ניתוח מולטי-אומיקס אינטגרטיבי של בוטי חואטן טאנג במחלת ריאות חסימתית כרונית

סיכום

פרופיל מולטי-אומיקס של Buti Huatan Tang (BTHTT) במחלות ריאות חסימתיות כרוניות חושף את הפוטנציאל שלו לווסת את ציר המטבוליזם של הורמון בלוטת התריס IL-1R2/IL-1β. עבודה זו מספקת מסגרת לאימות מכני נוסף של הרכיבים הביואקטיביים של BTHTT, ומבססת בסיס למחקרים עתידיים של התערבות סיבתית הנדרשים לאישור ציר זה.

תקציר

מחקר זה השתמש במסגרת מולטי-אומיקס וביולוגיה חישובית כדי לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של נוסחת הרפואה הסינית המסורתית (TCM) בוטי חואטן טאנג (BTHTT) נגד מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). שיפורים פיזיולוגיים משמעותיים נצפו במודל חולדה בעקבות התערבות BTHTT. ניתוח היסטולוגי הראה היפוך של נזק פתולוגי ריאתי, בעוד שבדיקות ביוכימיות וטרנסקריפטומיקה אישרו את הנורמליזציה של רמות IL-1β ו-IL-1R2 . בנוסף, פרופיל מטבולי גילה כי BTHTT תיקן הפרעות ברמות הורמון בלוטת התריס T3 ו-T4. נצפתה מתאם שלילי בין ציר IL-1β/IL-1R2 לבין הורמוני בלוטת התריס הללו, מה שמעיד כי ויסותם קשור להשפעה הטיפולית של הנוסחה. מעבר למדידות ישירות, אלגוריתמים של למידת מכונה זיהו עשרה גנים חתימתיים של COPD ממאגרי מידע קליניים. ניתוח העשרת מסלולים מצביע על כך ש-BTHTT עשוי לפעול דרך אינטראקציות בין ציטוקין-ציטוקין-קולטן ומסלולי סינתזת הורמוני בלוטת התריס. יתרה מזאת, בעוד שזוהו 283 רכיבים ב-vivo, תרכובות כמו טנשינון IIA וקריפטוטנשינון נחשבות כיום לחומרים פעילים מועמדים. תפקידם כמניעים ראשיים נתמך על ידי מודל שבו הם נקשרים באופן יציב ל-IL-1R2; הסקה זו מבוססת על סימולציות עגינה מולקולרית ודינמיקה מולקולרית (MD) ולא על בידוד ניסיוני ישיר. בסך הכול, הנתונים תומכים במודל שבו BTHTT מפעיל אפקט רב-מטרתי על COPD על ידי ויסות דלקת והומאוסטזיס מטבולי. גישה משולבת זו מספקת בסיס מדעי משוכלל ליישום קליני של BTHTT ומדגישה מסלולים ספציפיים לאימות ניסויי עתידי.

מבוא

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אחת ממחלות הנשימה הנפוצות ביותר בפרקטיקה הקלינית, הפכה לסיבת המוות השלישית בשכיחתה בעולם בשל שיעור הנכות הגבוה מאוד וההחמרות החריפות החוזרות^1. COPD היה גורם משמעותי שהוביל לאובדן כושר עבודה באוכלוסייה ולעלייה חדה בעלויות הטיפול במשפחה, כאשר הפסדים חברתיים וכלכליים עולים בהרבה על אלו של רוב המחלות הכרוניות². ביוזמת "סין הבריאה 2030", COPD הוזכרה כמחלה מרכזית למניעה ולטיפול. עקב הבנה לא מלאה של המנגנונים שמאחורי COPD, השימוש המשולב במרחילי סימפונות וקורטיקוסטרואידים נותר הטיפול העיקרי. למרות שגישה זו סיפקה הקלה די ברורה בתסמינים, היא אינה יכולה למנוע את הירידה ההדרגתית בתפקוד הריאות. יתרה מזאת, השימוש ארוך הטווח בקורטיקוסטרואידים מעלה בהכרח את שכיחות התגובות הלוואי, ומשפיע עוד יותר על יעילות התרופות לטווח הארוך ועל סבילות המטופלים³. מחקרים הראו שגם עם טיפול משולש, 28%–31% מהמטופלים עדיין חווים החמרה חריפה או החמרה בתסמינים. לכן, פיתוח תרופות יעילות ל-COPD נותר נושא מרכזי ומרכזי^{במחקר הנוכחי} 4.

