כך שתאי ה-CAR T הפעילו בעיקר תגובה חיסונית מסוג 1 (Th1/ציטוטוקסיק) המאופיינת בפעילות אפקטור גבוהה ובייצור ציטוקינים מדכא חיסון מוגבל.

figure-results-2
איור 3: פרופיל ציטוקינים מייצג של תאי CAR T לאחר תרכזה משותפת עם תאי גידול. תאי T מהונדסים של קולטני אנטיגן כימרי (CAR) גודלו במשותף במהלך הלילה עם תאי גידול JeKo-1. סופרנטנטים של תרביות תאים נקטפו לאחר 16 שעות של דגירה וצונטרו להסרת חלקיקים. דגימות מדוללות נותחו באמצעות לוח הציטוטוקסיות האנושי של מבחן המולטיפלקס. בוצעו שתי עקומות סטנדרטיות ונקבעו ריכוזי כל 12 האנליטים. מוצגת פלט נתונים מייצג לניתוח וחישוב ריכוזים ספציפיים לאנליט באמצעות מצב Express של ציטומטר הזרימה. גרף העמודות והטבלה הנלווית מציגים את הרמות המחושבות (פיקוגרם/מיליליטר) של 12 מולקולות האפקטור. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קינטיקה של הפרשת ציטוקינים של תאי CAR T בעת גירוי ספציפי לאנטיגן

לאחר קו-קולטורציה של תאי CAR T עם תאי מטרה שמבטאים (אנטיגן⁺) או חסרים (אנטיגן⁻) את האנטיגן הקורגינטי, הפרשת הציטוקינים נבדקה לאורך זמן באמצעות פאנל הציטוטוקסיות האנושית של מבחן המולטיפלקס. תאי CAR T הראו שחרור מהיר וחזק של ציטוקינים לאחר זיהוי מטרות אנטיגן⁺, עם עלייה חזקה ב-Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF ו-IL-2 בתוך 8–24 שעות, והגיעו לרמות שיא לאחר 48 שעות (איור 4). דפוס זה מצביע על הפעלה עוצמתית ותפקוד אפקטור ציטוטוקסי לאחר מעורבות אנטיגן. נצפו גם עליות מתונות ב-IL-6, IL-17A ו-IL-21, בעוד ש-IL-4, IL-10, MCP-1 ופרפורין נותרו נמוכים או גבוהים במידה מתונה. לעומת זאת, תרביות משותפות עם מטרות אנטיגן⁻ הראו השראה מינימלית של ציטוקינים בכל האנליטים (איור 4). יחד, הנתונים הללו מראים כי הפעלת תאי CAR T וייצור ציטוקינים אפקטוריים מתרחשים במיוחד בתגובה לזיהוי אנטיגנים ומתעצמים עם הזמן.

figure-results-3
איור 4: קינטיקה של הפרשת מולקולות אפקטור של תאי CAR T שהתרבות יחד עם תאי מטרה חיוביים לאנטיגן או אנטיגן. תאי T מהונדסים של קולטני אנטיגן כימרי (CAR) עובדו יחד עם תאי מטרה שמבטאים (אנטיגן⁺) או חסרים (אנטיגן⁻) את האנטיגן ה-CAR T הקורוגנטי במשך 4, 8, 16, 24 ו-48 שעות. בכל נקודת זמן, נאספו ונותחו סופרנטנטים בתרבות באמצעות פאנל הציטוטוקסיות האנושית של מבחן המולטיפלקס, כדי לכמת פאנל רחב של אנליטים ממוססים לאורך זמן. מוצג קינטיקה של ציטוקינים ל-12 אנליטים (פיקוגרם/מיליליטר). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחן המולטיפלקס שימש לפרופיל תגובות מתווכות חיסוניות ממססות בתרבות משותפות של תאי CAR T. תאי T של CAR שגודלו יחד עם תאי יעד חיוביים לאנטיגן הראו הפרשת מוגברת של IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, גרנזים B ו-IL-2, בהתאם להפעלת האפקטור ולפונקציה ציטוטוקסית 4,5,8. לעומת זאת, ביקורות שליליות לאנטיגן הציגו ייצור ציטוקינים נמוך, מה שהראה את יכולת הבדיקה להבחין בתגובות ספציפיות לאנטיגן בתנאים שנבדקו 5,8. תוצאות אלו תומכות ביישום הבדיקה להערכת תפקוד תאי CAR T, כולל שימוש בניתוחים הקשורים לעוצמה, פרופילינג הקשור לבטיחות וחקירות מכניות.

בעוד שהפאנל הקבוע של 12 אנליטים מספק סקירה רחבה של פעילות החיסון של CAR T, ייתכן שלא יהיה מעשי ללכוד את כל טווח האנליטים בכל היישומים. עבור תהליכי עבודה ממוקדים כמו אימות בדיקות או בדיקות בקרת איכות (QC) של מוצרי תאי CAR T, ניתן להקטין את הפאנל לתת-קבוצה מצומצמת (למשל, IL-2, IFN-γ ו-TNF-α) כדי לייעל את הניתוח תוך שמירה על רגישות פונקציונלית 1,2.

שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים תכנון קו-קולטורה של תאי CAR T ובחירת תנאי דגימה מתאימים. בפרט, משך הקו-קולטור ומספר תא האפקטור (יחס E:T) קובעים ישירות את גודל הציטוקינים ויש להגדירם במהלך הקמת הבדיקה 5,6. בנוסף, יש להתאים את דילול הדגימה כדי להבטיח שריכוזי האנליטים ייכנסו לטווח הדינמישל הבדיקה 1,2. לכן, פתרון תקלות צריך להתמקד באימות ביצועי עקומה סטנדרטית ובהתאמת תנאי קו-קולטור או גורמי דילול אם האותות חורגים מהטווח הכמותי 1,2.

בהשוואה ל-ELISA סינגל-פלקס מסורתי, פלטפורמת המולטי-פלטפורמה המבוססת ציטומטריה זרימה מייצרת מערכי נתונים מרובי אנליטים בצפיפות גבוהה מנפחי דגימות מינימליים. על ידי מתן אפשרות למדידה סימולטנית של מספר אנליטים בתוך דגימה אחת, מולטיפלקסינג יכול להפחית את צריכת המגיב הכוללת, להגדיל את קצב התפוקה של הדגימה ולקצר את זמן הבדיקה ביחס לביצוע מספר בדיקות סינגל-פלקס 1,2. רכישה אוטומטית ואפשרויות ניתוח סטנדרטי יכולות להפחית שונות תלויה במשתמש ולתמוך בשחזוריות וביכולת הרחבה בסביבות ניסוי או ייצור 5,8. רגישות גילוי ELISA סטנדרטית נעה בדרך כלל בין 16 ל-2000 pg/mL (יכולה להיות נמוכה יותר בערכות רגישות גבוהה). בתוך הפלטפורמה שהוצגה במחקר זה, הריכוזים הנמוכים ביותר לזיהוי נעים בין 0.05 pg/mL לאנליטים הרגישים ביותר ועד כ-93.8 pg/mL עבור אלו עם רגישות נמוכה יותר לבדיקה. בכל ההערכות הפנימיות, יותר מ-74% מהאנליטים שנמדדו הציגו מגבלות גילוי מתחת ל-5 pg/mL, ו-38% היו ניתנים לזיהוי מתחת ל-1 pg/mL, מה שמדגיש את הרגישות הכוללת של המערכת. מכיוון שרגישות המולטיפלקס יכולה להשתנות לפי ציטוקין, תחרות פוטנציאלית על אפיטופים נותרת שיקול חשוב. כדי למזער הפרעות כאלה, המבחן משתמש באפיטופים שאינם חופפים ללכידה וזיהוי של כל אנליט, ובכך מפחית הטיה הקשורה לתחרות ומשפר את אמינות המדידה בתנאים מרובבים.

ביצועי בדיקות מולטיפלקס עשויים להשתנות בין אנליטים בהתאם לרגישות הבדיקה ולהקשר הביולוגי, ובתנאים מסוימים, ריכוזי האנליטים עשויים להתקרב לגבול העליון של גילוי ולכן יש להעריך אותם במהלך הקמת הבדיקה. לעומת זאת, חלק מהאנליטים (למשל, MCP-1 ו-IL-4 במחקר זה) עשויים להישאר בלתי ניתנים לזיהוי בהתאם לתנאי הניסוי. בנוסף, גורמים פרה-אנליטיים כמו טיפול בדגימות יכולים להשפיע על מדידות ציטוקינים, ויש לשמור על תנאי עיבוד עקביים כדי להבטיח השוואה.

בסך הכול, גישה זו מאפשרת אפיון יעיל וכמותי של פונקציונליות תאי ה-CAR T. בהשוואה לרוב פלטפורמות גילוי הציטוקינים המולטי-פלקס הקיימות, הבדיקה תואמת לציטומוטרי זרימה סטנדרטיים וכוללת כלי תוכנה הקשור למכשירים המסייע באיסוף וניתוח נתונים יעילים. בעוד שזיהוי ציטוקינים במולטיפלקס שימש בסביבות חיסוניות אחרות, העבודה הנוכחית מדגימה את יישומה לפרופיל תפקודי של תאי CAR T במסגרת זרימת עבודה סטנדרטית. הפורמט המבוסס חרוזים מאפשר זיהוי בו-זמני של מספר אנליטים, ותומך בקצב העברה גבוה יותר בהשוואה לשיטות סינגל-פלקס. יישומים פוטנציאליים כוללים הערכה פונקציונלית של מוצר התרופה, כגון הערכת קושר CAR, אופטימיזציה וקטורית ופיתוח תהליכים. יכולת ההרחבה והניתוח האוטומטי של הבדיקה תומכות גם בבדיקות עוצמה, פרופיל בטיחות ומחקרים מכניים שמטרתם להבין את התנהגות ותפקוד תאי CAR T 5,7,8.

