מאמר שיטה

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

143 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70434

⸱

15 במאי 2026

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

תקציר

דיסקים דמיוניים של דרוזופילה נחקרו מזה זמן רב כמודלים של התפתחות, דפוסים והתחדשות אפיתליים. תיוג והדמיית נוגדנים של דיסקים דמיוניים מפורקים חשובים להמחשת דפוסי ביטוי חלבונים כסמנים של תהליכים התפתחותיים ופיזיולוגיים. שיטה זו לפירוק ותיוג דיסקים דמיוניים פותחה במקור למיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית של דיסקים דמיוניים של עיניים-אנטנות על ידי טומלינסון ורדי. באמצעות לוחות של 60 מיקרווול, ובהעברת רקמות בין תמיסות במקום להעביר תמיסות – ניתן לקבל תשומת לב אישית לדגימות רקמה עם בזבוז מועט מאוד. אפילו דיסקים דמיוניים בודדים ניתנים לעיבוד. השיטה דורשת רק כמויות קטנות של נוגדנים ותגובות אחרות. כדוגמה ליישום השיטה על רקמות קטנות אחרות, המאמר גם מדגים כיצד דיסקים דמיוניים של כנפיים ניתנים לניתוח ולתייג באותה שיטה. גישה דומה יכולה להיות מיושמת על כל רקמה קטנה במידות דומות, וכן על הליכים היסטוכימיים וסימון נוספים מלבד צביעת נוגדנים.

מבוא

דיסקים דמיוניים של דרוזופילה הם רקמות אב שמוסרות בצד במהלך העובר וגדלות בתוך הזחל מבלי להתמיין ותורמות למבני האפידרם הבוגרים במהלך שלבהגולם הראשון. המחקר שלהם סיפק תובנות רבות על מנגנוני דפוס התפתחותיים, כאשר דיסקים דמיוניים של העין והכנף נחקרו היטבבמיוחד 2,3,4,5,6. אימונוהיסטוכימיה שימושית במיוחד לחקר דפוסי ביטוי גנים מרחביים וזמניים בדיסקים דמיוניים, וכן לאפיון התנהגות תאים, כולל חלוקת תאים ומוות תאים.

כדי להקל על הדרישות הנוספות של ניתוח מיקרוסקופי אלקטרוני של דיסקים דמיוני עיניים מסומנים בנוגדנים, טומלינסון ורדי פיתחו פרוטוקול בקנה מידה קטן שהוא חסכוני במיוחד עם תגובות ומספק רמת אמינות והתאמה אישית גבוההמאוד. השיטה שלהם מתוארת בדפוס, אך אין וידאו זמין 3,8,9. השיטה מותאמת בקלות לתיוג דיסקים דמיוניים אחרים (או רקמות אחרות) וניתן ליישם אותה על דיסקים דמיוניים כנפיים בנוסף לדיסקים דמיוניים עין-אנטנתיים.

תיוג נוגדנים לדיסקים דמיוניים של דרוזופילה עוקב אחרי הקו הכללי החל על כל רקמה10 (איור 1). הרקמה חייבת להיות מפורקת ומקובעת לפני הדגירה עם נוגדנים ספציפיים לחלבונים הרלוונטיים. לאחר שהנוגדן הלא קשור נשטף, מוסיפים נוגדן משני מסומן (לעיתים פלואורסצנטי), שנקשר לנוגדן הראשוני, אשר עצמו קשור לחלבון הרצוי ברקמה הקבועה. לאחר שטיפה להסרת נוגדנים משניים לא קשורים, ניתן להתקין את הרקמה לבדיקה מיקרוסקופית, וניתן לראות את החלבונים הרלוונטיים. קיימים תיאורים כלליים רבים של תהליך זה שניתן ליישם על דיסקים דמיוניים ורקמות דרוזופילה אחרות11. כאן מסופק פרוטוקול לשיטת Tomlinson & Ready, שבה דגימות רקמה מועברות בנפרד בין בארות דגירה קטנות על פלטת מיקרווול ונצפות על ידי מיקרוסקופ סטריאו בכל שלב (איור 2). גישה זו עובדת הכי טוב לצביעת מספר קטן יותר של רקמות בו זמנית (עשרות דגימות) ואינה אידיאלית למנות גדולות (כלומר, מאות). גישה זו דורשת רק נפחי תמיסה קטנים של 13 מיקרוליטר בכל באר ולכן ניתן לבצע אותה עם מעט מאוד נוגדנים. מכיוון שיש אובדן רקמה מינימלי אין גודל דגימה מינימלי, ואפילו דיסקים דמיוניים בודדים יכולים להיות מעובדים באופן אמין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. יצירת כלי ההעברה

