מאמר מחקר

בידוד ואפיון של וזיקולות חוץ-תאיות מועשרות אקזוזום מתאי יונק מסוג 2 שנדבקו בנגיף דנגי

DOI:

10.3791/70437

⸱

27 במרץ 2026

 ,  ,  ,  , 
1Medical Laboratory Science Program, Texas State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את הבידוד של וזיקולות חוץ-תאיות מועשרות באקסוזום מסופרנטנט תרבית תאים מסוג 2 שנדבק בנגיף דנגי, ולאחר מכן מאפיינים את שלמות הווסיקולה והתפלגות הגודל, ונעריך את היעדר וירוס זיהומי ניתן לזיהוי באמצעות בדיקת פלאק בתנאים ניסיוניים מוגדרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVs מועשרים באקסוזומים הם שלחיצות המשתחררות מסוגי תאים שונים לנוזלים חוץ-תאיים כגון פלזמה, שתן, רוק, מדיום תרבית תאים ונוזלי גוף נוספים. הקוטר שלהם נע בין 30 ננומטר ל-150 ננומטר. הם היו מעורבים בתהליכים תאיים שונים, כולל תקשורת תאית ומודולציה חיסונית במהלך זיהום. בהתבסס על השפעות אלו, הם שימשו לחקר הפתוגנזה של מספר וירוסים. קשה לבודד EVs מועשרים באקסוזום מסופרנטנטים של תאים נגועים בנגיף באמצעות טכניקות טיהור עדכניות. הסיבה לכך היא חפיפה בגודל בין וירוסים מסוימים לבין רכבים חשמליים מועשרים באקסוזום. כאן, אנו שואפים לטהר רכבים חשמליים מועשרים באקסוזום מסופרנטנט תרביות תאים מסוג דנגי מסוג 2. רכבים חשמליים מועשרים באקסוזומים בודדו באמצעות ערכת בידוד אקסוזום מסחרית. עבור ה-EVs המבודדים המועשרים באקסוזום בפרוטוקול זה, לא זוהה וירוס מדבק באמצעות בדיקת פלאק בתנאים שנבדקו. ה-EVs המועשרים באקסוזומים המטוהרים אופינו באמצעות Western bloting לטטרספנינים, ניתוח מעקב ננו-חלקיקים ומיקרוסקופיית אלקטרונים לאישור גודל. הראינו כי ה-EVs המועשרים באקסוזומים שלנו שלמים ובטווח הקוטר הרגיל של אקזוזום של 30-150 ננומטר. בסך הכול, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה זולה לטיהור אלקטרוניים מועשרים באקסוזום מסופרנטנט של תרביות תאים נגועים בווירוס, שניתן להשתמש בו לבדיקות פונקציונליות במורד הזרם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVs מועשרים באקסוזומים הם שלחיצות בגודל ננומטרי שמשתחררים מכל תא בגוף. אלו תת-סוגים של וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן אנדוציטי. רכבים חשמליים מועשרים באקסוזומים התגלו לראשונה במדיה של תרבית רטיקולוציטים1. בעשורים האחרונים, רכבים חשמליים מועשרים באקסוזומים טוהרו ממספר נוזלי גוף, כולל דם, שתן, רוק, חלב אם, נוזלי זרע ונוזלי מי שפיר 2,3,4,5. קוטרן נע בין 30 ננומטר ל-150 ננומטר6. שחרורם לתחום החוץ-תאי מתרחש באמצעות מיזוג של גופים רב-וזיקולריים (MVBs) עם ממברנת הפלזמה של התא. בהקשר של זיהומים ותגובות חיסוניות, ידוע כי EVs מועשרים באקסוזומים מעוררים תגובה ספציפית בתאי יונקים. תגובות כאלה כוללות שחרור ציטוקינים או שינויים ברגישות לזיהום 7,8,9.

