מאמר שיטה

מנגנון אבקת ארמיאו בטיפול בדלקת ערמונית: מחקר המבוסס על פרמקולוגיה רשתית ואימות ניסויי

DOI:

10.3791/70356

⸱

29 במאי 2026

 , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2The Second Department of Healthcare, China-Japan Friendship Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות גישה של פרמקולוגיה רשתית, מחקר זה חשף כי אבקת ארמיאו מפעילה את השפעתה הטיפולית נגד דלקת הערמונית על ידי עיכוב גורמים דלקתיים ונתיבי איתות נלווים. ניסויים מאוחרים יותר במבחנה הראו כי התמצית המימית שלו דיכאה משמעותית את ביטוי הציטוקינים הדלקתיים המרכזיים במודל המושרה על ידי LPS של תאי אפיתל הערמונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שילוב של פרמקולוגיה רשת וגישה לאימות ניסויי לבחינת מנגנון הפעולה של אבקת ארמיאו (EMP) בטיפול בדלקת ערמונית. זרימת העבודה מתבצעת לפי שלב: (i) סינון מבוסס מסד נתונים של תרכובות ומטרות פעילות, (ii) בנייה וניתוח של רשתות אינטראקציה, ו-(iii) אימות ניסיוני במבחנה . ראשית, רכיבים פעילים של EMP והיעדים המתאימים להם נאספו ממאגר הנתונים של TCMSP, בעוד שמטרות הקשורות לדלקת ערמוניות התקבלו ממאגר GeneCards. הצומת בין מטרות EMP למטרות מחלות שימשה לזיהוי מטרות טיפוליות מרכזיות. שנית, נבנתה רשת "תרופות–חומר פעיל–מטרה–מחלה" באמצעות Cytoscape. ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) והעשרת מסלולי אנציקלופדיית קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) בוצעו על היעדים המרכזיים, וחשפו כי גורמים דלקתיים כמו IL6 ו-TNF שימשו כמטרות ליבה, והמסלולים כמו PI3K/AKT ו-MAPK הועשרו משמעותית. לבסוף, בוצעה אימות במבחנה באמצעות מודל דלקתי מושרה על ידי LPS של תאי אפיתל הערמונית. הטיפול ב-EMP הפחית משמעותית את שחרור הגורמים הפרו-דלקתיים IL-6 ו-TNF-α בהשוואה לקבוצת ה-LPS (p < 0.05), מה שמאשר את היעילות האנטי-דלקתית של EMP. גישה אינטגרטיבית זו מספקת מסגרת ניתנת לשחזור שניתן להתאים לחקר מערכות טיפוליות רב-רכיביות אחרות. לסיכום, מחקר זה מבהיר בראשית כי EMP מפעיל את השפעתו נגד דלקת הערמונית דרך מנגנון רב-רכיבי, רב-מטרות ורב-מסלולים, הקשור קשר הדוק לדיכוי תגובות דלקתיות, ובכך מספק בסיס מדעי ליישומה הקלינית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת ערמונית, במיוחד פרוסטטיטיס כרונית לא-חיידקית, מייצגת הפרעה אורולוגית נפוצה המאופיינת באטיולוגיה מורכבת ובחוסר בטיפולים יעילים במיוחד, ומטילה נטל משמעותי על איכות חייהם של המטופלים 1,2,3. הניהול הקליני הנוכחי של דלקת הערמונית משתמש בגישה משולבת הכוללת אנטיביוטיקה, חוסמי קולטנים α ותרופות אנטי-דלקתיות שאינן סטרואידיות 4,5,6. האתגרים העיקריים כוללים היעדר טיפולים ספציפיים לאטיולוגיה והאינטראקציה המורכבת בין גורמים פסיכולוגיים לתסמינים פיזיים, אשר תורמים יחד לתוצאות טיפול לא מספקות ולחזרה תכופה7. בשנים האחרונות, גישות לרפואה אינטגרטיבית, כגון דיקור סיני ורפואה צמחית, יושמו באופן נרחב בניהול דלקת הערמונית והראו יעילות מבטיחה. הבטיחות והיעילות של גישות טיפוליות אלו אושרו על ידי סדרת ראיות מחקריות איכותיות 8,9,10,11,12.

