מדידת מתקן היציאה ועמידה בעיני עכבר אקס ויבו באמצעות מערכת מזרק-משאבת

סיכום

שילוב גישות אנליטיות משיטות מבוקרי לחץ מבוססות אופטימיזציה של מערכת משאבת מזרק פשוטה וזולה להערכת מתקן הזרימה היציאה והתאמת העיניים בעיני העכברים.

תקציר

שמירה על לחץ תוך-עיני (IOP) ברמה מתאימה ויציבה היא חיונית לבריאות העין. התכונות הביומכניות של רשת טרבקולרית (TM), תעלת שלם (SC) וכל מעטפת הקורניאוסקלריה ממלאות תפקיד מרכזי בהומאוסטזיס של ה-IOP. מתקן יציאה (C) הוא פרמטר מרכזי להערכת היעילות של TM ו-SC בניקוז הומור מימי, בעוד שציות עיני (φ) משקף את האלסטיות של מעטפת הקרניאוסקלריה ואת הזרימה החולפת דרך TM ו-SC. בעבר פותחה מערכת פשוטה וחסכונית של משאבת מזרק להערכת C. עם זאת, שימוש ברגרסיה ליניארית פשוטה לניתוח נתונים ב-vivo מגבל באפיון פונקציית TM ו-SC. במחקר זה, מערכת משאבת המזרק אופטימלית על ידי יישום גישות אנליטיות שפותחו למערכות פרפוזיה עינית מבוקרי לחץ מבוססות. ערכי C ו-φ שנמדדו בעיניים מחוץ לחי הושוו לערכי מערכת הפרפוזיה שפורסמו בעבר והיו תואמים לטווחים שדווחו. לסיכום, מערכת משאבת מזרק פשוטה וזולה זו מקלה על הערכת התכונות הביומכניות של TM ו-SC.

מבוא

שמירה על רמת לחץ תוך-עיני (IOP) מתאימה ויציבה היא חיונית לבריאות העין¹. עלייה מתמשכת ב-IOP היא גורם הסיכון העיקרי לגלאוקומה ^2,3. תנודות ארוכות טווח ב-IOP לאורך חודשים או שנים תורמות גם הן לאובדן ראייה ^4,5. מחקרים עדכניים זיהו צורה נוספת של תנודות IOP – תנודות חולפות הנגרמות מפעילות יומיומית, שעשויות גם להאיץ את התקדמות הגלאוקומה ^6,7. לדוגמה, גבר בן 46 עם היסטוריה של 20 שנה של שפשוף עפעפיים וגבר בן 52 ששפשף את עיניו במשך 10 שנים, שניהם הציגו נזק מואץ לדיסק הראייה ^8.9. ממצאים אלו מדגישים את חשיבות תגובות מתאימות בזמן לשינויים ב-IOP כדי למזער את הסיכון לאובדן ראייה.

ה-IOP מוסדר על ידי האיזון בין ייצור הומור מימי (AH)^לבין הניקוז שלו. AH יוצא מהעין בעיקר דרך המסלולים הקונבנציונליים והאובאוסקללריים¹¹. הן בעיניים תקינות והן בעיניים עם גלאוקומטה, המסלול הקונבנציונלי הכולל את רשת הטרבקולרית (TM) ותעלת שלם (SC) הוא המקור העיקרי להתנגדות לזרימה היוצאת שמשפיעה על ההומאוסטזיס IOP 12,13,14. לכן, התכונות הביומכניות של TM ו-SC חיוניות לעין כדי להסתגל לשינויים ב-IOP 15,16,17.

התקדמות טכנולוגית אחרונה אפשרה הערכה מדויקת יותר של זרימת AH. שיטות פולשניות, כגון פרפוזיה מבוססת כבידה ומערכת משאבת מזרק, פותחו לחישוב מתקן הזרימה היציאה (C), שמראה כיצד TM ו-SC מווסתים את זרימת היציאה במצב יציב 18,19,20,21,22,23,24. שיטות לא פולשניות, כגון טונוגרפיה²⁵ ופלואורופוטומטריה²⁶, שימשו קלינית לקביעת C בחולים עם גלאוקומה. עם זאת, רוב הגישות אינן מסוגלות להעריך באופן ספציפי את תפקוד TM ו-SC. לדוגמה, במערכת מזרק-משאבה, נתוני קצב זרימה ולחץ במצב יציב מותקנים באמצעות רגרסיה ליניארית פשוטה, והשיפוע מפורש כ-C התלוי בלחץ. עם זאת, ה-C המחושב הזה בעכברים חיים אינו יכול לשקף במדויק את קיבולת יציאת ה-AH דרך המסלול הקונבנציונלי, כיוון שהוא מושפע מהפרשת AH, זרימת יובאוסקלריה ולחץ ורידי אפיסקלרלי, כפי שמתואר במשוואת גולדמן.

