הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור מהיר של SLFN14 ריבונוקלאז רקומביננטי וניתוח סטויכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה

961 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

20 בפברואר 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את ייצור ריבנוקלאז SLFN14 הרקומביננטי האנושי ואת ניתוחו הסטוכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה.

תקציר

ריבונוקלאזים הם קבוצה מיוחדת של חלבוני קישור RNA שמזרזים את חיתוך ה-RNA ותורמים לתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל ויסות גנים. עם זאת, המבנה, התפקוד והוויסות של רבים מהריבונוקלאזים האנושיים נותרו מאופיינים בצורה לקויה בשל האתגרים בייצור חלבונים רקומביננטיים. שיטה זו מתארת גישה יעילה לביטוי חולף, טיהור וניתוח סטוכיומטרי של ריבנוקלאז Schlafen 14 (SLFN14) האנושי. SLFN14 מתויג דגל רקומביננטי התבטא בתאי תלייה HEK293 ובודד באמצעות תהליך טיהור מהיר דו-שלבי הכולל כרומטוגרפיית אנטי-זיקה לדגל ואחריה כרומטוגרפיה של הדרה ברזולוציה נמוכה. פוטומטריית מסה, טכניקת מולקולה בודדת רגישה, גילתה שבתנאים פיזיולוגיים של מלח SLFN14 יוצר הומודימר יציב הקשור ל-RNA תאי, בעוד שמלח גבוה מקדם דיסוציאציה של RNA תוך שמירה על סידור ההומודימר. חלבון SLFN14 האנושי הרקומביננטי שנוצר מתאים למחקרים מבניים במורד הזרם ולבדיקות ביוכימיות איכותיות. גישה מהירה זו לבידוד חלבוני אדם רקומביננטיים ולאפיון דגימות רלוונטית באופן רחב לייצור ריבונוקלאזים ויונקים אחרים וחלבוני קישור RNA המיועדים לאפיון ביופיזיקלי וביוכימלי.

מבוא

שלאפן 14 (SLFN14)הוא ריבנוקלאז וגורם הגבלת מארח יונקים 1,2,3 שנחקר מספיק. חלבון SLFN14 האנושי שייך למשפחה בת שישה חברים של רגולטורים גנטיים של SLFN, הממלא תפקידים בחסינות, פעילות אנטי-ויראלית, רגישות לכימותרפיה ובהבדלות תאים 4,5,6,7,8. תובנה מכנית לגבי תפקידם של רגולטורים גנטיים של SLFN נותרה לא שלמה; עם זאת, רבים מהחברים מחזיקים בפעילות ריבונוקלאז החיונית לשליטה תרגומית 7,9. ריבונוקלאזים של SLFN מופעלים בהומודימריזציה של חלבון, ויוצרים שסע קושר RNA מורכב המיומן בפיצול הסובסטרט10,11. כדי להגן על תאים מפני פיצול RNA שגוי, רוב הריבונוקלאזים של SLFN קיימים בעיקר כמונומר וממתינים להפעלה על ידי אותות מולקולריים הספציפיים לכל בן משפחה 5,7,11,12.

ייצור רקומביננטי של SLFN14 אנושי אפשר מחקרים מולקולריים מקיפים של הריבונוקלאז שנחקר עד כה, וסיפק תובנות חדשות לגבי תפקודו ורגולציה 2,13,14. חלבון SLFN14 הרקומביננטי המטוהר האיץ את אפיון פעילות החיתוך התלויה במבנה, באמצעות בדיקות חיתוך RNA במבחנה 2,14. מחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו (cryoEM) של חלבון SLFN14 מטוהר חושפים גם סידור הומודימר SLFN14, שבו עומסי RNA דו-ערוצים לתוך סדק מרכזי 2,13,14. הרכבה מסדר גבוה של SLFN14 התאפיינה עוד יותר בפוטומטריית מסה, טכניקת חד-מולקולית למדידת מסה מולקולרית. באופן בלתי צפוי, טכניקה רגישה זו מראה ש-SLFN14 יוצר בעיקר הומודימר עמיד למלח, אך גם יכול ליצור הומוטטראמר רגיש למלח בעל תפקוד לא ידוע 2,13,14. ביחד, היכולת להשיג חלבון SLFN14 אנושי מטוהר הייתה אבן דרך קריטית, שאפשרה תובנות מולקולריות מוקדמות שיניעו ללא ספק שלב חדש ומרגש במחקר בקרת תרגום מתווכת SLFN14.

