הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השפעת הרגולציה של מוקסיביושן על קיטוב והגירה של מקרופאגים בעכברי מודל RA ותפקיד TIM-3

196 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70436

⸱

27 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בוחן את ההשפעות הרגולטוריות של מוקסיבוסטיון על קיטוב והגירה של מקרופאגים במודלים של חולדות של דלקת מפרקים שגרונית, עם דגש על תפקיד האימונוגלובולין בתאי T וחלבון 3 המכיל תחום המוסין (TIM-3), להבהרת המנגנונים הטיפוליים של מוקסבושציה במחלה זו.

תקציר

מחקר זה נועד לבחון את ההשפעות הרגולטוריות של מוקסיביושן על קיטוב ונדידת מקרופאגים במודל חולדה של דלקת מפרקים שגרונית, וכן את תפקיד האימונוגלובולין של תאי T וחלבון 3 המכיל תחום המוסין (TIM-3) בתהליך זה. ביום ה-0 של הניסוי, חולקו חולדות ספרג–דולי (SD) לחמש קבוצות. הוזרק האדjuvant המלא של פרוינד (CFA) לרפיות האחוריות כדי לקבוע את מודל דלקת מפרקים שגרונית. בנוסף, הוזרק הוזרק התערבות RNA של Havcr2 (LV-Havcr2-RNAi) בתיווך לנטיווירוס לכריות הרגליים האחוריות כדי לעכב ביטוי TIM-3. החל מהיום השביעי, העכברים עברו טיפול מוקסיביושן במחזורים שכללו שישה ימי טיפול ויום מנוחה אחד, בסך הכל שלושה מחזורים שלמים. לאחר סיום הטיפול במוקסיבוסטיון, המצב הדלקתי הוערך באמצעות ניתוח היסטולוגי ומדידת עובי כפות הרגליים. סמנים פנוטיפיים של מקרופאגים M1 ו-M2 הוערכו באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזים (ELISA) ואימונופלואורסצנציה. ביטוי TIM-3 זוהה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR) ו-Western blot. יתרה מזאת, מקרופאג'ים פריטונאליים (PEMs) בודדו מעכברי SD נוספים, ונדידת המאקרופאגים נבדקה באמצעות בדיקת Transwell. המחקר מצא כי לאחר הזרקת CFA, חולדות הראו אדמומיות ונפיחות משמעותית בכפות הרגליים, יחד עם חוסר איזון בביטוי הפנוטיפ של המאקרופאגים. בנוסף, בדיקות נדידת טרנסוול גילו כי חולדות מודל שנגרמו על ידי CFA הראו נדידת מקרופאגים מוגברת ביחס לדגימות ביקורת. עם זאת, טיפול במוקסבושציה הפחית את השינויים הללו. התוצאות גם הראו שמוקסיביושן הגביר את ביטוי TIM-3, ולאחר התערבות לנטיוויראלית, רמות TIM-3 ירדו משמעותית, מה שהוביל להחמרה של תסמינים דלקתיים ולחוסר איזון במאקרופאגים. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-TIM-3 משמש כמתווך מרכזי בוויסות מוקסיבושציה של קיטוב והגירת מקרופאגים.

מבוא

דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה אוטואימונית מערכתית נפוצה שמופיעה קלינית בדלקת דלקתית סימטרית. הדלקת מכוונת בעיקר לממברנה הסינוביאלית, לסחוס ולעצם, מה שמוביל להרס רקמתי ומוביל לעיוות בלתי הפיך במפרק1. הניהול הפרמקולוגי הנוכחי של דלקת מפרקים שגרונית מתבסס בעיקר על תרופות אנטי-ראומטיות משנות מחלה (DMARDs)2, שלרוב דורשות מתן לכל החיים. עם זאת, תרופות אלו קשורות לתופעות לוואי שונות. כתוצאה מכך, מספר משמעותי של מטופלים מחפשים טיפולים משלימים בטוחים ויעילים להקל על תסמינים קליניים ואולי להפחית את התלות שלהם במשטרי תרופות קונבנציונליים. כמרכיב מרכזי ברפואה הסינית המסורתית, מוקסיאבושציה עשויה לשמש כטיפול משלים מבטיח לדלקת מפרקים שגרונית. הוא מפעיל את השפעותיו הטיפוליות באמצעות מנגנונים אנטי-דלקתיים ומודולטוריים סיסטמיים3. הראיות מצביעות על כך שמוקסיבוסטיון יכול להקל על התסמינים ולהגן על מבני המפרקים4. יתרה מזאת, בהשוואה לרעילות ההפטורנלית הפוטנציאלית, סיכוני הזיהום והעלויות הגבוהות הקשורים ל-DMARDs, מוקסיובסטיון מציע בטיחות טובה יותר ועלות נמוכה יותר. עם זאת, מוקסיבושציה אינה תרופת פלא ואינה יכולה להחליף לחלוטין את DMARDs לניהול RA. מוקסיבושציה בדרך כלל דורשת טיפולים חוזרים וארוכי טווח כדי להשיג את השפעותיו. במהלך החמרות חריפות של דלקת מפרקים שגרונית, ייתכן שלא לספק שליטה מהירה בתסמינים. יתרה מזאת, התוצאה הטיפולית של מוקסיבוסטיון תלויה מאוד במיומנות ובניסיון של המטפל, מה שיוצר שונות. לכן, יש לשקול שילוב מוקסיביושן עם DMARDs כדי להשיג אפקט סינרגטי של "יעילות מוגברת עם רעילות מופחתת", מה שהופך אותו לאסטרטגיה ישימה לניהול ארוך טווח של RA5.