תכולת ה-EVs המועשרים באקסוזומים מושפעת ממספר גורמים, והחשוב שבהם, סוג ומצב התא שמייצר אותם10,11. בנוסף, התוכן שלהם קובע גם את ההשפעות שיש להן על תאי המקבל התמימים. כיום משמשות מספר שיטות לבידוד זרמים חשמליים מועשרים באקסוזומים מנוזלים ביולוגיים. שיטות נפוצות כוללות אולטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית, משקעים, לכידת אימונואפיניות, כרומטוגרפיה של הדרת גודל, בידוד מבוסס מגנטי ובידוד מבוסס מיקרופלואיד.

אולטרצנטריפוגציה דיפרנציאלית נחשבת לאחת הטכניקות הנפוצותביותר 12,13,14. שיטת טיהור האולטרה-צנטריפוגה יקרה ודורשת מיומנות טכנית משמעותית. שיטה זו גם גורמת לאובדן משמעותי של EV עקב שלבי אולטרה-צנטריפוגציה מרובים. לבסוף, ה-EVs העשירים באקסוזומים שנוצרים אינם נקיים מחלקיקי ויראליים פעילים בשל תכונותיהם הפנוטיפיות הדומות. דבר זה הפך את טיהור ה-EVs המועשרים באקסוזומים מסופרנטנטים של תאים נגועים בווירוס למאתגר. לכן חשוב לפתח פרוטוקול אופטימלי להפחתת רמות נגיף הדנגי (DENV) לרמות בלתי ניתנות לזיהוי בתמיסת ה-EV המועשרת באקסוזום, משום שוירוסים חולקים גדלים וצפיפויות דומים לאקזוזומים15,16.

בהשוואה לטכניקות נפוצות אחרות, פרוטוקול זה מציע מספר יתרונות, כולל קיצור זמן הטיהור, הסתמכות על ציוד מעבדה זול ונגיש ברבים, ויכולת לבודד רכבים חשמליים מועשרים באקסוזום ללא זיהום ויראלי חי שניתן לזיהום. בנוסף, אף ששיטות כמו צנטריפוגה בגרדיאנט צפיפות ובידוד מגנטי יכולות להציע יתרונות, כולל תפוקה מוגברת וטוהר גבוה יותר, גישות אלו דורשות שלב ראשוני של אולטרה-צנטריפוגה. מטרת מאמר זה היא להציג שיטה לבידוד רכבים חשמליים מועשרים באקסוזום מסופרנטנטים נגועים ללא וירוס זיהוי שניתן לזהות באמצעות בדיקת פלאק בתנאים שנבדקו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה ללא אקסוזומים

  1. חבר פילטר של 0.1 מיקרון לבסיס המקלט בתוך ארון הבטיחות הביולוגית Class II (BSC).
  2. שפוך באופן אספטי את סרום הבקר העוברי (FBS) המושבת בחום על המסנן וחבר אותו למשאבת הוואקום בתוך ה-BSC.
  3. חזור על שלב 1.2 עם ה-flowthrough עוד פעמיים.
  4. הכינו מדיום מלא שיכיל 10% מה-FBS המסונן בשלוש פעמים, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין.
    הערה: שיטת הסינון המשולש משמשת כדי למנוע צורך במכשירים כמו אולטרה-צנטריפוגה.

2. זיהום וירוס דנגי בתאי יונקים

  1. גדלו תאי ורו בלילה בבקבוק תרבית T75ס"מ 2 בתוך אינקובטור תרביות רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
  2. למחרת, בדקו שהתא בין 70% ל-80% מתאחדים והדביקו את התאים ב-0.1 ריבוי זיהום (MOI) של DENV-2 ב-5 מ"ל של מדיום מלא ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך שעתיים.
  3. לאחר שעתיים, הסר את הסופרנטנט ושוטף את הבקבוק 3 פעמים עם מלח זרחן סטרילי (PBS).
  4. הוסף 50 מ"ל של מדיה מלאה לבקבוק ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 4 ימים (ממש לפני הבחנה בהשפעות ציטופתיות).