הריבונוקלאז הרקומביננטי SLFN14 היה היסטורית קשה להשגה באמצעות אסטרטגיות ייצור חלבון סטנדרטיות. הדוח המקורי שתיאר את הפעילות האנזימטית של SLFN14 ציין את התפוקה הנמוכה, היציבות המופחתת והמסיסות הנמוכה1. חלבון SLFN14 האנושי מאופיין בשרשרת פוליפפטידית ארוכה, הידרופוביות בולטת וציטוטוקסיות תלויה בריבונוקלאז, אשר יחד מקבלות במידה רבה את השימוש במערכות ביטוי חיידקיות קונבנציונליות 1,13,14. עם זאת, מנגנוני תרגום אאוקריוטיים מתקדמים ומלווה מציעים חלופה עוצמתית שמייצרת ביעילות חלבון SLFN14 אנושי15 באורך מלא. מערכות ביטוי של נגיף בקולו-חרקים ויונקים שימשו להשגת חלבון SLFN14 אנושי באורך מלא למחקרי קריוEM ובדיקות ביוכימיות 2,13,14. עם זאת, במקרים מסוימים חלבון SLFN14 שמקורו בחרקים דרש מוטציות מייצבות כדי למנוע הצטברות דגימה2. העברת גנים בתיווך נגיף הבאקולו-וירוס קשורה גם להתחייבות משמעותית למאמץ ולזמן המתנה ארוך שמעכב את התקדמות המחקר15,16. מצד שני, חלבון SLFN14 רקומביננטי שמבודד ממארח ביטוי יונקי מציע יתרון במהירות ומונע צורך בהנדסת חלבונים באופטימיזציה של דגימה.

שיטה זו נועדה לספק גישה מהירה ובעלת מאמץ נמוך יחסית לייצור חלבון SLFN14 פראי רקומביננטי המתאים למחקרים מולקולריים במורד הזרם. השימוש בתאי יונקים מספק סביבה כמעט טבעית לשימור קיפול חלבוני תקין ללא צורך בהנדסת חלבונים SLFN1413. שיטת העברת גנים מבוססת כימיקלים, בניגוד לאסטרטגיית וקטור ויראלי, גם היא מאיצה את לוח הזמנים של הייצור מחודשים לימים15. כדי לאזן את העלות הגבוהה יחסית של תרבית תאי יונקים, שיטה זו עושה שימוש בתאי כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) היעילים ביעילות פוליאתילנימין (PEI) בפוליאתילנימין (PEI) ויעיל בטרנספקציה שגדלו בתנאיתאי 17,18. כדי למזער אובדן חלבון במהלך עיבוד הדגימה, הליך זה גם עושה שימוש באסטרטגיות צריכת דגימה נמוכה לטיהור חלבון SLFN14 וניתוח סטויכיומטרי לבקרת איכות דגימה. פרוטוקול בן ארבעה ימים זה מספק פרטים ספציפיים כיצד לבצע 1) ביטוי גנים חולף בתאי HEK293, 2) תהליך כרומטוגרפיה דו-שלבי באמצעות עמודות ספין, ו-3) קביעת סטוכיומטריית חלבונים באמצעות פוטומטריית מסה. התוצר הסופי מההליך הוא חלבון SLFN14 אנושי מסוג פראי, המכיל תג Myc-Flag כפול בקצה C (SLFN14Myc-Flag) שניתן להשתמש בו למחקרי קריוEM במורד הזרם ולאפיון ביוכימי איכותי13. גישה ורסטילית זו יכולה לשמש לבידוד ואפיון חלבוני קישור RNA אנושיים אחרים שלא נחקרו, במיוחד גנים גדולים וציטוטוקסיים של ריבונוקלאז שקשה לעיתים להתפרז במערכות ביטוי הטרולוגיות. לכן, פרוטוקול זה מוריד את המחסום לאפיון מולקולרי מקיף של הפרוטאום האנושי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים הכוללים תרבית תאים HEK293 צריכים להתבצע בתנאי בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2) בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים מאושרים.