בהקשר זה, נוסחאות רפואה סינית מסורתית (TCM) כמו אבקת ארמיאו (EMP), הידועה בתכונותיהן האנטי-דלקתיות והמנקות רעלים, מציעות גישה טיפולית חלופית מבטיחה 13,14,15. עם זאת, המנגנונים הפרמקולוגיים המדויקים שעומדים בבסיס יעילות ה-EMP נגד דלקת הערמונית נותרו לא ברורים במלואם, בעיקר בשל אופיו הרב-רכיבי. הופעת הפרמקולוגיה הרשתית מספקת כלי עוצמתי לפענוח מצב הפעולה המורכב "רב-רכיבי, רב-מטרות, מסלולים מרובים" האופייני לנוסחאות הרפואה הסיניתהסינית 16,17. האסטרטגיה שלנו כללה זיהוי המרכיבים הפעילים של EMP והיעדים הפוטנציאליים שלו, ואחריהם ניתוח רשת כדי לאתר מטרות ונתיבים מרכזיים. ניסויים נוספים נערכו כדי לאמת ביולוגית את ההשפעות האנטי-דלקתיות והמנגנונים המרכזיים, במטרה לבסס בסיס מדעי ליישום EMP. מחקר זה מציג מסגרת משולבת של פרמקולוגיה רשת וניסויי, המשפרת את הפרשנות המכאנית של טיפולים מרובי רכיבים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא נדרש אישור אתי למחקר זה, שכן הוא לא כלל משתתפים אנושיים או דגימות קליניות. כל ההליכים הכוללים קווי תאים בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות בטיחות ביולוגית מוסדיות. קו התאים האפיתל של הערמונית ששימש במחקר זה התקבל מספק מסחרי מוסמך.

הערה: כל התגובות, הכלים והתוכנות ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים. תרשים הזרימה של מחקר זה מוצג באיור 1.

1. סינון של מרכיבים פעילים

  1. גש למסד הנתונים של TCMSP.
  2. בחר "שם עשב" בתיבת החיפוש, הכנס "Huangbo" ולחץ על "חיפוש".
  3. לחץ על מסנן "OB", הגדר "≥30" והגיש מועמדות.
  4. לחץ על מסנן "DL", הגדר "≥0.18" והגיש מועמדות.
  5. העתק את התוצאות המסוננות לגיליון אקסל.
  6. יש להשתמש באותה שיטת סינון כדי לקבל את המרכיבים הפעילים של "צ'אנגג'ו".
  7. הסר את המרכיבים הפעילים הכפולים על ידי ייבוא כל מערכי הנתונים ל-Microsoft Excel (גרסה 2019) ומיזוג רשימות התרכובות בפורמט Excel.
  8. הסר רכיבים פעילים כפולים על ידי אחידת שמות התרכובות וזיהוי ערכים זהים. כאשר מספר רשומות התאימו לאותו תרכוב, נשמרה רק רשומה מייצגת אחת.
  9. הקמת קשרים בין "חואנגבו", "צ'אנגג'ו" וחומרים פעילים.

2. להשיג את היעדים המתאימים לרכיבים הפעילים

  1. גש למסד הנתונים של TCMSP.
  2. בחר "שם כימי" בתיבת החיפוש, הזן את המרכיבים הפעילים ולחץ על "חיפוש".
  3. העתק את שם Target המתאים לכל רכיב פעיל.
  4. הסר שמות Target כפולים ויצר קשרים בין רכיבים פעילים לשמות Target.
  5. היגש למסד הנתונים UniProt (https://www.uniprot.org/)18, שלף את סמלי הגנים הרשמיים של כל שם Target, והחלף אותם באופן שיטתי.

3. רכישת מטרות מחלה

  1. גישה למסד הנתונים של GeneCards (https://www.genecards.org)19.
  2. הזן "דלקת ערמונית" בשדה החיפוש ולחץ על אייקון החיפוש כדי לקבל את רשימת הגנים הרלוונטית.
  3. מיין גנים בסדר יורד לפי ציון רלוונטיות.
  4. ייצא את הגנים הרלוונטיים בפורמט אקסל.
  5. מטרות עם ציון ≥1 נבחרו כמטרות הקשורות לדלקת ערמונית.

