פרוטוקול זה מפרט הדמיית סידן ב-vivo של נוירונים היפותלמיים באמצעות מיקרוסקופ מוקטן (מיניסקופ) בעכברים המתנהגים בחופשיות במהלך מניפולציה של מצב חברתי (בידוד חברתי ואיחוד חברתי). שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה של נוירון יחיד של פעילות ההיפותלמוסית שמייצגת צורך חברתי וסיפוק חברתי, ומאפשרת מחקרים מכניים של הומאוסטזיס חברתי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
In Vivo הדמיית סידן עם מיקרוסקופ מיניאטורי בהיפותלמוס להבנת התנהגויות חברתיות בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
התנהגות חברתית אצל חולייתנים מוסדרת בקפדנות דרך מעגלי היפותלמוס. סוגי נוירונים היפותלמים מוגדרים מולקולרית זוהו לאחרונה כדי לקודד צורך חברתי באופן הומאוסטטי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע הדמיית סידן בגרעין הפרה-אופטי המדיאלי ההיפותלמי (MPN) באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי המותקן על ראש בעכברים החופשיים. שיטה זו מאפשרת רישום אורך של דינמיקת אוכלוסיות נוירונים במהלך בידוד חברתי ואיחוד מחודש, ובכך מאפשרת מחקרים מכניים של צורך חברתי וסיפוק חברתי ברזולוציה של נוירון יחיד. באופן ספציפי, עכברים בוגרים מקבלים הזרקות סטריאוטקסיות של וירוס אדנו-מקושר (AAV) המבטא אינדיקטור סידן מקודד גנטית ל-MPN, ולאחר מכן השרשה של עדשת GRIN ולוח בסיס מיניסקופ. לאחר ההחלמה, העכברים מתרגלים למערכת הדמיה מיניסקופית ונחשפים לבידוד חברתי מתוכנן ואיחוד מחדש, שבמהלכם מתעדים פעילויות נוירונליות. אותות הסידן מסונכרנים עם התנהגות בעלי חיים לניתוח נוסף. פרוטוקול זה מספק הנחיות מקיפות להדמיית סידן בגוף עם מיניסקופ בהיפותלמוס העכבר במהלך התנהגויות חברתיות. ניתן להתאים אותו בקלות להדמיה באזורים עמוקים אחרים במוח ובהקשרים התנהגותיים שונים. גישה זו מגשרת בין פעילות עצבית ברמת התא להתנהגות חברתית, ומקדמת את הבנתנו את הבסיס העצבי של התנהגות מורכבת בבעלי חיים הנעים בחופשיות.
מבוא
היכולת לשמור על קשרים חברתיים היא יסודית להישרדות בעלי חיים 1,2,3. בידוד חברתי ממושך גורם לחרדה, ליקויים קוגניטיביים ושינויים מטבוליים, בעוד שאיחוד מחדש משיב מעורבות חברתית וצרכים חברתיים 4,5,6. ההתאוששות שנצפתה בהתנהגות החברתית לאחר בידוד חברתי קצר טווח מרמזת על קיומו של מנגנון הומאוסטטי7, בדומה לוויסות רעב 8,9 או צמא 10,11,12. עם זאת, המצעדים העצביים המתווכים את ההומאוסטזיס החברתי עדיין אינם מובנים היטב.
מחקרים עדכניים חשפו כי אוכלוסיות נוירונליות היפותלמיות מובחנות מקודדות צורך חברתי ושובע חברתי, בהתאמה7. הדמיית סידן ב-vivo הראתה כי אוכלוסייה של נוירונים גלוטמטרגיים מוגדרים גנטית בגרעין הפרה-אופטי המדיאלי (MPN) הופכת לפעילה במהלך הבידוד (נוירוניבידוד MPN), בעוד שאוכלוסייה אחרת של נוירונים GABAergic הופכת לפעילה עם האיחוד מחדש(נוירוני איחוד MPN). הפעלה אופטוגנטית של נוירוניבידוד MPN מחקה מצב בידוד חברתי, והפעלה אופטוגנטית של נוירוני MPNReunion מחלישה את הריבאונד החברתי, מה שמרמז על תפקידיהם המנוגדים בוויסות הצורך החברתי. אוכלוסיות אלו מתקשרות הדדית ומתחברות למעגלים עצביים במוח, ויוצרות לולאת משוב שמווסתת דינמית את הצורך החברתי.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט שמטרתו הכללית היא לאפשר לחוקרים לתעד דינמיקת סידן במוח העמוק ברזולוציית נוירון יחיד בעכברים הנעים בחופשיות במהלך התנהגויות חברתיות רלוונטיות אתולוגית כמו בידוד חברתיואיחוד מחודש. השילוב של טכניקת הדמיה זו עם פרדיגמות חברתיות רלוונטיות אתולוגית מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור את הייצוג העצבי של מצבים חברתיים מובחנים. ההיגיון בפיתוח שיטה מותאמת זו נובע מהצורך להמחיש כיצד הצורך החברתי והשביעות הרצון מיוצגים דינמית במבני מוח עמוקים כמו MPN. בעוד שהשימוש במיניסקופ תואר בעבר 14,15,16, השימוש בו במהלך אינטראקציות חברתיות בלתי מוגבלות, במיוחד אלו הכוללות מעברים בין בידוד למפגש מחדש, דורש התאמות טכניות והתנהגותיות ספציפיות לשמירה על יציבות אופטית, מזעור ארטיפקטים של תנועה והבטחת ביטוי התנהגותי טבעי.
בהשוואה לפוטומטריית סיבים, הגישה המבוססת על מיניסקופ מציעה רזולוציה תאית, המאפשרת הבחנה בין סוגי נוירונים פונקציונליים שונים באותו אזור. הוא מאפשר הקלטות ארוכות טווח של בעלי חיים הפועלים בחופשיות, דבר חיוני לחקר דינמיקה עצבית מונעת חברתית. מחקרים קודמים שהשתמשו במיקרואנדוסקופיה של פוטון אחד התמקדו בעיקר בקורטקס או בהיפוקמפוס הגבי במהלך משימות מרחביות או חושיות 14,15,16. הפרוטוקול שלנו מרחיב את ההתקדמויות הללו לאזורים תת-קורטיקליים עמוקים יותר במהלך התנהגויות חברתיות מורכבות, ומספק תבנית לחקירת מעגלי מצב רגשי בתנאים טבעיים.
הפרוטוקול מותאם לאזורי מוח עד ~5 מ"מ, באמצעות השתלת עדשת GRIN ומדדי סידן מקודדים גנטית. שיקולים מרכזיים כוללים דיוק כירורגי, מיקום עדשות, עיצוב פרדיגמה התנהגותית וניתוח נתונים קשורים. שיטה זו ניתנת להתאמה לאזורים עמוקים אחרים במוח ובהקשרים התנהגותיים. פרוטוקול זה מדריך את המשתמשים בכל השלבים הקריטיים: הכנה לניתוח, הפצת ויראליים, השתלת עדשות, עיצוב התנהגותי, חיבור מיניסקופ, הדמיה וניתוח נתונים (איור 1A-E). אנו צופים שתהליך עבודה נגיש ומפורט זה יאפשר את חקר אוכלוסיות עצביות במוח העמוק במגוון רחב של התנהגויות טבעיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים באוניברסיטת ווסטלייק עם פרוטוקול בעלי חיים #25-076-LD-9. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות משאבי בעלי חיים במעבדה באוניברסיטת ווסטלייק. כל הציוד והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.
1. ניתוח הזרקת וירוס
- הניחו את העכבר בתא הרדמה עם 2-3% איזופלורן.
הערה: השראה מוצלחת של הרדמה מאושרת על ידי היעדר רפלקס צביטת אצבעות ונוכחות נשימה עמוקה ויציבה. - לאחר 2-3 דקות, או לאחר שהרפלקס ההזדקן אובד, העבר במהירות את החיה לכלי הסטריאוטקסי. אבטח את האף בקונוס האף של ההרדמה ושמור על הרדמה עם איזופלורן של 1-1.5% לאורך כל תקופת הניתוח (איור 1B). קצב זרימת החמצן נקבע בדרך כלל בין 0.8 ל-1.2 ליטר לדקה.
הערה: עקבו אחרי קצב הנשימה של בעל החיים וסימנים פיזיולוגיים נוספים. אם קצב הנשימה של בעל החיים עולה והוא מראה שפם וסימני התעוררות נוספים, יש להעלות את ריכוז האיזופלוראן ל-2-3%. - אבטח את שיני החותכת של העכבר דרך מוט השיניים של הכלי הסטריאוטקסי. הדק את מהדק האף כדי לתקן את הראש.
- הכנס בזהירות שני מוטות אוזניים לתעלות השמיעה החיצוניות עד שינחו היטב, כדי להבטיח קיבוע ראש יציב וקשיח (איור 1B).
הערה: (1) מיקום לא נכון שמדחס רקמות צוואר עלול לגרום למצוקה נשימתית או קיבוע לא יציב. (2) אם החיה מראה סימני נשימה קשה או מאבק במהלך הקיבוץ, שחררו מיד והעבירו את מוטות האוזניים, שכן הדבר מעיד על לחץ אפשרי של דרכי הנשימה. (3) לוודא ששני מוטות האוזניים נמצאים באותו גובה. זה חיוני ליישור מדויק של הגולגולת לאחר מכן. - מרחו משחה עינית על שתי עיני העכבר כדי למנוע מהעיניים להתייבש.
- הסר את פרוות הראש באמצעות קרם הסרת שיער. נגב היטב את האזור עם מגבוני אתנול של 75% כדי להסיר שאריות קרם ושיער.
- חטא את העור החשוף עם מגבונים עם 75% אתנול ובטאדין. שימוש במספריים כירורגיים עדינים ליצירת חתך סגיטלי במרכז הקרקפת. למשוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת במלואה מעל אזור המוח היעד. נקה בעדינות את פני הגולגולת עם מטלית כותנה כדי להסיר את הפריאוסטאום.