1. ביטוי חולף של SLFN14Myc-Flag בתאי יונקים

  1. תאי תלייה HEK293 של יונקים זרעים במילוי 0.5 x 106 תאים/מ"ל לתוך מדיום גדילה מחומם מראש ללא סרום לנפח סופי של 320 מ"ל בבקבוק מאוורר של 1 ליטר.
  2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 125 סל"ד, 8%CO2, לחות של 75-80% למשך 24-32 שעות.
  3. וודא שמספר התאים הוא 1.2-1.8 x 106 תאים/מ"ל ועמידות גבוהה מ-90% באמצעות צבע כחול טרייפן ומונה תאים19.
  4. דקנט 40 מ"ל תרבית לשמונה צינורות חרוטיים.
  5. קציר תאים בצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס.
  6. להשליך את מדיום הגידול.
  7. החזירו בעדינות כל כדור תא ב-38 מ"ל של מדיום טרנספקציה ללא סרום מחומם מראש לנפח סופי של 304 מ"ל.
    הערה: 16 המ"ל הנותרים מנפח התרבית המקורי המתוארים בשלב 1.1 יסופקו על ידי תערובת הטרנספקציה המתוארת בשלב 1.12.
  8. העבר את התאים לבקבוק חדש עם אוורור של 1 ליטר.
  9. בצינור קוני, מוסיפים 320 מיקרוגרם DNA פלסמיד מטוהר המקודד את גן SLFN14Myc-Flag ל-8 מ"ל של מדיום טרנספקציה ללא סרום ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס.
    הערה: ריכוז הפלסמיד הוא בדרך כלל 500 ng/μL בנפח סופי של 640 מיקרוליטר.
  10. במקביל לשלב 1.9, הוסף 960 מיקרוגרם של PEI מעוקר במסנן 0.22 מיקרון ל-8 מ"ל מדיום טרנספקציה ללא סרום ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס.
    הערה: מלאי עבודה הוא בדרך כלל 1 מ"ג/מ"ל בנפח סופי של 960 מיקרוליטר.
  11. הוסף לאט את תערובת PEI (ראה שלב 1.10) בזרם הנפילה לתמיסת ה-DNA הפלסמידית הרקומביננטית (ראה שלב 1.9) ודגר 15 דקות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס.
  12. הוסיפו לאט 16 מ"ל מתערובת DNA/PEI בזריזות לתאים שהוכנו בשלב 1.8.
  13. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 125 סל"ד, 8%CO2, לחות של 75-80% למשך 48 שעות.
  14. שחרור 40 מ"ל של תאים שעברו לשמונה צינורות חרוטיים.
  15. קצור תאים שעברו טרנספקט בצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס.
  16. פרק את הסופרנטנט ואחסן את שמונת הכדורים התאים בטמפרטורה של -80°C.

2. טיהור דו-שלבי רקומביננטי SLFN14Myc-Flag

  1. כרומטוגרפיית אנטי-זיקה לדגלים.
    בצע את פרוטוקול הכרומטוגרפיה האנטי-Flag לאפיניטי בשכפול, תוך שימוש בארבעה כדורי תאים משלב 1.16 לכל הכנה.
    1. הכנת שרף.
      1. איזון שרף אגרוז נגד דגל ל-20-25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      2. החזירו בעדינות את השרף על ידי הפיכת הבקבוק מיד לפני העברת 40 מיקרוליטר של 50% תערובת שרף לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל.
        הערה: חתכו את קצה קצה הפיפטה כדי לאסוף בקלות את התערובת הצמיגית.
      3. החזירו את השרף ל-1 מ"ל של בופר שטיפה עם מלח גבוה (50 מ״מ טריס pH 7.4, 600 מ״מ NaCl, 5 מ״מ מ״ר מ״ג מ״ק2, 0.5 מ״מ β-ME, 0.1% טווין-20).
      4. דגרו במשך 45 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      5. צנטריפוגה את תערובת השרף בעוצמה של 8,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      6. שאופים והשליכו את בופר ה-High Salt Wash תוך שמירה על זהירות לא להפריע לשרף.
    2. הבהרת ליזאט תאי.
      1. החזירו כל כדור תא שעבר טרנספקט עם 225 מיקרוליטר של בופר השעיה מקוררת (50 מ"מ טריס pH 7.4, 600 מ"מ מ' NaCl, 5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ β-ME, 0.5% טריטון-X-100, 1 מ"מ PMSF, 5 מיקרוגרם/מ"ל לאופפטין, 1 מ"מ בנזמידין, 0.7 מיקרוגרם/מ"ל פפסטין A, 0.25 U/mL נוקלאז ג'יניס) לנפח כולל של 900 מיקרו-ליטר בארבעה כדורי תאים.
      2. העבר תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה בקוטר 2 מ"ל שקירר מראש על קרח.
      3. דגרו את צינור המיקרוצנטריפוגה אופקית על נוטאטור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
        הערה: יש לאחסן 20 מיקרוליטר אליקוט של ליזאט כולל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לצורך פתרון בעיות במקרה של רמות ביטוי חלבון נמוכות.
      4. להבהיר את ליזאט התא באמצעות צנטריפוגציה ב-21,300 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. לכידת זיקה לחלבון ושטיפה.
      1. שלבו את הליזאט המובהר (ראו שלב 2.1.2.4) עם שרף אנטי-דגל מאוזן (ראו שלב 2.1.1.6).
      2. דגרו את תערובת הליזאט-רזין בצינור מיקרוצנטריפוגה הממוקם אופקית על נוטאטור למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      3. צנטריפוגה את תערובת הליזאט-שרף בעוצמה של 8,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ליצירת כדור שרף.
      4. השליכו כ-700 מיקרול של סופרנטנט תוך זהירות לא להפריע לכדור השרף.
        הערה: יש לאחסן 20 מיקרו-ליטר של סופרנטנט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחר קשירת שרף לצורך פתרון תקלות במקרה של יעילות לכידה ירודה.
      5. החזירו את תערובת השרף-סופרנטנט שנותרה והעבירו את התמיסה לעמוד ספין ריק בקיבולת 800 מיקרוליטר, שהוכנס לצינור מיקרוצנטריפוגה ריק בנפח 2 מ"ל.
      6. צנטריפוגה את עמודת הסיבוב ב-1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הזרימה.
      7. שטוף את צינור המיקרוצנטריפוגה הריק מהשלב 2.1.3.5 עם 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה עם מלח גבוה והעבר את התמיסה לעמוד הספין.
        הערה: שלב זה מסייע לשחזר כל שרף שנותר בצינור המיקרוצנטריפוגה.
      8. צנטריפוגה את עמודת הסיבוב ב-1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הזרימה.
      9. הוסיפו 500 מיקרול של בופר שטיפה עם מלח גבוה לעמוד הסיבוב. צנטריפוגה את עמודת הסיבוב ב-1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הזרימה. חזור על השלב הזה לסך הכל ארבע שטיפות עם מלח גבוה.
      10. הוסף 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה דל מלח (50 מ"מ טריס pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ β-ME, 0.1% טווין-20) לעמוד הספין. צנטריפוגה את עמודת הסיבוב ב-1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הזרימה. חזור על השלב הזה לסך הכל שתי שטיפות עם מלח נמוך.
      11. הוסף 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה ATP (50 מ"מ טריס pH 7.4, 150 מ"מ מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ β-ME, 0.1% טווין-20, 10 מ"מ ATP) לעמוד הספין. סתום את תחתית עמוד הסיבוב ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. נתק את עמוד הסיבוב והצנטריפוגה בעוצמה של 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וזרוק את ה-flow-through. חזור על השלב הזה לסך של ארבע שטיפות ATP.
      12. בצע שטיפה סופית על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה דל מלח לעמוד הסיבוב. צנטריפוגה את עמודת הסיבוב ב-1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הזרימה.
    4. הסרת חלבון באמצעות 3xFlag פפטיד.