4. הכנה לבניית רשת רגולציה של מרכיב פעיל תרופתי-יעד-מחלה

  1. קבל את החיתוך בין היעדים הקשורים לרכיבים הפעילים לבין היעדים הקשורים לדלקת ערמונית, והגדר אותם כמטרות EMP לטיפול בדלקת הערמונית.
  2. קבע את הקשר בין הרכיבים הפעילים למטרות הטיפוליות של EMP לדלקת ערמונית.
  3. צור קובץ אקסל בשם "Network" כאשר שלוש העמודות הראשונות נקראות "Node1", "Node2" ו-"Net".
  4. הדביקו את הקשרים בין EMP לתרופה בעמודות "Node1" ו-"Node2", תוך הזנת "ddrugs" בעמודת "Net" בכל השורות.
  5. הדביקו את הקישור בין חומרים פעילים לתרופות בעמודות "Node1" ו-"Node2", תוך הזנת "ingredient" בעמודת "Net" לכל השורות.
  6. מילאו את עמודות "Node1" ו-"Node2" באסוציאציות של רכיב פעיל-יעד למטרות EMP לטיפול בדלקת ערמונית, כאשר "יעד" מוזן בעמודת "Net".
  7. הדביקו את היעדים הטיפוליים של EMP לדלקת ערמונית, בעמודת "Node1", תוך הזנת "דלקת ערמונית" בעמודת "Node2" ו"מחלה" בעמודת "Net" לכל השורות.
  8. שמור את קובץ האקסל "Network" כקובץ בפורמט txt.
  9. צור קובץ אקסל בשם "Type" כאשר שתי העמודות הראשונות נקראות "Node" ו-"Type".
  10. למלא את עמודת "צומת" ב"EMP", כאשר "formula" מוזן בעמודת "Type".
  11. הכניסו את "הואנגבו" ו"צ'אנגג'ו" לעמודת "צומת"; הזן "תרופה" בעמודת "סוג" עבור כל השורות.
  12. הזן רכיבים פעילים בעמודת "Node", תוך הזנת "ingredient" בעמודת "Type" עבור כל השורות המתאימות.
  13. מילאו את עמודת ה"צומת" במטרות הטיפוליות של EMP לדלקת ערמונית, כאשר "יעד" מוזן בעמודת "סוג".
  14. הזן את היעדים הקשורים לדלקת הערמונית בעמודת "צומת", תוך הזנת "מחלה" בעמודת "סוג" לכל השורות המתאימות.
  15. שמור את קובץ האקסל "Type" כקובץ בפורמט .txt.

5. המחשה של רשת הרגולציה "רכיב פעיל תרופתית-מחלה-מטרה" על ידי Cytoscape

  1. שגר את סייטוסקייפ.
  2. גש ל"קובץ > ייבוא > רשת ממערכת הקבצים" ופתח את הקובץ "network.txt".
  3. פתח את לוח ה"סגנון". בחר "צורה", בחר "טיפוס" מהתפריט הנפתח "עמודה", והגדר את "מיפוי סוג" ל"מיפוי בדיד".
  4. הקצה צורות צמתים מובחנות לקטגוריות הבאות: נוסחה, תרופה, מרכיב, מטרה, מחלה.
  5. בחר "מילוי צבע", בחר "הקלדה" מהתפריט הנפתח "עמודה", והגדר את "מיפוי סוג" ל"מיפוי בדיד".
  6. הקצה צבעי צמתים מובחנים לקטגוריות הבאות: נוסחה, תרופה, מרכיב, מטרה, מחלה.
  7. בחר "גובה" ו"רוחב", בחר "Type" מתוך תפריט הנפתח "Column", והגדר את "Mapping Type" ל"מיפוי דיסקרט".
  8. הקצו גדלי צמתים שונים לקטגוריות הבאות: פורמולה, תרופה, מרכיב, מטרה, מחלה.
  9. בחר "גודל גופן תווית", בחר "להקיד" מתוך תפריט הנפתח "עמודה", והגדר את "מיפוי סוג" ל"מיפוי דיסקרט".
  10. הקצה גדלים שונים של גופני תווית לקטגוריות הבאות: נוסחה, תרופה, מרכיב, מטרה, מחלה.
  11. מיקום מחדש ידנית של הצמתים כדי לייעל את פריסת הרשת.
  12. לך ל"קובץ > ייצוא > תמונת רשת לקובץ" ושמור את הרשת כתמונה.

6. ניתוח והמחשה של רשתות PPI

  1. גש https://cn.string-db.org/ ועבור למודול "חלבונים מרובים".
  2. הזן את רשימת הגנים היעד בתיבת החיפוש, בחר "הומו ספיינס" כאורגניזם, ולחץ על "חיפוש".
  3. לאחר טעינת התוצאות, לחץ על "המשך".
  4. פתח את לוח "הגדרות", הגדר את "ציון האינטראקציה המינימלי הנדרש" ל"ביטחון גבוה (0.700)", וסמן "הסתרת הצמתים המנותקים ברשת".
  5. לחץ על "Update", ואז יייצא את נתוני הקישור של PPI בפורמט TSV דרך תפריט "ייצוא".
  6. הפעל את Cytoscape, עבר לתפריט הקבצים, ובחר "ייבוא רשת ממערכת הקבצים" כדי לפתוח את קובץ ה-TSV שלך.
  7. נווט לתפריט "כלים", ואז בחר ב"NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Treat the Network כלא מכוונת".
  8. עבור לתפריט "קובץ", בחר "ייצוא טבלה למערכת הקבצים", ולייצא את נתוני הרשת.
  9. נווט ללוח "סגנון" והגדר את התכונות "צורה", "צבע מילוי", "גובה" ו"רוחב".
  10. כוון את פריסת רשת ה-PPI על ידי מיקום מחדש של הצמתים.
  11. עברו לתפריט "קובץ", בחרו "ייצוא תמונת רשת לקובץ", וייצאו את הרשת הוויזואלית כתמונה.
  12. פתח את נתוני רשת ה-PPI המיוצאים עם WPS ומיין אותם בסדר יורד לפי עמודת "דרגה".
  13. בחר את 20 היעדים הממוינים ביותר, יצר תרשים עמודות, ושמור את התרשים כתמונה.

7. ניתוח העשרת מסלולי KEGG

  1. פתח טרמינל או שורת פקודה, הקלד R ולחץ על אנטר.
  2. בקונסולת R, הריץ את הפקודות הבאות אחת אחת:
    install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
    BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
  3. המרו את סמלי הגנים של יעדי EMP לטיפול בדלקת הערמונית ל-Entrez IDs באמצעות ארגון. Hs.eg.db.
  4. קראו את מזהי Entrez ובצעו ניתוח העשרה KEGG באמצעות חבילת clusterProfiler עם פרמטרים: organism = "has", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05.
  5. לאחר הסרת מסלולים הקשורים למחלות ומטבוליזם בבני אדם מתוצאות ניתוח ההעשרה של KEGG, מיין את המסלולים הנותרים לפי ספירת הגנים המועשרים.
  6. הקם את הקשר בין 15 מסלולי האיתות המדורגים ביותר לבין היעדים.
  7. הכין קובץ דו-עמודי עם אסוציאציות "pathway" ו-"target", ואז ייבא אותו ל-Cytoscape דרך "File > Import > Network from File".
  8. הגדר צורות וצבעים של הצמתים כדי להבדיל בין מסלולים למטרות באמצעות לוח "סגנון".
  9. כוון את הפריסה ידנית וייצא את הרשת כתמונה.

8. הכנה תרופתית

הערה: הנוסחה EMP מורכבת מ-15 גרם של Phallodendri Chinensis Cortex (הואנגבו) ו-15 גרם של Atractylodis Rhizoma (צ'אנגג'ו). שיטת שאיבת מים ומשקעים אלכוהוליים שימשו לקבלת התמצית בניסויים מבוססי תאים20.

  1. טבלו את התרופה במסה של פי 10 מים למשך שעה.
  2. דקוקט במשך שעה, ואז מסנן דרך גזה כדי לקבל את הדקוקציה.
  3. מוסיפים שוב מסה של פי 10 מים לתרופה לתרופה, לערבב 30 דקות, ולסנן דרך גזה כדי לקבל את התפוצה.
  4. הוסיפו מסה של פי 10 מים לתרופה פעם נוספת, מבטלים 30 דקות, וסיננו דרך גזה כדי לקבל את הדקוקציה.
  5. מערבבים את שלושת הנקבות המסוננות, ואז סיננו את התערובת דרך נייר סינון.
  6. ריכז את הדקוקציה בלחץ מופחת ל-10% מהנפח המקורי שלו.
  7. מקררים את הריכוז, מוסיפים לאט את האתנול ל-75% עם ערבוב, ואז אטימו ואחזו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
  8. צנטריפוגה את התערובת ואספו את הסופרנטנט.
  9. המשך בזיקוק בלחץ מופחת.
  10. לבסוף, ליופיליזציה של המוצר באמצעות מייבש הקפאה ואקום.
    הערה: האבקה הליופילית יכולה להיאחסן בטמפרטורה של –20 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים, מה שמשמש כנקודת עצירה בטוחה. כדי להמשיך, לשחזר את האבקה בממס מתאים לפי הצורך.

9. הפשרת תאים ותרבות

הערה: התאים שנרכשו נמסרו למעבדה על קרח יבש. לפני תחילת הניסוי, הוכנה מראש מדיום חופשי לסרום קרטינוציטים (K-SFM) על ידי השלמת גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי (rEGF) לריכוז סופי של 5 ng/mL, תמצית יותרת המוח בקר לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל, ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.

  1. הפעל את אמבט המים וכיוון את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. הסר את התאים מהקרח היבש וערבב אותם מיד באמבט מים עד להפשרה מלאה.
  3. הוסף 5 מ"ל K-SFM לתאים. מערבבים בעדינות, ואז צנטריפוגות את התערובת (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות).
  4. הסר את הסופרנטנט ותשהה מחדש את הכדור ב-K-SFM מלא.
  5. העבר את התאים לבקבוק T-25 והניח אותם באינקובטור תרביות תאים.
    הערה: הפרמטרים הסביבתיים של חממת תרבית התאים נשמרו על 37°C, 5% CO₂ ו≥-95% לחות יחסית.

10. תת-תרבות תאים

הערה: תת-תרבות בוצעה כאשר התאים הגיעו ל-80–90% מפגש תתי-תרבית, עם יחס תת-תרבית של 1:2 ל-1:3.

  1. שאיפת הסופרנטנט של תרבית התכלית, ואחריה שתי שטיפות של התאים עם PBS ללא סידן ומגנזיום.
  2. הכנס 2 מ"ל של טריפסין-EDTA ותן לתאים לשבת 3 דקות לפירוק אנזימטי.
    אזהרה: פרוטוקול זה כולל שימוש בתגובות מסוכנות, כולל ליפופוליסכרידים (LPS), כלורופורם, אתנול ותגובת טריזול. כל ההליכים הכוללים כימיקלים מסוכנים צריכים להתבצע עם מכסה אדים כימי מוסמך תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על עיניים). יש לטפל בחומרים ביולוגיים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית.
  3. הוסיפו מדיום K-SFM בתוספת 10% סרום בקר עוברי לסיום העיכול.
  4. העבר את תערובת התאים לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, צנטריפוגה (4°C, 500 × גרם, 5 דקות), והוציא את הסופרנטנט.
  5. כדור התא הושעה מחדש ב-K-SFM מלא ולאחר מכן הועבר לבקבוקי תרבית חדשים.

11. קביעת ריכוז הטיפול המרבי באמצעות בדיקת MTS

הערה: כל ריכוז תרופה נבדק עם 5 שכפולים טכניים.

  1. לעכל תאי RWPE-1 בשלב הצמיחה הלוגריתמי.
  2. מחזירים את התאים לתווך מלא של K-SFM, ואז קובעים את ריכוז התאים על ידי ספירה.
  3. כוון את תליית התא לצפיפות של 1 ×10 5 תאים/מ"ל עם מדיום K-SFM מלא.
  4. פזר את מתלה התא ללוח 96 בארות עם 100 מיקרוליטר לכל באר.
  5. צלחת 96 הבארות הונחה באינקובטור תרבית תאים לגידול.
  6. לאחר 24 שעות, לאחר שהתאים נדבקו במלואם, מדיום התרבית נשאף והושלך.
  7. החלף את התווך בתווך K-SFM שלם המכיל ריכוזים שונים של תמיסת EMP.
  8. החזר את הפלטה לאינקובטור תרביות התאים לעוד 24 שעות של דגירה.
  9. שואף את המדיום, ואז שטוף את התאים פעמיים עם PBS.
  10. הוסיפו 100 מיקרוליטר מדיום K-SFM שלם לכל באר, ואז דגרו את הפלטה באינקובטור תרבית התאים למשך עוד 4 שעות.
  11. יש לשחרר 10 מיקרוליטר של תמיסת MTS לכל באר, ולקבוע את ה-OD ב-490 ננומטר לאחר דגירה של שעה.
  12. באמצעות קבוצת הביקורת הריקה (תאים שגודלו בתווך מלא ללא גירוי LPS או טיפול תרופתי) כקו בסיס, חושב התרבות התאים תחת כל ריכוז טיפול.
    הערה: הריכוז הגבוה ביותר שאינו מראה השפעה משמעותית על התרבות התאים הוגדר כטיפול במינון גבוה, אחריו חצי ריכוז כטיפול במינון בינוני, ורבע ריכוז כטיפול במינון נמוך.

12. התערבות תאית

  1. לעכל תאי RWPE-1 בשלב הצמיחה הלוגריתמי.
  2. התאים הושעו מחדש בתווך מלא של K-SFM, וריכוז התאים נקבע על ידי ספירת התאים.
  3. תליית התא הותאמה לצפיפות של 5 × 105 תאים/מ"ל באמצעות מדיום K-SFM מלא.
  4. מתלה התא הוזרע ללוח עם 6 בארות בקצב של 2 מ"ל לכל באר.
  5. הפלטה הונחה באינקובטור תרבית ודגרה במשך 12 שעות כדי לאפשר היצמדות תאים.
  6. התאים טופלו בריכוזי EMP נמוכים (150 מיקרוגרם/מ"ל), בינוניים (300 מיקרוגרם/מ"ל) וגבוהים (600 מיקרוגרם/מ"ל), בהתאמה.
  7. לאחר שעה נוספה תמיסת LPS של 10 מיקרוגרם/מ"ל לתווך התרבית.
  8. לאחר 24 שעות טיפול, נאסף הסופרנטנט ל-ELISA, והתאים נאספו לניתוח RT-PCR.
    הערה: LPS נבחר לעורר תגובה דלקתית בשל יכולתו המבוססת להפעיל מסלולי איתות פרו-דלקתיים בתאי אפיתל הערמונית; הריכוז (10 מיקרוגרם/מ"ל) נבחר בהתבסס על מחקרים קודמים שהראו השראה עמידה לציטוקינים.

13. בידוד RNA כולל

הערה: כדי למנוע התדרדרות RNA, נלבשו כפפות ומסכות לאורך כל תהליך הניסוי, והשתמשו בקצות פיפטות וצינורות צנטריפוגה ללא RNase.

