תכנון ניסוי והכנת העלילה
הניסוי נערך ביולי ותחילת אוגוסט 2023 ו-2024. בדרך כלל, עונת גידול הסויה באוהיו מתרחשת בערך מאפריל עד נובמבר. האתרים בהם השתמשו בעונת הגידול של 2023 היו במחוז קלינטון (39.488, -83.769) ובמחוז יוניון (40.296, -83.283), אוהיו. האתרים בהם השתמשו בעונת הגידול של 2024 היו במחוז קלינטון (39.489, -83.762), מחוז פרבל (39.893, -84.611), ובמחוז ליקינג (39.948, -82.501), אוהיו.
הניסוי השתמש בעיצוב בלוק אקראי שלם כדי לשלוט בהשפעות מרחביות בתוך שדה הסויה. בתוך כל בלוק הוקצו 5 חלקות לטיפול מסוים. הטיפולים כללו שני שלבי גדילה (R3 ו-R5) ושני זמני יישום (אמצע הבוקר והצהריים), וקבוצת ביקורת לא מטופלת. כתוצאה מכך בוצעו 4 יישומים של חומרי הדברה על חלקות בכל בלוק: R3 באמצע הבוקר, R3 באמצע היום, R5 באמצע הבוקר, R5 באמצע היום. היישומים באמצע הבוקר או באמצע היום התקיימו בתוך חלון של ~שעתיים, כאשר יישומים באמצע הבוקר התרכזו בערך סביב 10:00 בבוקר ויישומים בצהריים סביב 12:30. בנוסף לחמשת חלקות הטיפול בכל בלוק, 3 חלקות הוגדרו כחלקי חילוף שניתן להחליף למגרשים טיפוליים במקרה של יישוב או גידול סויה לקויה. שלבי צמח הסויה נקבעו בעזרת מדריכי שלב כמו זה שפורסם על ידי אוניברסיטת מינסוטה Extension39.
בלוקים של מגרשי סויה היו מרווחים של כ-1.016 מטר (40 אינץ') זה מזה, כדי לאפשר לחוקרים ללכת ביניהם בקלות. חלקות הסויה היו בגודל 1.9 מטר על 8.5 מטר (0.0016 הקטר; 6.25 רגל על 28 רגל), וזן הסויה ששימש לכל האתרים היה Pioneer P35T155E (קורטבה, אינדיאנפוליס, אינדיאנה). 6 שורות נשתלו בכל חלקה והיו מרווחים של 38 ס"מ (15 אינץ'). קצב זריעה של 370,658 זרעים לדונם (150,000 זרעים לאונם) שימש. הדבורים שהשתתפו בניסוי היו כולן מאוכלוסיות מקומיות. לא נוספו דבורים משלימות על ידי חוקרים. המחברים לא ידעו על כוורות נייחות או נודדות בקרבת אתרי הניסוי. כל החומרים ששימשו לניסוי מופיעים בטבלת החומרים.
הכנת חומרי הדברה
חומרי ההדברה ששימשו היו קוטל פטריות פיטנס (41.8% חומר פעיל פרופיקונאזול) וקוטל חרקים Fastac EC (10.9% חומר פעיל אלפא-סייפרמטרין). שיעורי השימוש בחומרי הדברה היו 6 אונקיות נוזל לאקרם (438.47 מ"ל לדונם) עבור קוטל הפטריות SBI ו-3.8 אונקיות פלורימטר לאקר (277.70 מ"ל לדונם) עבור קוטל החרקים פירתרואיד. להכנת חומרי ההדברה ליישום, ערבבו עם מים 9.375 מ"ל קוטל פטריות SBI ו-5.937 מ"ל חומר הדברה פירתרואידי כדי להגיע לנפח סופי של 3 ליטר בתערובת המיכל. כפפות עמידות לכימיקלים נלבשו בזמן הכנת התערובת. הריכוז הסופי של קוטל הפטריות SBI במיכל היה 3.125 מ"ל לליטר. הריכוז הסופי של קוטל חרקים פירתרואיד במיכל היה 1.979 מ"ל לליטר.
שימוש בחומרי הדברה
תערובת זו יושמה על מגרשי סויה בודדים בכל בלוק באמצעות מרסס תיק גב מותאם אישית. תערובת חומרי ההדברה הונחה בראש חופת הסויה, במהירות ~5 קמ"ש. לאחר תחילת תהליך מריחת חומרי ההדברה לטיפול מסוים, לקח ~10 דקות עד שכל המגרשים קיבלו את השימוש. לכל מיכל של 3 ליטר, ניתן לכסות שטח של ~0.027 הקטר בתערובת חומרי הדברה. נפח הריסוס הנצרך לדונם הוא כ-113 ליטר. משמעות הדבר היא ש~0.18 ליטר מתערובת המיכל הוחל לכל חלקה. כדי למנוע סחף חומרי הדברה לחלקות אחרות עקב רוח, נמנעו משימושים בימים סוערים. ציוד מגן אישי מלא (חולצה ארוכת שרוולים ומכנסיים ארוכים, כפפות עמידות לכימיקלים, נעליים וגרביים ומשקפי מגן) נלבשו בעת מריחת חומר ההדברה. אם הייתה עודפת תערובת חומרי הדברה לאחר סיום יישום חומרי הדברה, היא הוסרבה לפי המלצות סוכנות הפיקוח הסביבתי של המדינה.