      1. מרחו את תחתית עמודת הסיבוב במגבון עם סיבים נמוכים כדי להסיר נוזלים עודפים וסתום את תחתית עמודת הסיבוב.
      2. הוסף 55 מיקרוליטר של בופר 3xFlag Elution (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM β-ME, 0.1% Tween-20, 300 מיקרוגרם/מיליטר 3xFlag פפטיד) ישירות מעל השרף.
      3. אטום את פתח עמוד הסיבוב עם פרפילם ומניח את העמודה בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מ"ל.
      4. דגרו את עמודת הסיבוב אנכית על נוטאטור למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
        הערה: כדי להחזיק את עמוד הסיבוב אנכי, התקן מתקן צינורות מיקרוצנטריפוגה על הנוטאטור עם גומיות.
      5. הסר את הפרפילם ופלאג עמוד סיבוב. אסוף את חלבון SLFN14Myc-Flag הרקומביננטי המוחלף בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.7 מ"ל באמצעות צנטריפוגה בעוצמה של 1,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      6. שמור 50 מיקרוליטר של אלואט שרף אנטי-פלאג לכרומטוגרפיה של הדרה בגודל הבא ו-5 מיקרוליטר לניתוח SDS-PAGE.
  2. כרומטוגרפיית הוצאת גודל.
    בצע את פרוטוקול הכרומטוגרפיה של הדרת גודל באמצעות בופר הסרת מלח נמוך (150 mM NaCl) לניתוח חלבוןMyc-Flag סטנדרטי של SLFN14 או בופר הסרת מלח גבוה (500 mM NaCl) לאפיון APO SLFN14Myc-Flag .
    1. שילוב שני שרפים של 50 מיקרו-ליטר נגד דגל משלב 2.1.4.6 לסך של דגימה של 100 מיקרוליטר.
    2. הכינו עמוד הסרת מלח סיבוב של 0.5 מ"ל עם חיתוך משקל מולקולרי של 40 קילו-דלטון על ידי שחרור המכסה, הסרת הסגירה התחתונה והכנסת העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל.
    3. צנטריפוגה את עמוד הסחרור הסיבוב בטמפרטורה של 700 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את תמיסת האחסון בעמודה. השליכו את ה-flow-through.
    4. הוסף 300 מיקרוליטר של בופר הסרת מלח נמוך או גבוה (20 מ"מ טריס pH 7.4, 150/500 מ"מ NaCl, 1 מילימטר MgCl2, 1 מ"מ TCEP) לעמוד הסרת המלח בספין. צנטריפוגה את עמודת הסיבוב ב-700 x g למשך 1-2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וזרוק את ה-flow-through. בצע את השלב הזה שלוש פעמים כדי לאזן את העמודה במלואה.
    5. לטשטש את תחתית עמוד הסרת המלח עם מגב עם סיבים נמוכים.
    6. העבר את עמודת הסרת המלח בספין לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.7 מ"ל.
    7. הוסף 100 מיקרוליטר של שרף אנטי-פלאג משולב (ראה שלב 2.2.1) למרכז שכבת העמודה מבלי להפריע לשרף.
    8. חלבון SLFN14Myc-Flag הרקומביננטי על ידי צנטריפוגה של עמודת הסרת המלח בספין בעוצמה של 700 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    9. לשמור 95 מיקרוליטר של חלבון רקומביננטי ששוחזר לצורך אפיון מולקולרי ו-5 מיקרוליטר לניתוח SDS-PAGE.
  3. אפיין דגימת חלבון SLFN14 עםדגל Myc-Flag מטוהר רקומביננטי.
    1. בצע אלקטרופורזה ג'ל נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE).
      1. שלבו 5 מיקרוליטר של 2x בופר דגימה Laemmli עם 5 מיקרו-ליטר אליקווטים של דגימה שנאספו בשלבים נפרדים לאורך פרוטוקול הטיהור.
      2. דגימות חום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. פתרון סולם חלבון רחב טווח יחד עם 10 מיקרוליטר של תערובת בופר דגם-Laemmli ב-4-15% SDS-PAGE ב-200V למשך 30 דקות.
      4. הצג רצועות חלבון על ידי צביעת הג'ל בתמיסת צביעת Coomassie G-250 למשך 30 דקות על שייקר אורביטלי והסרת צבע הג'ל במים דה-יוניים על שייקר אורביטלי עד שהרקע יהיה ברור.
      5. בדקו את רצועות החלבון המתקבלות כדי לוודא שהדגימה שנאספה משלב 2.2.9 היא רצועת חלבון אחת התואמת את המשקל המולקולרי התיאורטי של SLFN14Myc-Flag של 107.5 קילודלקטון (kDa).
    2. כמת חלבון וחומצה גרעין באמצעות ספקטרופוטומטריית UV/vis.
      1. רוקן ספקטרופוטומטר מיקרונפח עם 2 מיקרוליטר של בופר הסרת מלח נמוך או גבוה, בהתאם לבופר אחסון החלבון.
      2. מדדו את הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר מ-2 מיקרוליטר של חלבוןMyc-Flag רקומביננטי SLFN14 ששוחזר (ראו שלב 2.2.9) באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      3. חשב את ריכוז החלבון הרקומביננטי SLFN14Myc-Flag באמצעות הספיגה המתועדת ב-280 ננומטר ומקדם ההכחדה שלו (93330 M-1 ס"מ-1) באמצעות חוק ביר-למברט20.
      4. חשב את יחס הספיגה A260/280 על ידי חלוקת ערך הספיגה שנמדד ב-260 ננומטר בערך הספיגה שנמדד ב-280 ננומטר כדי לקבוע האם חומצה גרעין מטהרת יחד עם חלבון SLFN14Myc-Flag רקומביננטי.
        הערה: יחס A260/280 מעל 0.7 ככל הנראה מצביע על נוכחות חומצה גרעינית21.
    3. כמת RNA תאי באמצעות פלואורומטריה.
      1. כימות את תכולת ה-RNA באמצעות 1-3 מיקרוליטר של חלבון רקומביננטי משוחזר משלב 2.2.9 באמצעות צבע פלואורסצנטי ספציפי ל-RNA ברגישות גבוהה22.