למרות שמחקרים רבים אישרו את היעילות הטיפולית של מוקסיבושציה ב-RA 6,7,8, מנגנוני הפעולה המדויקים שלו עדיין אינם ברורים. מחקר זה בוחן את השפעות המוקסיבושציה על קיטוב והגירה של מקרופאגים ב-RA, תוך שימוש באימונוגלובולין של תאי T וחלבון 3 המכיל תחום המוקין (TIM-3) כנקודת כניסה מכנית. גישה זו נועדה להבהיר מסלול אימונומודולטורי פוטנציאלי דרכו מפעילה השפעותיה נגד דלקת מפרקים.

בתאי חיסון מרכזיים, המאקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי בפתוגנזה ובהתקדמות של RA 9,10. עם הופעת הדלקת, המאקרופאגים המתגוררים ברקמה משחררים מגוון ציטוקינים וכמוקינים. מולקולות איתות אלו פועלות על תאי אנדותל כלי דם, ומקדמות התמיינות של מונוציטים במחזור הדם למאקרופאגים ולגיוסם לרקמה דלקתית11,12. המקרופאגים החודרים הללו מחזקים עוד יותר את התגובה הדלקתית על ידי יצירת מתווכים נוספים, אשר בתורם מגייסים יותר מקרופאגים ומחריפים את חדירת הרקמות, ובכך יוצרים מעגל קסמים של דלקת וחדירת רקמות.

בהתאם לגירויים סביבתיים, המקרופאגים מראים פלסטיות משמעותית על ידי קיטוב לפנוטיפים פונקציונליים מובחנים, בעיקר מצבים M1 (מופעל קלאסית) ו-M2 (מופעל לסירוגין)13. בתנאים פיזיולוגיים, קיטוב המאקרופאגים שומר על שיווי משקל דינמי בין פנוטיפים של M1 ו-M2. עם זאת, ב-RA, שיווי המשקל הזה מופר, המאופיין בקיטוב מוגבר של M1 עם שחרור מוגבר של מתווכים פרו-דלקתיים, כולל אינטרפרון (IFN)-γ וסינתאז תחמוצת חנקן מושרה (iNOS), שמחמיר תגובות דלקתיות. במקביל, הקיטוב של M2 נחלש, מלווה בשחרור מופחת של גורמים אנטי-דלקתיים, כולל אינטרלוקין (IL)-4 ו-CD206, מה שפוגע ביכולתם לעכב הפעלה והתרבות תאי T, ובכך מחמיראת התקדמות המחלה. מספר מחקרים גילו כי ויסות מאזן המקרופאגים M1/M2 עשוי להקל על התקדמות RA15,16.

TIM-3, שמזוהה כגליקופרוטאין על פני שטח של תאי T, מתבטא באופן נרחב בספקטרום של תאי חיסון, כולל תאי T, מאקרופאגים ותאי הרג טבעיים, שם הוא נקשר לליגנדים ספציפיים כדי להפעיל פונקציות אימונו-רגולטוריות17. איתות TIM-3 משפיע באופן מכריע על ביטוי וקיטוב ציטוקינים דלקתיים של מקרופאגים. ראוי לציין כי TIM-3 מתבטא מאוד במקרופאגים של M2, שם הוא מקדם את הפנוטיפ של M2 תוך דיכוי הפנוטיפ של M1. לעומת זאת, מחקרים מראים כי עיכוב TIM-3 יוצר את האפקט ההפוך, שמפעיל קיטוב M1 ומחליש את הקיטוב של M2 18,19,20. בנוסף, ראיות מדגישות את TIM-3 כגורם מרכזי להתנהגות נדידה של מקרופאגים21,22. לכן, התערבות טיפולית המיועדת ל-TIM-3 לשליטה בקיטוב מקרופאגים ודינמיקת נדידה מראה פוטנציאל משמעותי כאסטרטגיית טיפול בדלקת מפרקים שגרואינית.