בעוד שפרופילי הפרשת ציטוקינים מספקים תובנות חשובות לגבי הפעלת תאי CAR T ועוצמה תפקודית במבחנה, הם אינם יכולים לשחזר במלואו את הביולוגיה המורכבת שקובעת את היעילות הטיפולית במטופלים. גורמים כמו מיקרו-סביבת הגידול, צפיפות האנטיגן, ויסות מערכת החיסון, והתמדה בחיים משפיעים על ביצועי תאי CAR T מעבר למה שניתן למדוד בבדיקות מבוקלות 6,8,10. עם זאת, הקמת בדיקות פונקציונליות חזקות וסטנדרטיות כגון פרופיל ציטוקינים מרובה מהווה צעד חשוב לקראת אפיון תפקודי של מוצר התרופה 3,4. דפוסי הציטוקינים אינם רק מעידים על פעילות תאי CAR T אלא גם קשורים באופן הדוק לתופעות רעילות, כולל תסמונת שחרור הציטוקינים (CRS) ותסמונת הנוירוטוקסיות הקשורה לתאי האפקטור החיסוניים (ICANS)3,6,7. נכון להיום, שונות בשיטות המדידה ובדיווח מגבילה את ההשוואה בין ניסויים, מה שמדגיש את הצורך בפרופיל מתווך חיסוני סטנדרטיוניתן לשחזור 1,2,3. ככל שטכנולוגיות אנליטיות ומאגרי נתונים קליניים ממשיכים להתקדם, המטרה הסופית היא להגדיר חתימות הפרשה חיזויות המשקפות באופן אמין הן את הפוטנציאל הטיפולי והן את בטיחות המטופל, ולגשר על הפער בין בדיקות עוצמה טרום-קליניות ליעילות קלינית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.L. ו-M.H. רשומים כממציאים בבקשת פטנט WO2021/058811A1. מ.ה. רשום כממציא בבקשות פטנט וקיבל פטנטים הקשורים לטכנולוגיות CAR T שהוגשו על ידי מרכז המחקר לסרטן פרד האצ'ינסון, סיאטל, וושינגטון, ועל ידי אוניברסיטת וירצבורג, וירצבורג, גרמניה. M.H. הוא מייסד שותף ובעל מניות של T-CURX GmbH, וירצבורג, גרמניה. מ.ה. קיבל כבוד מ-Celgene/BMS, יאנסן, קייט/גילעד. J.J, A.R. ו-C.E. הם עובדים ב-Miltenyi Biotec.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי יוזמת התרופות החדשניות 2 במסגרת הסכם מענק מספר 945393, T2EVOLVE. מיזם משותף זה מקבל תמיכה מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי, הפדרציה האירופית של תעשיות ואגודות התרופות (EFPIA) והאגודה האירופית להמטולוגיה (EHA) (ל-M.H., C.Q., M.L.), ERA-NET TRANSCAN-3 (קריאה ממומנת משותפת של EC 2021, SmartCAR-T ל-M.H. ו-M.L.), וילהלם-סנדר-קרן (מענק מס' 2022.134.1 ל-M.L.), קרן פאולה & רודג'ר רייני (ל-M.H. ו-M.L.), IZKF Würzburg (S-511, C-543 ל-M.L.), הקרן הגרמנית למחקר (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG, TRR 221 (תת-פרויקטים A03 ו-A06 ל-M.H. ו-M.L.); SFB-TRR 338/3 2026–452881907 (תת-פרויקטים A02 M.H. ו-C04 M.L.) ו-CRC1525 (מענק זרעים ל-M.L.), מרכז מחקר הסרטן הבווארי (BZKF; TANGO ל-M.H. ו-M.L.), פרס אינקה מאת נוברטיס (ל-M.L.)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת MACSPlex תאי T ציטוטוקסיים/NK, אדםMiltenyi Biotec130-125-800מבחן ציטוקינים מרובה מבוסס חרוזים עבור ציטומטריית זרימה
כלי MACSPlex InspectoRMiltenyi Biotec\כלי מבוסס אינטרנט לחיבור אוטומטי וניתוח של נתוני MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 ציטומטר זרימהMiltenyi Biotec130-096-343מכשיר ציטומטרי זרימה של מדידת נתונים מרובים
MACSQuant Analyzer 16 ציטומטר זרימהMiltenyi Biotec130-109-803מכשיר ציטומטרי זרימה של מדידת נתונים מרובים
מצב MACSQuant ExpressMiltenyi Biotec\תוכנה לחיבור אוטומטי וניתוח
מדיום TexMACSMiltenyi Biotec130-097-196מדיום תרבות תאים נטול סרום אופטימלי שפותח לגידול והרחבה של תאי T אנושיים ועכבריים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy. Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).
  2. Boulch, M., et al. A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity. Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).
  3. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).
  4. Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).
  5. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).
  6. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).
  7. Wang, X., et al. Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro. Front Immunol. 15, 1254162(2024).
  8. Ren, Y., et al. An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome. Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).
  9. Lock, D., et al. Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells. J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).
  10. Bethke, M., et al. Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer. Cells. 13 (22), 1880(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Immunology and InfectionChimeric Antigen Receptor T Cell TherapyCytokinesChemokinesGranzyme BImmunophenotypingMultiplex AssayHuman
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים