מאמר מחקר

הערכת ביופילם השוואתית במבחנה סטפילוקוקוס אוראוס על משטחים מודפסים בתלת-ממד עם חומצה פולילקטית ופוליאתילן טרפתלאט עם גליקול מותאם

DOI:

10.3791/70394

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory of Emerging Infectious Diseases, School of Medicine, Pontifícia Universidade Católica do Paraná

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מעריך את היווצרות ביופילם על חומצה פולילקטית מודפסת תלת-ממד (PLA) ופוליאתילן טרפתלאט גליקול (PETG) באמצעות מודלים סטטיים, חצי-סטטיים ודינמיים במבחנה . המתודולוגיה תומכת בפיתוח בטוח יותר של מכשירים רפואיים ומקדמת מחקר ביופילם בביוחומרים מודפסים בתלת-ממד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדפסה תלת-ממדית (תלת-ממדית) האיצה את פיתוח המכשירים הרפואיים המותאמים אישית, אך היווצרות ביופילם על חומרים מודפסים נותרה איום משמעותי על בטיחות וביצועי השתלים. מכיוון שכימיה של חומר ותכונות משטח התלויות בהדפסה יכולות להשפיע על היצמדות חיידקים וסבילות לאנטיביוטיקה, נדרשות גישות סטנדרטיות במבחנה שמאפשרות השוואות משמעותיות בין פולימרים להדפסת תלת-ממד נפוצים. כאן, אנו משווים התפתחות ביופילם על חומצה פולילקטית (PLA) ופוליאתילן טרפתלאט גליקול (PETG) באמצעות מסגרת הערכה רב-מודלית במבחנה , הלוכדת היבטים משלימים של ביולוגיית ביופילם, כולל הידבקות מוקדמת, הבשלה וסבילות לאנטימיקרוביאליה, הן בתנאי סטטי והן בתנאי זרימה. ביופילמים של S. aureus הוכחו והוערכו באמצעות נקודות קצה כמותיות (עומס חיידקי בר קיימא וריכוז מינימלי לחיסול ביופילם [MBEC]) ואיכותית (מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת). גם PLA וגם PETG תמכו ביצירת ביופילם במודלים שונים; עם זאת, PLA נטו להראות הידבקות מוקדמת גבוהה יותר וצפיפות ביופילם גבוהה יותר. בבדיקות סטטיות, PLA הראה ערכי CFU גבוהים יותר מ-PETG, בעוד שערכי MBEC של ונקומיצין היו דומים בין חומרים. הבדלים התלויים במבחנים ב-MBEC נצפו בין פלטפורמות, מה שהדגיש כיצד מבנה המודל יכול להשפיע על רגישות אנטימיקרוביאלית נראית לעין. בזרימה דינמית, עומס הביופילם עלה יחסית לתנאים סטטיים, עם הבדלים מינימליים התלויים בחומר. ביחד, תוצאות אלו מדגישות את הרגישות של שני הפולימרים להיווצרות ביופילם ומדגימות את הערך של מסגרת רב-מודלית להערכת התנהגות ביופילם הקשור לחומר ולהשוואת ביצועי אנטימיקרוביאליים על מצעים הרלוונטיים למכשירים מודפסים בתלת-ממד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות אחרונה בהדפסת תלת-ממד הובילה לאימוץ גובר של מכשירים רפואיים מודפסים בתלת-ממד, בזכות חסכונותם, דיוקם הגבוה, עיצוב מבני מורכב, ניצול יעיל של חומרים ועיצוב ייחודילמטופל 1,2. ההתקדמות הזו מניעה התקדמות קלינית משמעותית בפיתוח שתלים אורתופדייםמותאמים אישית 3,4,5,6, קרניופציאליים 7,8, דנטלי 1,9 ועמוד שדרה10,11.

טכניקות וחומרים רבים מאפשרים כיום שליטה מדויקת על פרמטרי התכנון, מה שמאפשר אופטימיזציה של מאפייני פני השטח ולשפר את פונקציונליות המכשירהכוללת 2,12,13. משטח השתל חשוב מאוד, שכן הוא משמש כממשק הראשי עם סביבת המארח ומשפיע על תגובות חיסוניות, הידבקות חיידקית ואינטגרציה של רקמות — גורמים חיוניים לביצועים ארוכי טווח של המכשיר14,15. עם זאת, ממשק זה מהווה גם אתגר משמעותי, שכן זיהומים הקשורים למכשירים רפואיים מושתלים עלולים לגרום לסיבוכים חמורים ולעיתים קרובות קשה לטיפול בהם בשל יכולת הפתוגנים ליצור ביופילמים מחוברים למשטחים 16,17,18,19.