בהתבסס על הנימוק שהוזכר לעיל, נערך מחקר זה כדי לתרום לגוף הידע ההולך וגדל לגבי המנגנונים שבאמצעותם מוקסיבוסטיה מפעיל את השפעותיו הטיפוליות ב-RA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה ואמצעי בטיחות
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (2024029). במהלך כל הליכי ההזרקה, כולל מתן CFA ולנטיווירוס, המפעילים חייבים ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) הכולל כפפות חד-פעמיות, משקפי מגן ומעילי מעבדה. הליכים אלו חייבים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית או בסביבה מאווררת היטב. כל הגזים שבאו במגע עם חומרים חייבים להיות מושלכים מיד למכלי הגז המיועדים. במהלך הטיפול במוקסבוסטיון, המפעיל עקב מקרוב אחר תגובת החיה. קונוס המוקסה הוחלף במהירות כדי למנוע פגיעה תרמית בעור. בנוסף, יש לשמור על חומרים דליקים נקיים מהמוקסה הבוערת כדי למנוע סכנות אש.

1. הקמת מודל RA

שלושים חולדות SD זכרים (משקל: 200 ± 20 גרם), בגיל שישה שבועות (מספר רישיון: SCXK 2020-030), חולקו באקראי לחמש קבוצות (n = 6): קבוצת ביקורת, קבוצת מודל RA (קבוצת RA), קבוצת טיפול ב-Moxibustion + RA (קבוצת Mox), קבוצת ההפרעה RA + TIM-3 לנטיווירוס (קבוצת RA + TIM-3– קבוצת התערבות לנטיווירוס), וקבוצת טיפול ב-Moxibustion (RA + TIM-3– + קבוצת Mox). לפני הניסוי, החולדות הסתגלו במשך שבעה ימים בסביבה מבוקרת עם טמפרטורה של 22–24 מעלות צלזיוס, 20% לחות, ומחזור טבעי של אור/חושך, עם גישה חופשית למזון ולמים. ביום ה-23 של הניסוי, נרכשו חמישה זכרים נוספים בני שלושה שבועות מאותה חברה. חולדות אלו הסתגלו לחמישה ימים בתנאי מגורים זהים לפני ששימשו להפקת PEM. דיאגרמה סכמטית המסכמת את הליך הניסוי ותמונות פרוצדורליות מייצגות מוצגות באיור 1.

ביום האפס של הניסוי, הוזרק 0.5 מ"ל/ק"ג של CFA לכפות הרגליים האחוריות של כל העכברים למעט אלו שבקבוצת הביקורת כדי לגרום לדלקת דלקת מפרקים שגרונית. אותו נפח של תמלח ניתן באותו מקום גם בעכברי קבוצת הביקורת. עובי כפות שימש כקריטריון להערכת הצלחת הקמת דגם RA23.

2. הזרקת לנטיווירוס

חולדות בקבוצות RA + TIM-3- ו-RA + TIM-3- + Mox קיבלו הזרקה של LV-Havcr2-RNAi (94435-1) לכפות הרגליים האחוריות (3.5 ×10 7 TU/mL; 10 מיקרוליטר לכל פד) ביום הראשון של הניסוי. כל שאר העכברים קיבלו הזרקות זהות של תמיסת מלח תקינה באותו אתר אנטומי24.

3. מוקסיבוסטיון

ביום השביעי של הניסוי, חולדות בקבוצות Mox ו-RA + TIM-3- + Mox קיבלו טיפול מוקסבסטיון. כדי להקל על ההליך, גולח שיער באזור של כ-1 × 1 ס"מ סביב נקודות BL23 ו-ST36 (הליך זה בוצע גם לחולדות בקבוצות הנותרות). במהלך ה-moxibustion, כל עכברוש הוחבר בעדינות לבלוק עץ מעט גדול מגודל גופו באמצעות שתי רצועות אלסטיות לחשיפת אזורי הטיפול במלואן (חולדות בקבוצות אחרות היו מוגבלות באותה מידה). לאחר מכן, חרוטי מוקסה בצורת גרעין הונחו על שתי נקודות הדיקור. כדי להבטיח עקביות בגירוי תרמי בין הפרטים, כל קונוס מוקסה (קוטר: 2 מ"מ; גובה: 5 מ"מ; תכולת צמר מוקסה: 60%) הוכן ממנה סטנדרטית של 5 מ"ג של צמר מוקסה. בכל יום, חמישה קונוסים הונחו על שתי נקודות הדקור בצד אחד של הגוף, כאשר הטיפול התחלף לצד הנגדי ביום הבא. פרוטוקול הטיפול החלופי הזה נשמר במשך שלושה שבועות, עם תקופת מנוחה של יום אחד כל שבע ימים.