הערה: חשיפת שטח גדול מספיק בגולגולת היא הכרחית כדי לספק עוגן חזק למלט השיניים, ולהבטיח יציבות ארוכת טווח של השתל. - התקן פיפטת זכוכית על מחזיק הסטריוטקס למדידת פני הגולגולת. מתחת למיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ, מקם את קצה הפיפטה אל הברגמה (החיתוך של התפרים הסגיטליים והקורונליים) וקבע אותו כמקור (X = 0, Y = 0, Z = 0, איור 1C).
- מזיזים את קצה הפיפטה למיקומים ±2 מ"מ לרוחב הברגמה ומכוונים את גובה הגולגולת עד שההפרש בגובה בין שתי הנקודות יגיע ל-±0.03 מ"מ.
- לאחר מכן, מזיזים את הפיפטה ללמדה (החיתוך של התפרים הסגיטליים והלמדואידים) ומכוונים את ההטיה הקדמית האחורית עד שההפרש בגובה בין ברגמה למבדה מגיע ל-±0.03 מ"מ (איור 1C).
הערה: (1) הערכה ויזואלית והתאמה קודמת של הגולגולת יכולים לייעל משמעותית את תהליך היישור העדין. (2) ייבוש פני השטח של הגולגולת באוויר דחוס לפני היישור משפר את נראות התפרים הגולגולתיים. - השתמש במקדחה ידנית עם ראש מקדח בקוטר 0.8 מ"מ כדי לבצע קרניוטומיה מעל אזור המוח המטרה (למשל, לעכברים C57BL6/J). הקואורדינטות הן ברוחב הקדמי-אחורי (AP) 0 מ"מ, מדיאל-לטרלי (ML) 0.3 מ"מ, ו-4.8 מ"מ דורסלי-וונטרלי (DV) -4.8 מ"מ כדי למקד את אזור ה-MPN; בעכברי FVB/NJ, הקרניוטומיה מתבצעת ב-AP +0.4 מ"מ-+0.5 מ"מ, ML 0.3 מ"מ, ו-DV -4.8 מ"מ) (איור 1C).
הערה: במקרה של דימום, יש להעלות זמנית את ריכוז האיזופלוראן ל-2-2.5%. השתמשו בקצה כותנה סטרילי או בספוג המוסטטי לספיגת הדם, ואז מיד מרחו סליין סטרילי. החזר את האיזופלוראן לרמת תחזוקה (1-1.5%) לאחר המוסטזיס והסרת נוזלים עודפים. - לאחר הקרניוטומיה, יש לבצע הזרקה סטריאוטקסית של הווירוס המבטא את מדד הסידן באזור המוח המיועד.
- לדלל את ה-AAV-hSyn-jGCaMP7f, וירוס אדנו-המשמש לביטוי אינדיקטור סידן מקודד גנטית בנוירונים ולאפשר הדמיה של פעילות נוירונים באמצעות אותות סידן, עד לטווח סופי של כ-5 ×-10¹² גנומים ויראליים למיליליטר לפני ההזרקה.
- מלאו פיפטת זכוכית בשמן מינרלי תחילה, ואז בתמיסה הוויראלית, כדי להבטיח היעדר בועות אוויר. מקם את הפיפטה בקואורדינטות המטרה על פני הגולגולת והוריד אותה לאט לעומק המטרה.
- הזרקו את הווירוס באופן חד-צדדי בקצב איטי וקבוע (למשל, 30 ננוליטר לדקה), בנפח כולל של 400 ננו-ליטר7, כדי להבטיח זיהום של מספיק נוירונים באזור ה-MPN. כמות זו ניתנת להתאמה לפי גדלים ספציפיים של אזורי מוח והאם קיימות מגבלות נוספות, כמו מערכת Cre-loxP.
- לאחר סיום הטיפול, השאר את הפיפטה במקום למשך 10-15 דקות כדי לאפשר דיפוזיה ויראלית מספקת ולמזער את הריפלוקס לאורך מסלול ההזרקה, לפני שמושכים אותה בהדרגה.
הערה: (1) אליקווטים ויראליים עם טיטרים מתאימים ועקביים הם קריטיים לביטוי מוצלח ועקבי בקרב בעלי חיים. טיטר גבוה מדי עלול לגרום לנוירוטוקסיות, בעוד שטיטר לא מספק מוביל לביטוי חלש וליחס אות לרעש נמוך בהדמיה. (2) מהירות הזרקה איטית וזמן המתנה מספק לפני משיכת הפיפטה הם קריטיים למזעור נזק לרקמות ומניעת ריפלוקס ויראלי, מה שמבטיח ביטוי ויראלי מדויק וחזק באזור היעד. - לאחר הזרקת הווירוס, תופרים את העור מעל הגולגולת בתפרים נספגים.
- הזרקת קרפרופן תת-עורית (5 מ"ג/ק"ג) מיד לאחר הניתוח לטיפול בכאבים, עם המשך מעקב ומתן נוסף לפי הצורך בשלושת הימים הבאים.
- הניחו את העכבר בנפרד לאחר ניתוח הזרקת הווירוס למשך לפחות 2-3 שבועות כדי לאפשר החלמה מספקת של בעלי חיים וביטוי ויראלי.
הערה: השתלת עדשת GRIN (סעיף 2) יכולה להתבצע באותו יום כמו ההזרקה הוויראלית או 2-3 שבועות לאחר ההזרקה הוויראלית. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיטה הדו-שלבית, המאפשרת לנסיין להעריך ביטוי ויראלי במהלך השתלת עדשת GRIN.
2. השתלת עדשת GRIN
- חזור על השלבים 1.1-1.10 כדי לפתוח מחדש את הקרניוטומיה. גרדו את פני הגולגולת עם סכין כדי לאחוז טוב יותר במלט דנטלי בשלב 2.8. בקרניוטומיה החדשה, הקוטר צריך להיות מעט גדול יותר מעדשת GRIN (בדרך כלל ~1 מ"מ) כדי לאפשר השתלה חלקה. לנקות בקפידה את כל שאריות העצם לאחר הקידוח.
- כדי להפחית דחיסת רקמה במהלך השתלת עדשת GRIN, הכנס פיפטה מזכוכית לאזור המוח היעד והזיז את הפיפטה באיטיות לכיוון בינוני ליצירת חתך. המיקרו-חיתוך הזה הוא באורך ~1 מ"מ כדי ליצור מקום להשתלת עדשת GRIN (איור 2A).
הערה: שלב זה קריטי להצלחת כל הפרוטוקול. - לפני השתלת עדשת ה-GRIN, חטא את העדשה עם 75% אתנול, ואז שטוף אותה עם סליין סטרילי, ונגב בעדינות עם רקמת עדשה.
- החזק את עדשת ה-GRIN עם מחזיק עדשה וחבר את המיניסקופ לחלק העליון של העדשה.
- מקם את כל ההרכבה בברגמה והגדר את כל הקואורדינטות לאפס (כלומר, X = 0, Y = 0, Z = 0). לאחר מכן, מקם אותו לקואורדינטות X-Y של המטרה מעל הקרניוטומיה.
- הרטיב את פני הגולגולת במי מלח סטריליים. הורידו לאט מאוד את עדשת ה-GRIN אל רקמת המוח בקצב של כ-100 מיקרומטר לדקה עד שהיא מגיעה למטרה (איור 2B).
הערה: (1) אם השתלת עדשת GRIN מתבצעת 2-3 שבועות לאחר הזרקת הווירוס, במהלך הכנסת העדשה, יש להפעיל את המיניסקופ כדי לצפות בשינויים בפלואורסצנציה בזמן אמת. כאשר העדשה מתקרבת לאזור היעד, האות הפלואורסצנטי הכולל בשדה הראייה הופך לבהיר יותר, ושינוי זה ניתן לקריאה ישירה מהיסטוגרם האות בזמן אמת באמצעות תוכנת ההדמיה (איור 2C, D). (2) יש להיזהר מדימום במהלך ההשתלה, שכן קרישי דם פוגעים משמעותית באיכות האות. (3) אם הדימום בלתי נמנע וחמור, יש להסיר את עדשת ה-GRIN, לנקות את העדשה ולהשתיל אותה מחדש לאחר הפסקת הדימום. - לאחר השתלת העדשה, ייבשו היטב את פני הגולגולת על ידי ספיגת נוזלים שנותרו ונשיפה באוויר דחוס.
- מרחו בזהירות מלט דנטלי כדי לעגן את בסיס עדשת GRIN לגולגולת ולבנות כיסוי ראש מלא שמכסה את הגולגולת החשופה (איור 2B). היזהר שלא המלט ייגע ברקמות השריר הסובבות. לאחר מכן שחררו בזהירות את מחזיק העדשה והסירו יחד עם המיניסקופ.
הערה: (1) ערבבו מלט דנטלי במשטח מקורר על קרח כדי להאט את תהליך ההתמצקות ולספק זמן עבודה ארוך יותר. (2) מומלץ להוסיף מוט ראש מאחורי העדשה כדי להחזיק את העכבר במהלך חיבור המיניסקופ. (3) היו זהירים מאוד לא להדביק את המלט על מחזיק העדשה או על המיניסקופ. - הכינו את דבק הסיליקון הדו-חלקי על ידי ערבוב שני נוזלים יחד. הניחו אותו על החלק העליון של עדשת GRIN כדי ליצור אטימה מגן מפני אבק ושריטות במהלך תקופת ההתאוששות.
- לאחר השתלת עדשת GRIN, הניחו את העכבר בנפרד כדי למנוע נזק אפשרי לעדשה על ידי חבריו לכלוב במהלך ההתאוששות.
3. התקנת לוח בסיס
- שבועיים עד שלושה לאחר השתלת עדשת GRIN, מתבצעת התקנת לוח בסיס. הרדמה וקבע את העכבר במכשיר הסטריאוטקסי כפי שתואר לעיל.
- הסר את אטם הסיליקון מהחלק העליון של עדשת ה-GRIN ונקה בעדינות את פני השטח עם חתיכת טישו של העדשה.
- חבר את פלטת הבסיס למיניסקופ. התקן את כל מכלול המיקרוסקופ-בסיס על זרוע המניפולטור הסטריאוטקסית דרך מחזיק חשמל.
- חבר את המיניסקופ לתיבת איסוף הנתונים והפעיל את ההדמיה החיה.
- יישר את מטרת המיניסקופ ואת עדשת ה-GRIN המושתלת על ידי כוונון עדין של המניפולטור כדי להשיג יישור קואקסיאלי אופטי מדויק בין המיניסקופ לעדשת ה-GRIN.
- מקמו את מטרה המיניסקופ כך שתהיה מקבילה למשטח העליון של עדשת GRIN וודאו שהמסגרת של כל עדשת ה-GRIN כלולה בחלון התמונה עם מראה מעגלי מושלם, ומרכז העדשה נמצא במרכז חלון ההדמיה.
- הורידו את המיניסקופ למרחק עבודה אופטימלי כדי לצלם תמונות ברורות של נוירונים במישור המוקד היעד.
- השתמש במלט דנטלי כדי לגשר ולעטוף את לוח הבסיס על כיסוי המלט הקיים (איור 2B).
הערה: (1) שלב קריטי הוא להרים את המיניסקופ במרחק קטן, שנקבע אמפירית (כ-50-100 מיקרון) לפני הקיבוע הסופי, כדי לפצות על הזזת מישור המוקד האפשרית הנגרמת מהתכווצות המלט במהלך ההתמצקות. (2) היו זהירים מאוד למנוע מהמלט הדנטלי לגעת בכל חלקי המיניסקופ שיש להפריד לאחר התקנת לוח הבסיס. - לאחר שהמלט הדנטלי התקשה לחלוטין, שחרר את המחזיק, נתק בזהירות את המיקרוסקופ מפלטת הבסיס, ומיד הברג מכסה על הבסיס כדי להגן על הממשק האופטי.
- שים את העכבר בנפרד למשך 3-5 ימים לאחר התקנת הבסיס ואז איחד אותו עם חבריו לכלוב לפחות שבוע לפני מניפולציה של מצב חברתי (למשל, בידוד חברתי).
4. קביעת פרמטרים של הרגל והדמיה
- להרגיל את העכברים המושתלים למשענת ראש זמנית לחיבור מיניסקופ ולמערכת ההדמיה 2-3 פעמים לפני מפגשי הדמיה פורמליים.
- כדי לחבר את המיניסקופ ללוח הבסיס, יש לרסן את ראש העכברים המושתלים, להסיר את מכסה הבסיס ולחבר את המיניסקופ לפלטת הבסיס דרך ממשק מגנט. לאחר מכן, מהדק את הבורג הצדדי כדי לקבע את המיניסקופ. בצע הדמיית סידן למשך 10 דקות, שבמהלכן החיה נעה בחופשיות בזירה או בכלוב.
- הכניסו גירויים, כמו מגע עדין ועכבר חדש, במהלך סשן ההדמיה הפיילוט הזה. ניתחו את הנתונים (ראו פרטים בסעיף 6) כדי לבדוק האם ניתן להפיק אותות של נוירון יחיד. במהלך ההתמכרות, קבעו את הגדרות ההדמיה האופטימליות על ידי התאמת מישור המוקד של המיניסקופ לאורך מרחק העבודה שלו כדי למקסם את מספר הנוירונים הנצפים ואת חדות התמונה.
- הגדר את עוצמת התאורה ל-~10% מהערך המקסימלי ואת הרווח של החיישן ל-~10-20% מהערך המקסימלי כדי לקבל אותות ברורים ללא רוויה. תמונה ברזולוציה מרחבית של 1280 על 800 עם קצב דגימה של 20 הרץ. שמרו את ההגדרות הללו עבור כל בעל חיים והשתמשו בהן שוב במהלך מפגשי ההדמיה הבאים.
5. בדיקות התנהגות חברתיות להדמיית סידן במיניסקופ
- מבחן איחוד חברתי (איור 3A)
- בודד את העכבר המושתל במיניסקופ למשך 1, 3 או 5 ימים לפני ההדמיה. בצע הדמיית סידן במהלך הבסיס, האיחוד והבידוד מחדש.
- קו בסיס: חבר את העכבר למיניסקופ והקליט במשך 10 דקות שבמהלכן העכבר נשאר מבודד.
- מפגש מחודש: מוסיפים קוגמנט לשעבר לחדר ההקלטות ומקליטים 10 דקות.
- בידוד מחדש: הסר את הקאגמט לאחר 10 הדקות של המפגש המחודש, וצלם עוד 10 דקות במהלך הבידוד המחודש.
- מבחן בידוד חברתי (איור 3B)
- בודד את העכבר המושתל במיניסקופ למשך 6 שעות, והקלט אותות סידן בתחילת כל שעה למשך 15 דקות.