כדי לענות על צרכים אלו, פותחו נוסחאות מסורתיות מסורתיות כמו Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin ו-Bu Fei Tang. ביניהם, BTHTT היה בולט במיוחד בהשפעותיו המשמעותיות בחיזוק הריאות, חיזוק האנרגיה ופתרון ליחה להקלה על שיעול 5,6,7,8. BTHTT שימש רבות בטיפול קליני ב-COPD, לא רק בשל יעילותו המרשימה ותופעות הלוואי המינימליות, אלא גם בשל הפוטנציאל שלו להפוך את הירידה ההדרגתית בתפקוד הריאות. הוא הבטיח מאוד בהקשרים קליניים וחברתיים והיה לו פוטנציאל ל"פיתוח משני" כתרופה מרכזית, עם ערך מדעי וכלכלי משמעותי ^9,10,11,12. עם זאת, בשל היעדר מחקר מדעי שיטתי וארוך טווח, מחקרים על BTHTT סבלו בדרך כלל מהבנה לא ברורה של הבסיס המרכיב שלו ומטרות הליבה הלא מזוהות. בעיקרון, הדבר נבע מליקויים משמעותיים במחקר על המנגנון המרכזי והבסיס האפשרי לחומר טיפולי של BTHTT.

בתגובה למאפיין זה, שילוב טכנולוגיות אומיקס מרובות כגון מטבולומיקה וטרנסקריפטומיקה, וכן שיטות כרייה מרובות אלגוריתמים, תוך התמקדות במתאמים העיקריים בין גנים מרכזיים אופייניים לבין מסלולי מטבוליקה מרכזיים במיקרו-סביבת הגוף, 13,14,15 אינם יכולים רק לחקור את מהות הטיפול אלא גם להעריך את היעילות הסינרגטית של הרכיבים הפעילים. מוקד במיוחד ציר הורמון בלוטת התריס, שכן מחקרים מתקדמים מראים כי תפקוד לקוי של בלוטת התריס הוא תחלואה נלוויה נפוצה ב-COPD, לעיתים קרובות קשורה לעלייה בדלקת מערכתית ולפגיעה בתפקוד שרירי הנשימה. מודולציה של ציר זה עשויה לייצג מסלול חדש לשיקום הומאוסטזיס מטבולי במחלת ריאות^16,17.

לסיכום, מחקר זה אימץ גישה משולשת המשלבת אינטגרציה של מולטי-אומיקס עם ביולוגיה חישובית, בהתבסס על ההנחה של תסמונת והתאמה בין נוסחאות. מצד אחד, היא השתמשה בטכניקות פרמקוכימיה של הסרום הסיני כדי לזהות את הרכיבים המועברים בדם של BTHTT בתנאים יעילים. מצד שני, תוך התמקדות בגנים המאפיינים המרכזיים של COPD, השתמשו במטבולומיקה מקיפה של רקמות כדי לגלות סמנים ביולוגיים של מחלות ממולקולות קטנות אנדוגניות ולבנות הערכה מדויקת של ההשפעות הכוללות של הנוסחה. במקביל, בשילוב עם כרייה רב-אלגוריתמית וניתוח זיהוי טרנסקריפטומי, הוא זיהה את הגנים המאפיינים המרכזיים המווסתים על ידי BTHTT בתנאים יעילים וביצע ניתוח קורלציה בין הגנים המאפיינים המרכזיים לבין מסלולי חילוף החומרים המרכזיים. בסיס החומר הטיפולי הפוטנציאלי נבדק באמצעות עגינה מולקולרית וניתוח דינמיקה מולקולרית.

בהתבסס על מסגרת המולטי-אומיקס שלנו והפרופיל הפרמקולוגי של BTHTT, מחקר זה מציע את התחזיות הבאות הניתנות לבדיקה. מודולציה אנטי-דלקתית: התערבות BTHTT מפחיתה משמעותית את סמני הדלקת הסיסטמית והריאתית, במיוחד על ידי נרמול ציר הביטוי של IL-1β/IL-1R2 כדי לצמצם נזק לרקמות. שיקום מטבולי: BTHTT ישנה אותות במסלול סינתזת הורמון בלוטת התריס, מה שיוביל לתיקון מדיד של רמות T3/T4 ולשיפור במצב המטבולי של מיקרו-סביבת הריאה. שיקום מטבולי: BTHTT ישנה אותות במסלול סינתזת הורמון בלוטת התריס, מה שיוביל לתיקון מדיד של רמות T3/T4 ולשיפור במצב המטבולי של מיקרו-סביבת הריאה.

פרוטוקול

הערה: הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

רכישת נתונים קליניים ועיבוד מוקדם

כדי לחקור את החתימות המולקולריות של COPD, נאספו מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים ממאגר Gene Expression Omnibus (GEO). נבחרו בסך הכל חמישה מערכי נתונים: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 ו-GSE222965. הנתונים הגולמיים וקבצי ההערות של הפלטפורמה הורדו למיפוי גלאי-לגנים. כאשר מספר גלאים כוונו לגן אחד, ערך הביטוי המרבי נשמר. מטריצות ביטוי הגנים שהתקבלו (שורות כגנים, עמודות כדגימות) אוחדו למאגר נתוני גילוי אחד. כדי להתחשב בהבדלים טכניים בין פלטפורמות מיקרוארי שונות וקבוצות מחקר, בוצעה תיקון אפקט אצווה באמצעות אלגוריתם ComBat מחבילת sva R. יעילות התיקון אומתה באמצעות גרפים של ניתוח רכיבים עיקריים (PCA). לאחר תיקון באצווה, מאגר הגילוי המאוחד שימש לניתוח דיפרנציאלי. גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) בין חולי COPD לביקורת בריאה זוהו באמצעות חבילת לימה. ספי המשמעות נקבעו ב-|logFC| ≥ 1 ו-p ≤ 0.05.