3. ניתוח מסה מולקולריתשל SLFN14 Myc-Flag באמצעות פוטומטריית מסה

  1. הגדרת מכשיר פוטומטר מסה.
    1. הפעל את הלייזר באמצעות המתג שבגב תיבת האלקטרוניקה של פוטומטר המסה.
    2. הפעל את דק הבידוד ולחץ על כפתור "בידוד" כדי למזער רעידות במכשירים.
    3. פתח את תוכנת AcquireMP.
    4. המתינו שעה עד שהמכשיר יגיע לשיווי משקל תרמי.
  2. הכנת שקופית הכיסוי.
    1. החזק מגלדת כיסוי זכוכית במצב אנכי באמצעות פינצטה רכה.
    2. שטוף את שני צידי מחסנית הזכוכית עם מים אולטרה-טהורים מסוג I ואחריהם אלכוהול איזופרופיל. חזור על שלב זה בסך הכל שלוש פעמים.
    3. שטוף כל צד של מחסנית כיסוי הזכוכית בפעם האחרונה עם מים אולטרה-טהורים מסוג I למשך 45 שניות.
    4. הסר בעדינות טיפות מים עודפות מהסלייד של כיסוי הזכוכית באמצעות שאיבה באמצעות קצה פיפטה נקי שמחובר לקו ואקום.
    5. אחסן את סלייד הזכוכית הנקי בקופסה מפלסטיק מרופדת בנייר עדשה להובלה לפוטומטר המסה.
  3. התקן את הסלייד של המכסה על הכלי.
    1. הניחו אטם סיליקון עם 6 בארות על כלי היישור המתכתי באמצעות פינצטה רכה.
    2. הניחו את מחסנית כיסוי הזכוכית הנקי משלב 3.2.5 מעל אטם הסיליקון והשתמשו בפינצטה הרכה כדי ללחוץ בעדינות סביב אטם הסיליקון.
      הערה: אין להפעיל לחץ על בארות הדגימה.
    3. הנח טיפה של שמן טבילה על העין של פוטומטר המסה.
    4. הפוך את מחסנית כיסוי הזכוכית כך שהאטם הסיליקון פונה כלפי מעלה והניח בעדינות את מגלש כיסוי הזכוכית על האוקולוס באמצעות פינצטה רכה.
    5. אבטח את הפינות העליונה השמאלית והתחתונה הימנית של סלייד כיסוי הזכוכית באמצעות מגנטים.
    6. בשליטה רוחבית, בחר את הבאר השמאלית העליונה בתוכנת AcquireMP כדי ליישר את הלייזר עם מרכז הבאר.
  4. נתח תקני חלבון רחבי טווח.
    1. הכינו תמיסה עם כיול רחב טווח של 50x (90 kDa ל-1MDa) על ידי דילול 1 מיקרוליטר של 500x חומר מכייל ל-9 מיקרוליטר 1x זרח-מלח.
    2. הכינו מאגר עבודה עם כיול 5x על ידי שילוב של 2 מיקרוליטר מהתמיסה הרחבה של 50x משלב 3.4.1 ל-18 מיקרוליטר 1x פספט-מלוץ-מלח.
    3. הוסף 10 מיקרוליטר של בופר הסרת מלח נמוך או גבוה מסונן בעומק 0.22 מיקרון לבאר הריקה.
      הערה: חשוב להתאים את הבופר המסונן בשלב זה לבין הבופר ששימש להכנת דגימתMyc-Flag של SLFN14 בשלב 2.2.9.
    4. סגור את המכסה.
    5. תחת 'מצא פוקוס', לחץ על 'דילול טיפות' בתוכנת AcquireMP כדי לקבוע את המיקוד הנכון של באר הדגימה.
    6. הוסיפו 10 מיקרוליטר מהמלאי העובד עם כיול 5x לטיפה של הבופר (ראו שלב 3.4.3) והעבירו בעדינות פיפט למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה.
    7. סגור את המכסה.
    8. בדוק את הגדרות הכלי כדי לוודא שהערכים לתנועה, אות, רוויה וחדות יציבים ואופטימליים.
      הערה: הערכים האופטימליים יופיעו בכחול, והחריגים יהיו בצבע כתום.
    9. לחץ על "הקלטה" בתוכנת AcquireMP כדי להקליט וידאו של 60 שניות.
    10. שמור את קובץ התוצאה (.mpr) עם כותרת תיאורית וחותמת זמן.
  5. צור עקומת כיול.
    1. פתח את תוכנת DiscoverMP.
    2. תחת מדידות, לחץ על כפתור "+ פתח" ועבור לקובץ התוצאות המכויל משלב 3.4.10.
