הערכת השפעות טריפטוליד על גפירין בהיפוקמפוס, קוליביסטין ואוטופגיה במודל עכבר Aβ1-42

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הקמת מודל עכברים דמוי מחלת אלצהיימר שנגרמה על ידי Aβ1-42 וערכת השפעות הטריפטולידים על חלבוני מעכבים היפוקמפיים הקשורים לסינפזה, איתות PI3K/Akt/GSK-3β, וסמנים הקשורים לאוטופגיה.

תקציר

מחלת אלצהיימר קשורה לתפקוד לקוי סינפטי, אך נהלים סטנדרטיים להערכת האופן שבו פתולוגיה מושרה על ידי Aβ משפיעה על חלבונים מעכבים הקשורים לסינפסות ועל איתות אוטופגיה לאחר התערבות מועמדת נותרות מוגבלות. פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה להקמת מודל עכבר דמוי מחלת אלצהיימר המושרה על ידי Aβ1-42 והערכת השפעות הטריפטוליד על גפירין בהיפוקמפוס, קוליביסטין, איתות PI3K/Akt/GSK-3β וסמנים הקשורים לאוטופגיה. עכברים בוגרים מסוג C57BL/6J מקבלים הזרקה דו-צדדית של Aβ1-42 בתוך החדרים, שהוכנה בתנאים המעוררי הצטברות, ולאחר מכן מתן יומי תוך-פריטוניאלי של טריפטוליד עם או בלי מעכב PI3K LY294002. למידה מרחבית וזיכרון מוערכים באמצעות בדיקות מבוך מים של מוריס. פגיעה נוירונית בהיפוקמפוס והצטברות Aβ מוערכות על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין ואימונוהיסטוכימיה Aβ, וליזטים היפוקמפליים מנותחים על ידי ווסטרן בלוטינג לכימות גפירין, גפירין מזרחן, קוליביסטין, חלבוני איתות PI3K/Akt/GSK-3β, LC3-II/I, ו-p62. שיקולים פרוצדורליים מרכזיים כוללים הכנה סטנדרטית ל-Aβ1-42, הזרקה סטריאוטקסית מדויקת, תנאי בדיקה התנהגותיים עקביים, בחירת אזור עניין עיוורת, וניתוח תמונה וצפיפות סטנדרטי. באמצעות תהליך עבודה זה, מתן Aβ1-42 גרם לליקויים בלמידה מרחבית ובזיכרון, פגיעה בנוירונים בהיפוקמפוס, הצטברות Aβ, הפחתת ביטוי גפירין וקוליביסטין, שינוי באיתות PI3K/Akt/GSK-3β, והגברת הצטברות LC3-II/I ו-p62. טריפטוליד הפך חלקית את השינויים ההתנהגותיים, ההיסטולוגיים והמולקולריים הללו, בעוד LY294002 הפחית את השפעותיו. פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת שינויים מולקולריים בהיפוקמפוס המושרים על ידי Aβ והתערבויות מועמדות, תוך הכרה בכך שמודל זה אינו משחזר את ההתקדמות הכרונית והרב-גורמית של מחלת האלצהיימר בבני אדם.

מבוא

מחלת אלצהיימר (AD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המתאפיינת בירידה קוגניטיבית, פגיעה בזיכרון והפרעות התנהגותיות, והיא מהווה אחת הסיבות המובילות לדמנציה בקרב מבוגרים. למרות שהפקעת עמילואיד-β (Aβ), פתולוגיית טאו, תפקוד לקוי סינפטי, דלקת עצבית והומאוסטזיס חלבוני פגום היו מעורבים באופן נרחב בפתוגנזה של AD, המנגנונים המולקולריים המקשרים בין רעילות הקשורה ל-Aβ להפרעה מעכבת של חלבון סינפטי נותרו לא מובנים^במלואם 1,2,3,4 . תפקוד סינפטי מעכב עלול להפר את האיזון בין עירור לעיכוב במעגלים עצביים, ובכך לתרום לאי-יציבות ברשת ולפגיעה קוגניטיבית. עם זאת, אירועי האיתות התוך-תאי שמווסתים חלבוני פיגום מעכבים הקשורים לסינפסות בתנאים פתולוגיים דמויי AD המושרים על ידי Aβ דורשים הבהרה נוספת⁵.

גפירין הוא חלבון פיגום פוסט-סינפטי עיקרי שמעגן ומייצב קולטני נוירוטרנסמיטר מעכבים, כולל קולטני גליצין וקולטני חומצה γ-אמינובוטירית מסוג A, באתרים פוסט-סינפטיים⁶. קוליביסטין, המקודד על ידי ARHGEF9, הוא גורם חילוף נוקלאוטידי גואנין שמקיים אינטראקציה עם גפירין ומקדם את האשכול ואת מיקום הממברנה של רכיבים סינפטיים מעכבים⁷. האינטראקציה הפונקציונלית בין גפירין לקוליביסטין חיונית לכן לארגון, תחזוקה ופלסטיות של סינפסות מעכבות. הפרעה של קומפלקס חלבוני זה עלולה לפגוע בהעברת עצבים מעכבת ולתרום לליקויים קוגניטיביים. ראוי לציין כי יציבות גפירין ואשכול סינפטי ניתנים לוויסות באמצעות מנגנונים התלויים בזרחון. דווח כי איתות מקושר לאוליגומר Aβ משפיע על קינאזים כמו גליקוגן סינתאז קינאז-3β (GSK-3β), אשר עשוי לקדם זרחון גפירין בסרין 270 ובכך להשפיע על הצטברות ופירוק גפירין. ממצאים אלו מצביעים על כך שווסות גפירין בתיווך קינאז עשוי לייצג קשר מולקולרי חשוב בין פתולוגיה הקשורה ל-Aβ לבין תפקוד לקוי סינפטי מעכב ^8,9.

מסלול PI3K/Akt הוא מסלול איתות תוך-תאי מרכזי המעורב בהישרדות נוירונים, פלסטיות סינפטית, הומאוסטזיס חלבוני וויסות אוטופגיה. פעילות AKT יכולה לדכא את GSK-3β באמצעות פוספורילציה מעכבת, ובכך לווסת את הסובסטרטים במורד הזרם המעורבים בתפקוד הנוירונים וביציבות הסינפטית. דיסרגולציה של איתות PI3K/Akt/GSK-3β נקשרה לפגיעה נוירונית הקשורה ל-AD ועשויה לתרום הן לפגיעה סינפטית והן לפירוק חלבוני חריג^10,11. במקביל, אוטופגיה היא נתיב חיוני לפירוק תוך-תאי שמסר אברונים פגומים וחלבונים מקופלים בצורה שגויה. תפקוד לקוי של אוטופגיה-ליזוזום קשור קשר הדוק להצטברות Aβ, פתולוגיית טאו ונזק נוירוני^ב-12 לספירה. עם זאת, שינויים ב-LC3-II/I לבדם אינם יכולים להבחין בין היווצרות אוטופגוזומים מוגברת לבין פגיעה בפירוק האוטופגיה; לכן, נדרשים סמנים נוספים כמו P62 כדי להעריך טוב יותר שינויים בשטף הקשורים לאוטופגיה. יחד, תצפיות אלו תומכות בצורך לבחון פעילות PI3K/Akt, ויסות גפירין בתיווך GSK-3β, וסמנים הקשורים לאוטופגיה באותה מסגרת ניסויית.

טריפטוליד, דיטרפני טריאפוקסיד ביואקטיבי שבודד מ-Tripterygium wilfordii, דווח כמפעיל השפעות אנטי-דלקתיות, אימונומודולטוריות ומגני עצב¹³. מחקרים קודמים הציעו כי טריפטוליד יכול לשפר ביצועים קוגניטיביים ולשמר חלבונים מעכבים הקשורים לסינפסה במודלים דמויי AD. עם זאת, הקשר המכניסטי בין טיפול בטריפטוליד, הפעלת מסלול PI3K/Akt, זרחון גפירין בתיווך GSK-3β, ביטוי קוליביסטין ושינויים בחלבונים הקשורים לאוטופגיה טרם הוגדר במלואו. האם הטריפטוליד מווסת את ביטוי הגפירין והקוליביסטין בהיפוקמפוס דרך מנגנון הקשור ל-PI3K/Akt/GSK-3β במודל עכבר דמוי AD מושרה על ידי Aβ1-42 נותר לא ברור^14,15.

בהשוואה למודלים כרוניים של AD טרנסגניים, כגון עכברי APP/PS1 או 5xFAD, ומודלים מבוססי טאואופתיה, הזרקה תוך-תוך-חדרית של Aβ1-42 מצטברת מספקת גישה מהירה ונגישה טכנית לגרימת פגיעה בהיפוקמפוס הקשורה ל-Aβ ולפגיעה קוגניטיבית. פרוטוקול זה מתאים כאשר מטרת הניסוי היא להעריך נוירוטוקסיות קצרה הנגרמת על ידי Aβ, שינויים מולקולריים בהיפוקמפוס והשפעות הקשורות להתערבות על מסלולי איתות מוגדרים. עם זאת, מודל זה אינו משחזר את ייצור האמילואידים הכרוני, פתולוגיית הטאו, שינויים וסקולריים, מורכבות נוירואימונית או התקדמות תלויה בגיל של AD בבני אדם. לכן, יש לפרש את הממצאים באמצעות פרוטוקול זה כפתולוגיה דמוית AD שנגרמה על ידי Aβ ולהיות מאומתים באופן אידיאלי במודלים טרנסגניים כרוניים, מודלים הקשורים לטאו או מערכות נוירונים שמקורם באדם. למרות ראיות קודמות שקישרו פתולוגיה של Aβ, איתות PI3K/Akt/GSK-3β, חלבונים מעכבים הקשורים לסינפסות וחריגות הקשורות לאוטופגיה לפתולוגיה דמוית AD, מעטים הפרוטוקולים משלבים בדיקות התנהגותיות, הערכה היסטולוגית של ההיפוקמפוס, Aβ אימונוהיסטוכימיה, ניתוח חלבונים מעכבים הקשורים לסינפסה, הערכת איתות קינאז, וזיהוי סמנים הקשורים לאוטופגיה בתוך מודל התערבות מושרה על ידי Aβ1-42. פער מתודולוגי זה מגביל את ההערכה הניתנת לשחזור האם תרכובות מועמדות מווסתות שינויים בחלבוני סינפסה מעכבים דרך מסלולי איתות תוך-תאי מוגדרים.

מטרת פרוטוקול זה היא לספק זרימת עבודה ניתנת לשחזור להערכת ביטוי גפירין וקוליביסטין בהיפוקמפוס ומנגנוני הרגולציה הנלווים להם במודל עכבר דמוי AD מושרה על ידי Aβ1-42 ומטופל בטריפטוליד, עם או בלי מעכב PI3K LY294002. התרומה המקורית של עבודה זו היא שילוב מתן Aβ1-42 סטריאוטקסי, מודולציה פרמקולוגית של מסלולי איתות, בדיקות מבוך מים של מוריס, הערכה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית, וניתוח ווסטרן בלוט של חלבונים מעכבים הקשורים לסינפזה, איתות PI3K/Akt/GSK-3β, וסמנים הקשורים לאוטופגיה. ההשערה העובדת הייתה שפתולוגיה דמוית AD הנגרמת על ידי Aβ1-42 תהיה קשורה לפגיעה באיתות PI3K/Akt, שינוי בפוספורילציה של גפירין הקשור ל-GSK-3β, ירידה בביטוי גפירין וקוליביסטין בהיפוקמפוס, והצטברות חריגה של חלבונים הקשורים לאוטופגיה, בעוד שטיפול בטריפטוליד יהפוך חלקית את החריגות ההתנהגותיות והמולקולריות הללו.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הרפואית של אוניברסיטת הוביי לרפואה ובוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מס' SYXK2019-0031). כל ההליכים הכוללים בעלי חיים, Aβ1-42, טריפטוליד, LY294002, פאראפורמלדהיד, קסילן, אתנול וחומרים כימלומינסנטיים צריכים להתבצע עם ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. גופות בעלי חיים, רקמות מוח, צרכים מזוהמים ב-Aβ, פסולת פאראפורמלדהיד, פסולת קסילן וחומרים מזוהמים ב-ECL צריכים להיאסף בנפרד ולהיפטר בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מוסדית וטיפול בפסולת כימית. ניתוח תמונה בוצע באמצעות ImageJ. לצורך ניתוח אימונוהיסטוכימי, התמונות הומרו לגווני אפור של 8 ביט או עברו דה-קונבולוציה צבעונית לבידוד צביעת DAB חיובית. אותו סף הוחל על כל התמונות באותו ניסוי. נמדדו שטח הצביעה החיובי, שטח האזור הכולל והצפיפות המשולבת. ל-Western blotting, נמדדו עוצמות הרצועה באמצעות כלי ניתוח הג'ל לאחר חיסור רקע. רמות חלבוני המטרה נורמל ל-β-אקטין, בעוד שחלבונים מזוספורילטים נורמל לרמות החלבון הכוללות המתאימות להם.

החומרים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים, כולל שמות מוצרים, יצרנים, מספרי קטלוג או דגם, ותיאורים כלליים.

בעלי חיים וקיבוצים ניסיוניים
ארבעים ושמונה עכברים בוגרים מסוג C57BL/6J, כולל 24 זכרים ו-24 נקבות, בגילאי 10-12 שבועות ומשקל 22-28 גרם, נרכשו ממרכז הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת הוביי לרפואה. העכברים הוחזקו בתנאים מסוימים ללא פתוגנים בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס, עם גישה חופשית למים מאוטוקליים ולאוכל מכרסמים סטנדרטי. לאחר שבוע של הסתגלות, העכברים חולקו באקראי לארבע קבוצות: קבוצת הביקורת, קבוצת המודל דמוית AD שהושרה על ידי Aβ1-42, קבוצת הטיפול בטריפטוליד, וקבוצת הטיפול המשותף LY294002 ועוד טריפטוליד, עם 12 עכברים בכל קבוצה. העכברים הזכרים והנקבות היו מאוזנים בין הקבוצות באופן שווה ככל האפשר.