כדי לזהות את הגנים המאפיינים החזקים ביותר, שולבו שלושה אלגוריתמים עצמאיים של למידת מכונה. כדי להבטיח את אמינות המודלים ולמנוע דליפת נתונים, תהליך בחירת התכונות הוקנן בתוך לולאות האימות החוצה כאשר הדבר רלוונטי, ומערך הגילוי הופרד בקפדנות ממערכות האימות העצמאיות. מודל LASSO הוחל על ה-DEGs באמצעות חבילת glmnet. השתמשנו באימות צולב של 10 פעמים כדי לקבוע את פרמטר העונש האופטימלי. ערך פרמטר העונש האופטימלי התואם לשגיאת האימות הצולב המינימלית נבחר כסף לזיהוי גנים של תכונות מרכזיות. SVM שימש לדרג גנים לפי כוח ההבחנה שלהם. יושמה אסטרטגיית אימות צולב בת 10 פעמים לזיהוי נקודת השגיאה המינימלית של הכללה, ובכך לקבוע את המספר האופטימלי של גנים אופייניים. חבילת ה-randomForest שימשה לדירוג DEGs על פי Mean Reduce Accuracy ומדד Gini שלהם. גנים עם ציוני החשיבות הגבוהים ביותר נבחרו כמאפיינים הקשורים למחלה.

החיתוך בין התכונות שזוהו על ידי LASSO, SVM ו-randomForest נלקח כדי להגדיר את הגנים הסופיים של המאפיינים המרכזיים. ביצועי האבחון של גנים אלו הוערכו באמצעות ניתוח עקומת Receiver Operating Feature (ROC). השטח מתחת לעקומה (AUC) ורווחי האמון של 95% (CIs) נלווים חושבו באמצעות חבילת pROC. גן נחשב כבעל ערך אבחוני גבוה אם ה-AUC > 0.70. לבסוף, רמות הביטוי והדיוק האבחוני של גנים אלו אומתו עוד במערך אימות עצמאי כדי להבטיח הכללה של הממצאים.

באמצעות PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) ו-drugbank (https://go.drugbank.com/), הושגו בסך הכול 12 פרופילי תרופות ספציפיים, כגון LABAs, LAMAs, SABAs, SAMAs, פלוטיקאזון פרופיונאט, בודסוניד, בקלומטזון, פלוטיקאזון, סלמטרול, אומקלידניום, וילנטרול, תאופילין. המטרות שנאספו כויללו באמצעות מסד הנתונים Uniprot (https://www.uniprot.org/), שבו הוסרו גנים לא-אנושיים, ומטרות כפולות לא תקינות נמחקו כדי לקבל שמות גנים סטנדרטיים. על ידי הזנת מילות המפתח "מחלת ריאות חסימתית כרונית", "COPD" במאגרי GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) ו-DisGENET (https://www.disgenet.org/), הושגו מטרות הקשורות למחלות. כל היעדים משלושת מסדי הנתונים אוחדו לקובץ אקסל, גנים כפולים הוסרו, והנתונים כויללו באמצעות מסד הנתונים Uniprot לקבלת המידע הסופי של גן המטרה למחלה.

פיתוח מודלים של למידת מכונה

מסגרת למידת מכונה רב-אלגוריתמית נבנתה באמצעות שימוש רציף בחבילות R glmnet, e1071 ו-randomForest. באופן ספציפי, בוצעה רגרסיית LASSO להפחתת ממדיות מבוססת עונש, ניתוח מכונת וקטור תמיכה (SVM) שימש להערכת שגיאות אימות על בסיס קיבוץ מדגם, ויער אקראי שימש לסינון תכונות לפי ציוני חשיבות. תהליך זה הניב ויזואליזציות אבחנתיות מתאימות, כולל עקומות אימות צולבות וגרפים של בועות חשיבות הגנים. לאחר בניית המודל, בוצע ניתוח דיאגרמת ון על מערכי הגנים שזוהו על ידי אלגוריתמים מרובים אלו כדי לחלץ את הגנים החופפים של תכונות "חיתוך", ובכך לשפר את אמינות הסמנים הביולוגיים הפוטנציאליים. מטריצת הביטוי של גני החיתוך הללו הופקה לאחר מכן כדי להמחיש הבדלי ביטוי בין קבוצות באמצעות גרפים של כינור. לבסוף, עקומות ROC נוצרו דרך לולאות איטרטיביות לכל גן לחישוב ה-Area Under the Curve (AUC), תוך אימות ערך האבחון שלהן כסמנים ביולוגיים מועמדים.