  1. השתמש בפליירים כדי לחתוך ~2.5 ס"מ של חוט טונגסטן בקוטר 0.005 אינץ'. השתמש במלקחיים כדי ליצור קצה אחד של החוט לוו או לולאה (איור 3). הכנס את הקצה השני למחזיק מחט. זה ישמש להעברת הדיסקים עם מעט או ללא העברת נוזלים. הלולאה אולי קלה יותר לשימוש, אבל הוו מעביר פחות נוזל בין התמיסות לשימוש.

2. ניתוח ותיקון דיסקים דמיוניים של עין-אנטנות

  1. שטוף את הזחלים עם ~7.5 מ"ל בופר נתרן פוספט (pH7.2) בצלחת פטרי (קוטר 60 מ"מ) להסרת מדיה של זבובים או פסולת אחרת. ראו שלב 6 לפירוק דיסקים דמיוניים של כנף במקום דיסקים עין-אנטנות. שני הדיסקים המדומים הללו ממוקמים בתוך החלק הקדמי של הגוף (איור 4).
    הערה: ניתן גם להשתמש ב-PBS במקום בופר פוספט בשלבים 2.1–2.3.
  2. העבר את הזחלים לצלחת פטרי המכילה בופר טרי.
    הערה: חלק מהעובדים מעדיפים לנתח זחלים בודדים בטיפות בופר בודדות בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ; אחרים משתמשים בשקופיות ל-Depression Well.
  3. בעת התבוננות תחת מיקרוסקופ ניתוח, החזק את הזחלים ~50% מהדרך לאורך הגוף באמצעות מלקחיים. השתמש בזוג מלקחיים דקים נוסף כדי לאחוז בוו הפה ולמשוך. דיסקי האנטנות של העין יצאו מחוברים לחלקי הפה. המוח עשוי גם להישאר מחובר לדיסקי העין.
  4. השתמש בכלי החוט כדי להעביר את הרקמה המנותקת לצלחת פטרי קטנה (בקוטר 35 מ"מ) המכילה ~3 מ"ל קיבוע, לדוגמה, פורמלדהיד 3.7% בבופר פוספט נתרן (pH7.2) בעומק 0.1 מטר, המיוצר על ידי דילול תמיסת מלאי פורמלדהיד של 37% בבופר.
    הערה: פעל לפי נהלי בטיחות מאושרים מקומית לטיפול בפורמלדהיד. פורמלדהיד 3.7% הוא קיבע פשוט שיהיה מספק במקרים רבים, אך מקבענים אחרים עשויים להיות אופטימליים לאנטיגנים מסוימים. PBS או PEM (צינורות 0.1 M pH 7.0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) יכולים לשמש כבופר קיבוע במקום 0.1 מיליון פוספט נתרן, או שתמיסת פורמלדהיד יכולה להתקבל על ידי המסה של פאראפורמלדהיד מוצק, ולא מתמיסה מרוכזת. הקיבוע הפרפורמלדהיד-ליזין-מחזורי (PLP) משלב קיבוע חלבוני עדין יותר עם קישור צולב פחמימות ומשמר טוב יותר את מבני הממברנה12. לדוגמה, הגליקופרוטאין Scabrous של דרוזופילה יישאר אנטיגני לאחר קיבוע PLP אך לא לאחר קיבוע פורמלדהיד. הכינו PLP טרי כך: (1) מוסיפים 2 גרם אבקת פאראפורמלדהיד ל-25 מ"ל מים דה-יוננים בבקבוק חרוטי במכסה אדים וערבבו בחום נמוך; (2) טובלים פיפטה בתמיסת נתרן הידרוקסיד 50% והעבירו שארית נוזל (הרבה פחות מטיפה אחת) לתערובת. הפרפורמלדהיד אמור להימס תוך כמה דקות מבלי שהתמיסה תרתח. בעת קירור תמיסת פורמלדהיד 8%, יש להמיס 0.36 גרם ליזין ב-10 מ"ל מים דה-יוננים, 7.5 מ"ל 0.1 מיליון נתרן פוספט pH 7.2, 2.5 מ"ל 0.1 מ' Na2HPO4 ולשמור על הקרח. ערבבו 15 מ"ל מתמיסת ליזין קר עם 5 מ"ל של פורמלדהיד טרי 8% ו-50 מ"ג נתרן מחזורי בצינור עם מכסה בורג של 50 מ"ל, ערבבו באמצעות מערבולת והשתמשו בהם כשהם טריים.
  5. לאחר 15–20 דקות בטמפרטורת החדר, העבר את הרקמה המנותקת לצלחת פטרי אחרת המכילה 0.1 מטר בופר נתרן פוספט (pH 7.2).
    הערה: ניתן גם להשתמש ב-PBS במקום בופר פוספט. קיבוע על קרח עשוי להיות מועדף עבור אנטיגנים מסוימים, או כאשר רצוי לצלם את הפלואורסצנציה האנדוגנית של GFP או RFP המובע ברקמה. ההתמקדות ב-PLP היא תמיד 45 דקות על הקרח.

3. חסימה ודגירה עם נוגדן ראשוני

  1. העבר רקמה לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה ~3 מ"ל בופר שטיפת נוגדנים NSG לחסימה. דגרו את צלחת פטרי על הקרח לפחות 15 דקות. NSG הוא 0.1 מיליון בופר נתרן פוספט (pH 7.2), 0.1% ספונין, 5% סרום עז רגיל. מלאי בופר לשטיפה מאוחסנים בסינון מחוטא בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: בופרי שטיפה שונים עשויים להיות אופטימליים לנוגדנים מסוימים. לדוגמה, בעוד שספונין הוא חומר ניקוי עדין ולא יוני שממסיס במיוחד את ממברנת הפלזמה, ייתכן שדטרגנטים אחרים יהיו מועדפים לזיהוי אנטיגנים בתוך הגרעין. לדוגמה נוספת, הנוגדן שפותח נגד החלבון האטונלי הגרעיני על ידי Jarman ואחרים, הוא היעיל ביותר באימונוריאקטיבי בבופרים המכילים NP40 כחומר ניקוי. ראו את טבלת החומרים למתכונים לבופרי שטיפה חלופיים: PDT, PBT או NSG. כאשר משתמשים בסרום רגיל כחלבון חוסם, רצוי שהוא צריך להיות מהמין שבו מיוצר הנוגדן המשני, לדוגמה, סרום עז רגיל אם יש להשתמש בנוגדנים משניים לעז, או סרום חמור רגיל אם יש להשתמש בנוגדנים משניים לחמור. בפועל, זה לא משנה הרבה.
  2. נקה כל רקמה לא רצויה מהדיסקים הדמיוניים של האנטנות בעין במהלך החסימה באמצעות מלקחיים דקים, למעט קרסי הפה. להשאיר את חלקי הפה מחוברים לעת עתה כדי להקל על ההעברות.
    הערה: רקמות מיותרות, למשל מוח, יכולות להישאר גם הן עד להתקנת המגלש (שלב 5.4), כל עוד הן אינן מפריעות לצבועים או לנראות.
  3. במהלך החסימה, יש להכין דילול של 1:100 של תמיסת נוגדנים mAb40-1a ב-NSG, לדוגמה, 1 מיקרוליטר נוגדן ב-100 מיקרוליטר NSG. תערוב על ידי פיפטינג, לא על ידי מערבולת.
    הערה: mAb40-1a הוא נוגדן מונוקלונלי שמוגדל נגד בטא-גלקטוזידאז. הדילול האופטימלי של נוגדנים ובופ השטיפה ישתנו בהתאם לנוגדנים הספציפיים בהם משתמשים.
  4. הוסיפו 13 מיקרוליטר תמיסות נוגדנים לכל אחת משישה בארות בעמודה הראשונה של מיני-מגש מיקרובאר עם 60 בארות. מיקרובארות חרוטיות עם צדדים ישרים חשובות לבהירות אופטית. אם נדרשים יותר משישה בארות, תתחילו מיני-מגש שני.
  5. העבירו דיסקים דמיוניים של עיניים-אנטנות, רצוי שעדיין מחוברים לחלקי הפה, לתמיסת הנוגדן הראשית אחת אחרי השנייה באמצעות לולאת חוט או וו.
    הערה: מספר הדיסקים הדמיוניים שניתן להוסיף לכל באר תלוי בנוגדן. יותר מדי רקמה יכול לרוקן חלק מהנוגדנים עד כדי כך שהסימון פוחת. 5 זוגות בכל באר בדרך כלל מספקים. לכן, ניתן לתייג ~60 דיסקים בקלות באמצעות 6 שורות של לוחות מיקרוטיטר עם 60 בארים. ניתן להשתמש בנוגדנים שונים לכל שורה. האם ניתן להשתמש שוב בתמיסות נוגדנים דורשת בדיקה אמפירית לכל מקרה; זה לא שגרה במעבדה שלנו.
  6. סגור את הפלטה עם המכסה ואטום עם פרפילם כדי להגביל את האידוי. דגרו על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עד הלילה. נדנוד אינו הכרחי.
    הערה: הזמן והטמפרטורה האופטימליים של דגירה של נוגדנים תלויים בנוגדן. במקרים רבים, 1–2 שעות בטמפרטורת החדר יספיקו, אך חלק מהנוגדנים יניבו תוצאות משופרות לאחר דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולעיתים קרובות יהיה נוח לדגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. במקרים מעטים מאוד, דגירות נוגדנים ראשוניות של 2–3 ימים עשויות להיות אופטימליות. אטימת מכסה המיקרובאר נחוצה רק לדגירות ארוכות יותר מ-~4 שעות.

4. שטיפה ודגירה עם נוגדן משני

  1. הוסיפו 13 מיקרוליטר של בופר NSG לשלוש עמודות הבארות הבאות לאחר כל באר נוגדנים, שכן הדגימות יישטפו שלוש פעמים. העבר את הדגימות לשטיפה במשך 5 דקות בכל באר ברצף.
  2. במהלך השטיפה, יש להכין דילול של 1:200–400 של נוגדנים משניים פלואורסצנטיים בבופר NSG, לדוגמה, 0.5 מיקרוליטר נוגדן ב-100 מיקרוליטר NSG. תערוב על ידי פיפטינג, לא על ידי מערבולת. צנטריפוגה את תמיסת מאגר הנוגדנים המשנית למשך 60 שניות (במהירות מקסימלית) לפני הדילול, שכן אגרגטים של נוגדנים יכולים להיקשר באופן לא ספציפי לפני הרקמה.
    הערה: דילול נוגדנים משני אופטימלי עשוי להשתנות בין יצרן. נוגדנים מצומדים אלקסה או ציאנין זמינים בהפחתת מינים אחרים כדי לאפשר תיוג מרובה.
  3. הוסיפו 13 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית לעמוד הבארות הבא (החמישי).
  4. העבר דגימות לנוגדן המשני באמצעות הלולאה או הוו.
  5. סגור את הפלטה עם המכסה ואטום עם פרפילם כדי להגביל את האידוי. דגרו על קרח במשך 4 שעות בלילה.
    הערה: הזמן והטמפרטורה האופטימליים של דגירה של נוגדנים תלויים בנוגדן. במקרים רבים, 1–2 שעות בטמפרטורת החדר יספיקו, אך חלק מהנוגדנים יניבו תוצאות משופרות לאחר דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולעיתים קרובות יהיה נוח לדגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. אטימת מכסה המיקרובאר נחוצה רק לדגירות ארוכות יותר מ-~4 שעות.