פפטיד Aβ1-42 הומס במי מלח נורמליים סטריליים לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מיקרוליטר. להכנת Aβ1-42 בתנאי הצברה, התמיסה נדגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים באמבט מים מחזור, ערבבה בעדינות לפני השימוש, ונשמרה על קרח במהלך ההזרקה. תנאי הכנה זה הותאם מהליכי אגרגציה שפורסמו קודם לכן ב-Aβ42. במחקר הנוכחי, מצב ההצטברות של אצווה מדויקת של Aβ1-42 שהוזרקה לא אופיין באופן עצמאי על ידי פלואורסצנציה של תיאופלבין T, SDS-PAGE/ווסטרן בלוטינג, או מיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית. לכן, המונח "Aβ1-42 מצטבר" בפרוטוקול זה מתייחס ל-Aβ1-42 שהוכן בתנאי דגירה המעוררי אגרגציה.

לצורך הקמת המודל, העכברים הורדמו על ידי הזרקה תוך-פריטוניאלית של 10% פנטוברביטל נתרן במינון של 0.04 מ"ל/10 גרם משקל גוף. הרדמה מספקת אושרה על ידי היעדר תסמיני גמילה מהפדלים ורפלקסים בקרנית. כל עכבר הוצמד לאחר מכן למכשיר סטריאוטקסי, והקרקפת גולחה וחוטאה ביודופור או 75% אתנול. בוצעה חתך בקו האמצע לחשיפת הגולגולת, והברגמה זוהתה תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ. הגולגולת הותאמה כך שהברגמה והלמדה ממוקמים באותו מישור אופקי.

הזרקות צדדיות דו-צדדיות בוצעו באמצעות הקואורדינטות הבאות ביחס לברגמה: אנטרופוסטריור, −0.50 מ"מ; בינוני, ±1.00 מ"מ; ודורסוונטרל, −3.00 מ"מ משטח הגולגולת. נפח כולל של 2 מיקרוליטר תמיסת Aβ1-42 מצטברת הוזרקה לאט (2 מיקרוליטר/דקה) לכל חדר צידי באמצעות מיקרו-מזרק. ההזרקה בוצעה במהירות נמוכה וקבועה כדי להפחית נזק לרקמות וריפלוקס. לאחר ההזרקה, המחט הושארתה במקום כ-5 דקות, ואז הוצאה לאט לאט. עכברי הביקורת קיבלו נפח שווה של תמלח סטרילי נורמלי באותם קואורדינטות ובשימוש באותו הליך ניתוחי. לאחר ההזרקה, החתך בקרקפת נסגר באמצעות תפרים או קליפסים, והעכברים הוכנסו לכלוב התאוששות מחומם עד שהתעוררו. ההחלמה לאחר הניתוח, משקל גוף, ריפוי פצעים, התנהגות טיפוחית, פעילות תנועה וסימני כאב או מצוקה נבדקו מדי יום.

התערבות תרופתית החלה שבועיים לאחר הזרקה סטריאוטקסית, לאחר שהמודל נחשב יציב. הטריפטוליד הומס במי מלח רגילים המכיל 4% פרופילן גליקול וניתן תוך-פריטונית פעם ביום במשך 30 ימים רצופים. קבוצת הטיפול בטריפטוליד קיבלה טריפטוליד במינון 0.2 מ"ג/ק"ג ביום, בעוד שקבוצת הטיפול המשותפת ב-LY294002 פלוס טריפטוליד קיבלה טריפטוליד יחד עם מעכב PI3K LY294002 ב-0.3 מ"ג/ק"ג פעם ביום במשך 30 ימים רצופים. קבוצת הביקורת וקבוצת הדגם הדומה ל-AD שהושרה על ידי Aβ1-42 קיבלו נפחים שווים של תמיסת רכב באמצעות אותו לוח הזרקה¹⁶.

מבחן מבוך מים של מוריס
למידה מרחבית וזיכרון הוערכו באמצעות מבוך המים מוריס 24 שעות לאחר מתן התרופה הסופי. מבוך המים כלל בריכה עגולה מלאה במים שנשמרה בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ± 1 מעלות צלזיוס. רמזים ויזואליים הוצבו סביב הבריכה ונשמרו ללא שינוי לאורך כל הניסוי. במהלך שלב הניווט במקום, הפלטפורמה הנסתרת הייתה קבועה ברבע המטרה. לפני הבדיקות בכל יום, העכברים הורשו להסתגל לחדר הבדיקה למשך כ-30 דקות.

מבחן הניווט בשטח נערך במשך 6 ימים רצופים. בכל ניסוי, העכבר הונח בעדינות למים, פונה לקיר הבריכה מאחד הרבעים ההתחלתיים, וניתן היה לחפש את הפלטפורמה הנסתרת עד 60 שניות. אם העכבר מצא את הפלטפורמה בתוך 60 שניות, הוא הורשה להישאר על הפלטפורמה במשך 15 שניות. אם העכבר לא הצליח לאתר את הפלטפורמה בתוך 60 שניות, הוא הונחה לפלטפורמה ואפשר לו להישאר שם במשך 20 שניות כדי לאפשר איחוד זיכרון מרחבי. כל עכבר עבר 4 ניסויים ביום, והשהיית הבריחה, מרחק השחייה ומהירות השחייה תועדו באמצעות מערכת מעקב וידאו אוטומטית.

ביום השביעי, הפלטפורמה הוסרה למשפט החקירה. העכבר הונח למים מהרבע שמול הפלטפורמה המקורית ואפשר לו לשחות בחופשיות במשך 60 שניות. נרשמו מספר חציית הפלטפורמות ואחוז הזמן שבילה ברבע היעד. לאחר כל ניסוי, העכבר יובש והוחזר לכלוב מחומם כדי למנוע היפותרמיה^17,18.

איסוף רקמות
לאחר בדיקות התנהגות, העכברים הורדמו עמוקות באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של 10% פנטוברביטל נתרן במינון של 0.04 מ"ל/10 גרם משקל גוף. שמונה עכברים מכל קבוצה נבחרו באקראי להפקת חלבון בהיפוקמפוס. מוחם הוסר במהירות על קרח, ורקמות היפוקמפוס דו-צדדיות ננתקו על משטח קר כקרח. דגימות ההיפוקמפוס הונחו בקריוביאלים מסומנים מראש, הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי, ונשמרו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד להפקת חלבון.

ארבעת העכברים הנותרים מכל קבוצה שימשו לניתוחים היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים. בהרדמה עמוקה, העכברים עברו פרפיוז טרנסקרדיאלי עם מי מלח מפוזרים בפוספט עד שהכבד הפך לחיוור, ואחריו 4% פאראפורמלדהיד. המוחות הוסרו בזהירות והוכנסו לפוסט ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות. לאחר הקיבוע הוקבע, רקמות המוח הוגשו לפלטפורמת הניסוי לפתולוגיה, שם בוצעו הטמעת פרפין וחתך לאחר מכן. פאראפורמלדהיד טופל במכסה אדים כימיקלים, ופסולת המכילה פאראפורמלדהיד נאספה בנפרד בהתאם לדרישות מוסדות להשלכת פסולת כימית.

צביעת המטוקסילין ואאוזין
רקמות מוח מוטמעות בפרפינים נחתכו לחתכים קורונליים בגודל 4 מיקרון המכילים את ההיפוקמפוס. החלקים נאפו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך שעה, דה-פרפין פעמיים בקסילן למשך 10 דקות כל אחד, והודרו מחדש באמצעות תמיסות אתנול מדורגות (100%, 95%, 85% ו-75%) ואחריהן מים מזוקקים (5 דקות לכל שלב). לאחר ההידרציה מחודשת, קטעים צובקו בהמטוקסילין במשך 10 דקות, נשטפו במי ברז זורמים, הובדלו לזמן קצר באלכוהול חומצי (2 שניות) במידת הצורך, וכחולו במי ברז זורמים. החלקים צובעו לאחר מכן באאוזין למשך 5 דקות, יובשו באמצעות אתנול מדורג, נוקו פעמיים בקסילן במשך 5 דקות כל אחד, והותקנו בשרף נייטרלי.

מורפולוגיה של ההיפוקמפוס נצפתה תחת מיקרוסקופ אור. התמונות נלקחו מאותו תת-אזור היפוקמפלי בכל הקבוצות, תוך שימוש בפרמטרים של הגדלה והדמיה של 20×. הנזק הנוירוני הוערך על בסיס צפיפות נוירונים, פיקנוזיס גרעיני וסידור לא מסודר באמצעות תוכנת ניתוח תמונה על ידי חוקר עיוור להקצאת קבוצות¹⁹.

Aβ אימונוהיסטוכימיה
באימונוהיסטוכימיה של Aβ, מקטעי הפרפין עברו דה-פרפין והודרו מחדש כפי שתואר לצביעת המטוקסילין ואאוזין. שליפת אנטיגנים בוצעה בבופר שחזור אנטיגנים ב-EDTA ב-pH 8.0 על ידי חימום החלקים במיקרוגל בעוצמה גבוהה למשך 3 דקות פעמיים. החלקים הורשו להתקרר לטמפרטורת החדר ואז נשטפו שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד. פעילות פרוקסידאז אנדוגנית נחסמה עם 3% מי חמצן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריה שטיפה של PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת. קישור לא ספציפי נחסם עם 5% סרום עזים רגיל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. החתכים נבנו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני נגד Aβ מדולל ב-1:200 ב-PBS. לאחר הדגירה, החלקים נשטפו שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד, ואז דגרו בנוגדן משני מצ'וגט ל-HRP למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה עם PBS, הונח מצע DAB והתפתחות הצבע נבדקה תחת מיקרוסקופ. התגובה נעצרה במים מזוקקים ברגע שצביעת חום-חיובית נראית. החלקים צוברו בהמטוקסילין, יובשו באמצעות אתנול מדורג, נוקו בקסילן, והותקנו בשרף נייטרלי. התמונות צולמו מאותו תת-אזור היפוקמפלי בכל הקבוצות באמצעות הגדרות מיקרוסקופ זהות בהגדלה של 20×. Aβ אימונוסיינינג נמדד באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. סף הצביעה החיובי נשמר עקבי בכל התמונות, והפקדת Aβ חושבה כשטח הצביעה החיובי חלקי מספר התאים הכולל בכל שדה מיקרוסקופי.

חילוץ חלבון היפוקמפוס וניתוח כתם מערבי
רקמות היפוקמפוס קפואות נשמרו על קרח והומוגניזציה בבופר RIPA קר המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז. ההומוגנטים הודגרו על קרח במשך 30 דקות והופנו לסירוגין כדי להבטיח פירוק מספק. לאחר מכן ליזטים צנטריפוגים ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנטים נאספו לניתוח חלבונים. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA לפי הוראות היצרן. בקצרה, דגימות תקני BSA וחלבון הוכנו בשכפול, מעורבבים עם תגובת BCA עובדת, הודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ונמדדו ב-562 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. ריכוזי החלבון חושבו לפי העקומה הסטנדרטית, וכל הדגימות הותאמו לאותו ריכוז סופי לפני אלקטרופורזה²⁰.

20 מיקרוגרם של חלבון כולל מכל דגימת היפוקמפוס הופרדו על ידי 12% SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF. האלקטרופורזה בוצעה ב-80 וולט לערימה ו-120 וולט להפרדה. החלבונים הועברו לממברנות PVDF שהופעלו במתנול באמצעות העברה רטובה ב-100 וולט למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר ההעברה, הממברנות נחסמו עם 5% BSA למשך שעה בטמפרטורת החדר. הממברנות נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד גפירין (דילול 1:1000), גפירין מזרחן (דילול 1:500), קוליביסטין (דילול 1:1000), PI3K (דילול 1:1000), Akt (דילול 1:1000), אקט מזרחן (דילול 1:1000), GSK-3β (דילול 1:1000), GSK-3β מזרחרח (דילול 1:1000), LC3 (דילול 1:1000), p62 (דילול 1:1000) ו-β-אקטין (דילול 1:5000). לאחר שטיפה עם TBST, הממברנות נדגרו בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעה בטמפרטורת החדר (דילול של 1:5000). רצועות חלבון הוצגו באמצעות מצע כימי לומינסנטי ECL ונלכדו באמצעות מערכת הדמיה כימלומינסנטית. עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. רמות הביטוי הכולל של החלבון נורמל ל-β-אקטין. תמונות ווסטרן בלוט לא חתוכות ברזולוציה גבוהה נכללו בחומרים המשלימים שלו.

נתונים סטטיסטיים
הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח סטטיסטי ותוכנות ליצירת גרפים. הנתונים הובאו לידי ביטוי כממוצע ± SD, כפי שמצוין בכתובות האיורים. בדיקות התנהגות וכימות תמונה בוצעו על ידי חוקרים שהיו עיוורים להקצאת קבוצות. השהיה הבריחה במהלך שלב האימון במבוך המים של מוריס נותחה באמצעות ANOVA דו-כיווני עם מדידות חוזרות, כאשר קבוצה ויום אימון היו גורמים. נתוני ניסויי הגשוש, כימות היסטולוגי, כימות אימונוהיסטוכימי וצפיפות ווסטרן בלוט נותחו באמצעות בדיקת ANOVA חד-כיוונית. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05. סימון מובהקות סטנדרטי שימש כך: *p < 0.05, **p < 0.01, ו-***p < 0.001. גודל המדגם המדויק דווח באגדות האיורים המתאימים. עכברים זכרים ונקבות היו מפוזרים באופן שווה בין קבוצות הניסוי. עם זאת, לא בוצע ניתוח סטטיסטי מדורג מין, משום שהמחקר לא תוכנן או קיבל כוח לזהות השפעות ספציפיות למגדר. מגבלה זו מוכרת בסעיף הדיונים.

תוצאות

פגיעה בלמידה ובזיכרון בעכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 ושיפור חלקי לאחר טיפול בטריפטוליד

כדי להקים מודל עכבר דמוי AD מושרה על ידי Aβ1-42, הוזרק Aβ1-42 המאוגד באופן סטריאוטקסי לחדרים הצדדיים הדו-צדדיים של עכברי C57BL/6J. לאחר הקמת הדגם, העכברים טופלו בכלי רכב, טריפטוליד או טריפטוליד בשילוב עם מעכב PI3K LY294002. למידה מרחבית וזיכרון הוערכו לאחר מכן באמצעות מבוך המים מוריס.

במהלך שלב הניווט של 6 ימים, השהיה הבריחה ירדה בהדרגה בכל הקבוצות, מה שמעיד שהעכברים השיגו את משימת הלמידה המרחבית באמצעות אימון חוזר (איור 1A). עם זאת, עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 הראו השהיה בריחה ארוכה יותר בעקביות מאשר עכברי ביקורת, במיוחד בימי האימון המאוחרים יותר, מה שמעיד על פגיעה בלמידה מרחבית. טיפול בטריפטוליד קיצר את השהיה הבריחה בהשוואה לקבוצת המודל הדומה ל-AD שנגרם על ידי Aβ1-42, בעוד שטיפול משותף עם LY294002 החליש את השיפור הזה. ממצאים אלו מצביעים על כך שטריפטוליד שיפר חלקית את הפגיעה בלמידה מרחבית שנגרמה על ידי Aβ1-42, והשפעה זו הוחלשה על ידי עיכוב PI3K.