הכנסת מודל בעלי חיים

הפרוטוקול הניסויי אושר על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת גויז'ואו הרפואית (2303411) ופעל לפי הנחיות ARRIVE ותקנות רווחת בעלי החיים. סה"כ 72 זכרים של חולדות ספרג-דולי (SD) בדרגת SPF (230 ± 20 גרם). לאחר שבוע של מגורים אדפטיביים בתנאים סטנדרטיים (25 ± 1 מעלות צלזיוס, 50 ± 5% לחות, מחזור אור-חושך של 12 שעות), חולקו העכברים באקראי לקבוצת הביקורת (קבוצת C) (n = 24) וקבוצת הדגם (קבוצת M) (n = 48).

קבוצת M עברה מודלים דו-גורמיים: חשיפה לסירוגין לעשן סיגריות (9 שבועות, 6 ימים בשבוע, 3 סיגריות מחקריות ביום מחולקות ל-2 מפגשים, 30 דקות במפגש) והזרקת LPS תוך-קנה הנשימה (200 מיקרוגרם להזרקה, פעם בשבועיים)^18,19. קבוצת C קיבלה נפח שווה של תמלח רגיל. לאחר מידול מוצלח, הקבוצות חולקו באקראי לקבוצת M (n = 12), קבוצת BTHTT במינון גבוה (קבוצת H) (גבוה, 1× מינון קליני, n = 12), וקבוצת BTHTT במינון נמוך (קבוצת L) (נמוך, 1/2× מינון קליני, n = 12), עם התערבות מתמשכת של הערכה למשך שבועיים. קבוצות C ו-M קיבלו מים מזוקקים בסינכרונית.

משקל הגוף ופרמטרי הפעילות הספונטנית נרשמו מדי שבוע. בסיום המודלים והטיפול, נאספו רקמת ריאה, סרום, ונוזל שטיפה בסרום ובונכואלוואולרי (BALF). רמות הסמנים הדלקתיים (כגון TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN ו-MCP-1) נמדדו באמצעות ELISA לפי הוראות הערכה. בוצעו גם ניתוחי פתולוגיה רקמתית ומולטי-אומיקס.

מתן טיפול

בוטי חואטן טאנג (BTHTT) מורכב מתשעה עשבי מרפא סיניים מסורתיים: Astragalus membranaceus (פיש.) בגה. (Astragali Radix, 15 גרם), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix, 15 גרם), Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex, 15 גרם), Angelica sinensis (אוליב.) דילס (Angelicae Sinensis Radix, 10 גרם), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15 גרם), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 גרם), Raphanus sativus L. (זרע Raphani, 10 גרם), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 גרם), ו-Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 גרם). החומרים הצמחיים הושרתו במים פי 10 ממשקלם המשולב למשך 30 דקות ולאחר מכן הושרו במשך שעה. הסוכר סינן, והסינון נאסף וחולק לשלוש מנות שוות למתן דרך הפה.

בהתבסס על בטיחות ויעילות קלינית, המינון הסטנדרטי של BTHTT למבוגרים היה 1.57 גרם ק"^{ג-1∙ביום לפי} הנחיות התרופות הקליניות. בהתחשב בפקטור המרת המינון בעכברים, שהצביע על כך שהמינון הסטנדרטי של התרופה לעכברים הוא 6.3× המינון הסטנדרטי האנושי, קבוצת ה-H המקבילה לחולדות נקבעה על 9.9 g∙kg-1∙day-1, וקבוצת L נקבעה על חצי מנה זו (4.95 g∙^kg-1∙^day-1). בהינתן שנפח המרוכז הסופי של BTHTT היה 50 מ"ל, הנפח הניתן לקבוצת H בעכברים היה כ-1.6 מ"ל, ובקבוצת L כ-0.8 מ"ל. התרופה ניתנה פעם ביום באמצעות שיפוץ אוראלי.

איסוף רקמות ו-BALF

בנקודות הסיום של הניסוי (שבוע 9 ושבוע 11), חולדות הורדמו באמצעות הזרקה תוך-פריטונאלית של 5% נתרן פנטוברביטל (1 מ"ל/100 גרם). נאסף דם מווריד הפורטל, הושאר לעמוד 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז צונטריפוגה ב-13,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט אוחסן בטמפרטורה של -80°C. רקמות הריאות הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי ואוחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C. BALF נאסף בשלוש שטיפות רצופות עם PBS קר.