    3. לחצו פעמיים על קובץ תקני החלבון המופיעים כדי לצפות בתוצאות.
    4. בתצורת הגרם, כוונן את גבולות הניגודיות ל-0.00000 ו-0.03000-, בהתאמה.
    5. הגדר ידנית עקומת גאוס לארבעת הפסגות הראשונות של חלבון על ידי גרירת הסמן על פני כל פסגה בודדת.
    6. לחץ על "יצירה" ובחר "כיול מסה".
    7. מתחת לכותרת הכיול, הקצה כל שיא כיול מותאם משלב 3.5.5 למסת המולקולר הידועה שלו של 86, 172, 258 ו-344 קילברנט, בהתאמה.
    8. ודאו שלעקומת הכיול יש R2 קרוב ל-1.0 ושגיאת מסה מרבית (MME) נמוכה מ-2%.
    9. לחץ על "אישור כיול" ושמור את קובץ עקומת הכיול (.mc).
      הערה: יש לכייל מחדש את פוטומטר המסה כל שעה.
  6. ניתוח חלבוןMyc-flag של SLFN14 רקומביננטי בתנאים עם מלח נמוך וגבוה.
    1. הכינו תמיסה של 50 מיקרוליטר של חלבוןMyc-Flag רקומביננטי SLFN14 באורך 50 ננומטר (ראו שלב 2.2.9) באמצעות בופר הסרת מלח נמוך לניתוח דגימות סטנדרטי בתנאי מלח פיזיולוגיים או בופר הסרת מלח גבוה לאפיון דגימות חלבון APO.
    2. צנטריפוגה את תערובת החלבון הרקומביננטית SLFN14Myc-Flag של 50 ננומטר ב-21,300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס כדי להסיר את האגרגט הפוטנציאלי של חלבונים ואבק.
    3. בשליטה רוחבית, לחץ על "הבא הבא" בתוכנת AcquireMP.
    4. טעין 10 מיקרוליטר של 0.22 מיקרומטר עם בופר הסרת מלח נמוך או גבוה לבאר וסגר את המכסה.
      הערה: חשוב להתאים את הבופר המסונן בשלב זה לבין הבופר המשמש להכנת דילול הדגימהMyc-Flag של SLFN14 בשלב 3.6.1.
    5. תחת חיפוש פוקוס, לחץ על "דילול טיפות" כדי לקבוע את המיקוד הנכון של הבאר הדגימה החדשה.
    6. טענו 10 מיקרוליטר של תמיסת החלבוןMyc-Flag של SLFN14 רקומביננטית באורך 50 ננומטר משלב 3.6.2 לטיפה הבופר ופיפטה עדינה לערבוב הדגימה.
    7. סגור את המכסה וודא את הגדרות המכשירים האופטימליות כפי שמתואר בשלב 3.4.8.
    8. לחץ על "הקלטה" בתוכנת AcquireMP כדי להקליט וידאו של 60 שניות.
      הערה: רזולוציית מסה אופטימלית מושגת מסרטון של 60 שניות עם כ-1,000-4,000 ספירות בסך הכל.
    9. שמור את קובץ התוצאה (.mpr) עם כותרת תיאורית וחותמת זמן.
  7. חשב את המסה המולקולרית והסטוכיומטריה של חלבוןMyc-Flag הרקומביננטי SLFN14.
    1. במדידות בתוך תוכנת DiscoverMP, לחץ על כפתור "+ פתח" כדי לבחור את קובץ התוצאה משלב 3.6.9.
    2. תחת כיולים, יש ללחוץ פעמיים על קובץ עקומת הכיול שנוצר בשלב 3.5.9 כדי ליישם את הכיול.
    3. הגדר ידנית עקומת גאוס לכל מיןMyc-Flag שנצפה SLFN14 על ידי גרירת הסמן על פני כל פסגה לקבלת ערך מסה מולקולרי מחושב.
    4. חשב את המסה המולקולרית הממוצעת לכל מין אוליגומרי משלוש מדידות עצמאיות, יחד עם סטיית התקן המתאימה לו.
    5. קבעו את הסטוכיומטריה של חלבוןMyc-Flag רקומביננטי SLFN14 על ידי הערכת המסה המולקולרית הממוצעת המחושבת עם מספרים שלמים של ערך המסה התיאורטי של פרוטומר SLFN14Myc-Flag .
      הערה: המסה התיאורטית של מונומרMyc-Flag של SLFN14 היא 107.5 קילו-דלטון, דימר הוא 215 קילו-דלטון, טרימר הוא 322.5 קילו-דלטון, וטטראמר הוא 430 קילוואן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