בהקשר זה, בדיקות חוץ-גופיות של מודלים ביופילמים על חומרים המיועדים לייצור מכשירים רפואיים מושתלים מהווים שלב יסודיבתהליך הערכת הסיכונים ופיתוח המוצר. בדיקות אלו מאפשרות חקירת רגישות החומר להידבקות מיקרוביאלית, יצירת ביופילם והבשלת, וכן הערכת יעילות של אסטרטגיות אנטימיקרוביאליות או שינויים על פני השטח שמטרתם למנוע צמיחת מיקרואורגניזמים.

מגבלה נוספת של בדיקות ביופילם רבות במבחנה היא שהן מתבצעות לעיתים קרובות על מצע יחיד וסטנדרטי (לעיתים פולימר אחד או חומר מעבדה גנרי), בהנחה מרומזת שהתוצאות ניתנות להעברה בין חומרי המכשיר21. דבר זה בעייתי עבור מכשירים רפואיים מודפסים בתלת-ממד, שבהם כימיה של פולימרים ותכונות משטח תלויות בייצור יכולות להשתנות באופן משמעותי ועלולות להשפיע ישירות על היצמדות חיידקים, בישרות ביופילם וסבילות לאנטימיקרוביאליים. כתוצאה מכך, הערכת התנהגות הביופילם על הפולימרים המשמשים בפועל בייצור, במקום הסקה ממצע ייחוס יחיד, פותרת פער חשוב בפרקטיקות הבדיקות הנוכחיות.

מכיוון שמשטח השתל הוא הממשק המרכזי עם המארח, הוא משפיע מאוד על הידבקות חיידקית ויצירת ביופילם, אשר תומכים בזיהומים רבים ובכישלונות טיפוליים הקשורים למכשיר. השענו כי פולימרים מודפסים בתלת-ממד הנפוצים שונים ביכולתם לתמוך בהתפתחות ביופילם S. aureus וברגישותם להכחדת ביופילם מתווך ונקומיצין. בהתאם לכך, ביצענו הערכה איכותית וכמותית של היווצרות ביופילם על מודלים של חומר מודפס בתלת-ממד. במחקר הנוכחי בוצעה הערכה איכותנית וכמותית של היווצרות ביופילם על מודלים של חומר מודפס בתלת-ממד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הכימיקלים המסוכנים (למשל, גלוטראלדהיד, בופר קקודילאט נתרן, הקסמתילידילזאן [HMDS] ואתנול) טופלו בהתאם למדיניות הבריאות והבטיחות הסביבתית (EHS) המוסדית. הכנה ושימוש בחומרים נדיפים/רעילים בוצעו באמצעות מכסה אדים כימי מוסמך עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה, מגן עיניים וכפפות עמידות לכימיה), וממסים דליקים נשמרו הרחק ממקורות הצתה. הפסולת הכימית הופרדה ונאספה במיכלים מסומנים כראוי (כולל פסולת ייעודית המכילה ארסן לקקודילטה ופסולת ממסית ל-HMDS/אתנול) להשלכה במסגרת תוכנית הפסולת המסוכנת המוסדית. חומרים ביו-מסוכנים (תרביות חיידקים, צלחות מזוהמות וחומרים חד-פעמיים) עברו טיהור בהתאם לנהלי בטיחות ביולוגית (כגון אוטוקלבינג או חומרי חיטוי מאושרים) לפני ההשלכה, וכל עיקור אתילן אוקסיד בוצע בהתאם לפרוטוקולים מוסמכים של המתקן ולשיטות האוורור הנדרשות.

דגמים מודפסים בתלת-ממד
הדגמים תוכננו באמצעות תוכנת עיצוב חינמית בעזרת מחשב והודפסו באמצעות מדפסת תלת-ממד המצוידת בטכנולוגיית מידול הפקדה מותכת, עם סיבים בקוטר 1.75 מ"מ של חומצה פולילקטית (PLA) ופוליאתילן טרפתלאט גליקול (PETG) (טבלת חומרים). פרמטרי ההדפסה לייצור הדגימות היו כדלקמן: מהירות תנועה של פיה (0.4 מ"מ) של 1800 מ"מ לדקה; מהירות השכבה הראשונה של 300 מ"מ לדקה; טמפרטורת הדיה של האקסטרוזיה של 220 מעלות צלזיוס (PLA) ו-255 מעלות צלזיוס (PETG); טמפרטורת המיטה של 60 מעלות צלזיוס; גובה שכבה של 0.08 מ"מ; רוחב אקסטרוזיה של 0.48 מ"מ ו; צפיפות מילוי של 100% לכל הדגימות. אף אחת מהדגימות לא דרשה שימוש במבני תמיכה. מודלים תלת-ממדיים כללו דיסקים, פלטות שטוחות, מכשיר הביופילם קלגרי (CBD) ומכשיר רובינס המותאם (MRD). הדיסקים תוכננו כצילינדר בקוטר 6 מ"מ (קוטר) x 6 מ"מ (גובה).