5. שטיפה והרכבת רקמות למיקרוסקופיה

  1. הכינו את שלוש עמודות הבארות הבאות לאחר באר הנוגדן המשנית עם 13 מיקרוליטר NSG. העבר את הדגימות דרך כל באר למשך 5 דקות.
  2. העבר את הדגימות לשטיפה סופית בבארהתשיעית באמצעות 13 מיקרוליטר של בופר נתרן פוספט 0.1M (pH 7.2). שטיפת בופר זו נחוצה כאשר בופרי השטיפה מכילים רכיבים שמשקעים במדיום ההתקנה.
  3. . הוסיפו 13 מיקרוליטר של מדיום התקנה לעמוד הקידוח הסופי (העשירי). מדיום ההרכבה מיוצר על ידי המסה של 2% n-פרופיל גלאט ב-75% גליצרול ו-25% 0.1 מ' בופר נתרן פוספט, pH 7.2. הכינו מדיום התקנה חדש בכל שבוע על ידי ערבוב הרכיבים על פלטפורמה מסתובבת. תן לבועות אוויר להתפזר לפני השימוש.
    הערה: מדיה להרכבה זמינה גם מסחרית.
  4. פיפטה 20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על סלייד מיקרוסקופ נקי. העבר דגימות למדיום שעל הסלייד. זו הזדמנות אחרונה להסיר רקמות לא רצויות. יש להסיר את חלקי הפה הקוטיקולריים מדיסקי אנטנות העין.
  5. כדי לסדר דגימות כך שלא יסחפו כאשר זכוכית הכיסוי מונחת מעל, השתמשו בכלי החוט כדי לגרור דגימות מתוך הטיפה הראשית של הרכב. הורד בעדינות זכוכית כיסוי נקייה בעובי #1.5 בגודל 22 מ"מ על 40 מ"מ על המחסנית בעזרת מלקחיים, מבלי להכניס בועות אוויר.
  6. תן למחסניות לשבת שעה אחת במחזיק מקרטון כדי לתת למדיה להרכבה לשקוע. הימנעו מהפרעה למחסניות, שכן הדגימות השבירות עלולות להינזק אם זכוכית הכיסוי זזה.
  7. לאחר שזכוכית הכיסוי התייצבה, אטמו את הקצוות עם לק לציפורניים. אל תזיז או תלחץ על הזכוכית בזמן זה. תן ללק להתייבש לפחות שעה לפני ההדמיה.
    הערה: למרבה הצער, רוב הלק הקוסמטי כיום משתמש בממסים שאינם מתפזרים באופן אחיד על שקופיות זכוכית ואינם שימושיים, ולכן יש להשיג לק מדעי לציפורניים.
  8. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ניתן בדרך כלל להדגים ולהצטלם מחדש דגימות במשך חודשים.
    הערה: ניתן גם לאחסן מגלשות בטמפרטורה של -20°C.