לאחר שלושה מחזורי טיפול במוקסיביסטיון, החולדות הורדמו באמצעות איזופלורן (4% השראה, 2% תחזוקה, שאיפה), ונאספו 5 מ"ל דם עורקי מאאורטה הבטנית. לאחר הצנטריפוגה (2,000 × גרם, 15 דקות, 4 מעלות צלזיוס), הסרום הסופרנטנטי הועבר לצינורות מיקרוצנטריפוגה ואוחסן בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס. לאחר דגימת דם, העכברים הושמתו כתוצאה מפריקה צווארית. מפרקי הקרסול נחתכו בקפידה וקיבעו ב-4% פאראפורמלדהיד. רקמות וסינוביאלים והטחול הוקפאו במהירות באמצעות חנקן נוזלי ואוחסן בטמפרטורה של −80°C.

4. מדידת עובי כף הרגל של העכברוש

האמצע של כפות הרגליים האחוריות של העכברים סומנו בסמן עמיד למים כדי להבטיח מיקום מדידה עקבי. עובי הרגליים נמדד באמצעות קליפרים של ורנייר לפני המידול, לאחר מידול מוצלח, ובין כל תהליך טיפול (בימים 0, 7, 14, 21 ו-28 של הניסוי).

5. ניתוח היסטולוגי

לאחר קיבוע ב-4% פאראפורמלדהיד, מפרקי הקרסול של העכברים הונחו בצינורות צנטריפוגה המכילים נפח נרחב של תמיסת דה-קלציפיקציה (10% חומצה פורמית). הצינורות הותקנו על שייקר ועברו ערבוב עדין בטמפרטורת החדר במשך 30 שעות. במהלך תקופה זו, תמיסת הדקלציפיקציה הוחלפה במרווחים קבועים, ומצב הרקמה נבדק כדי למנוע דקלציפיקציה מופרזת. לאחר מכן, הרקמות הועברו לתמיסת תיוסולפט נתרן 5% לנטרול במשך 6 שעות, ואחריה שטיפה יסודית של 4 שעות תחת מים זורמיםשל ברז 25 שעות. הרקמות התייבשו והוטמעו בבלוקי פרפין. החתכים נחתכו לרוחב בעובי של 5 מיקרון. לאחר דה-פרפיניזציה וההידרציה, החלקים צוברו בהמטוקסילין למשך 3 דקות, שטפו במים, הובדלו בקצרה (5 שניות), שטפו שוב, וכחולו במשך 5 שניות, ואחר כך שטיפה יסודית במי ברז זורמים. לאחר מכן, הקטעים יובשו ב-95% אתנול למשך דקה אחת וצבעו באאוזין במשך 15 שניות. לבסוף, החלקים יובשו, פונו והותקנו עם כיסוי לתצפית תחת מיקרוסקופ קל. עם צביעה זו, הגרעינים נראו כחולים, בעוד שציטופלזמה, סיבי קולגן ותאי דם אדומים נראו בגוונים שונים של ורוד; השכבה הקרטינית בדרך כלל צבועה באדום בוהק.

6. אליסה

בהתאם לפרוטוקול היצרן, נוספה 100 מיקרו-ליטר אליקוט מכל דגימת סרום (מדוללת מראש 1:2) לבארות המיועדות. בארות ריקות וסטנדרטיות נכללו במקביל. לאחר האיטום, הפלטה דוגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר שלב השטיפה, נוסף נוגדן הזיהוי והונחם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר שטיפה נוספת, נוספה streptavidin–HRP קונג'וגט. לאחר שטיפה יסודית, נוספה תמיסת המצע להתפתחות צבע, שנעצרה על ידי הוספת תמיסת עצירה. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר (OD₄₅₀). ריכוזי הדגימה של IL-4 ו-IFN-γ נקבעו על ידי אינטרפולציה מהעקומה הסטנדרטית, והריכוזים הסופיים חושבו על ידי הכפלה בגורם הדילול המתאים.