  1. לאחר ההתערבות, שטוף את התאים פעמיים עם PBS.
  2. הוסיפו 1 מ"ל של תגובת טריזול לתאים וערבבו עם פיפטה שוב ושוב כדי להבטיח הומוגניזציה.
    אזהרה: ביצוע כל ההליכים עם קפוצ'ון אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
  3. העבר את הליזאט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ותן לו לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  4. לאחר מכן, מוסיפים 0.2 מ"ל כלורופורם ומעבירים את הדגימה בעוצמה.
  5. לאחר שנתנו לה לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, יש לצנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 10,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר הצנטריפוגה, העבר בזהירות את הפאזה המימית העליונה חסרת הצבע לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
  7. מכניסים כמות שווה של איזופרופנול מקורר מראש, ערבבו היטב, ואז דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  8. צנטריפוגה את הדגימה פעם נוספת (4 מעלות צלזיוס, 10,000 × גרם, 10 דקות), לאחר מכן זרקו את השלב הנוזלי ושמרו את המשקעים.
  9. שטפו את הפלט ב-1 מ"ל אתנול מקורר מראש ו-75% אתנול ותלו אותו בעדינות באמצעות פיפטינג.
  10. בצע צנטריפוגציה סופית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-7,500 × גרם למשך 10 דקות, ואז הסר את הסופרנטנט ומאפשר לכדור ה-RNA להתייבש באוויר בארון בטיחות ביולוגית.
  11. המיס את ה-RNA המטוהר ב-50 מיקרוליטר של מים מטופלים ב-DEPC.
  12. קבעו את ריכוז ה-RNA, יחס A260/A280 ויחס A260/A230 באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop להערכת טוהר ה-RNA ולהבטיח זיהום מינימלי של חלבונים וממסים לפני ניתוחים במורד הזרם.

14. RT-PCR

  1. השתמש ב-1 מיקרוגרם RNA כולל להכנת מערכת תגובת שעתוק הפוך של 20 מיקרוליטר.
  2. דגרו את מערכת התגובה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, לאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז מקררים ל-4 מעלות צלזיוס.
  3. מדלל פי 10 את ה-cDNA המתקבל באמצעות מים מזוקקים.
  4. הכינו מערכת תגובה PCR בנפח 20 מיקרוליטר באמצעות cDNA מדולל.
  5. תכנתו את המחזור התרמי וקבע אחיזה ראשונית על 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס ל-15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס ל-60 שניות.
  6. לבצע ניתוח עקומת התכה ולרשום את ערכי ה-CT לכל הגנים היעד והגנים הייחוס לאחר סיום הניתוח.
  7. השתמשו בשיטת 2(-ΔΔCT) כדי לקבוע את רמות הביטוי המנורמל של הגנים היעדים.

15. מבחן ELISA

הערה: שלפו את ערכת ELISA מהאחסון והשאירו לה להתאזן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש.

  1. הכינו את התמיסה הסטנדרטית לפי הוראות היצרן, ובצעו דילול מתאים לסטנדרטים, נוגדנים ביוטינילטים, קונוגטים של אנזימים ובופרים של שטיפה.
  2. צנטריפוגה את הסופרנטנט של תרבית התאים שנאספה (4 מעלות צלזיוס, 10,000 × גרם, 10 דקות) ואספו את הסופרנאנט.
  3. העבר 100 מיקרוליטר מדילול סטנדרטי ודגימות בדיקה לבארות מצופות מראש.
  4. אטום את הבארות עם רצועת דבק ודוגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  5. להשליך את הנוזל מהבארות ולשטוף את הפלטה באמצעות שטיפת לוחות אוטומטית.
    הערה: הגדר את פרמטרי השטיפה האוטומטית ל: 350 מיקרוליטר בופר שטיפה לבאר, זמן השריה של 15 שניות בין הזרקה לשאיבה, 5 מחזורים מלאים.
  6. הזרים 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ביוטינילאטית לכל באר. יש לתת לדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  7. זרוק את התמיסה ושוטף את הצלחת כפי שמתואר ב-15.5.
  8. פיפט 100 מיקרוליטר של תמיסת אנזים קונג'וגט עובדת לכל באר, ואז דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  9. זרוק את התמיסה ושוטף את הצלחת כפי שמתואר ב-15.5.
  10. לכל באר, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של מצע כרומוגני. שמור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות תוך הגנה מפני אור.
  11. פיפט 100 מיקרולטר של תמיסת עצירה לכל באר, ואז ערבב בעדינות.
  12. למדוד מיד את הצפיפות האופטית (OD) ב-450 ננומטר.
  13. הקמת עקומה סטנדרטית על ידי הצגת ערכי OD ממוצעים מול הריכוזים הסטנדרטיים באמצעות תוכנת Curve Expert.
  14. קבעו את ריכוז כל דגימה באמצעות אינטרפולציה מהעקומה הסטנדרטית באמצעות ערך ה-OD שלה.