עבור ה-CBD נוצר מודל (טבלת חומרים). ה-CBD כלל שני חלקים: פלטת בסיס, לוח מיקרוטיטר סטנדרטי עם 96 בארות (פורמט ANSI/SLAS), ומכסה (פלטת יתדות): מכסה פולימרי (PLA או PETG) עם 96 יתדות גליליות בקוטר 2 מ"מ (קוטר) ו-5 מ"מ (גובה). ה-MRD פותח עם פינים בקוטר 4 מ"מ (קוטר וגובה) שהיו מקובעים במודל בורג-הברג (טבלת חומרים). לאחר סיום תהליך ההדפסה, המודלים הוסרו בזהירות מלוח הבנייה, נבדקו ויזואלית לאיתור עיוותים, ולאחר מכן עוטרו עם תחמוצת אתילן.

מודל דיסק של ביופילם סטטי
שיטה זו שימשה להשראת יצירת ביופילם על PLA באמצעות דיסקים גליליים בקוטר 6 מ"מ × 6 מ"מ23 שתוארו קודם (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: דיסקי PLA ו-PETG ולוחית עם 24 בארות ליצירת ביופילם במודלים של דיסקים אלו. (א) דיסקי PLA ו-PETG מודפסים בתלת-ממד מייצגים לפני חיסון חיידקים ויצירת ביופילם. (B) דיסקי PLA ו-PETG הממוקמים בלוח של 24 בארות במהלך השראת ביופילם בתנאי תרבית חוץ-גופית . קיצורים; PLA = חומצה פולילקטית; PETG = פוליאתילן טרפתלאט גליקול שעבר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

S. aureus אוחסן בטמפרטורה של −80°C במרק סויה טריפטי (TSB) עם תוספת של 15% גליצרול, ולפני כל ניסוי גודל על אגר דם ודגרה במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מושבה מבודדת הועלתה מחדש ב-10 מ"ל של TSB עם תוספת של 50 מ"מ מ"ל גלוקוז, נוספה לצינור קוני של 50 מ"ל, ודגרה במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר אורביטלי במהירות 120 סל"ד. התרבית שנוצרה עברה צנטריפוגה למשך 5 דקות בעוצמה של 200 x g, והסופרנטנט נזרק. הכדור נשטפ שלוש פעמים עם 10 מ"ל של NaCl סטרילי של 0.9%. בשלב השטיפה הסופי, הכדור הושתה מחדש ב-10 מ"ל של TSB טרי לקבלת תלייה חיידקית עם עכירות השווה לסטנדרט 0.5 מקפרלנד (כ-1.5 × 108 CFU/mL), כפי שנקבע בנפלומטריה. לאחר מכן דולל המתלה ביחס של 1:10 ל-10 מ"ל של TSB בצינור חרוטי של 15 מ"ל כדי להגיע לריכוז חיידקי סופי של 107 CFU/mL. לניסויים עם דיסקים, נוספו 2 מ"ל מהמתלה החיידקית הקודמת לכל באר של לוחות סטריליים עם 24 בארות כדי לכסות כל קבוצת דיסקים (PLA ו-PETG) למשך שעתיים כדי לאפשר היצמדות תאים. הדיסקים הועברו אז באופן אפטי באמצעות פינצטה סטרילית ללוח סטרילי חדש עם 24 בארות המכיל 2 מ"ל של 0.9% NaCl להסרת תאי פלנקטוניים. נוספו 10 מ"ל טרי של TSB לבארות, והלוחות דוגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. במהלך שלב זה, תאים שדבקו למשטחי הדיסק יצרו ביופילם. לאחר הדגירה, מדיום התרבית נאסף, והדיסקים נשטפו ב-2 מ"ל של 0.9% NaCl להסרת מדיום שנותר ותאים לא דביקים לאזור. הוכנה פלטת 24 בארות עם 1 מ"ל תמיסת ונקומיצין בדילול סדרתי (2–4,096 מ"ג/ליטר), והדיסקים הוטבעו במשך 24 שעות. קבוצת ביקורת ללא ונקומיצין (NaCl 0.9%) נכללה. לאחר 24 שעות, הדיסקים נשטפו ב-2 מ"ל NaCl 0.9%.

כדי לכמת את החיידקים הדבוקים על הדיסקים, כל דיסק הועבר באמצעות פינצטה סטרילית למיקרוצינור המכיל 1 מ״ל של NaCl סטרילי 0.9% וסוניקציה באמבט אולטרסוני למשך 15 דקות בתדרים של 40 קילוהרץ ו-37 מעלות צלזיוס לניתוק התאים הדבוקים לניתוק. המיקרוצינוריות היו מערבולות במשך 60 שניות כדי להבטיח פירוק מלא של אשכולות תאים. אליקווטים של 100 מיקרוליטר של הדגימה הלא מדוללת (10°) ו-10⁻2 ו-10⁻4 בדילול סטרילי של 0.9% NaCl צויפו על TSA ונדגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צמיחת חיידקים נמדדה על ידי ספירת CFU על צלחת ומובעת כ-CFU/mL.