מסלולי שחייה ייצוגיים תמכו עוד יותר בשינויים ההתנהגותיים הללו (איור 1B). עכברי בקרה הראו דפוס חיפוש ישיר יותר, ממוקד מטרה, סביב מיקום הפלטפורמה, בעוד שעכברים דמויי AD שהושרו על ידי Aβ1-42 הציגו מסלול שחייה מפוזר ולא יעיל. עכברים שטופלו בטריפטוליד הראו שיפור בהתנהגות החיפוש, כאשר המסלולים מרוכזים יותר סביב אזור היעד. לעומת זאת, עכברים שטופלו ב-LY294002 ובטריפטוליד הראו חיפוש יעיל פחות מאלו שטופלו בטריפטוליד בלבד. בניסוי הגשוש שנערך לאחר הסרת הפלטפורמה, עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 חצו את מיקום הפלטפורמה המקורי פחות פעמים מעכברי ביקורת, מה שמעיד על פגיעה בשימור זיכרון מרחבי (איור 1C). טיפול בטריפטוליד הגדיל את מספר חציית הפלטפורמות, בעוד שהטיפול המשותף LY294002 הפחית אפקט זה. באופן דומה, אחוז הזמן שבילה ברבע המטרה ירד בעכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 לעומת עכברי ביקורת, עלה לאחר טיפול בטריפטוליד, וירד שוב לאחר טיפול משותף LY294002 (איור 1D).

יחד, תוצאות התנהגותיות אלו מראות כי הזרקה דו-צדדית של Aβ1-42 מצטבר בכירה למידה מרחבית וחסרי זיכרון במרחב בעכברים. טריפטוליד הפך חלקית את הליקויים ההתנהגותיים הללו, בעוד LY294002 הפחית את אפקט ההגנה של הטריפטוליד, מה שמרמז כי איתות PI3K/Akt עשוי לתרום להשפעות ההתנהגותיות שנצפו במודל זה.

הזרקת Aβ1-42 גרמה לפגיעה עצבית בהיפוקמפוס ולהצטברות Aβ, שהוחלשה על ידי טריפטוליד

כדי לאמת עוד יותר את הקמת שינויים פתולוגיים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 ולהעריך את השפעת הטריפטוליד על פגיעה בהיפוקמפוס, בוצעו צביעות המטוקסילין ואאוזין ואימונוהיסטוכימיה Aβ על חתכי מוח מכל קבוצה.

צביעת HE הראתה כי הנוירונים בקבוצת הביקורת היו מסודרים בצפיפות ובסדירות, עם מורפולוגיית תאים ומבנה גרעיני ברורים יחסית (איור 2A). לעומת זאת, עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 הראו נזק נוירוני היפוקמפלי ברור, שהתאפיין בסידור תאים לא מסודר, ירידה בצפיפות נוירונים ועיבוי גרעיני מוגבר. טיפול בטריפטוליד שיפר חלקית את המורפולוגיה הנוירונית של ההיפוקמפוס, עם סידור תאי שמור יותר ופיקינוזה גרעינית פחות בולטת בהשוואה לקבוצת המודל המושרה על ידי Aβ1-42. עם זאת, טיפול משותף עם LY294002 הפחית את האפקט המגן של טריפטוליד, כפי שמשתקף בחוסר סדר ופגיעה נוירונים בולטים יותר בהשוואה לקבוצת הטיפול בטריפטוליד.

לאחר מכן בוצעה אימונוהיסטוכימיה Aβ להערכת שקיעת Aβ בהיפוקמפוס (איור 2B). צביעת Aβ חיובית מינימלית נצפתה בקבוצת הביקורת, בעוד שבקבוצת המודל דמוית AD שנגרמה על ידי Aβ1-42 הראתה עלייה משמעותית באותות חומים של Aβ חיובי. טיפול בטריפטוליד הפחית צביעה חיובית ב-Aβ בהשוואה לקבוצת המודל, מה שמעיד כי טריפטוליד החליש את השקיעת Aβ במודל זה. לעומת זאת, עכברים שטופלו ב-LY294002 פלוס טריפטוליד הראו צביעה חיובית מוגברת ב-Aβ בהשוואה לעכברים שטופלו בטריפטוליד בלבד. ניתוח כמותי אישר עוד יותר את התצפיות ההיסטולוגיות הללו. שטח האות החיובי Aβ המנורמל למספר התאים הכולל בכל שדה מיקרוסקופי גדל בקבוצת המודל הדמוי AD שנגרם על ידי Aβ1-42 בהשוואה לקבוצת הביקורת, הופחת לאחר טיפול בטריפטוליד, ועלה שוב חלקית לאחר טיפול משותף LY294002 (איור 2B).

תוצאות אלו מצביעות על כך שהזרקת Aβ1-42 גרמה לפגיעה בנוירונים בהיפוקמפוס ולהצטברות Aβ, בעוד שטריפטוליד הקל חלקית על שינויים פתולוגיים אלה. ההיפוך שנצפה לאחר טיפול משותף LY294002 מצביע על כך שאיתות PI3K/Akt עשוי לתרום לאפקט ההגנה של הטריפטוליד.

טריפטוליד החזיר את ביטוי הגפירין והקוליביסטין בהיפוקמפוס ווויתן את האיתות PI3K/Akt/GSK-3β

כדי לקבוע האם השינויים ההתנהגותיים וההיסטולוגיים לוו בשינויים בחלבוני סינפסה מעכבים ובאיתות הרגולציה שלהם במעלה הזרם, נותחו ליזטים היפוקמפליים מכל קבוצה באמצעות Western blotting. בהשוואה לקבוצת הביקורת, עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 הראו ירידה ניכרת בביטוי הגפירין בהיפוקמפוס, בעוד שרמות הגפירין המזרחנים עלו (איור 3A). טיפול בטריפטוליד החזיר חלקית את ביטוי הגפירין הכולל והפחית את רמות הגפירין המזורחן. לעומת זאת, טיפול משותף LY294002 החליש את השפעת הטריפטוליד, כפי שהודגם על ידי ביטוי גפירין מופחת והגברת הגפירין המזרחן בהשוואה לקבוצת הטיפול בטריפטוליד. תוצאות אלו מצביעות על כך שפתולוגיה שנגרמה על ידי Aβ1-42 הייתה קשורה לא רק להפחתת שפע הגפירין בהיפוקמפוס אלא גם לשיפור הזרחון הגפיריני, בעוד שטריפטוליד הפך חלקית את השינויים הללו.