- הוסיפו קאגמט לשעבר לתא ההקלטה והקליטו במשך 10 דקות בסיום כל מפגש ההדמיה כדי לזהות נוירונים שמווסתים באופן משמעותי על ידי איחוד חברתי (ראו פרטים בסעיפים 6 ו-7).
הערה: (1) לוח הזמנים הספציפי הזה משמש למזעור הלבנת האותות ולאפשר ניטור פעילות נוירונית במהלך שש השעות הראשונות של בידוד חברתי. (2) המיניסקופ מחובר לאורך כל ההליך. (3) גישה זו מאפשרת מעקב אחר אותו אנסמבל נוירוני לאורך כל מושב ההדמיה. (4) מזון והידרוג'ל מסופקים במהלך ההדמיה.
6. קדם-עיבוד נתונים
- ייבא סרטוני הדמיה גולמיים לתוכנת עיבוד הנתונים.
- דגימה מרחבית וזמנית של הסרטון המקורי כשנדרש כדי להפחית את העומס החישובי לניתוח הנתונים.
הערה: לצורך ניתוח זה, נתוני הדמיה גולמיים נלכדים ברזולוציה מרחבית של 1280 x 800 ב-20 הרץ; דגימה מרחבית של הסרטון פי 4 והורדה זמנית פי 2. - יש להחיל מסנן פס מרחבי עם חיסור ממוצע גלובלי כדי להפחית את רעש התדר הגבוה ואת הסטייה ברקע בתדר נמוך.
- תיקון ארטיפקטים של תנועה באמצעות אלגוריתם תיקון התנועה בתוכנת עיבוד הנתונים. בדוק ויזואלית את הסרט המתוקן בתנועה כדי להבטיח יציבות של סומטה עצבית ומעט ארטיפקטים שאריתיים של תנועה.
- לחץ על כפתור "זיהוי תאים" ובחר "CNMFe" ברשימה כדי לחלץ עקבות פעילות סידן של נוירונים בודדים באמצעות אלגוריתם CNMF-E17 (Constrained Non-negative Matrix Factorization for microEndoscopic data).
- לחץ על כפתור הסרגל בתוכנת עיבוד הנתונים ומדד את קוטר הסומה (בפיקסלים) מנוירונים מייצגים. הזן את הגודל הממוצע בתיבת "ממוצע קוטר תא (פיקסלים)". לאחר מכן לחץ על כפתור Apply כדי להריץ CNMF-E.
- כוון את הגדרות האתחול של CNMF-E כאשר זיהוי התאים אינו מספיק, מופיעים רכיבים שאינם תאים מופרזים, או כאשר מתרחשת סגמנטציה יתר.
- בדוק את כל הרכיבים שהופקו וקבל/דחה אותם בהתבסס על מורפולוגיית התאים ודינמיקת הסידן הביולוגית הסבירה. להוציא רכיבים עם צורות לא סדירות וקוצניות. החריגו עקבות הנשלטים על ידי רעש או ארטיפקט תנועה.
הערה: (1) איורים 2E ו-2F מציגים שני נוירונים מקובלים עם מורפולוגיה ברורה של נוירונים וכן את החולפים האופייניים לסידן. (2) איורים 2G ו-2H מראים שני נוירונים שנדחו עם תנודות בסיסיות בולטות וחוסר בחולפות סידן טיפוסיות. - ייצוא עקבות פלואורסצנציה של נוירונים מקובלים מתוכנת עיבוד הנתונים לזיהוי במורד הזרם של נוירונים מודולציה חברתית (סעיף 7).
7. זיהוי נוירונים המווסתים במצב חברתי
- השתמש ב-MATLAB או Python כדי לנתח עוד את הנתונים המעובדים מראש.
- יישר עקבות פעילות הסידן של הנוירונים המקובלים לחותמות זמן התנהגותיות.
- מצא את נקודת הזמן של המפגש החברתי מתוך סרטון ההתנהגות. עבור כל נוירון, יש לחלק את הפעילות לתקופת בידוד חברתי לפני האיחוד של 300 שניות ותקופת איחוד חברתי של 300 שניות.
- עבור כל נוירון, כמת את התפלגות פעילות הסידן במהלך תקופות הבידוד והאיחוד.
- בצע את ניתוח מאפיין הפעולה של המקלט (ROC)18 כדי להעריך את יכולת הפעילות הנוירונית להבחין בין מצבי בידוד לאיחוד, ומניב ערך AUC שמחשב את השטח מתחת לעקומת ה-ROC.
- הערך את המשמעות הסטטיסטית באמצעות מבחן פרמוטציה. עבור כל נוירון, ערכי פעילות הסידן מעורבבים מעגלית בין מצבי התנהגות במגדלי זמן של שנייה למשך 1,000 פעמים כדי ליצור התפלגות אפסית של ערכי AUC. נוירונים עם ערכי AUC שנצפו העולים על האחוזון ה-95 של התפלגות האפס המעורבבת שלהם נחשבים למודולטים באופן מובהק על ידי המצב החברתי.
- סווג את הנוירונים המוסדרים באופן משמעותי לפי כיוון המודולציה. סווג את הנוירונים המעוכבים על ידי איחוד כנוירוני הבידוד ומופעלים על ידי איחוד כנוירוני איחוד (איור 4).