לוחות שטוחים עם 24 בארות לריכוז מינימלי של חיסול ביופילם
לניסויים בלוחות עם 24 בארות, נוספו 3 מ"ל של השעיה חיידקית (שהוכנה כמתואר לעיל) לכל באר למשך שעתיים כדי לאפשר היצמדות תאית מספקת. לאחר מכן, השעיה החיידקית נשאפה, והוספה 3 מ"ל של NaCl סטרילי של 0.9% להסרת תאי פלנקטוניים. נוספו 3 מ"ל TSB טריים, והלוחות דוגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. במהלך שלב זה, תאים שדבקו למשטחי הבאר יצרו ביופילם. לאחר הדגירה, ה-TSB נשיפה, והבארות נשטפו ב-3 מ"ל של 0.9% NaCl להסרת תווים שנותרו ותאי מדיה שאינם דבקים. 3 מ"ל תמיסת ונקומיצין בדילול סדרתי (2–4,096 מ"ג/ליטר) נוספו לכל באר. קבוצת ביקורת ללא ונקומיצין (NaCl 0.9%) נכללה.

לאחר 24 שעות, התמיסה הוסרה, וכל באר נשטפה בעדינות פעמיים עם 3 מ"ל של 0.9% NaCl. שלושה מיליליטרים של 0.9% NaCl נוספו לכל באר, הלוח כוסה ונאטם בפארפילם, ואז סוניקי באמבט אולטרסוני במשך 15 דקות ב-40 קילוהרץ ו-37 מעלות צלזיוס כדי לפרק את הביופילם הדבוק. נאספו אליקווטים של 100 מיקרוליטר מהבארות, והדגימה הלא מדוללת (10°), 10⁻2 ו-10⁻4 של דלילים שהוכנו ב-NaCl 0.9% סטרילי צויפו על TSA ודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צמיחת החיידקים נמדדה לאחר מכן על ידי ספירת CFU/mL. כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. ריכוז מינימלי של חיסול ביופילם (MBEC) הוגדר כהפחתה של לפחות 3 log10 בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2).

figure-protocol-2
איור 2: לוחות מודפסים עם 24 בארות. (א)לוחות עם 24 בארות מודפסים ב-PLA. (ב)לוחות עם 24 בארות מודפסים עם PETG. קיצורים; PLA = חומצה פולילקטית; PETG = פוליאתילן טרפתלאט גליקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מכשיר הביופילם של קלגרי
ה-CBD מורכב מלוח מיקרוטיטר עם 96 בארים ומכסה עם 96 יתדות, שכל אחת מתוכננת להתאים בדיוק לבאר כאשר המכסה מונח על הפלטה. כדי לגרום להיווצרות ביופילם, כל באר של לוח סטרילי בן 96 בארות מולא ב-200 מיקרוליטר של מתליית חיידקים, ולאחר מכן הונחו מכסי יתד סטריליים על הלוח. הלוחות שהורכבו נדגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בתנאים סטטיים כדי לאפשר התפתחות ביופילם על הפנים. לאחר הדגירה, מכסי היתדות נשטפו בעדינות בצלחת 96 בארות המכילה 200 מיקרוליטר של 0.9% NaCl להסרת תאי פלנקטוניים. הפלטה עם היתדות הוטבלה בלוח נוסף עם 96 בארות שהכילה ונקומיצין בריכוזים מתקדמים (2–4,096 מ"ג/ליטר) ודגרה בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות בתנאים סטטיים.

הפלטה עם היתדות נשטפה בלוח 96 בארות המכיל 200 מיקרוליטר של 0.9% NaCl, והפינים הוטבעו בקפידה בפלטת TSA בקוטר 15 ס"מ ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. נצפתה גידול חיידקים, ו-MBEC הוגדר כרכוז הנמוך ביותר שבו לא התרחש צמיחה. כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים (איור 3).

figure-protocol-3
איור 3: מכשיר קלגרי ולוחות שטוחים עם 96 בארות מודפסים עם PLA ו-PETG. (A) מכשיר קלגרי מודפס עם PLA. (ב)לוחות שטוחים עם 96 בארים מודפסים ב-PLA. (C) מכשיר קלגרי מודפס עם PETG. (D) לוחות שטוחים עם 96 בארות מודפסים ב-PETG. קיצורים; PLA = חומצה פולילקטית; PETG = פוליאתילן טרפתלאט גליקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מערכת דינמית בתנאי זרימה רציפים
כל MRD מכיל חמישה יתדות נפרדות הקבועות בדגם ברג-הברג ומסודרות בקו ישר לאורך תעלה עם חתך מלבני. המערכת הדינמית כללה בקבוק המכיל 1 ליטר תמיסה עם האנטיביוטיקה לבדיקה, מחוברת למשאבה פריסטלטית באמצעות צינור סיליקון המחובר ל-MRD. ההרכבה בוצעה בארון זרימת אוויר למינרי כדי למנוע זיהום. קצב הזרימה הבינוני נשמר על 1 מ"ל לדקה והסתובב במערכת במשך 24 שעות. הנוזל העובר דרך ה-MRD נזרק לבקבוק זכוכית אחר (ללא סירקולציה מחודשת).