כדי להתמודד עם מגבלה זו, מילר ואח' חישבו את זרימת AH, זרימת היציאה הקונבנציונלית והזרימה האובאוסקללרית באותה עין עכבר באמצעות מספר מדידות זרימה קבועה, בהתבסס על הנחה של היעדר זרימת AH, ללא לחץ ורידי אפיסקלרלי, ויציאה יובאוסקללרית ללא שינוי לאחר המתת חדות²². בשנת 2016, שרווד ואחרים דיווחו כי זרימת היציאה האובאוסקללרית היא 0 בעיניים מחוץ לחי ב-0 מ"מ כספית, ואז ענו על אותה שאלה על ידי הצגת מודל חוק הספק המשתמש ב-iPerfusion (מערכת פרפוזיה מבוקרת לחץ שתיקרא מעתה מערכת הפרפוזיה)²⁷. ההתקדמות המתודולוגית הבהירה את התפקידים הייחודיים של TM ו-SC, והעמיקה את ההבנה של תפקידיהם הפיזיולוגיים בשמירה על יציאת AH במצב יציב.

בנוסף, התגובה החולפת של TM ו-SC לתנודות IOP חיונית לשמירה על הומאוסטזיס של ה-IOP. כדי לעקוב אחרי תנועה זו, Xin ואחרים פיתחו טומוגרפיה אופטית רגישה למופע (OCT), המאפשרת תצפית בקנה מידה של²⁸ שניות. מיקרוסקופ אלקטרונים סריאתי תלת-ממדי לסריקת בלוק-פנים יכולה לבחון תנועה זו ברמה אולטרה-מבנית²⁹. עם זאת, שיטות מבוססות תמונה מעריכות רק את התכונות הביומכניות של TM ו-SC ואינן מניבות ערכים ממשיים של ניקוז AH חולף. בשנת 2019, לאחר פיתוח iPerfusion, שרווד ואח' חישבו את ההתאמה העין (φ) כמדד מרכזי הן לאלסטיות הקרנוסקלרלית והן לתגובה החולפת של TM ו-SC³⁰. התקדמות זו מספקת פרמטר כמותי להערכת ההתנהגויות החולפות של TM ו-SC בתגובה לתנודות IOP.

בהתבסס על התקדמות זו בהערכת תפקוד TM ו-SC, מחקר זה שיפר את מערכת המשאבה על ידי שילוב מודל חוק ההספק לחישוב C ושילוב מתודולוגיות חדשות לחישוב φ. מדידות אלו הושוו לנתונים שפורסמו שהתקבלו באמצעות מערכת הפרפוזיה כדי להעריך האם מערכת המשאבה המותאמת מתאימה להערכת מתקני יציאה ועמידה בעיני עכבר מחוץ לחיים .

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ולהנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים במעבדה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת צ'ינגדאו (QDU-AEC-2022069).

1. בחירת וטיפול בבעלי חיים

1. השתמש בעכברים בני 5 חודשים עם רקע גנטי של 50% C57BL/6 ו-50% BALB/c. אל תחשבו על מין בעיצוב הניסוי.
2. שמרו על עכברים במחזור אור–חושך של 12 שעות ל-12 שעות בטמפרטורה של 23 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות של 50 ± 5%.

2. מדידת IOP

1. הרדמו עכברים באמצעות 2.5% איזופלוראן עם 80% חמצן (vol/vol) בתא אטום למשך 3.5 דקות.
   אזהרה: איזופלוראן הוא חומר הרדמה נדיף. בצע הרדמה באזור מאוורר היטב או במערכת בידוד מתאימה.
2. העבר עכברים לפלטפורמת הפעלה. שמרו על הרדמה עם מסכה למשך 30 שניות נוספות.
3. בצע את כל המדידות בין 9:00 ל-12:00. רשמו שלוש מדידות לכל עין. חשב את הערך הממוצע לכל נקודת נתונים.