7. qRT-PCR

סך ה-RNA הופק מדגימות סרום באמצעות תגובת טריזול בהתאם לפרוטוקול מותאם. בקצרה, 100 מיקרוליטר סרום עברו הומוגני עם 1 מ״ל של תגובת טריזול באמצעות פיפטינג נמרץ. לאחר מכן נוספו 100 מיקרוליטר כלורופורם, והתערובת נערכה בעוצמה במשך 15 שניות, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. הדגימה עברה צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להשגת הפרדת פאזה. השלב המימי העליון הועבר בזהירות לצינור חדש, מעורבב עם 0.5 מ"ל איזופרופנול, ונדגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. בהמשך, סך ה-RNA פוזר בצנטריפוגציה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כדור ה-RNA שהתקבל נשטף פעם אחת עם 1 מ"ל של 75% אתנול (צנטריפוגה ב-8,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) ויובש באוויר לפני המסה סופית. ה-RNA שהתקבל עבר שעתוק הפוך באמצעות ערכת סינתזת cDNA. ניתוח ביטוי גנים בוצע על ידי qRT-PCR באמצעות תוכנת מערכת PCR כמותית בזמן אמת. β-אקטין שימש כגן ניקיון לנירמול הבית. הביטוי היחסי של mRNA ב-TIM-3 חושב באמצעות שיטת 2−ΔΔCt . פרטי המבנים מתווספים בטבלה 1.

8. כתם מערבי

הטחול שנלקח נשטף שלוש פעמים עם מלח מקורר מראש (PBS), נחתך לחתיכות קטנות ונוסף על ידי הוספת בופר ליזיס בנפח גדול פי עשרה מזה של הרקמה. הומוגניזציה בוצעה באמצעות צינור הומוגנייזר. ההומוגנט הונח על הקרח למשך 30 דקות לצורך ליסיס, עם חמישה עד שישה סבבים של מערבולת כדי להבטיח הפרעה מלאה ברקמות. הדגימות צונו בצנטריפוגה ב-12,000 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנט נאסף כתמצית החלבון הכוללת. ריכוזי החלבון המטרה נמדדו באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA) בהתאם לפרוטוקול ה-KIT.

לאחר הפרדה באמצעות אלקטרופורזה של 10% סודיום דודציל סולפט–פוליאקרילאמיד ג'ל (SDS–PAGE), דגימות החלבון שהופקו הועברו לממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF). הממברנה נחסמה בטמפרטורת החדר במשך שעה עם מלח טריס-בופר המכיל Tween 20 (TBST) בתוספת חלב דל שומן של 5%, ואחריה דגירה לילית בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים. לאחר שטיפה יסודית, הממברנה דוגרה בנוגדנים משניים מצומדים מסוג פרוקסידאז חזרת (HRP) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לבסוף, התמונות צולמו באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציונית ונותחו לעוצמת גווני אפור באמצעות תוכנת ניתוח ChemiScope. פרטי הנוגדנים הראשוניים והמשניים מפורטים בטבלה 1.

9. זיהוי אימונופלואורסצנציה

הרקמה הסינוביאלית שנלקחה הוטבלה ב-4% פאראפורמלדהיד, יובשה, והוטמעה בפרפין לפני שנחתכה לפרוסות בעובי 5 מיקרון. החלקים עברו הסרת שעווה ברצף בקסילן I, קסילן II וקסילן III (10 דקות כל אחד), ולאחר מכן שלוש שטיפות באתנול מוחלט (5 דקות כל אחד) ושטיפה אחרונה במים מזוקקים.

לאחר שאיבת אנטיגנים בחומצה אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA), השקופיות נשטפו שלוש פעמים במי מלח עם בופר פוספט (PBS) (5 דקות כל אחת) עם ערבוב עדין. החתכים נחסמו על ידי דגירה עם אלבומין סרום בקר (BSA) של 3% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר החסימה, הוחלו נוגדנים ראשוניים, כולל סינתאז אנטי-אינדוקטיבי חנקן (iNOS) (1:500) ואנטי-CD206 (1:400), ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר שלוש שטיפות של 5 דקות ב-PBS, הקטעים הועברו לדגירה למשך 50 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך עם נוגדן משני (Cy3-conjugated goat stag anti-rabbit IgG, 1:300). צביעת גרעינית בוצעה על ידי שטיפת השקופיות שלוש פעמים עם PBS (5 דקות בכל כביסה), ולאחר מכן טיפול בתמיסת צביעה 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. התמונות נבדקו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

10. בידוד PEM

לאחר המתת חסד בעקבות ניתוק צוואר הרחם, חולדות חוטאו ב-75% אתנול למשך 10 דקות והועברו לארון בטיחות ביולוגית סטרילי. עור הבטן נחתך במספריים סטריליים, ולאחר מכן הזרקה תוך-פריטוניאלית של 15 מ"ל מלח עם בופר פוספט (PBS) באמצעות מזרק. הבטן עוסה בעדינות לפני שהנוזל הפריטונאלי נשאף חזרה למזרק והועבר לצינורות צנטריפוגה לקבלת תלשות מקרופאג'.