ביופילמים של S. aureus הושרו על הפינים של MRD, והפלו את הפינים על לוחות 24 בארות עם TSB עם 3 מ"ל בריכוז של 107 CFU/mL. היתדות נשטפו בעדינות בטבילה בצלחת בת 24 בארות הממולאת ב-3 מ"ל של תמיסת NaCl של 0.9%. היתדות הוברגו בזהירות לתוך ה-MRD (n = 5). תמיסת ונקומיצין (40 מ"ג/ליטר) מדוללת ב-0.9% NaCl הוזרמת דרך ה-MDR באמצעות המשאבה כפי שתואר לעיל למשך 24 שעות. קבוצת ביקורת ללא אנטיביוטיקה (0.9% NaCl) נכללה. ריכוז זה נבחר בהתבסס על ריכוז הסרום שהושג במינונים גבוהים של ונקומיצין תוך-ורידי, כפי שתוארקודם 24. הפינים הוסרו באופן אספטי מה-MRD באמצעות פינצטה סטרילית, הונחו במיקרופופרופסים המכילים 1 מ"ל של NaCl סטרילי 0.9% לאחר שטיפה עם 0.9% NaCl, וסוניקו באמבט אולטרסוני למשך 15 דקות ב-40 קילוהרץ ו-37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח ניתוק מוחלט של הביופילם. המיקרוצינורות עברו מערבולת במשך 60 שניות, וההליך חזר על עצמו שלוש פעמים כדי לשבש את האגרגטים הביופילמים שנותרו. אליקווטים של 100 מיקרוליטר צויפו ב-TSA, והלוחות דוגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. גידול החיידקים נמדד ובוטא כ-CFU/mL (איור 4).

figure-protocol-4
איור 4: מכשיר רובינס מותאם עם PETG ו-PLA ותמונה של המערכת הדינמית. (א) מכשיר רובינס מותאם שהודפס עם PETG או PLA. (ב) תמונה של המערכת הדינמית. קיצורים; PLA = חומצה פולילקטית; PETG = פוליאתילן טרפתלאט גליקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת
כדי להמחיש את המורפולוגיה והמבנה של הביופילמים, בוצעה מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM) על הדיסקים. ביופילם הושר על דיסקים כפי שמתואר בפרוטוקולים. הדיסקים הוסרו בזהירות מהצלחת באמצעות פינצטה סטרילית וקיבעו בתמיסה (0.68 גרם סוכרוז, 0.42 גרם קקודילט נתרן ו-0.6 מ"ל 30% גלוטראלדהיד), עם 19.4 מ"ל מים דה-יוניים, למשך 45 דקות. לאחר מכן, הדגימות הועברו לתמיסת בופר (0.68 גרם סוכרוז ו-0.42 גרם קקודילט נתרן) למשך 10 דקות. הדגימות יובשו לאחר מכן בסדרת אתנול מדורגת (35%, 50%, 70%, ו-100%) למשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן, הדגימות הועברו לצלחת פטרי אחרת וכוסו ב-100% הקסמתיל דיזילזאן למשך 10 דקות. לבסוף, הדיסקים צופו בזהב באמצעות משאבה סיבובית והותקנו על עמוד מתכת לתצפית בהגדלות שונות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 5).

figure-protocol-5
איור 5: מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת של מודלים מודפסים תלת-ממדיים PLA ו-PETG עם ובלי השראה ביופילם. (א) צילום מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של PLA ללא ביופילם. (B) צילום מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של PETG ללא ביופילם. (C) צילום מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של חיידקים יוצרים ביופילם על דיסקי PLA. (ד) צילום מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של חיידקים יוצרים ביופילם על דיסקי PETG. C ו-D מראים תכונות טיפוסיות של ביופילמים: ארגון חיידקים למבנה תלת-ממדי, היצמדות למשטחים, ונוכחות של מטריצה חוץ-תאית. פס קשקשים לבן מייצג 10 מיקרון. קיצורים; PLA = חומצה פולילקטית; PETG = פוליאתילן טרפתלאט גליקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח סטטיסטי
חלק מהניתוחים היו תיאוריים. בנתונים כמותיים, גודל המדגם הצדיק את השימוש בממוצע עם טווח בין-רבעוני, עם מבחן מאן-וויטני להשוואה סטטיסטית. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל דיסק של ביופילם סטטי
בדיקה זו משמשת לקביעת ה-MBEC על דגימות בודדות. דילול דו-כיפי של ונקומיצין הראה יצירת ביופילם בסיסית של 7.48 × 105 CFU/mL [IQR 6.34–8.72] עבור PLA ו-3.60 ×10 5 CFU/mL [IQR 3.08–5.52] עבור PETG. למרות ששני החומרים הראו צפיפויות ביופילם בטווח 105 , נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בייצור הביופילם ביניהם (p = 0.015). כאשר נחשף לונקומיצין, ה-MBEC היה 512 מ"ג/ליטר עבור שני החומרים (איור 6).