6. ניתוח ותיקון דיסקים דמיוניים של כנפיים

  1. כדי לנתח דיסקים דמיוניים של כנף במקום דיסקים דמיוניים של עיניים-אנטנות, עקוב אחר השלבים הבאים במקום שלבים 2.3–2.5 למעלה.
  2. תחת מיקרוסקופ ניתוח, אחזו בחלקי הפה של הזחל עם מלקחיים דקים. באמצעות מספריים מיקרודיסקציה, חצו את הזחלים ב-30%–40% מהדרך מהמטה מהקדמיים.
  3. הפוך את החלק הקדמי של הזחל על ידי פיזור הקצה הפתוח והחתוך של הזחל באמצעות זוג מלקחיים נוסף ודחיפת הראש וחלקי הפה דרכו, בדומה להיפוך גרב
  4. השתמשו במלקחיים כדי להעביר את הזחלים הקדמיים ההפוכים לקיבוע לצלחת פטרי קטנה (קוטר 35 מ"מ) המכילה ~2.5 מ"ל קיבוע, לדוגמה, 3.7% פורמלדהיד בבופר נתרן פוספט של 0.1 מ' (pH 7.2), המיוצר על ידי דילול תמיסת פורמלדהיד 37% ב-PBS.
    הערה: אם רוצים, גופות הפוכות יכולות להיות מועברות ל-400 מיקרוליטר של קיבוע בצינור מיקרופוג', מה שמקל על קיבוע במכסה אדים. אותן אפשרויות קיבוע זמינות לקיבוע דיסק עין-דמיוני חלות גם על קיבוע דיסק כנף (ראו הערה בשלב 2.4). הקיבוע האופטימלי ולתיוג דיסקים דמיוניים של עיניים-אנטנות יהיו בדרך כלל זהים לדיסקים כנפיים.
  5. לאחר 15–20 דקות בטמפרטורת החדר, העבר את הרקמה המנותקת לצלחת פטרי אחרת המכילה 0.1 מטר בופר נתרן פוספט (pH 7.2).
    הערה: אותן אפשרויות בופר שטיפה הזמינות לקיבוע דיסק עין-דמיוני חלות גם על קיבוע דיסק כנף (ראו הערה בשלב 2.4). בופר השטיפה האופטימלי לתיוג דיסקים דמיוניים של עיניים-אנטנות יהיה בדרך כלל זהה לדיסקי כנף.
  6. הסר דיסקי כנף מהזחלים באמצעות מלקחיים דקים. אם עדיין קיימים, ניתן להסיר את דיסק ההולטר הקטן יותר ודיסק הרגל כעת או להישאר מחוברים לדיסקי הכנף כדי להקל על ההעברה.
    הערה: דיסקי הכנפיים עשויים שלא להיות גלויים בקלות בתוך הגופה עד שגוף השומן או רקמה אחרת יימשכו (תמיד יש לזהות רקמה לפני הסרתה). דיסקי הכנפיים הם הדיסקים המדומים הגדולים ביותר ומחוברים לדופן הגוף, קשורים קשר הדוק לקנה הנשימה. להן צורת טיפה, כמו קווי המתאר של דרום אמריקה1 (איור 4).
  7. המשך בשלבים 3–5 כפי שתואר למעלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההליך Tomlinson and Ready מניב באופן קבוע תוצאות מצוינות של צביעת נוגדנים. כאן מוצגים דיסקים דמיוניים של עין, אנטנות וכנפיים עם שלוש תוויות. באיור 5A, דיסק דמיוני עין-אנטנה בשלב שלישי סומן בשלוש תוויות כדי לזהות את פקטור השעתוק Senseless (כחול), סמן אב עצבי Elav (אדום), וסימון אנטי-GFP של שיבוטי תאים המבטאים RNAi עבור תמלול Ocho (ירוק). באיור 5B, דיסק דמיוני של כנף בשלב שלישי סומן באמצעות מערכת TIE-DYE שמסמנת באופן עצמא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צביעת נוגדנים של רקמות דרוזופילה באמצעות לוחות קוניים של 60 בארים בשיטת טומלינסון ורדי מניבה תוצאות מצוינות ואמינה מאוד, שכן כל דיסק דמיוני עוקב אחרי מיקרוסקופ הניתוח במהלך כל מניפולציה. השיטה דורשת רק כמויות קטנות של מגיב נוגדנים, ומחליפה פתרונות באופן מלא יותר בכל שלב, שכן הדגימות מועברות עם מעט מאוד נוזל נלווה. הוא מתאים במיוחד לטיפול במספר קטן של דגימות שעלולות להיאבד או להיפגע בקלות בשיטות בכמויות גדולות שבהן הדגימות אינן נצפות בנפרד בכל שלב. השיטה שימושית במיוחד כאשר: (1) ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