תליית התא נשטפה שלוש פעמים עם PBS לפני שהוזרעה במדיום Eagle (DMEM) המותאם של Dulbecco, המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS). התאים גודלו במשך 24 שעות באטמוספרה לחה של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. התאים הדבקים שהתקבלו לאחר תקופת הדגירה זוהו כמאקרופאגים.

11. טרנסוול

מבחן ההגירה בוצע באמצעות לוחות של 24 בארות. לאחר 24 שעות של רעב בדם, נוספו לתא העליון 4 ×-10-4 מקרופאגים ב-300 מיקרוליטר DMEM עם 1% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה (50 U/mL פניצילין, 50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין), בעוד 700 מיקרוליטר DMEM המכילים 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה הוכנסו לתא התחתון. התאים טופלו מראש בסרום מקבוצות חולדות שונות במשך 24 שעות. לאחר מכן, הלוחות דגרו בטמפרטורה של 37°C בסביבה של CO₂ של 5% למשך 24 שעות. לאחר צביעת קריסטל סגול, החדר העליון נלקח להסרת תאים שאינם נודדים. תאים נודדים נמדדו באמצעות ספירה ידנית בארבעה שדות ראייה שנבחרו באקראי תחת מיקרוסקופ אופטי.

12. ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות גרסה 25.0 של SPSS. מערכי הנתונים נבדקו לראשונה לנורמליות והומוגניות של שונות. כאשר התקיימו הנחות פרמטריות אלו, בוצעו השוואות בין-קבוצתיות באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ואחריו ניתוח ההפרש המשמעותי הקטן ביותר (LSD) לאחר מכן. עבור נתונים שהפרו הנחות אלו, הוחל מבחן קרוסקל–ווליס הלא-פרמטרי, ואחריו מבחני Mann–Whitney U עם תיקון מתאים להשוואות מרובות. כל הערכים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ±, ו-P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זמינות נתונים
הנתונים הגולמיים שנוצרו במהלך המחקר הנוכחי זמינים במאגר Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197)

פתולוגיה מפרקית ועובי כפות רגליים בעכברים לאחר טיפול מוקסיבושציה
חולדות שהוזרקו ל-CFA פיתחו נפיחות ואדמומיות ברורות בכפות הרגליים. צביעת המטוקסילין ואאוזין הראתה כי קבוצת הביקורת הציגה ארכיטקטורה שלמה של מפרק עם רקמה סינוביאלית חלקה ומאורגנת היטב ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הניהול הנוכחי של RA מתבסס בעיקר על DMARDs. עם זאת, תרופות אלו לעיתים קרובות יקרות ומקושרות לתופעות לוואי בלתי מזניחות, כולל פגיעה בכבד וזיהומים חמורים2, המטילים עומס כבד על אנשים ומערכות הבריאות. לעומת זאת, כטיפול חיצוני, מוקסיבוסטיון מציג פרופיל בטיחות חיובי עם סיכון מדווח מינימלי לרעילות מערכתית. הטכניקה שלו פשוטה יחסית, ומאפשרת טיפול עצמי אפשרי למטופלים לאחר אימון מתאים. היבט זה יכול לשפר את מעורבות המטופלים ואת המסוגלות העצמית, שהם חיוניים לניהול מחלות כרוניות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 82374587) וקרן המדעים הטבעיים של מחוז סצ'ואן (מענק מס' 2024NSFSC2113). אנו מודים לאוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית על מתן מתקני מעבדה ותמיכה טכנית. תודה מיוחדת לבית הספר לדיקור סיני וטואינה על ההכוונה שלהם בפרוטוקולי מוקסיבוסטיון. אנו גם מודים לצוות הטיפול בבעלי חיים על סיועו בתחזוקת מודלי העכברים. לבסוף, אנו מביעים את הערכתנו לכל העמיתים שתרמו לניתוחים ההיסטולוגיים והמולקולריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פרוינד שלם עוזר (CFA)סיגמא-אלדריץ'F5881משמש להשראת מודל דלקת מפרקים שגרונית (RA) בעכברים
לנטיווירוס (TIM-3 RNAi)GenChem Biotechnology, שנגחאי3.5&f; 107 TU/mLמשמש להשתקת ביטוי גן TIM-3
קונוסים מוקסה (בגודל חיטה)ספק הרפואה הסינית המסורתיתלא זמיןמשמש למוקסיבוסטיון בנקודות BL23 ו-ST36