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציע הערכה מקיפהבמבחנה של יצירת ביופילם על פולימרים רפואיים מודפסים בתלת-ממד, במיוחד PLA ו-PETG, תוך שימוש בארבע פלטפורמות ניסוי משלימות: בדיקות דיסק סטטיות, מודלים של לוחות 24 בארות, ה-CBD, ומערכת זרימה דינמית המבוססת על MRD. על ידי שילוב מודלים אלו, המחקר שואף לאפיין כיצד חומרי הדפסה מובחנים מתנהגים כאשר הם נחשפים לאינדוקציה ביופילם של S. aureus, ולקבוע את ה-MBEC של ונקומיצין בתנאי בדיקה שונים. גישה רב-פרמטרית זו מאפשרת השוואה בין שונות תלויה בחומר בהידבקות מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין ניגודי עניינים. ChatGPT שימש לסקירת דקדוק.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות לרני פלימן על ההזמנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% NaClפרזניוס קבי ברזיל, קיארה, ברזיל17811
מדפסת תלת-ממד עם טכנולוגיית מידול פיוזד דפקידציה (Bambu X1-Carbon) מעבדת במבו, שנזן, סיןPF001-P
אגר דםNewProv, פאראן´, ברזילPA31
מכשיר קלגרי לביופילם להורדהאין חברהראו קישור (ללא מספרי קטלוג)https://www.printables.com/model/1464751-calgary-model-biofilm
צלחת רב-באר תרבית תאים, 24 בארגריינר ביו-וואן, קרמסם; נסטר ואומל; סטרייך, אוסטריה  662160
צנטריפוגה (5910 רי)אפנדורף, המבורג, גרמניה5943000511
צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"לקורנינג, מיזורי, ארה"ב430790
צינור צנטריפוגה סטרילי 50 מ"לקורנינג, מיזורי, ארה"ב430291
בקר פיפט אלקטרוני (Easypet® 3)אפנדורף, המבורג, גרמניה4430000018
אתנול (> 99.5%, תגובת ACS)סיגמא-אלדריץ', מיזורי, ארה"ב459844
גלוטראלדהידמרק, דרמשטאדט, גרמניה8143931000
הקסמתילדיזילזאןמרק, דרמשטאדט, גרמניה440191
חממה (502/4-C)פאנם, ס&אטילדה; פאולו, ברזיל502007700
ארון זרימת אוויר למינרי (BioSEG 9)וקו, ס&אטילדה; פאולו, ברזיל1EAC3770
פיפטה מכנית (Eppendorf Reference & reg; 2)אפנדורף, המבורג, גרמניה4924000061
מכשיר רובינס מותאם להורדהאין חברהראו קישור (ללא מספרי קטלוג)https://www.printables.com/model/1481700-robbins-device-modified
נפלומטר אלפאקיט, פלוריאן&אוקיוט; פוליס, ברזיל7718
משנע אורביטלי (INNOVA 44R)אפנדורף, המבורג, גרמניהM1282-0314
פאראפילם Mאמקור, אילינוי, ארה"בPM-996
משאבה פריסטלטית (מיניפולס&3)גילסון, וילייה-לה-בל, צרפתF117604
צלחת פטרי (90 x 15 מ"מ)גריינר ביו-וואן, Sã או פאולו, ברזיל630164
טיפ פיפטה 1– 200μ Lקורנינג, מיזורי, ארה"בCLS4142
פוליאתילן טרפתלאט גליקול (PETG)קריאליטי, סין44759
חומצה פולילקטית (PLA) אולטרפיוז & רג; PLA PRO1BASF, מרסן, הולנדPR1-7501A075
משאבה סיבובית (Q150R ES Plus)Quorum Technologies, לואיס, בריטניה13034
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (Vega3 LMU)טסקאן, ברנו, צ'כיהראו קישור (ללא מספרי קטלוג)https://tescan.com/product-portfolio
פיפטה סרולוגית 10 מ"לקורנינג, מיזורי, ארה"בCLS4488
נתרן קקודילאטסיגמא-אלדריץ', מיזורי, ארה"בC0250
סטפילוקוקוס אוראוס ATCC® זן 25923לבורקלין, פינייס, ברזיל660674
סוקרוזהסיגמא-אלדריץ', מיזורי, ארה"ב59378
ה-24 בארות שטוח להורדהאין חברהראו קישור (ללא מספרי קטלוג)www.printables.com/model/104339-24-well-plates 
טריפטית סויה אגר קסווי, מדריד, ספרדK25-1068
מרק סויה טריפטי  סיגמא-אלדריץ', מיזורי, ארה"ב22092
מקפיא אולטרה נמוך (IULT 335 D)אינדרל, פארןá, ברזיל12038
אמבטיה אולטרסונית (Soniclean 15)סנדרס מדיקל, מינאס ז'ראיס, ברזילראו קישור (ללא מספרי קטלוג)https://sandersdobrasil.com.br/produto/lavadora-ultrassonica-soniclean-15d/
ונקומיציןABL, Sã פאולו, ברזיל15,56,20,041
מערבולת (FLEXVORTEX)לוקוס, ס&אטילדה; פאולו, ברזיל4500