קוליביסטין הראה דפוס ביטוי דומה לזה של גפירין כולל. עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 הראו ביטוי קוליביסטין מופחת בהיפוקמפוס בהשוואה לעכברי ביקורת, בעוד שטיפול בטריפטוליד שיקם ביטוי קוליביסטין. LY294002 טיפול משותף הפך חלקית את האפקט הזה (איור 3B). ממצאים אלו מצביעים על כך שטריפטוליד שמר על הביטוי של חלבוני פיגום מעכבים הקשורים לסינפסות בהיפוקמפוס, והשפעה זו הוחלשה על ידי עיכוב PI3K. מסלול האיתות PI3K/Akt/GSK-3β נבדק לאחר מכן כדי להבהיר עוד יותר את השינויים המולקולריים שמאחורי זרחון גפירין. בקבוצת המודל הדמוי AD שהושרה על ידי Aβ1-42, ביטוי PI3K ויחס p-Akt/Akt הופחתו בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמעיד על פגיעה בפעילות איתות PI3K/Akt (איור 3B). יחס p-GSK-3β/GSK-3β גם הוא הופחת בקבוצת המודלים. מכיוון שזרחון GSK-3β באתר המעכב משקף דיכוי פעילות GSK-3β, הפחתה זו מצביעה על פעילות GSK-3β מוגברת יחסית בהיפוקמפוס דמוי AD המושרה על ידי Aβ1-42. טיפול בטריפטוליד הגביר את ביטוי PI3K, החזיר את יחס p-Akt/Akt, והעלה את יחס p-GSK-3β/GSK-3β. השפעות אלו הוחלשו בעקבות טיפול משותף LY294002.

יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שפתולוגיה דמוית AD שנגרמה על ידי Aβ1-42 הייתה קשורה להפחתת ביטוי גפירין וקוליביסטין בהיפוקמפוס, להגברת פוספורילציה של גפירין, ולפגיעה בזרחון מעכב בתיווך PI3K/Akt של GSK-3β. טריפטוליד הפך חלקית את השינויים המולקולריים הללו, בעוד LY294002 הפחית את השפעות הטריפטוליד, ותמך במעורבות האיתות PI3K/Akt/GSK-3β בוויסות גפירין וקוליביסטין בהיפוקמפוס במודל זה.

טריפטוליד החליש חריגות חלבונים הקשורות לאוטופגיה בהיפוקמפוס של עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42

כדי לקבוע האם פתולוגיה דמוית AD וטיפול בטריפטוליד שנגרמו על ידי Aβ1-42 קשורים לשינויים בחלבונים הקשורים לאוטופגיה, נבדקו ביטוי LC3 ו-p62 בליזטים היפוקמפליים באמצעות Western blotting. בהשוואה לקבוצת הביקורת, עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42 הראו יחס LC3-II/I מוגבר, מה שמעיד על הצטברות מוגברת של LC3-II הקשור לאוטופגוזומים. במקביל, ביטוי p62 גם הוא עלה בקבוצת המודלים, מה שמרמז על הצטברות של תת-קרקעים הקשורים לאוטופגיה בהיפוקמפוס. טיפול בטריפטוליד הפחית הן את יחס LC3-II/I והן את ביטוי p62 בהשוואה לקבוצת מודל דמוית AD שנגרמה על ידי Aβ1-42. תוצאות אלו מצביעות על כך שהטריפטוליד החליש את ההצטברות הלא תקינה של חלבונים הקשורים לאוטופגיה שנגרמה על ידי Aβ1-42. לעומת זאת, טיפול משותף LY294002 העלה את יחס LC3-II/I ואת ביטוי p62 בהשוואה לטיפול בטריפטוליד בלבד, מה שמרמז כי עיכוב PI3K הפחית את השפעת הטריפטוליד על שינויים חלבונים הקשורים לאוטופגיה (איור 4).

בסך הכול, קבוצת הביקורת סיפקה את הפרופיל הבסיסי ההתנהגותי, ההיסטולוגי והמולקולרי, בעוד שקבוצת המודל דמוי AD שהושרה על ידי Aβ1-42 אישרה כי מתן Aβ1-42 תוך-חדרי גרם לפגיעה קוגניטיבית, פגיעה נוירונית בהיפוקמפוס, הצטברות Aβ, הפחתת חלבונים מעכבים הקשורים לסינפזה, שינויים באיתות PI3K/Akt/GSK-3β, והצטברות חלבונים הקשורים לאוטופגיה. ההשוואה בין קבוצת המודל שהושרה על ידי Aβ1-42 לבין קבוצת הטיפול בטריפטוליד הראתה כי טריפטוליד הפך חלקית את החריגות הללו. ההשוואה בין קבוצת הטיפול בטריפטוליד לבין קבוצת הטיפול המשותף ב-LY294002 פלוס טריפטוליד הראתה עוד כי עיכוב PI3K הפחית את השפעות הטריפטוליד. תוצאות אלו תומכות בהשערת העבודה כי טריפטוליד מווסת שינויים בגפירין, קוליביסטין וחלבונים הקשורים לאוטופגיה בהיפוקמפוס במודל דמוי AD מושרה על ידי Aβ1-42 באמצעות מנגנון PI3K/Akt/GSK-3β.

זמינות נתונים:

כל הנתונים הגולמיים הנדרשים לשחזור ממצאי מחקר זה מסופקים כקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2. אלה כוללים את תמונות הבלוט והג'ל המערביות המקוריות, נתוני כתם לא חתוכים, ערכים מספריים גולמיים המשמשים לניתוחים סטטיסטיים, והגרפים שנוצרו. (קובץ משלים 1 ותיק משלים 2) קבצים אלו מספקים את הנתונים הגולמיים התומכים בתוצאות הכמותיות המדווחות באיור 1–4.