ניתוח טרנסקריפטומיקה

סך ה-RNA הוצא מרקמת ריאה ונבקר באיכות באמצעות (A₂₆₀/_{A 280} > 1.8) (RIN ≥ 7.0. ספריות ריצוף RNA נבנו: mRNA הועשר באוליגו(dT), פורק, ושימש לסינתזת cDNA דו-גדילי, אשר קושר לאחר מכן לאוליגונוקלאוטידים מתאמים והוגבר על ידי PCR. הספריות נמדדו ונבדקו איכות לפני הרצף. כולל בדיקת התפלגות תוכן, ניתוח התפלגות צפיפות FPKM של כל מדגם, וניתוח הערכת איכות כולל של RNA-seq²⁰.

נתוני טרנסקריפטומיקה גולמיים שנוצרו על ידי פלטפורמת הריצוף עובדו באמצעות סקריפטים של פרל להסרת רצפי מתאם וקריאות באיכות נמוכה (קריאות עם Q ≤ 25 בסיסים המהווים > 60% או שיעור N > 5%). קריאות נקיות התקבלו לאחר תהליך הסינון הזה. הקריאות הנקיות יושרו לגנום הייחוס באמצעות HISAT2, ורמות ביטוי הגנים נמדדו לחישוב ערכי FPKM. בוצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי (עם קריטריוני סינון |log2FC| > 1 ו-p-adj < 0.05). הערות פקטורי שעתוק התבססו על מאגרי מידע של Animal TFDB או Pfam/DBD, תוך התאמת מזהי גנים ומידע בתחום החלבונים²¹.

שימשה אסטרטגיית מיפוי גנים אורתולוגית כדי להבטיח קפדנות מתודולוגית לאימות בין מינים. אסטרטגיה זו כללה שליפת אורתולוגים בעכברים עבור גנים אנושיים מרכזיים (למשל, SRPX2, IL-1R2, TFF3) באמצעות מאגרי המידע NCBI HomoloGene ו-Ensembl BioMart. הבחירה הוגבלה לזוגות גנים שהראו קשר מיפוי ברור "אחד לאחד" וזהות רצף חלבון גבוה. במקרים בהם היו מועמדים מרובים, ניתנה עדיפות לזוגות אורתולוגיים שאושרו על ידי ה-HGNC. כדי להבטיח דיוק זיהוי גבוה, תוכננו פריימרים ספציפיים ל-RT-qPCR בהתבסס על רצפי mRNA של האורתולוגים של העכברים שזוהו. קריטריוני האימות הוגדרו על ידי עקביות בכיוון הביטוי ואימות פונקציונלי. עקביות בכיוון הביטוי: במודל COPD של עכברים שנגרם מעשן, RT-qPCR הראה כי מגמות הביטוי של גני המטרה ברקמת הריאות של העכברושים היו עקביות לחלוטין עם אלו שנצפו במאגרי נתונים קליניים GEO אנושיים. גנים שהפגינו את אותה קוטביות שינוי בין מינים נחשבו כבעלי שימור כסמנים ביולוגיים של מחלה. אימות פתולוגי: לאחר עקביות הביטוי, בוצע ניתוח קורלציה כדי לאמת את מעורבות גנים אלו באבולוציה הפתולוגית של COPD.

זרימת עבודה של מטבולומיקס

רקמת הריאה (20–50 מ"ג) עברה הומוגניזציה במים מתנול-אצטוניטריל מקוררים מראש (2:2:1, v/v) והוסוניקה באמבט קרח. ההומוגנט עבר צנטריפוגה של 13,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט היה מרוכז בוואקום, מומס מחדש במי אצטוניטריל (1:1, v/v), וסונן דרך ממברנה של 0.22 מיקרון לניתוח LC-MS²².

הפרדה כרומטוגרפית הושגה באמצעות עמודת UPLC מבוססת אמיד (1.7 מיקרון, 2.1 מ"מ × 100 מ"מ). טמפרטורת העמודה נשמרה על 25 מעלות צלזיוס. השלב הנייד כלל (A) מים המכילים 25 mM אמוניום אצטט ו-25 mM אמוניה, ו-(B) אצטוניטריל. קצב הזרימה נקבע על 0.5 מ"ל/דקה, ונפח ההזרקה היה 2 מיקרוליטר. תוכנית שחרור הגרדיאנט הייתה: 0–0.5 דקה, 95% B; 0.5–7 דקות, ירידה ליניארית של B מ-95% ל-65%; 7–8 דקות, ירידה ליניארית של B מ-65% ל-40%; 8–9 דקות, B נשאר על 40%; 9–9.1 דקות, עלייה ליניארית של B מ-40% ל-95%; 9.1–12 דקות, B שמרה על 95%. במהלך כל הניתוח, הדגימות נשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באוטוסמפלר. כדי להבטיח יציבות המערכת ואמינות נתוני הניסוי, הדגימות נותחו ברצף אקראי, כאשר דגימות בקרת איכות (QC) שולבו בתור. ניתוח ספקטרומטריית מסה בוצע באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC) המחוברת לספקטרומטר מסה. הדגימות יוננו באמצעות יינון אלקטרוספריי (ESI) הן במצב יונים חיוביים והן שליליים. הגדרות מקור ESI ו-MS היו כדלקמן: גז הנבולייזר (גז 1) הוגדר ל-50, גז עזר (גז 2) ל-2, טמפרטורת מקור היונים ל-350 מעלות צלזיוס, ומתח ריסוס (ISVF) ל-3,500 וולט במצב יון חיובי ו-2,800 וולט במצב יון שלילי. טווח המסה של MS1 נקבע בין 70 ל-1,200 ד"א, עם רזולוציה של 60,000 וזמן צבירת סריקה של 100 מילישניות. ב-MS2 נעשה שימוש ברכישת נתונים תלויה (DDA) עם אנרגיית התנגשות מדורגת. טווח המסה של MS2 נקבע גם הוא בין 70 ל-1,200 ד"א, עם רזולוציה של 60,000 וזמן צבירת סריקה של 100 מילישניות. זמן ההחרגה הדינמי נקבע ל-4 שניות.