16. ניתוח סטטיסטי

  1. הפעלת תוכנת SPSS (גרסה 20.0).
  2. ייבא את מערך הנתונים לסטטיסטיקות SPSS והגדר משתנים בצורה נכונה. השתמש בניתוח > סטטיסטיקה תיאורית> חקור כדי לחשב את הממוצע וסטיית התקן (SD).
  3. השתמש ב-Analyze > Compare Means > ANOVA חד-כיווני להשוואות בין קבוצות מרובות.
  4. קבל ערכי p ישירות מטבלאות הפלט של הבדיקה ודווח עליהם בהתאם.
  5. הצג את כל התוצאות כממוצע ± SD ושקול הבדלים מובהקים סטטיסטית כאשר p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי תרכובות פעילות וחיזוי מטרות

תוצאות אלו מדגימות את יעילות הפרמקולוגיה הרשתית המשולבת שלנו ושל גישת ה-in vitro שלנו בזיהוי ואימות מטרות הטיפול של EMP בדלקת ערמונית. חיפוש במאגר הנתונים של TCMSP זיהה 46 רכיבים ביואקטיביים מהצמחים המרכיבים את EMP, המתאימים ל-178 יעדים פוטנציאליים. ממאגר Genecards נרכשו 13,960 מטרות הקשורות לדלקת ערמונית. 162 המטרות המשותפות לשתי הקבוצות הוגדרו כמטרות ל-EMP בטיפול בדלקת ערמונית. בהמשך, נבנתה והוצגה ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משלב פרמקולוגיה רשת עם אימות ניסיוני כדי לספק מסגרת שיטתית לחקר מנגנוני טיפול רב-רכיבים. צעדים קריטיים כוללים סינון מדויק של תרכובות פעילות באמצעות ספים מוגדרים (OB ≥ 30%, DL ≥ 0.18), בניית רשת אמינה, ובחירה מתאימה של מודלים ניסיוניים לאימות מדויק. בחירת פרמטרים קפדנית בניתוחי ביואינפורמטיקה ושליטה קפדנית על תנאי הניסוי חיוניים להבטחת שחזוריות.

דלקת הערמונית היא הפרעה אורולוגית מאתגרת לניהול קליני בשל אטיולוגיה לא ברורה, תגובה לקויה לטיפולים קונבנצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים בעבודה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט הנוער של בית החולים לידידות סין-יפן (מס' 2020-1-QN-8), קרן המחקר המדעי של בית החולים מרכז התעופה (מס' YN202530).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת IL-6 ELISA אנושית4אביוCHE0009
אנושי TNF-α אליסה קיט4אביוCHE0019
תוספים ל-K-SFMפרוסלCM-0200
ליפופוליסכרידיםסולרביולוגיהL8880
MTSפרומגהG1111
מערכת תמלול הפוךפרומגהA3500
RWPE-1פרוסלCL-0200RRID:CVCL_EQ24
מדיום שלם של תא RWPE-1פרוסלCM-0200
SYBR Green Realtime PCR Master MixטויובוQPK-201
ריאגנט טריזולתרמו פישר סיינטיפיק (Invitrogen)15596026
טריפסין-אדטהגיבקו (תרמו פישר)25200072