NEB מודה לאנדרו טומלינסון על שיתוף השיטה וללוסי פירת' על השיפורים. אנו מודים לאבישק בהאטצ'ריה על תרומת איור 5A. אנו מודים לג'וינר קרוז, ג'ונתן גונזלס, צ'לסי נויין וג'נסן נורת'רופ. המחקר במעבדת המחברים ממומן על ידי מענקים מה-NIH (GM120451 CA284362). איור 2 ואיור 4 נוצרו עם Biorender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
די-נתרן פוספטפישר7558-79-4Na2HPO4 - נתרן פוספט די-בסיסי חסר מים. ניתן להשתמש במצבי הידרציה אחרים אך לשנות את המשקל המולקולרי
מלקחיים: Dumont #5 מלקחיים ביולוגייםכלי מדע מדויק11252-20סגנון: #5
           צורת הקצה: ישר
               אורך: 11 ס"מ
           כספת אוטוקלאב: כן
           טיפים: ביולוגיה
           מידות קצה:
         0.05 x 0.02 מ"מ
           סגסוגת / חומר: Inox
פורמלדהידפישרBP531-500דירוג ביולוגיה מולקולרית, 37% פורמלדהיד. 500 מ"ל
קיבוע פורמלדהידפישרBP531-5003.7% פורמלדהיד ב-0.1M נתרן פוספט בופר pH7.2 המיוצר מדילול ממלאי של 37%.
גליצרולביוריאגנטים של פישרBP229-1
קרחהעדפת משתמש
L-ליזין, 98%תרמו-מדעיJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sאנטי-בטא גלקטוזידאז
צינורות מיקרוצנטריפוגהארה"ב מדעית1615-5520צינורות של 1.5 מ"ל לאחסון דגימות.
מיקרודיסקציה מספרייםכלי המדע המדויק15003-08קצה חיתוך 5 מ"מ, קצה ישר, 8.5 ס"מ
מונוסודיום פוספטפישר7558-80-7NaH2PO4 - פוספט נתרן מונו-בסיסי ללא הידר. אם משתמשים בתבנית הידרטית, המשקל הנדרש לייצור תמיסה של 0.1 מטר ישתנה.
מדיום הרכבהתמיסת גליצרול 75% ב-0.1M נתרן פוספט בופר pH7.2 עם 2.5% n-פרופיל גלאט. ערבב על ידי היפוך כדי למזער בועות.
NSG0.1M בופר נתרן פוספט pH7.2, 0.1% סאפונין, 5% NGS
גלאט N-פרופילביומדיקל MP210274780
לק לציפורנייםטד פלה, נרכש מפישרNC0381432לאיטום שקופיות
מחזיק מחטפישרNC0099380למחטים למיקרודיסקציה. פלדת אל-חלד חלולה; אורך הידית: 4 3/4 אינץ'
מיני-מגשים של Nunc Microwellתרמו-סיינטיפיק12565155MicroWell MiniTray ליישומים סרולוגיים. באר ספירה 60
פאראפילםStatLabPM996StatLab ParaFilm M סרט גמיש ואטום עצמי
פאראפורמלדהידפוליסיינסס, בע"מ00380-250
10x PBSהעדפת משתמשהכינו 800 מ"ל מים מזוקקים במיכל מתאים.
           הוסיפו 1.37 מיליון נתרן כלוריד לתמיסה.
             הוסף 26.8 מ"מ מולר של כלורי אשלגן לתמיסה.
             הוסף 101mM של נתרן פוספט די-בסיסי לתמיסה.
         הוסף 18.0mM של פסלגן פוספט מונובסיסי לתמיסה.
         כוון את התמיסה ל-pH הרצוי (בדרך כלל pH ואסימפ; 7.4).
           הוסף מים מזוקקים עד שהנפח מגיע ל-1 ליטר.
PBTהעדפת משתמש0.1M בופר נתרן פוספט pH7.2, 0.1% אלבומין סרום בקר, ו-0.2% טריטון X-100.
PDTהעדפת משתמש0.1M בופר נתרן פוספט (pH = 7.2), 0.3% דאוקסיכולאט, ו-0.3% טריטון x-100
פטרי דישפלקוןקורנינג 351007פטרי דיש; 60 מ"מ; לא מטופל
פטרי דישפלקוןקורנינג 351008פטרי דיש; 35 מ"מ; לא מטופל
פלייריםהעדפת משתמש
PLPלא זמין2% פאראפורמלדהיד 1.35% ליזין ב-0.05M בופר נתרן פוספט pH7.2
נוגדנים משנייםJackson ImmunoResearch715-545-1510.5 מ"ג אלקסה פלואר 488 דונקי אנטי-עכבר IgG.
כיסויי שקופיותVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (מארז)