מקורות

  1. Gravallese, E. M., Firestein, G. S. Rheumatoid Arthritis - Common Origins, Divergent Mechanisms. N Engl J Med. 388 (6), 529-542 (2023).
  2. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  3. Hao, F., et al. Effect of moxibustion on autophagy and the inflammatory response of synovial cells in rheumatoid arthritis model rat. J Tradit Chin Med. 42 (1), 73-82 (2022).
  4. Chen, Y., et al. Moxibustion of Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) Alleviates Cartilage Degradation through RANKL/OPG Signaling in a Rabbit Model of Rheumatoid Arthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2019, 6436420(2019).
  5. Shang, J., et al. The efficacy and safety of warming acupuncture and moxibustion on rheumatoid arthritis: A protocol for a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (34), e21857(2020).
  6. Gong, Y., et al. Effect of Moxibustion on HIF-1α and VEGF Levels in Patients with Rheumatoid Arthritis. Pain Res Manag. 2019, 4705247(2019).
  7. Liao, C., et al. The Effects and Potential Mechanisms of Moxibustion for Rheumatoid Arthritis-Related Pain A Randomized, Controlled Trial. J Pain Res. 16, 1739-1749 (2023).
  8. Tao, S., et al. The Efficacy of Moxibustion on the Serum Levels of CXCL1 and β-EP in Patients with Rheumatoid Arthritis. Pain Res Manag. 2021, 7466313(2021).
  9. Zheng, Y., et al. Macrophage polarization in rheumatoid arthritis: signaling pathways, metabolic reprogramming, and crosstalk with synovial fibroblasts. Front Immunol. 15, 1394108(2024).
  10. Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages in joint homeostasis, rheumatoid arthritis and disease remission. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 384-397 (2022).
  11. Kemble, S., Croft, A. P. Critical Role of Synovial Tissue-Resident Macrophage and Fibroblast Subsets in the Persistence of Joint Inflammation. Front Immunol. 12, 715894(2021).
  12. Huang, Q. Q., et al. Critical role of synovial tissue-resident macrophage niche in joint homeostasis and suppression of chronic inflammation. Sci Adv. 7 (2), eabd0515(2021).
  13. Mosser, D. M., Hamidzadeh, K., Goncalves, R. Macrophages and the maintenance of homeostasis. Cell Mol Immunol. 18 (3), 579-587 (2021).
  14. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: A systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  15. Liu, X., et al. KLF11 alleviates rheumatoid arthritis by regulating M1 macrophage polarization via downregulation of YAP1 expression. Arthritis Res Ther. 27 (1), 171(2025).
  16. Wen, Y., et al. Wuwei Ganlu and Myricetin alleviate rheumatoid arthritis by inhibiting M1 macrophage polarization through modulation of SHBG/SREBP1-mediated lipid metabolism. Phytomedicine. 146, 157167(2025).
  17. Zhao, L., Cheng, S., Fan, L., Zhang, B., Xu, S. TIM-3: An update on immunotherapy. Int Immunopharmacol. 99, 107933(2021).
  18. Du, X., et al. Increased Tim-3 expression alleviates liver injury by regulating macrophage activation in MCD-induced NASH mice. Cell Mol Immunol. 16 (11), 878-886 (2019).
  19. Ni, X., et al. Interrogating glioma-M2 macrophage interactions identifies Gal-9/Tim-3 as a viable target against PTEN-null glioblastoma. Sci Adv. 8 (27), eabl5165(2022).
  20. Yang, H., et al. Tim-3 aggravates podocyte injury in diabetic nephropathy by promoting macrophage activation via the NF-κB/TNF-α pathway. Mol Metab. 23, 24-36 (2019).
  21. Guo, Q., et al. Cancer cell intrinsic TIM-3 induces glioblastoma progression. iScience. 25 (11), 105329(2022).
  22. Li, G., et al. Peripheral Injection of Tim-3 Antibody Attenuates VSV Encephalitis by Enhancing MHC-I Presentation. Front Immunol. 12, 667478(2021).
  23. Haiyan, Z., et al. Efficacy of Moxa-burning heat stimulating Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) on expressions of macrophage migration inhibitory factor and macrophage apoptosis in rabbits with adjuvant-induced arthritis. J Tradit Chin Med. 42 (6), 980-987 (2022).
  24. Tang, Q., et al. RNAi Silencing of IL-1β and TNF-α in the Treatment of Post-traumatic Arthritis in Rabbits. Chem Biol Drug Des. 86 (6), 1466-1470 (2015).
  25. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  26. Miao, W., Yan, Z., Hui, Z., Hongfang, Z. Moxibustion enables protective effects on rheumatoid arthritis-induced myocardial injury transforming growth factor beta1 signaling and metabolic reprogramming. J Tradit Chin Med. 43 (6), 1190-1199 (2023).