8. אימות לאחר הניסוי
- פרפיו את העכברים ובצעו היסטולוגיה סטנדרטית כדי לאמת את מסלול עדשת GRIN ואת ביטוי הווירוס (ראו דוגמה להדמיה היסטולוגית באיור 2I).
- השתמש ב-4% PFA כדי לחבר את כל ראש העכבר עם השתל, ואז הסר את עדשת GRIN כדי לדמיין מסלול עדשה נקי.
הערה: כלול רק את הנתונים מהחיות עם מיקוד נכון.
9. פתרון תקלות וטיפים מעשיים
- אבטח מוט ראש עם מלט דנטלי מאחורי המיניסקופ כדי להקל על הרכבת והסרת המיניסקופ.
הערה: מוט הראש לא אמור להיות ארוך מדי וניתן למקם אותו בזווית מעט מוטה כדי למנוע הפרעה להתנהגות חברתית. - יש לאחסן את העכברים המושתלים בנפרד במהלך תקופת ההחלמה לאחר הניתוח למשך לפחות שבוע אחד. זה מספק זמן מספיק לעכברים להחלים ומונע נזק להשתל על ידי עכברים אחרים.
- לאחד מחדש את העכברים המושתלים עם חבריהם הקודמים לאחר שיאוששו לחלוטין. בדוק והדק באופן קבוע את מכסי הכיסוי. הכינו כובעי כיסוי נוספים והחליפו אותם כאשר הם אובדים במהלך תחזוקת בעלי החיים.
- בדקו את אותות הסידן 3-4 שבועות לאחר הזרקת וירוס GCaMP. אם האותות חלשים או לא ברורים מדי, תקופת התאוששות ארוכה יותר לעיתים משפרת את איכות האותות.
- שימו לב למשטחי העדשה בצד של עדשת GRIN או בצד המיניסקופ. שמור על עדשות נקיות וללא שריטות. כסו את העדשה כשאתם לא משתמשים.
- לפני ההדמיה, כוון את אורך כבל האות כך שיהיה ארוך מספיק כדי שהחיה תגיע לפינות של זירת ההדמיה ויהיה קצר מספיק כדי לאפשר אינטראקציות חברתיות חלקות.
- הגנו על הכבל בשכבת חומר קשה כשצריך כדי למנוע נשיכה של עכברים אחרים במהלך אינטראקציות חברתיות. בדוק את כבל האות באופן קבוע כדי לבדוק אם הוא מעוות בעקבות אינטראקציה חברתית אינטנסיבית.
- כדי לזהות את אותו אנסמבל נוירוני ממפגשי הדמיה עוקבים (למשל, באיור 3B), ניתן היה לחבר את סרטוני ההדמיה הגולמיים כדי להפיק עקבות סידן.
- כדי לסנכרן אותות מרובים, למשל סרטוני התנהגות ואותות סידן, משתמשים בדרך כלל בקלטי TTL נפוצים ופנסים מסונכרנים ליישור קבצי הקלטה שונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
זיהוי אוכלוסיות נוירונים
הבענו את וירוס GCaMP והשתלנו עדשת GRIN ב-MPN של עכבר C57BL/6J. לאחר הניתוח, העכבר התאושש באופן אישי והתאחד עם חבריו לכלוב לפחות לשבוע אחד. העכבר הוחזק לבד במשך 3 ימים לפני מפגש הדמיית הסידן. במהלך ההדמיה נרשם תחילה קו בסיס בידוד של 10 דקות, ואחריו מפגש חברתי של 10 דקות עם בן לווייתו לשעבר בכלוב. פעילות הסידן שנרשמה לפני ואחרי האיחוד החברתי (300 שניות לכל תקופה) שימשה לניתוח ROC (ראו פרטים בסעיף 7).
שתי אוכלוסיות נוי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מפרט גישה משולבת המשלבת הדמיית סידן מיניסקופ in vivo עם פרדיגמות התנהגותיות חברתיות להערכת פרופיל הפעילות של נוירונים היפותלמים. הוא מאפשר הדמיית סידן ברזולוציה תאית לטווח ארוך ממבני מוח עמוקים במהלך אינטראקציות חברתיות טבעיות. החלקים הבאים דנים בצעדים הקריטיים, המשמעות המתודולוגית, המגבלות והפוטנציאל העתידי של גישה זו.
הצלחת הפרוטוקול הזה תלויה בסדרה של פרוצדורות כירורגיות וניסויים קפדניות ומקושרות. ראשית, הדיוק בהזרקת וירוסים סטריאוטקסיי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגוד עניינים. ChatGPT שימש בתהליך עריכת כתב היד, עם הגהה מדוקדקת ומפורטת על ידי כל המחברים.