וקטור יונק מהונדס לביטוי גנים חולף של חלבוןMyc-Flag רקומביננטי אנושי SLFN14 באורך מלא מוצג באיור 1. תהליך טיהור דו-שלבי מציג את הבידוד של חלבוןMyc-Flag SLFN14 מתאי HEK293 (איור 2A). ג'ל דנטור מוצלח של חלבון SLFN14Myc-Flag מטוהר מוצג באיור 2B. שלב הכרומטוגרפיה בזיקה נשען על אינטראקציה סלקטיבית ובעלת זיקה גבוהה בין תג דגל בקצה C של SLFN14 לבין שרף הנוגדנים המנוגד נגד ד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר צעדים קריטיים מדגישים את הביצועים והגמישות של פרוטוקול ייצור החלבון הזה. כדי למקסם את תפוקת החלבון הרקומביננטי, אנו משתמשים בתאי HEK293 בעלי קליטה גבוהה של DNA פלסמיד זר וניתן לתרבתם בתנאי תלייה כדי למקסם את צפיפות התאים לאורך נפח23. תגובת טרנספקציה PEI משמשת בפרוטוקול העברת הגנים בקנה מידה גדול זה, משום שהיא יכולה להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה בעלות יחסית נמוכה בהשוואה למגבים פופולרייםאחרים 17. תאים שעברו טרנספקט מודגרים לתקופה קצרה כד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדת פילון על קריאתם הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר החוץ-מורלית של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS; R35GM147123 ל-M.C.P.) הועבר למכללת הרפואה של ביילור והועבר לאוניברסיטת מדינת ניו יורק בבאפלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואנול (b-Me)סיגמאM3148-500ML14.3 M פתרונות טוק
AcquireMP 2024 R2רפיין/תוכנת רכישת נתונים
אדנוזין-5'-טריפוספט די-סודיום מלח טריהידרט (ATP)כימ-אימפקס אינטרנשיונל00015-100Gכוון את התמיסה ל-pH 7.0
ג'ל זיקה נגד דגלים M2מיליפורA2220שרף נגד זיקה לדגל
הידראט בנזמידין הידרוכלורידסיגמאB6506-25Gמעכב פרוטאז
תקני חלבון רחבי טווח (10-250 קילודאטון)ביו-ראדP7719Sתקני חלבון מוכתמים מראש
רוזנת 3InvitrogenA49862מונה תאים אוטומטי
DiscoverMP v2024 R2רפיין/תוכנת ניתוח נתונים
המלח הממופר בפוספט של דולבקוקורנינג21-031-CVקת תמיסה 1x
פפטיד DYKDDDDKתרמו פישר סיינטיפיקA368053xFlag פפטיד
תאי FreeStyle 293-Fתרמו פישר סיינטיפיקR79007תאי תלייה ביונקים
Geniust M Nuclease DMF הגישסנטה קרוזSC-391121Bנוקלאז אוניברסלי
HyClone CDM4HEK293 מדיהציטיבהSH3085802מדיום גדילה ללא סרום
מדיה HyClone SFM4Transfx-293ציטיבהSH3086002מדיום טרנספקציה חולף
Immersol 518Fצייס4Y00-R0DY-1007-3BF3שמן טבילה
אלכוהול איזופרופילמקרון פיין כימיקלים3032-02
בופר דגימות Laemmliביו-ראד16107372x קת תמיסה
לופטיןVWRJ580-25MGמעכב פרוטאז
מגנזיום כלוריד הקסיהידרט (MgCl2)פישר סיינטיפיקM33-500
MassFerence P1 רפייןMP-CON-41033קת עם כיול 500x
ערכת ההכנה לדוגמה של MassGlass UCרפייןMP-CON-21022סלייד ואטם
עמודת מיקרו-ביו-ספיןביו-ראד7326204עמודת ספין פוליפרופילן ריקה
מערכת Milli-Q IQ 7000מיליפורZIQ7000T0Cמים אולטרה-טהורים מסוג I
ג'לים ללא כתמים של Mini-Protean TGXביו-ראד45680864-15% SDS-PAGE
מיניטרון עם לחות, קירור ו-CO2אינפורס72175מנער אינקובטור
ערכת יישור MPרפייןMP-CON-21019כלי יישור, פינצטה רכה, מגנט
ננופוטומטרImplenNP80ספקטרופוטומטר UV-vis
נוטייטורקליי אדמס ברנד421105
פפשטטין Aסנטה קרוזSC-45036Bמעכב פרוטאז
פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF)Research Products InternationalP20270-25.0מעכב פרוטאז
בקבוק שייק פוליקרבונט דוראן ויטון קימבלWPFBC1000Sבקבוק בסיס מבולבל מאוורר
פוליאתילנימין (PEI) MW 40,000מדעים פולי-מדעיים24765מגיב טרנספקציה
פלואורומטר קיוביט 4תרמו פישר סיינטיפיקQ33226
ערכת בדיקה רגישות גבוהה ל-RNA קיוביטתרמו פישר סיינטיפיקQ32852כימות באמצעות צבע ייחודי ל-RNA
SimplyBlue SafeStainתרמו פישר סיינטיפיקLC6065קומאסי G-250
DNA של ביטוי פלסמיד SLFN14אוריג'יןRC226257שיבוט ORF מתויג אנושי
נתרן כלוריד (NaCl)מיליפור1.37017
טריס, pH 7.4תרמו פישר סיינטיפיקJ60202. K2קת תמיסה ממופרת באורך 1 מטר
Tris (2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד (TCEP)ביוטכנולוגיה זהבTCEP10TCEP
טריטון X-100VWRM143-1Lדטרגנט
Trypan Blue Stainתרמו פישר סיינטיפיקT102820.4% מניית תמיסה
גיל 20VWR0777-1Lדטרגנט
TwoMPרפייןMP-PRO-00001פוטומטר מסה
עמודת דזלטין Zeba 40Kתרמו פישר סיינטיפיקA57759כרומטוגרפיית החרגת גודל

מקורות

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ייצור חלבון רקומביננטיחלבונים קושרים RNAתאי HEK293 בתליהכרומטוגרפיית זיקהכרומטוגרפיית הדרגה לפי גודלסטוכיומטריה של חלבוניםג'ל SDS-PAGEאפיון ביוכימי
ייצור מהיר של SLFN14 ריבונוקלאז רקומביננטי וניתוח סטויכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.