שקופיותפישר125442Fisher Glass Slides 10bx/CS
נתרן דאוקסיכולטתרמו פישר מדעי89904אבקת נתרן דאוקסיכולאט; 5 מ"ג
נתרן מחזוריסיגמא אולדריץ'71859-25GSodium Periodate ו-ndash; 25 גרם
בופר נתרן פוספט0.1M בופר NaPO4 pH 7.2. ערבבו 28 מ״ל של 0.1 מיליון מונוסודיום פוספט אניהדרוס (11.998 גרם NaH2PO4 עד 1 ליטר מים מזוקקים) עם 72 מ״ל של 0.1 מיליון מאגר די-סודיום פוספט אניהידרוסי (14.196 גרם Na2HPO4 עד 1 ליטר מים מזוקקים) ליצירת 100 מ״ל של 0.1M NaPO4 בופר. לחלופין, ניתן להשתמש ב-PBS.
חוט טונגסטןטד פלה27-11.005" דיה.
טריטון X-100תרמו פישר מדעיA16046AE
מערבולתהעדפת משתמש

מקורות

  1. Bate, M., Martinez Arias, A. The development of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. 747-841 (1993).
  2. Tripathi, B. K., Irvine, K. D. The wing imaginal disc. Genetics. 220 (4), iyac020(2022).
  3. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  4. Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
  5. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  6. Held, L. I. J. Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation. , Cambridge University Press. (2002).
  7. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).
  8. Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak (1990).
  9. Rubin lab manual. , The Rubin Lab. https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page (1990).
  10. Mitchison, T. J., Sedat, J. Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos. Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).
  11. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  12. Mclean, I. W., Nakane, P. K. Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).
  13. Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors. Nature. 369, 398-400 (1994).
  14. Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster. Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).
  15. Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila. Elife. 9, e50535(2020).
  16. Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo. Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).
  17. Kiparaki, M., Baker, N. E. Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation. STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).
  18. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (91), e51792(2014).
  19. Yan, S. J., Li, W. X. Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest. Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).
  20. Klein, T. Immunolabeling of imaginal discs. Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).
  21. Phalle Bde, S. Immunostaining of whole-mount imaginal discs. Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).
  22. Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia. J Vis Exp. (125), e55901(2017).
  23. Brown, N. L. Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

60

מאמרים קשורים