תודות
אנו רוצים להודות לפרופסור קתרין דולאק על תמיכתה באימון הראשוני בניסויים במיניסקופ וליאנג סון על עזרתו בביצוע הניתוח. עבודה זו נתמכה במימון הסטארט-אפ מאוניברסיטת ווסטלייק ומימון מקרן NOMIS, מרכז טאן-יאנג למחקר אוטיזם באוניברסיטת הרווארד, פרס המחקר הרפואי ג'יין קופין צ'יילדס ל-D.L., ומלגת פוסט-דוקטורט של צ'ארלס א. קינג ל-D.L. אנו מודים לכל החברים במעבדת ליו על תגובותיהם לכתב היד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | טייטול | S0587-9 | וקטורים ויראליים, ניתוח |
| ספוג ג'לטין המוסטטי הסמוי | פוקאנגסן | FKS-A | ניתוח |
| תמיסת בטדין (10% יודינטפוידון) 500 מ"ל | היינאוט | Q13702855HNW002 | ניתוח |
| מצלמה לוידאו התנהגותי | דהנג | MER2-160-227-U3C | התנהגות |
| קרפרופן | MCE | HY-B1227 | ניתוח |
| כלי סטריאוטקס דיגיטליים | הנעה אחורית | 68803 | ניתוח |
| אתנול (75%) | חברת סינופארם ריגנט כימיקלים,Ld | 801769610 | ניתוח |
| משחת עיניים | FODU | H37022025 | ניתוח |
| תוכנת עיבוד נתונים אינסקופיקס (IDPS) | אינסקופיקס | 1000-006551 | ניתוח נתונים |
| איזופלוראן | הנעה אחורית | R510-22-10 | ניתוח |
| חבילת דבק Kwik-Sil בת 2 | וורלד פרסיז'ן אינסטרומנטס | קוויק-סיל | ניתוח |
| מיקרודריל | הנעה אחורית | 78001 | ניתוח |
| מושך מיקרופיפטות MP-1000 | הנעה אחורית | MP-1000 | ניתוח |
| פתרונות הרדמה בעלי חיים רב-תכליתיים | הנעה אחורית | טאיג'י-אי | ניתוח |
| משאבת מיקרוהזרקה בננוליטר | הנעה אחורית | R-480 | ניתוח |
| מיניסקופ nVista 3.0 | אינסקופיקס | 1000-004323 | הדמיה |
| מלקחי עיניים | הנעה אחורית | F12006-10 | ניתוח |
| הפעלת מספריים | הנעה אחורית | S14001-15 | ניתוח |
| ערכת שתל ProView | אינסקופיקס | 1000-004238 | ניתוחים ודימות |
| מלט שרף (סופר-בונד) | סאן מדיקל | סופר בונד C& B | ניתוח |
| סט של 5 כיסויי בסיס | אינסקופיקס | 1050-004639 | הדמיה |
| סט של 5 לוחות בסיס | אינסקופיקס | 1050-004638 | הדמיה |
| סט של 5 עדשות GRIN, קוטר 0.6 מ"מ, אורך 7.3 מ"מ | אינסקופיקס | 1050-004626 | ניתוחים ודימות |
| מיקרוסקופ סטריאוטקסיס | מורזידר | MSD205A | ניתוח |
| סליין סטרילי | קידוקלין | R1B25071902 | ניתוח |
מקורות
- Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
- Krause, J., Ruxton, G. D. Living in groups. , Oxford University Press. (2002).
- Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A. Why do birds flock? A role for opioids in the reinforcement of gregarious social interactions. Front Physiol. 10, 421(2019).
- Panksepp, J. B., Lahvis, G. P. Social reward among juvenile mice. Genes Brain Behav. 6 (7), 661-671 (2007).
- Matthews, G. A., Tye, K. M. Neural mechanisms of social homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 1457 (1), 5-25 (2019).
- Lee, C. R., Chen, A., Tye, K. M. The neural circuitry of social homeostasis: Consequences of acute versus chronic social isolation. Cell. 184 (6), 1500-1516 (2021).
- Liu, D., et al. A hypothalamic circuit underlying the dynamic control of social homeostasis. Nature. 640 (8060), 1000-1010 (2025).
- Luquet, S., Perez, F. A., Hnasko, T. S., Palmiter, R. D. NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates. Science. 310 (5748), 683-685 (2005).
- Balthasar, N., et al. Leptin receptor signaling in POMC neurons is required for normal body weight homeostasis. Neuron. 42 (6), 983-991 (2004).
- Zimmerman, C. A., et al. Thirst neurons anticipate the homeostatic consequences of eating and drinking. Nature. 537 (7622), 680-684 (2016).
- Augustine, V., et al. Hierarchical neural architecture underlying thirst regulation. Nature. 555 (7695), 204-209 (2018).
- Allen, W. E., et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 357 (6356), 1149-1155 (2017).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), (2017).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. J Vis Exp. (162), (2020).
- Burrows, R., Ma, C. H., Sun, Y. J. Long-term imaging of identified neural populations using microprisms in freely moving and head-fixed animals. J Vis Exp. (203), (2024).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, e28728(2018).
- Britten, K. H., Shadlen, M. N., Newsome, W. T., Movshon, J. A. The analysis of visual motion: a comparison of neuronal and psychophysical performance. J Neurosci. 12 (12), 4745-4765 (1992).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