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hua, L., et al. Prostatitis and male infertility. Aging Male. 28 (1), 2494550(2025).
  2. Ye, Y., et al. Thermosensitive hydrogel with emodin-loaded triple-targeted nanoparticles for a rectal drug delivery system in the treatment of chronic non-bacterial prostatitis. J Nanobiotechnol. 22 (1), 33(2024).
  3. Ma, X., et al. Study progress of etiologic mechanisms of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. Int Immunopharmacol. 148, 114128(2025).
  4. Franco, J. V. A., et al. Pharmacological interventions for treating chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a Cochrane systematic review. BJU Int. 125 (4), 490-496 (2020).
  5. Kwan, A. C. F., Beahm, N. P. Fosfomycin for bacterial prostatitis: a review. Int J Antimicrob Agents. 56 (4), 106106(2020).
  6. Magri, V., et al. Multidisciplinary approach to prostatitis. Arch Ital Urol Androl. 90 (4), 227-248 (2019).
  7. Pena, V. N., et al. Diagnostic and management strategies for patients with chronic prostatitis and chronic pelvic pain syndrome. Drugs Aging. 38 (10), 845-886 (2021).
  8. Sun, Y., et al. Efficacy of acupuncture for chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a randomized trial. Ann Intern Med. 174 (10), 1357-1366 (2021).
  9. Xue, Y., Duan, Y., Gong, X., Zheng, W., Li, Y. Traditional Chinese medicine on treating chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 98 (26), e16136(2019).
  10. Zhang, K., et al. Comparative analysis of efficacy of different combination therapies of α-receptor blockers and traditional Chinese medicine external therapy in the treatment of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: Bayesian network meta-analysis. PLoS One. 18 (4), e0280821(2023).
  11. Zheng, X., et al. Efficacy of acupuncture combined with traditional Chinese medicine on chronic prostatitis: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 100 (46), e27678(2021).
  12. Wu, Z., et al. Traditional Chinese herbal medicine retention enema combined with perineal massage (THREM): a promising therapeutic strategy for refractory chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS). Transl Androl Urol. 13 (5), 759-768 (2024).
  13. Li, Z., et al. Chinese herbal formula Ermiao powder regulates cholinergic anti-inflammatory pathway in rats with rheumatoid arthritis. Chin J Integr Med. 26 (12), 905-912 (2020).
  14. Wu, J., et al. An integrative pharmacology model for decoding the underlying therapeutic mechanisms of Ermiao powder for rheumatoid arthritis. Front Pharmacol. 13, 801350(2022).
  15. Xia, Z., Li, Q., Tang, Z. Network pharmacology, molecular docking, and experimental pharmacology explored Ermiao wan protected against periodontitis via the PI3K/AKT and NF-κB/MAPK signal pathways. J Ethnopharmacol. 303, 115900(2023).
  16. Jin, Q., et al. Network and experimental pharmacology to decode the action of Wendan decoction against generalized anxiety disorder. Drug Des Devel Ther. 16, 3297-3314 (2022).
  17. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  18. UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D609-D617 (2025).
  19. Stelzer, G., et al. The GeneCards suite: from gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1.30.1-1.30.33 (2016).
  20. Yu, X. B., et al. Chondroprotective effects of Gubitong recipe via inhibiting excessive mitophagy of chondrocytes. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 8922021(2022).
  21. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  22. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Shoskes, D. A., Nickel, J. C. Quercetin for chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. Urol Clin North Am. 38 (3), 279-284 (2011).
  25. Meng, L. Q., et al. Quercetin protects against chronic prostatitis in rat model through NF-κB and MAPK signaling pathways. Prostate. 78 (11), 790-800 (2018).
  26. Tian, Y. Q., et al. Berberine hydrochloride alleviates chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome by modifying gut microbiome signaling. Asian J Androl. 26 (5), 500-509 (2024).
  27. Alomari, G., Al-Trad, B., Al-Najjar, A., Haija, Y. A. Stigmasterol as a potential phytotherapeutic agent for benign prostatic hyperplasia: modulation of inflammation, oxidative stress, and apoptosis. Mol Biol Rep. 52 (1), 740(2025).
  28. D'Arcy, Q., et al. Beta-sitosterol alters collagen distribution in prostate fibroblasts. J Diet Suppl. 21 (3), 313-326 (2024).
  29. Otasek, D., et al. Cytoscape automation: empowering workflow-based network analysis. Genome Biol. 20 (1), 185(2019).
  30. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2023: protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D638-D646 (2023).
  31. Majeed, A., Mukhtar, S. Protein-protein interaction network exploration using Cytoscape. Methods Mol Biol. 2690, 419-427 (2023).
  32. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  33. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  34. Fan, S., et al. Polygonum capitatum combined with ciprofloxacin ameliorated chronic bacterial prostatitis by inhibiting NF-κB/IL-6/JAK2/STAT3 pathway. J Ethnopharmacol. 344, 119539(2025).
  35. Vickman, R. E., et al. TNF is a potential therapeutic target to suppress prostatic inflammation and hyperplasia in autoimmune disease. Nat Commun. 13 (1), 2133(2022).
  36. Liu, X., et al. NLRP3-mediated IL-1β in regulating the imbalance between Th17 and Treg in experimental autoimmune prostatitis. Sci Rep. 14 (1), 18829(2024).
  37. Liu, H., et al. IL-1β-primed mesenchymal stromal cells exert enhanced therapeutic effects to alleviate chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome through systemic immunity. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 514(2021).
  38. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5233462(2021).
  39. Zhang, Z., et al. Isoliensinine suppresses chondrocytes pyroptosis against osteoarthritis via the MAPK/NF-κB signaling pathway. Int Immunopharmacol. 143 (3), 113589(2024).
  40. Guo, Q., et al. NF-κB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 53(2024).
  41. Oeckinghaus, A., Ghosh, S. The NF-kappaB family of transcription factors and its regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (4), a000034(2009).
  42. Ou, Q., et al. Apoptosis releases hydrogen sulfide to inhibit Th17 cell differentiation. Cell Metab. 36 (1), 78-89.e5 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

KEGGPI3K AKTMAPK

מאמרים קשורים