איור 1: טריפטוליד שיפר חלקית ליקויים בלמידה מרחבית ובזיכרון בעכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42. (א) עיכוב בריחה במהלך שלב הניווט במיקום בן 6 ימים במבוך המים מוריס. (ב) מסלולי שחייה ייצוגיים במהלך ניסוי החקירה. (ג) מספר המעברים מעל מיקום הרציף המקורי לאחר הסרת הרציף. (ד) אחוז הזמן שבילה ברבע המטרה במהלך ניסוי החקירה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. עיכוב הבריחה נותח באמצעות ANOVA דו-כיווני עם מדידות חוזרות, ונתוני ניסוי הבדיקה נותחו באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני. Ctr, קבוצת ביקורת; AD, קבוצת מודל דמוית AD מושרה על ידי Aβ1-42; TP, קבוצת טיפול בטריפטוליד; LY, LY294002 וקבוצת טיפול משולב בטריפטוליד. n = 6 לכל קבוצה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: פגיעה עצבית מהיפוקמפוס מוחלשת על ידי טריפטוליד והפקדת Aβ בעכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42. (א) תמונות ייצוגיות של המטוקסילין ואאוזין של חתכי היפוקמפוס מכל קבוצה. פס קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) תמונות צביעה אימונוהיסטוכימיות מייצגות של Aβ וניתוח כמותי של הפקדה חיובית Aβ בהיפוקמפוס. פס קנה מידה = 50 מיקרון. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני. Ctr, קבוצת ביקורת; AD, קבוצת מודל דמוית AD מושרה על ידי Aβ1-42; TP, קבוצת טיפול בטריפטוליד; LY, LY294002 וקבוצת טיפול משולב בטריפטוליד. n = 3 לכל קבוצה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: טריפטוליד החזיר את ביטוי הגפירין והקוליביסטין בהיפוקמפוס ומווסת את האיתות הקשור ל-PI3K/Akt/GSK-3β בעכברים דמויי AD המושרים על ידי Aβ1-42. (א) תמונות מייצגות של כתם מערבי וניתוח כמותי של ביטוי כולל של גפירין וגפירין מזרחן בליזטים היפוקמפיים מכל קבוצה. (B) תמונות ייצוגיות של כתם מערבי וניתוח כמותי של קוליביסטין, PI3K, Akt, אקט מזרחן, GSK-3β, ו-GSK-3β מזרחן בליזטות היפוקמפליות. קוליביסטין ו-PI3K נורמל ל-β-אקטין. Akt מזורחן ו-GSK-3β המזורחנים נמדדו בהתאמה כיחס p-Akt/Akt ו-p-GSK-3β/GSK-3β. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני. Ctr, קבוצת ביקורת; AD, קבוצת מודל דמוית AD מושרה על ידי Aβ1-42; TP, קבוצת טיפול בטריפטוליד; LY, LY294002 וקבוצת טיפול משולב בטריפטוליד. n = 3 לכל קבוצה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: טריפטוליד החליש חריגות חלבונים הקשורות לאוטופגיה בהיפוקמפוס של עכברים דמויי AD שנגרמו על ידי Aβ1-42. תמונות מייצגות של כתם מערבי וניתוח כמותי של ביטוי LC3-I/II ו-p62 בליזטים היפוקמפיים מכל קבוצה. יחס LC3-II/I חושב על ידי חלוקת עוצמת רצועת LC3-II בעוצמת רצועת LC3-I, והביטוי של p62 נורמל ל-β-אקטין. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני. Ctr, קבוצת ביקורת; AD, קבוצת מודל דמוית AD מושרה על ידי Aβ1-42; TP, קבוצת טיפול בטריפטוליד; LY, LY294002 וקבוצת טיפול משולב בטריפטוליד. n = 3 לכל קבוצה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1: תמונות כתם מערבי לא חתוכות. הרצועות המשמשות לכימות מסומנות, וסמני משקל מולקולרי מוצגים כאשר זמינים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: ערכים מספריים גולמיים המשמשים לניתוחים סטטיסטיים במאמר זה. קובץ זה מכיל את מערכי הנתונים המספריים הגולמיים ששימשו ליצירת הגרפים הכמותיים באיור 1–4, כולל מדידות התנהגותיות של מבוך מים של מוריס, כימות אימונוהיסטוכימיה Aβ, וערכי צפיפות ווסטרן בלוט. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

ההצעה המכניסטית המרכזית של מחקר זה היא שהפתולוגיה המושרת על ידי Aβ1-42 מדכאת איתות PI3K/Akt, מפחיתה פוספורילציה מעכבת של GSK-3β, מקדמת זרחון גפירין, מפחיתה את ביטוי הגפירין והקוליביסטין בהיפוקמפוס, ותורמת להצטברות חלבונים הקשורים לאוטופגיה, בעוד שטריפטוליד מנטרל חלקית את השינויים הללו באמצעות מסלול הקשור ל-PI3K/Akt/GSK-3β. מחקר זה מראה כי פתולוגיה דמוית AD הנגרמת על ידי Aβ1-42 מלווה בלמידה ובזיכרון מרחביים פגועים, פגיעה בנוירונים מהיפוקמפוס, הגברת הצטברות Aβ, ירידה בביטוי גפירין וקוליביסטין, שיפור בפוספורילציה של גפירין, שינוי באיתות PI3K/Akt/GSK-3β, והצטברות חלבונים הקשורים לאוטופגיה. טריפטוליד הפך חלקית את החריגות ההתנהגותיות, ההיסטולוגיות והמולקולריות הללו, בעוד LY294002 הפחית את השפעותיו. ממצאים אלו תומכים במודל שבו טריפטוליד מגן על חלבונים מעכבים בהיפוקמפוס הקשורים לסינפזה, לפחות בחלקו, באמצעות ויסות PI3K/Akt/GSK-3β של זרחון גפירין ושינויים בחלבונים הקשורים לאוטופגיה. יש לציין כי מודל ההזרקה התוך-חדרית של Aβ1-42 משקף בעיקר נוירוטוקסיות ופתולוגיה דמוית AD הנגרמת על ידי Aβ, ולא את ההתקדמות הכרונית ורב-הגורלית המלאה של AD²¹ בבני אדם.

גפירין וקוליביסטין הם רכיבים מרכזיים בארגון סינפטי מעכב. גפירין מעגן קולטני נוירוטרנסמיטר מעכבים באתרים פוסט-סינפטיים, בעוד ש-Collybistin מקדם אשכולות גפירין ומיקום ממברנה. לכן, ביטוי מופחת של חלבונים אלו עלול להפריע ליציבות הסינפטית המעכבת ולתרום לפגיעה בתפקוד רשת ההיפוקמפוס⁸. במחקר זה, Aβ1-42 הפחית את ביטוי הגפירין והקוליביסטין בהיפוקמפוס, בעוד שהטריפטוליד השיב את שני החלבונים. העלייה בגפירין המזרחן מספקת מנגנון סביר לאובדן גפירין, שכן פוספורילציה ב-Ser270 נקשרה לפיזור גפירין, הפחתת אשכולות וחוסר יציבות חלבון. ההפחתה המקבילה בביטוי PI3K, פוספורילציית Akt ופוספורילציה מעכבת של GSK-3β מרמזת ש-Aβ1-42 מחליש את איתות PI3K/Akt ועשוי להגדיל את פעילות GSK-3β, דבר התואם לשיפור הזרחון הגפירין. לעומת זאת, טריפטוליד החזיר את הפוספורילציה של Akt, הגביר את הפוספורילציה המעכבת של GSK-3β, והפחית את הפוספורילציה של גפירין, בעוד LY294002 החליש את ההשפעות הללו. תוצאות אלו מצביעות על כך שטריפטוליד עשוי לשמר את ביטוי הגפירין והקוליביסטין באמצעות ויסות הקשור ל-PI3K/Akt/GSK-3β של פוספורילציה של גפירין. עם זאת, מכיוון שנעשה שימוש בליזטים היפוקמפיים שלמים, ממצאים אלו משקפים שינויים בשפע חלבוני ההיפוקמפוס ובפוספורילציה ולא עדות ישירה למיקום סינפטי^22,23.

חריגות הקשורות לאוטופגיה עשויות גם הן לתרום לשינויים המולקולריים שנצפו במודל זה. אוטופגיה חשובה לפרוטאוסטזיס נוירוני, אך פגיעה בהתדרדרות אוטופגית ב-AD עלולה להוביל להצטברות של אוטופגוזומים וסובסטרטים חלבונים פתולוגיים^24,25. במחקר הנוכחי, Aβ1-42 העלה הן את יחס LC3-II/I והן את ביטוי p62, מה שמרמז על הצטברות של LC3-II הקשורים לאוטופגוזום וסובסטרטים הקשורים לאוטופגוגיה. טריפטוליד הפחית את שני הסמנים, בעוד LY294002 הפך חלקית את האפקט הזה, מה שמרמז כי טריפטוליד עשוי להקל על הצטברות חלבונים הקשורה לאוטופגיה באמצעות מנגנון התלוי PI3K/Akt. יחד עם השינויים באיתות גפירין, קוליביסטין ו-PI3K/Akt/GSK-3β, ממצאים אלו מרחיבים את ההבנה של ההשפעות הנוירומגרטיות של הטריפטוליד מעבר לפעולות אנטי-דלקתיות או נוירופרוטקטיביות כלליות, ומציעים כי טריפטוליד עשוי גם להשפיע על חלבוני פיגום מעכבים הקשורים לסינפסות, איתות קינאז ונתיבים הקשורים לפרוטאוסטזיס בפתולוגיה דמוית AD²⁶ שקשורה ל-Aβ.