נתוני מטבולומיקה גולמיים הומרו לפורמט mzXML ואז עובדו ליישור שיא, תיקון זמן שמירה וחילוץ שטח שיא. תהליך הקדם-עיבוד של הנתונים כלל את השלבים הבאים: ראשית, פסגות יונים עם שיעור חסר >-50% הוסרו. שנית, הערכים החסרים הנותרים הועברו באמצעות אלגוריתם KNN. שלישית, תכונות מטבוליות עם סטיית תקן יחסית (RSD) >50% נזנחו. איכות נתוני הניסוי הוערכה באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) ואשכול דגימות בקרת איכות. ניתוחים מאוחרים יותר כללו סטטיסטיקה חד-משתנית (למשל, מבחני t), סטטיסטיקה רב-משתנית (PLS-DA), סקר מטבוליטים דיפרנציאלי (VIP > 1 ו-p < 0.05), וניתוח העשרת מסלולי KEGG (מבחן היפרגיאומטרי)^23,24.

הקמת שיטות אנליטיות לרכיבי in vivo ו-in vitro

הכנת דגימות BTHTT לבדיקות במבחנה : BTHTT הופק בתחתול במים (2 פעמים 30 דקות), ריכוז ל-1.1–1.2 גרם למ"ל, ואז יובש בהקפאה. לפני הניתוח, 600 מיקרוליטר של תמיסת האבקה המיובשת בהקפאה עורבבו עם 400 מיקרוליטר מתנול, הומסו מחדש ב-40% מתנול, וצונטרו לאיסוף הסופרנאנט.

הכנת דגימות BTHTT לבדיקות in vivo : הסרום עבר דה-חלבון על ידי ערבוב עם מתנול (1:1) והשקיעה בטמפרטורה של −20°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצנטריפוגה במשך 20 דקות. הסופרנטנט יובש בוואקום ומומס מחדש ב-40% מתנול לקבלת הדגימה הסופית. להכנת דגימות סרום ריק + BTHTT, הוספקה כמות מתאימה של סרום ריק עם סופרנאנט BTHTT במבחנה , והשלבים הנותרים בוצעו כפי שתואר.

הדגימות הופרדו באמצעות מערכת UHPLC המצוידת בעמודת UPLC בפאזה הפוכה (2.1 מ"מ × 100 מ"מ, 1.8 מיקרון). טמפרטורת העמודה נשמרה על 35 מעלות צלזיוס, וקצב הזרימה נקבע ל-0.3 מ"ל לדקה. השלב הנייד כלל (A) חומצה פורמית של 0.1% במים ו-(B) חומצה פורמית של 0.1% באצטוניטריל. בוצעה הסרת גרדיאנט כפי שמוצג בטבלה 1.

ספקטרומטר מסה שימש לרכישת ספקטרום MS1 ו-MS2. ספקטרומטר המסה היה מחובר למערכת UHPLC ופעל הן במצב ESI חיובי והן במצב שלילי. פרמטרי ESI היו כדלקמן: מתח ריסוס 3,800 וולט (ESI+) / 3500 וולט (ESI-), לחץ גז מעטפת 45 ארב, לחץ גז עזר 20 ארב, טמפרטורת צינור העברת יונים 320 מעלות צלזיוס, וטמפרטורת מאייד 350 מעלות צלזיוס. מצב הזיהוי הוגדר לסריקה/נתונים מלאה MS2 (Full-MS/dd-MS2) עם רזולוציות של 60,000 ל-MS1 ו-15,000 עבור MS2. עשרת היונים העליונים של MS1 נבחרו לקריסת MS/MS עם אנרגיות התנגשות מנורמלות מדורגות של 20, 40 ו-60. טווח המסה של MS1 נקבע בין 90 ל-1,300 ד"א.