3. הגדרת מערכת (איור 1)

1. חבר מזרק בנפח 100 מיקרוליטר למשאבת מזרק.
2. חבר את המזרק לחיישן לחץ זרימה.
3. חבר את החיישן למערכת איסוף נתונים.
   הערה: ודא שחיישן הלחץ ומחזיק העין מיושרים באותו גובה כדי למנוע ארטיפקטים של לחץ.
4. מלא את המערכת ב-1× סליין עם מאגר פוספט (PBS). הסר את כל בועות האוויר.
5. הנח את העין במחזיק עם שקע עגול (קוטר 4–6 מ"מ). ודא שהעין יציבה במהלך הקניולציה. מקם את חיישן הלחץ ואת מחזיק העין באותו גובה.
   הערה: חוסר יישור עלול לגרום לשגיאות מדידת לחץ. קובץ העיצוב של STL עבור מחזיק העין המותאם מסופק כקובץ משלים 1.

4. הפעלת תוכנה

1. כיול חיישן לחץ
   1. פתח את תוכנת רכישת הנתונים. טען את קובץ ההגדרות של הכיול. בחר את פונקציית הכיול .
   2. חבר את המערכת למאגר מים בשני גבהים מוגדרים.
   3. קלט שנמדד ולחצים בפועל באמצעות ההמרה:
      1 ס"מ H₂O = 0.735 מ"מ כספית
2. הגדרת משאבה
   1. פתח את הגדרות המודול. טען את קובץ הקונפיגורציה של הרגולטור.
   2. בחר את מכשיר המשאבה. הזן את קצב הזרימה המקסימלי ואת קוטר המזרק.
3. הקלטת נתונים
   1. תתחיל להקליט.
   2. הפסק להקליט אחרי כל שלב לחץ.
   3. הזן את ערך הלחץ הבא.
   4. התחל מחדש את ההקלטה.

5. הכנת מחט

1. למשוך מיקרופיפטה מזכוכית לפי פרוטוקול מבוסס⁸.
2. טחנו את הקצה לקוטר פנימי של 80–100 מיקרון. ללטש את קצה המחט.
   זהירות: טפל במחטים מזכוכית בזהירות כדי למנוע פציעות.
3. התקן את המחט על מיקרומניפולטור. חבר את המחט לממיר הלחץ.
4. מלא את המחט ב-PBS.
5. מקם את קצה המחט באותו גובה כמו חיישן הלחץ.
6. מדידת התנגדות
   1. להפעיל לחץ של 1 מ"מ כספית. רשום את קצב הזרימה.
   2. חישוב התנגדות המחט:
      
   3. השתמש במחטים עם התנגדות בין 0.01 ל-0.5 מ"מ כספית/(μL/דקה).

6. מתקן המערכת ועמידה בדרישות

1. מדידת מתקן
   1. תפרץ את המערכת עם PBS. אטום את המערכת באמצעות שסתום תלת-כיווני.
   2. הפעילו שלבי לחץ של 6, 8, 10, 12, 14 ו-16 מ"מ כספית.
   3. הקלט P ו-Q במשך 10 דקות בכל צעד. חשב ערכים ממוצעים מה-5 דקות האחרונות.
   4. בצע רגרסיה ליניארית. פרש את השיפוע כמתקן מערכת.
2. אימות
   1. חזור על המדידות 3 פעמים.
   2. ודאו שמתקן המערכת הוא פחות מ-0.2 nL/min/mmHg.
3. מדידת ציות
   1. הכנס צינור סיליקון בקוטר 35 ס"מ למערכת.
   2. מדדו את ההתאמה עם ובלי צינורות טפלון.
   3. חשב שינוי נפח באמצעות שיטת נפח בדיד¹⁴.
   4. קבעו עמידה במערכת כ-4 nL/mmHg.
4. בדיקת רגישות
   1. ודאו שהתאימות למערכת הניתנת לזיהוי גבוהה מ-9.9 nL/mmHg.

7. התפשטות

1. המית עכברים באמצעות_CO2 בקצב זרימה של 0.7 ליטר לדקה למשך 3 דקות.
   אזהרה: המתת חסד ל-CO₂ חייבת לעמוד בהנחיות מוסדיות כדי להבטיח נקודות סיום הומניות.
2. נתח שרירים חוץ-עיניים ועצבי ראייה באמצעות כלים סטריליים. להטיל את גלגלי העיניים.
3. התקן מיד עין אחת במחזיק בטמפרטורה של 35.5 מעלות צלזיוס.
4. שמרו את העין הנגדית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. מדוד את שתי העיניים באותה מערכת.

8. קנולציה

1. הכנסת מחט
   1. הכנס את המחט דרך הקרנית המרכזית בזווית של 45°.
   2. קדם את המחט לעומק של 0.3–0.5 מ"מ לתוך התא הקדמי.
2. אימות
   1. לייצב את המערכת. אשר תנודת לחץ ≤ 0.4 מ"מ כספית בחמש הדקות האחרונות.