  27. Tao, S. Y., et al. Moxibustion as an adjunctive treatment for rheumatoid arthritis and its effects on the serum levels of SOST and β-catenin. Zhongguo Zhen Jiu. 43 (12), 1384-1389 (2023).
  28. Hao, F., et al. [Effect of moxibustion on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in foot-pad synovium in rats with rheumatoid arthritis]. Zhongguo Zhen Jiu. 40 (11), 1211-1216 (2020).
  29. Zhong, Y. M., Zhang, L. L., Lu, W. T., Shang, Y. N., Zhou, H. Y. Moxibustion regulates the polarization of macrophages through the IL-4/STAT6 pathway in rheumatoid arthritis. Cytokine. 152, 155835(2022).
  30. Linlin, Z., et al. Moxibustion of Zusanli (ST36) and Shenshu (BL23) alleviates the inflammation of rheumatoid arthritis in rats through regulating macrophage migration inhibitory factor/glucocorticoids signaling. J Tradit Chin Med. 44 (2), 353-361 (2024).
  31. Zhu, L., et al. Effect of moxibustion at "Xinshu" (BL15) and "Feishu" (BL13) on expression of TRPV1 and CGRP in the myocardial tissue of chronic heart failure rats. Zhen Ci Yan Jiu. 49 (6), 551-557 (2024).
  32. Zhang, X. N., et al. Electroacupuncture and moxibustion-like stimulation activate the cutaneous and systemic hypothalamic-pituitary-adrenal axes in the rat. Acupunct Med. 40 (3), 232-240 (2022).
  33. Zhu, Y., et al. [Effect of moxibustion at "Zusanli"(ST36) and "Shenshu"(BL23) on miR-155-mediated TLR4/NF-κB signaling involving amelioration of synovitis in rheumatoid arthritis rats]. Zhen Ci Yan Jiu. 46 (3), 194-200 (2021).
  34. Wu, R., et al. Effects of Tim-3 silencing on the viability of fibroblast-like synoviocytes and lipopolysaccharide-induced inflammatory reactions. Exp Ther Med. 14 (3), 2721-2727 (2017).
  35. Nozaki, Y., et al. Inhibition of the TIM-1 and -3 signaling pathway ameliorates disease in a murine model of rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol. 218 (1), 55-64 (2024).
  36. Li, X., Zhao, Y. Q., Li, C. W., Yuan, F. L. T cell immunoglobulin-3 as a new therapeutic target for rheumatoid arthritis. Expert Opin Ther Targets. 16 (12), 1145-1149 (2012).
  37. Skejoe, C., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 is upregulated in rheumatoid arthritis, but insufficient in controlling inflammation. Am J Clin Exp Immunol. 11 (3), 34-44 (2022).
  38. Zhang, Y., et al. Tim-3 negatively regulates IL-12 expression by monocytes in HCV infection. PLoS One. 6 (5), e19664(2011).
  39. Kun, L., et al. Moxibustion inhibits the macrophage M1 polarization toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor kappa B signaling pathway by regulating T-cell immunoglobulin and mucin-containing protein-3 in rheumatoid arthritis. J Tradit Chin Med. 44 (6), 1227-1235 (2024).
  40. Liu, X., et al. Tim-3 Regulates Tregs' Ability to Resolve the Inflammation and Proliferation of Acute Lung Injury by Modulating Macrophages Polarization. Shock. 50 (4), 455-464 (2018).
  41. Wang, F., et al. Overexpression of Tim-3 reduces Helicobacter pylori-associated inflammation through TLR4/NFκB signaling in vitro. Mol Med Rep. 15 (5), 3252-3258 (2017).
  42. Dixon, K. O., Lahore, G. F., Kuchroo, V. K. Beyond T cell exhaustion: TIM-3 regulation of myeloid cells. Sci Immunol. 9 (93), eadf2223(2024).
  43. Paul, S., Chhatar, S., Mishra, A., Lal, G. Natural killer T cell activation increases iNOS(+)CD206(-) M1 macrophage and controls the growth of solid tumor. J Immunother Cancer. 7 (1), 208(2019).
  44. Luo, M., Zhao, F., Cheng, H., Su, M., Wang, Y. Macrophage polarization: an important role in inflammatory diseases. Front Immunol. 15, 1352946(2024).
  45. Peng, Y., et al. Regulatory Mechanism of M1/M2 Macrophage Polarization in the Development of Autoimmune Diseases. Mediators Inflamm. 2023, 8821610(2023).
  46. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  47. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  48. Chang, J. W., et al. Nesfatin-1 Stimulates CCL2-dependent Monocyte Migration And M1 Macrophage Polarization: Implications For Rheumatoid Arthritis Therapy. Int J Biol Sci. 19 (1), 281-293 (2023).
  49. Takayanagi, H. Osteoimmunology: shared mechanisms and crosstalk between the immune and bone systems. Nat Rev Immunol. 7 (4), 292-304 (2007).
  50. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TIM 3RNATranswellELISAWestern Blot
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.