מספר שלבים קריטיים קובעים את הצלחתו ויכולת השחזור של פרוטוקול זה. ראשית, יש לשלוט ולאמת בקפידה את מצב ההצטברות של Aβ1-42 לפני ההזרקה, שכן הכנת פפטידים יכולה להשפיע רבות על תוצאות פתולוגיות. שנית, הזרקה סטריאוטקסית מדויקת לחדרים הצדדיים היא חיונית; רפלוקס, מיקום לא נכון של המחטים או מהירות הזרקה מופרזת עלולים לגרום לחשיפה משתנה ל-Aβ ולתוצאות התנהגותיות או היסטולוגיות לא עקביות. שלישית, בדיקות מבוך מים של מוריס דורשות רמזים ויזואליים יציבים, טמפרטורת מים עקבית ומעקב אחרי מהירות השחייה כדי לשלול פגיעה מוטורית כגורם מבלבל. רביעית, יש לבצע כימות היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי באמצעות אזורים מוגדרים מראש של היפוקמפוס וניתוח עיוור. לבסוף, תוצאות ווסטרן בלוט תלויות בעומס חלבון שווה, ריכוז ג'ל מתאים, העברה יעילה ושימוש בתמונות בלוט לא חתוכות לאישור ספציפיות הרצועה.

יש לשקול מספר מגבלות. ראשית, מודל ההזרקה Aβ1-42 אינו משחזר את ההתקדמות הכרונית, הפתולוגיה של טאו, שינויים וסקולריים או מורכבות נוירואימונית של AD בבני אדם. שנית, אף על פי שעכברים זכרים ונקבות היו מפוזרים באופן שווה בין קבוצות, המחקר לא קיבל הונחה לניתוח מדרגות-מין²⁷. שלישית, ליזטים היפוקמפוניים שלמים אינם יכולים לקבוע האם שינויים בגפירין ובקוליביסטין מתרחשים ספציפית בסינפסות מעכבות. רביעית, מנגנון PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrin המוצע נשאר אסוציאטיבי, משום שפעילות GSK-3β וזרחון Gephyrin Ser270 לא עברו מניפולציה ישירה. לבסוף, LC3-II/I ו-p62 הן קריאות כתם מערביות סטטיות ואינן יכולות להגדיר באופן מלא שטף אוטופגי דינמי. מחקרים עתידיים צריכים להשתמש בפרקציה סינפטוזומלית, מיקום משותף אימונופלואורסצנטי עם סמנים פוסט-סינפטיים מעכבים, גישות רווח או אובדן תפקוד של GSK-3β, מבני מוטנט Gephyrin Ser270, ובדיקות שטף מבוססות מעכבי ליזוזומים. יהיה צורך גם באימות במודלים כרוניים של AD טרנסגניים, מודלים הקשורים לטאו ומערכות עצביות שמקורם באדם כדי לקבוע האם מסלול זה רלוונטי באופן רחב לפתולוגיית AD¹⁴. מגבלה נוספת היא שמצב ההצטברות של ההכנה המדויקת של Aβ1-42 ששימש להזרקה סטריאוטקסית לא אומת באופן עצמאי על ידי פלואורסצנציה של Thioflavin T, SDS-PAGE/ווסטרן בלוטינג, או מיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית. למרות שהפפטיד הוכן באמצעות הליך דגירה ממושך של 37 מעלות צלזיוס, המשמש בדרך כלל לקידום אגרגציה של Aβ1-42, שונות במצב האגרגציה בין אצווה עשויה להשפיע על תוצאות פתולוגיות. מחקרים עתידיים אמורים לאמת זרימת עבודה זו במודלים כרוניים של AD טרנסגניים, מודלים הקשורים לטאו ומערכות נוירונים שמקורם באדם. ניסויים נוספים צריכים לכלול אימות ישיר של מצב האגרגציה של Aβ1-42, הערכת דיוק בהזרקה סטריאוטקסית באמצעות צבע או אימות אנטומי, פרקציה סינפטוזומלית, לוקליזציה משותפת אימונופלואורסצנטית עם סמנים פוסט-סינפטיים מעכבים, גישות רווח או אובדן תפקוד של GSK-3β, ניסויים מוטנטים Gephyrin Ser270, ובדיקות שטף אוטופגיות מבוססות מעכבי ליזוזום. נדרשים גם מחקרי תגובה במינון ובטיחות של טריפטוליד לפני שניתן לשקול יישומים תרגומיים

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Primary antibody for Western blot detection of total Gephyrin.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Primary antibody for Western blot detection of phosphorylated Gephyrin.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Primary antibody for Western blot detection of Collybistin.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Primary antibody for Western blot detection of PI3K.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Primary antibody for Western blot detection of total Akt.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Primary antibody for Western blot detection of phosphorylated Akt.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Primary antibody for Western blot detection of total GSK-3β.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Primary antibody for Western blot detection of phosphorylated GSK-3β.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Loading-control antibody for Western blot normalization.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Primary antibody for Western blot detection of LC3-I and LC3-II.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Primary antibody for Western blot detection of p62/SQSTM1.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Primary antibody for detecting Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Secondary antibody for mouse primary antibodies in Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Secondary antibody for rabbit primary antibodies in Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Primary antibody for Aβ immunohistochemistry.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Amyloid-β peptide used to prepare the aggregation-inducing injection solution.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Test compound administered intraperitoneally.
LY294002	ab120243	abcam	PI3K inhibitor used for the co-treatment group.
paraformaldehyde	P0099	Beyotime	Fixative for transcardial perfusion and tissue post-fixation.
xylene	108298	Merck	Deparaffinization and tissue-clearing reagent.
ethanol	100983	Merck	Rehydration and dehydration reagent for paraffin sections.
propylene glycol	294004	Merck	Vehicle component for drug solution preparation.
protease and phosphatase inhibitors	P1045	Beyotime	Lysis-buffer additive used to preserve proteins and phosphorylation states.
RIPA lysis buffer	P0013	Beyotime	Lysis buffer for total protein extraction from hippocampal tissue.
EDTA antigen retrieval buffer	ab93680	abcam	Heat-mediated antigen retrieval buffer for immunohistochemistry.
pentobarbital sodium	P3761	Sigma	Anesthetic used for surgery and tissue collection.
Goat serum	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Blocking reagent for immunohistochemistry.
PVDF membranes	ISEQ00010	Merck Millipore	Membrane used for Western blot transfer.
Morris water maze	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Behavioral apparatus and video-tracking system for spatial learning and memory assessment.
chemiluminescence imaging system	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Imaging system for chemiluminescent Western blot signal acquisition.
stereotaxic apparatus	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Apparatus used for stereotaxic intracerebroventricular injection.
BCA protein assay kit	P0006	Beyotime	Colorimetric assay kit for total protein concentration measurement.
microplate reader	Synergy2	Biotek	Absorbance reader used for BCA assay measurement.
ImageJ	version 9.0.1	National Institutes of Health	Image-analysis software for histology, immunohistochemistry, and Western blot densitometry.
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	Statistical-analysis and graph-generation software.