לניתוח in vivo , כולל דגימות קבוצה ריקה, דגימות קבוצה במינון, ודגימות קבוצה ריקה + BTHTT, הוזרק 6 מיקרוליטר מכל דגימה בדיוק. לניתוח מעבדה של BTHTT, הוזרק 2 מיקרוליטר מהדגימה. כל אצווה של דגימות קבוצתיות ריקות ועם מינון הוזרקה פעם אחת, בעוד שדגימות הקבוצה הריקה + דגימות BTHTT הוזרקו בשלוש עותקים, ודגימות BTHTT הוזרקו בכפילים כפולים.

נתונים בפורמט mzXML עובדו והתרכובות זוהו בהתבסס על מאגר נתוני ספקטרומטריית מסה מסחרי ברזולוציה גבוהה של TCM מקומי. הקריטריונים לזיהוי נקבעו כך: שגיאת מסה של <25 חלקים למיליון עבור MS1 וציון התאמה > 0.7 עבור MS2 (כאשר הציון שיקף את הדמיון בין יוני מקטעים, כאשר ≥0.7 הוא סף אמין)^25,26. הניתוח הסטטיסטי כלל ספירת תרכובות וסיווג (למשל, פלבנואידים, אלקלואידים), שבוצע בשילוב עם הערות ממאגר ספקטרומטריית המסה²⁷.

עגינה מולקולרית וסימולציה של MD

כדי לחקור מצבי קישור פוטנציאליים בין החלבונים האופייניים שזוהו לבין הליגנדים המתאימים להם, בוצעה עגינה מולקולרית בסיליקו . המבנים התלת-ממדיים של המולקולות הקטנות נשלפו ממאגר PubChem, והתצורות הגיאומטריות שלהן אופטימליות. מבני הגביש של חלבוני המטרה התקבלו מבנק הנתונים של חלבוני RCSB (PDB). באמצעות PyMOL, מולקולות מים והטרואטומים הוסרו, וחולקו ליגנדים מתגבשים יחד כדי להגדיר את קואורדינטות האתר הפעיל. נוספו אטומי מימן, ומטעני גסטייגר הוקצו באמצעות תוכנה. בוצעו סימולציות עגינה, שיצרו 15 קונפורמציות עצמאיות בכל ריצה. הקונפורמציה עם אנרגיית הקשירה הנמוכה ביותר נבחרה לניתוח נוסף. כדי לאפיין במדויק את האינטראקציות הלא-קוולנטיות, קומפלקסי הקולטן-ליגנד נותחו באמצעות פרופילר אינטראקציה חלבון-ליגנד (PLIP). הערה: חשוב להדגיש כי תוצאות העגינה הללו מספקות תמיכה מבנית לאינטראקציות מולקולריות פוטנציאליות ומשמשות בסיס לשיפור דינמי נוסף; עם זאת, הם אינם מהווים ראיה עצמאית ליעילות ביולוגית.

כדי להעריך את היציבות וההתפתחות הקונפורמציה של קומפלקסי החלבון-ליגנד החזויים בתנאים פיזיולוגיים רלוונטיים, בוצעו סימולציות דינמיקה מולקולרית באמצעות חבילת התוכנה GROMACS. קבצי טופולוגיה עבור החלבונים והליגנדים נוצרו בהתבסס על שדה הכוח GROMOS96 43a1. כל קומפלקס הוצב במרכז קופסה דודקהדרלית, תוך שמירה על מרחק מינימלי של 1.0 ננומטר מקצוות הקופסה, ונמס באמצעות מודל המים של SPC. כדי להבטיח נייטרליות חשמלית, נוספו יוני נתרן או כלוריד למערכת לפי הצורך. מזעור האנרגיה בוצע באמצעות אלגוריתם הירידה התלול ביותר עד שהכוח המקסימלי היה פחות מ-1,000.0 kJ∙^mol-1∙^nm-1. לאחר מכן המערכת התאזנה לשני שלבים: ראשית, מערכת NVT שימשה לחימום המערכת ל-300 K מעל 100 PS באמצעות תרמוסטט V-rescale; שנית, נעשה שימוש באנסמבל NPT לייצוב הלחץ ב-1 בר מעל 100 PS באמצעות ברוסטט Parrinello-Rahman. סימולציות ייצור בוצעו למשך כולל של 10 ננו-שניות עם צעד זמן של 2 fs. אינטראקציות אלקטרוסטטיות לטווח ארוך חושבו באמצעות שיטת Particle Mesh Ewald (PME), בעוד שאינטראקציות ואן דר ואלס קצרות טווח ואינטראקציות אלקטרוסטטיות נוהלו ברדיוס חיתוך של 1.2 ננומטר. כדי להבטיח את אמינות הסימולציות, בוצעו שלוש ריצות עצמאיות במידת האפשרות. היציבות של הקומפלקסים הוערכה כמותית על ידי חישוב סטיית שורש ממוצע ריבועי (RMSD) ותנודת שורש ממוצע ריבועי (RMSF) של אטומי שדרת החלבון ביחס למבנה ההתחלתי. השגת רמה בפרופיל RMSD שימשה כקריטריון ראשי לאיזון המערכת וליציבות מבנית.