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kouhi, M., et al. Recent advances in additive manufacturing of patient-specific devices for dental and maxillofacial rehabilitation. Dent Mater. 40 (4), 700-715 (2024).
  2. Mamo, H. B., Adamiak, M., Kunwar, A. 3D printed biomedical devices and their applications: A review on state-of-the-art technologies, existing challenges, and future perspectives. J Mech Behav Biomed Mater. 143, 105930(2023).
  3. Przadka, M., et al. Advances in 3D printing applications for personalized orthopedic surgery: From anatomical modeling to patient-specific implants. J Clin Med. 14 (11), (2025).
  4. Ling, K., Wang, W., Liu, J. Current developments in 3D printing technology for orthopedic trauma: A review. Medicine (Baltimore). 104 (12), e41946(2025).
  5. Long, T., Tan, L., Liu, X. Three-dimensional printing in modern orthopedic trauma surgery: A comprehensive analysis of technical evolution and clinical translation. Front Med (Lausanne). 12, 1560909(2025).
  6. Cong, B., Zhang, H. Innovative 3D printing technologies and advanced materials revolutionizing orthopedic surgery: Current applications and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1542179(2025).
  7. Slavin, B. V., et al. 3D printing applications for craniomaxillofacial reconstruction: A sweeping review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (12), 6586-6609 (2023).
  8. Moncayo-Matute, F. P., et al. 3D printing and virtual surgical planning in craniofacial and thoracic surgery: Applications to personalised medicine. J Pers Med. 15 (9), (2025).
  9. Dimitrova, M., et al. Recent advances in 3D printing of polymers for application in prosthodontics. Polymers (Basel). 15 (23), (2023).
  10. Iqbal, J., et al. Recent advances of 3D-printing in spine surgery. Surg Neurol Int. 15, 297(2024).
  11. Hajnal, B., et al. Clinical applications of 3D printing in spine surgery: A systematic review. Eur Spine J. 34 (2), 454-471 (2025).
  12. Paul, G. M., et al. Medical applications for 3D printing: Recent developments. Mo Med. 115 (1), 75-81 (2018).
  13. Liaw, C. Y., Guvendiren, M. Current and emerging applications of 3D printing in medicine. Biofabrication. 9 (2), 024102(2017).
  14. Mendonça, C. J. aD., Dantas, L. R., Soni, J. F., Tuon, F. F. Antimicrobial action of a biodegradable thermoplastic impregnated with vancomycin for use in 3D printing technology. Braz Arch Biol Tech. 67, 13(2024).
  15. Dantas, L. R., Witt, M. A., Carneiro, E., Tuon, F. F. Nanoarchitectonics for advancing bone graft technology: Integration of silver nanoparticles against bacteria and fungi. Microorganisms. 12 (12), 2616(2024).
  16. Stewart, P. S., Bjarnsholt, T. Risk factors for chronic biofilm-related infection associated with implanted medical devices. Clin Microbiol Infect. 26 (8), 1034-1038 (2020).
  17. Amod, A., Anand, A. A., Sahoo, A. K., Samanta, S. K. Diagnostic and therapeutic strategies in combating implanted medical device-associated bacterial biofilm infections. Folia Microbiol (Praha). 70 (2), 321-342 (2025).
  18. Oliva, A., et al. Challenges in the microbiological diagnosis of implant-associated infections: A summary of the current knowledge. Front Microbiol. 12, 750460(2021).
  19. Veerachamy, S., Yarlagadda, T., Manivasagam, G., Yarlagadda, P. K. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proc Inst Mech Eng H. 228 (10), 1083-1099 (2014).
  20. Ortis, G. B., et al. Additive manufacturing, thermoplastics, CAD technology, and reverse engineering in orthopedics and neurosurgery applications to preventions and treatment of infections. Antibiotics (Basel). 14 (6), 561(2025).
  21. Coenye, T., Nelis, H. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. J Microbiol Methods. 83 (2), 89-105 (2010).
  22. Riga, E. K., Vohringer, M., Widyaya, V. T., Lienkamp, K. Polymer-based surfaces designed to reduce biofilm formation: From antimicrobial polymers to strategies for long-term applications. Macromol Rapid Commun. 38 (20), 1700216(2017).