9. Ocular C_r

1. יייצב את העין על 8 מ"מ כספית למשך 30 דקות.
2. הפעילו שלבי לחץ של 6, 8, 10, 12, 14 ו-16 מ"מ כספית.
3. הנח שלב אחרון ב-8 מ"מ כספית.
4. איסוף נתונים
   1. הגדר את קצב הזרימה המקסימלי ל-4 מיקרוליטר/דקה.
   2. הקלט P ו-Q במשך 10 דקות בכל צעד.
5. ניתוח
   1. גרף עקומות P–T ו-Q–T. חשב ערכים ממוצעים מחמש הדקות האחרונות.
   2. התאמת נתונים למודל חוק החזקה²⁷:
      
6. הגדר את C_r (לאחר חיסור מתקן המערכת) כמתקן יציאה עינית.
7. הגדר P_r = 8 מ"מ כספית.
8. הגדר β כמקדם הלא-ליניארי.

10. Ocular Φ_r

1. נתח עקומות P–T ו-Q–T במהלך העליות של לחץ. זהה את עליית הזרימה ל-Q_{מקסימום} ואת ההאטה שלאחר מכן.
2. חשב את שינוי הנפח בין t_{p ל-t מקסימום} באמצעות שיטת הנפח הבדיד³⁰.
3. התאמת נתונים למשוואת פרידנוולד^{המתוקנת 30}:
   
4. הגדר P_r = 13 מ"מ כספית. הגדר Φ_r (לאחר חיסור תאימות המערכת) כהתאמה עינית Φ_r, _עין ו-γ כפרמטר חומר.

תוצאות

הביצועים של מערכת המשאבה האופטימלית הוערכו על ידי השוואת C ו-φ בעכברים בני 5 חודשים עם ערכים שפורסמו בעבר ממחקרי פרפוזיה עינית מבוקרת לחץ. הנורמליות של מערכי הנתונים באיור 2F הוערכה באמצעות מבחן שפירו–וילק, והשוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות מבחן t של סטודנט בעל שני זנבות.

כפי שמוצג באיור 2A–C, ה-IOP, _{C r}, העין ו-Φ_r, העין היו 14.0 מ"מ כספית (רווח ...

דיון

מחקר זה מציג מערכת משאבת מזרק אופטימלית להערכת יכולת הזרימה היציאה והתאמות העין בעיני העכבר, ומספקת ערכים התואמים לאלו המדווחים במערכות פרפוזיה עינית מבוקרות בלחץ. הגישה הנוכחית משפרת את דיוק המדידות המבוססות על מזרק תוך שמירה על מערך ניסויי פשוט ונגיש. שילוב זה של שיפור מתודולוגי ונגישות עשוי להקל על אימוץ רחב יותר במעבדות שבהן מערכות מתקדמות יותר אינן זמינות בקלות.

היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שיפור דיוק הנתונים, המאפשר זיהוי גנים מרכזיים ונתיבים מולקולריים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנט	1× בופר PBS	תרמו פישר סיינטיפיק	10010023
איזופלוראן	חברת שנזן ריווד למדעי החיים בע"מ, סין	R640
חומר	100 & mu; מזרק L High Precision	המילטון	1710
זכוכית בורוסיליקט	סאטר, נובאטו, קליפורניה	BF100-50-10
מזרק סטרילי חד-פעמי	חברת Phenglin Medical Devices בע"מ, ג'יאנגשי, סין	10 מ"ל
חיישן לחץ	IcuMedical	PX26-015G
צינור סיליקון	רונזה פלואיד בע"מ, נאנג'ינג, סין	לא זמין
צינור PTFE שקוף	רונזה פלואיד בע"מ, נאנג'ינג, סין	לא זמין
ציוד	מושך פיפטות בוער/חום	סאטר, נובאטו, קליפורניה	P-97
מיקרומניפולטור ידני	מכשירי דיוק עולמיים (WPI)	M3301
אמבטיה מתכתית	ביולוגיית בונה, סוז'ואו, סין	2016C
מיקרופורג'	מעבדת המכשירים המדעיים נארישיגה, טוקיו, יפן	MF830
מטחנת מיקרופיפטות	MPInstrument Co., Ltd., ווהאן, סין	KDG-02
מיקרוסקופ בינוקולרי סטריאו זום PZMIII	מכשירי דיוק עולמיים (WPI)	PZMIII
משאבת מזרק	מכשירי דיוק עולמיים (WPI)	AL-1000