ניתוח סטטיסטי כללי

בניסוי זה, בוצעו חישובי קבוצות באמצעות מבחני t או ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA).

תוצאות

חיזוי גנים מאפיינים מרכזיים ב-COPD

לאחר תיקון אפקט אצווה של נתונים קליניים ממספר פלטפורמות מיקרו-מערך (קובץ משלים 1–איור משלים S1), בוצע ניתוח ביטוי שונה. זוהו 34 גנים מועמדים (32 בוויסות מוגבר ו-2 בוויסות מופחת), כולל SRPX2, CLDN10 ו-TFF3 (איור 1A).

כדי לחדד את המועמדים הללו לחתימת חיזוי חזקה, נעשה שימוש בשלושה אלגוריתמים של למידת מכ...

דיון

הסינתזה והתחזוקה של רמות הורמון בלוטת התריס משמעותיות עבור חולי COPD והן חורגות הרבה מעבר לתפקוד אנדוקריני בלבד, ומשפיעות עמוקות על התקדמות המחלה, מצב תזונתי, תפקוד ריאתי ותחזית כללית ^31,32,33. במיוחד במהלך החרפות חריפות, חולי COPD הפגינו לעיתים מצב דמוי תת-פעילות של בלוטת משתמש המכונה "תסמונת T3 נמוך". דווח כי ירידה ברמות הורמוני בלוטת התריס הייתה קשורה באופן חיובי לחומרת COPD^...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אצטוניטריל (דרגת כרומטוגרפיה)	מרק, גרמניה	1499230-935
אנלייזר ביולוגי Agilent 4150	אג'ילנט טכנולוגיות, ארה"ב
אצטט אמוניום	SIGMA, גרמניה	SRE0035-20230321
אנג'ליקה סיננסיס (אוליב.) דילס (אנג'ליקה סיננסיס רדיקס),	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240807
Astragalus membranaceus (פיש.) בגה. (Astragali Radix),	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240601
כימאופיס		תוכנת שרטוט מבנה כימי ומידול מולקולרי
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex),	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240901
צנטריפוגת אפנדורף 5430 R	אפנדורף, גרמניה
סיגריות ניסיוניות	הרבין טאיהואה, סין	20230208
GraphPad Prism 8		תוכנות לניתוח סטטיסטי וגרפים
סיגריות הואנגשאן		ניסויים בסיגריות מחקריות לחשיפה לעשן
IL-1 ובטא; ערכת ELISA	ביוטכנולוגיה עם קשרי אנזימים בשנגחאי, סין	E-EL-R0012c-20230522
פלטפורמת ריצוף Illumina Novaseq 6000	אילומינה, ארה"ב
לפידיום אפטלום וילד. (Descurainiae Semen)	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240201
לפידיום סאטיבום L. (זרע רפאני)	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240301
ליפופוליסכריד (LPS)	פארמה שאנדונג חואינו, סין	20230315
מהוניה פורצ'וני (לינדל.) פדה (Folium Mahoniae)	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240301
מתנול (דרגת כרומטוגרפיה)	פישר, ארה"ב	DK745764
ספקטרופוטומטר ND-2000 Nanodrop	תרמו סיינטיפיק, ארה"ב
Perilla frutescens (L.) Britt. (פרילה פוליום)	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240510
פסאודוסטלריה הטרופילה (Miq.) פאקס (Pseudostellariae Radix),	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20250201
פלואורומטרי קיוביט 4.0	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב
ערכת בניית ספריית RNA	ABclonal, ארה"ב	RK20301-20230415
סמינה		תוכנת עגינה מולקולרית
סלביה מילטיוריזה בגה. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)	חברת התרופות Guizhou Shanhaitongjia, Ltd., סין	20240902
מקליט פעילות ספונטנית של בעלי חיים קטנים (KW-ZF)	נאנג'ינג קרלווין ביוטכנולוגיה, סין
נתרן פנטוברביטל	חברת רכש תגובות ניסיוניות בשנגחאי, סין	20230412
TNF-α ערכת ELISA	ביוטכנולוגיה עם קשרי אנזימים בשנגחאי, סין	E-EL-R2856c-20230522
מאגר MS ברפואה סינית מסורתית (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		מאגר ספקטרומטריית מסה מסחרי ברפואה סינית מסורתית
ריאגנט טריזול	מגן, סין	20230508
עמוד UPLC BEH Amide		טור אנליטי מבוסס אמיד של UHPLC
עמודת UPLC HSS T3		עמודת UHPLC אנליטית בשלב הפוך (סוג T3)
מערכת Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS	תרמו סיינטיפיק, ארה"ב
Vanquish UHPLC-Q-Exactive HF-X MS	תרמו סיינטיפיק, ארה"ב