3. טיהור אקסוזום מבוסס ערכות

  1. העבר את מדיום תרבית התאים מהבקבוק לצינור חרוטי של 50 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. העבר את המדיה לצינור קוני חדש. הוסף 125 מיקרוליטר של תגובת משקעים EV, ואחריה 600 מיקרוליטר של השרף. מערבולת ל-10 שניות ותן לה לעמוד 10 דקות בתוך ה-BSC בטמפרטורת החדר.
  3. מערבולת לעוד 10 שניות וצנטריפוגה בכ-450 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. העבר ל-BSC, זרוק את הסופרנטנט, ומרח 600 מיקרוליטר של בופר תלייה מחדש על הכדור.
  4. מערבולת ל-10 שניות ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  5. מערבולת לעוד 10 שניות וצנטריפוגה בכ-25 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. העבר את הסופרנטנט לעמוד סיבוב פילטר ולצנטריפוגה בכ-4,500 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. אספו את ה-flowthrough המכיל רכבים חשמליים מועשרים באקסוזומים שלמים ואחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80°C עד שיהיו מוכנים לשימוש.
  7. ודאו שה-EV המועשר באקסוזומים נקי מווירוס חי על ידי ביצוע בדיקת פלאק17.
  8. אפיין את ה-EV העשיר באקסוזום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים לניתוח גודל ומעקב אחר ננו-חלקיקים להתפלגות גודל וריכוז18.

4. אפיון של רכב חשמלי מועשר באקסוזום לפי כתם מערבי

  1. קבעו את ריכוז החלבון של ה-EV המועשר באקסוזום באמצעות בדיקות כמו BCA.
  2. מערבבים נפחים שווים של תמיסת EV מועשרת באקסוזום ו-buffer RIPA ומוסיפים 4x בופר טעינה LDS (4:1).
  3. הפרדו חלבוני EV מועשרים באקסוזום באמצעות ג'ל ביס-טריס 4-12%.
  4. העבר את החלבונים לממברנת ניטרוצלולוזה.
  5. בלוק למשך שעה עם חלב 5% דל שומן מומס ב-1TBS-Tween באפר בטמפרטורת החדר.
  6. לדלל את הנוגדנים הראשוניים באמצעות חלב יבש דל שומן של 5% לדילול של 1:1,1000 ולבדוק את הממברנה לחלבוני אקזוזום כמו CD63 ו-CD9 בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה.
  7. הסר את הנוגדן הראשי ושוטף 5 פעמים 5 דקות עם 1x TBS-Tween buffer על רוקר.
  8. מדלל את הנוגדן המשני (אנטי-Cricket IgG HRP) עם חלב יבש דל שומן לדילול של 1:5,000 ודגר את הממברנה עם תמיסה זו למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את הנוגדן המשני ושוטף 5 על 5 דקות עם 1x TBS-Tween buffer על נדנדה (rocker).
  10. לפתח את הממברנה באמצעות תגובת זיהוי ECL ולזהות אותות חלבון באמצעות מכשיר הדמיה כימיולומינסציה.

5. אפיון של רכבים חשמליים מועשרים באקסוזום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור

  1. הוסיפו 5 מיקרוליטר דגימות אקסוזום לרשתות הנחושת של 200 רשתות עם ציפוי פורמוואר ופחמן, ואפשרו להם להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
  2. צבעו את הרשת באצטט אורניל מימי של 1% למשך 60 שניות וייבשו באוויר.
  3. צלם את התמונה באמצעות ה-TEM ב-80 קילו-וולט18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתחנו את ה-EV המועשר באקסוזום המבודד כפי שמתואר בפרוטוקול באמצעות בדיקת פלאק כדי לבדוק אם נוכל לזהות חלקיקי DENV-2 פעילים בתערובת. כפי שמוצג באיור 1, לא זוהו פלאקים בתנאים שנבדקו בהשוואה לקבוצת הביקורת החיובית. תוצאות אלו מצביעות על כך שהווירוס המדבק היה מתחת לסף הגילוי של בדיקת הפלאק. בדיקת הפלאק בוצעה בשלושה עותקים ביולוגיים וכפילויות טכניות. ריכוז החלבון של ה-EV המועשר באקסוזום הבודד נקבע באמצעות בדיקת BCA. התוצאה הראתה ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות אחרונה במחקר מחלות זיהומיות הראתה כי EVs מועשרים באקסוזומים המשתחררים מתאים נאיביים נגועים בנגיף ממלאים תפקיד קריטי בוויסות תגובת החיסון של המארח 7,8,9. ה-EVs המועשרים באקסוזומים יכולים לחזק את ההגנה החיסונית על ידי קידום תגובה אנטי-ויראלית מתאימה, או, להפך, להקל על התחמקות חיסונית ויראלית על ידי דיכוי מנגנוני ההגנה של המארח.

כדי להבהיר את ההשפעות המנוגדות הלל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר של האגודה האמריקאית למדעי המעבדה הקלינית (ASCLS) וקרן תוכנית שיפור המחקר (REP) של אוניברסיטת טקסס סטייט

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן מקושר ל-IgG-HRP אנטי-ארנבאיתות סלולרי7074Sנוגדן משני
CD63איתות סלולרי52090sנוגדן ראשוני
CD9איתות סלולרי13174Sנוגדן ראשוני
ערכת טיהור אקסוזום לתרביות תאיםנורגן60600ערכת טיהור אקסוזום
וירוס דנגי 2ATCCVR-1584וירוס
DMEMפישר סיינטי11-995-073מדיה תרבותית
EMEMATCC30-2003מדיה תרבותית
מיקרוסקופ אלקטרונים לשידור FEI Talos F200Xתרמופישר סיינטיפיק
אירום בקר עוברינוירומיקהFBS002תוספת מדיה
מנתח מעקב חלקיקים ננומטריקס חלקיקים
תאי ורוATCCCCL-81קו התאים של יונקים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation: Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262 (19), 9412-9420 (1987).
  2. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med. 9, 86(2011).
  3. Lässer, C., et al. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am J Rhinol Allergy. 25 (2), 89-93 (2011).
  4. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  5. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  6. Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 75 (2), 193-208 (2018).
  7. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected cells stimulate production of pro-inflammatory cytokines through trans-activating response (TAR) RNA. J Biol Chem. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  8. Fleming, A., et al. The carrying pigeons of the cell: Exosomes and their role in infectious diseases caused by human pathogens. Pathog Dis. 71 (2), 109-120 (2014).
  9. Olanrewaju, A. A., Hakami, R. M. The messenger apps of the cell: Extracellular vesicles as regulatory messengers of microglial function in the CNS. J Neuroimmune Pharmacol. 15 (3), 473-486 (2020).
  10. Tauro, B. J., et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 587-598 (2013).
  11. Pallet, N., et al. A comprehensive characterization of membrane vesicles released by autophagic human endothelial cells. Proteomics. 13 (7), 1108-1120 (2013).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  15. Sampey, G. C., et al. Exosomes and their role in CNS viral infections. J Neurovirol. 20 (3), 199-208 (2014).
  16. Jeppesen, D. K., et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 177 (2), 428-445.e18 (2019).
  17. Shi, L. Z., et al. N-butanol extract of Glycyrrhizae radix et rhizoma inhibits dengue virus through targeting envelope protein. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 263(2023).
  18. Alem, F., et al. Exosomes originating from infection with the cytoplasmic single-stranded RNA virus Rift Valley fever virus (RVFV) protect recipient cells by inducing RIG-I mediated IFN-β response that leads to activation of autophagy. Cell Biosci. 11 (1), 220(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Exosome Enriched EVsExtracellular VesiclesDengue VirusVirus Infected CellsExosome IsolationCell Culture SupernatantWestern BlottingNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyImmune Modulation

מאמרים קשורים