  23. Soni, J. F., et al. Evaluation of silver nanoparticle-impregnated PMMA loaded with vancomycin or gentamicin against bacterial biofilm formation. Injury. 54 (6), 110649(2023).
  24. Borges, N. H., Suss, P. H., Ortis, G. B., Dantas, L. R., Tuon, F. F. Synergistic activity of vancomycin and gentamicin against Staphylococcus aureus biofilms on polyurethane surface. Microorganisms. 13 (5), 1119(2025).
  25. Pedroni, M. A., et al. Different concentrations of vancomycin with gentamicin-loaded PMMA to inhibit biofilm formation of Staphylococcus aureus and their implications. J Orthop Sci. 29 (1), 334-340 (2024).
  26. Tuon, F. F., et al. Antimicrobial treatment of Staphylococcus aureus biofilms. Antibiotics (Basel). 12 (1), 87(2023).
  27. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  28. Carstensen, S., et al. Transcriptional evaluation of functional genes of resistance, biofilm, and quorum sensing in ctx-m15 ESBL-producing Klebsiella pneumoniae after meropenem concentration based on serum level. Res Microbiol. , (2025).
  29. Kraft, L., Ribeiro, V. S. T., Goncalves, G. A., Suss, P. H., Tuon, F. F. Comparison of amphotericin B lipid complex, deoxycholate amphotericin B, fluconazole, and anidulafungin activity against Candida albicans biofilm isolated from breakthrough candidemia. Enferm Infecc Microbiol Clin (Engl Ed). 41 (10), 596-603 (2023).
  30. Chaiben, V., et al. A carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii outbreak associated with a polymyxin shortage during the COVID pandemic: An in vitro and biofilm analysis of synergy between meropenem, gentamicin, and sulbactam. J Antimicrob Chemother. 77 (6), 1676-1684 (2022).
  31. Da Rocha, L., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilm adherence to PEEK and titanium-alloy prosthetic spine devices. Eur J Orthop Surg Traumatol. 32 (5), 981-989 (2022).
  32. Mendonca, J. R., Dantas, L. R., Tuon, F. F. Activity of multipurpose contact lens solutions against Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, and Candida albicans biofilms. Ophthalmic Physiol Opt. 43 (5), 1092-1099 (2023).
  33. Koch, J. A., et al. Staphylococcus epidermidis biofilms have a high tolerance to antibiotics in periprosthetic joint infection. Life (Basel). 10 (11), 314(2020).
  34. Dunne, W. M. Jr Bacterial adhesion: Seen any good biofilms lately. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 155-166 (2002).
  35. Beckman, R. L. T., Cella, E., Azarian, T., Rendueles, O., Fleeman, R. M. Diverse polysaccharide production and biofilm formation abilities of clinical Klebsiella pneumoniae. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 151(2024).
  36. Dantas, L. R., Ortis, G. B., Suss, P. H., Tuon, F. F. Advances in regenerative and reconstructive medicine in the prevention and treatment of bone infections. Biology (Basel). 13 (8), 582(2024).
  37. Molina-Manso, D., et al. In vitro susceptibility to antibiotics of staphylococci in biofilms isolated from orthopaedic infections. Int J Antimicrob Agents. 41 (6), 521-523 (2013).
  38. Cieslinski, J., et al. Direct detection of microorganisms in sonicated orthopedic devices after in vitro biofilm production and different processing conditions. Eur J Orthop Surg Traumatol. 31 (6), 1113-1120 (2021).
  39. Fernandez-Grajera, M., Pacha-Olivenza, M. A., Fernandez-Calderon, M. C., Gonzalez-Martin, M. L., Gallardo-Moreno, A. M. Dynamic adhesive behavior and biofilm formation of Staphylococcus aureus on polylactic acid surfaces in diabetic environments. Materials (Basel). 17 (13), 3184(2024).
  40. Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), (2015).
  41. Sikdar, R., Elias, M. H. Evidence for complex interplay between quorum sensing and antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa. Microbiol Spectr. 10 (6), e0126922(2022).
  42. Kruger, H. C., et al. Antimicrobial action, cytotoxicity, calcium ion release, and pH variation of a calcium hydroxide-based paste associated with Myracrodruon urundeuva Allemao extract. Aust Endod J. 48 (1), 170-178 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

in vitro

מאמרים קשורים