הגדרה/שימוש במקליט
ההגדרה הכללית והשימוש במקליטי אודיו דומים לפרוטוקול שתואר על ידי מחברים אחרים40. מקליטי אודיו ניידים (Sony ICD-PX370) חוברו ליתדות פלסטיק של גדר חשמליות עם סרט וו ולולאה, וקצף פתוח הונח מעל המיקרופון כשמשה קדמית. כיסוי גשם מודפס בצורת חרוט תלת-ממדי הוצמד ליתד בגובה ~3 ס"מ מעל המקליט כדי להגן עליו מפני מזג האוויר.
מקליטי שמע הונחו במרכז כל חלקה ~24 שעות לפני מריחת ההדברה הראשונה והותירו פועלים לפחות 24 שעות לאחר כל מריחה. שנים עשר מקליטים הוצבו לכל יום יישום, ארבעה לכל קבוצת זמן ביום (אמצע הבוקר, אמצע היום, בקרה) הן ב-R3 והן ב-R5.
עיבוד נתוני אודיו
כל הקלטות האודיו עובדו דרך כלי למידת המכונה "buzzdetect"41 , שניתן למצוא בכתובת: https://github.com/OSU-Bee-Lab/buzzdetect. כלי זה אומן להבחין בין רעשי זמזום של חרקים לבין קולות אחרים שמופיעים לעיתים קרובות בסביבה ניסיונית, כמו מכוניות, קומביינים או מטוסים. התוכנית אינה מסוגלת להבחין בין Apis mellifera המזמזם לבין מיני דבורים אחרים. עם זאת, buzzDetect מסוגל להבחין בין רעשי זמזום לבין רעשי חרקים אחרים שאינם זמזמים, אם כי קולות מסוימים (כמו קריאות צרצרים, בעיקר בלילה) עדיין קשים להבחנה. הוראות מדויקות יותר להרצת buzzDetect ניתן למצוא בכתובת: https://buzzdetect.readthedocs.io/en/latest/gui/. לאחר ניתוח השמע, R42 שימש לחישוב קצב הגילוי במרווחי זמן של שעה ו-8 שעות.
נתוני דליפיקציה
הערכות ההתעללות בוצעו על ידי הערכה ויזואלית של עלים מכיסוי הסויה העליון על 10 צמחים בכל חלקה המעורבים בניסוי, כולל כל הטיפולים וחלקות הביקורת הלא מטופלות כפי שהומלץ על ידי אוניברסיטת נברסקה Extension43. הערכות אלו בוצעו 24 שעות לאחר יישום חומרי ההדברה, בשלב הצמיחה של R5.
נתוני תפוקה
סויה נקטפה, והתפוקה נמדדה בבושל לדונם באמצעות קומביין חלקה ומערכת שקילת דגנים. מדידות התפוקה הותאמו ל-13% לחות. המגרשים כללו 6 שורות כל אחת; רק ארבע השורות המרכזיות נקטפו למדידות יבול.
ניתוח סטטיסטי
כל הסטטיסטיקות בוצעוב-R42. הנתונים נותחו באמצעות מודלים ליניאריים מעורבים דרך חבילת lme444 או רגרסיית בטא באמצעות חבילת glmmTMB45. הנתונים הגולמיים מ-BuzzDetect זמינים בחומרים המשלימים האלה. שלושה סוגי נתונים עיקריים נותחו למחקר זה. נתוני פעילות הדבורים הממוצעים לאורך שעה ו-8 שעות לאחר יישום חומרי הדברה, התפוקה של כל חלקת סויה, וההתעלמות של הסויה שנצפתה בשלב הצמיחה של R5.
הפעילות הממוצעת של הדבורים הושגה על ידי חישוב שיעור הזמן החיובי לזמזום הדבורים בחלון של 8 שעות או שעה. חלון השעה מיועד להערכת ההשפעות החריפות של מריחת חומרי הדברה על פעילות הדבורים, בעוד שחלון ה-8 שעות נועד להעריך את ההשפעות החריפות והשאריות. נתוני רעילות שאריתית אינם זמינים עבור אלפא-ציפרמתרין, אך דווח כי רעילות שאריתית לפירתרואידים אחרים היא ~8 שעות לאחר היישום הראשוני46. מכיוון שחישוב פעילות הדבורים הוא פרופורציה, הבדלים בפעילות נותחו באמצעות רגרסיית בטא שנערכה עם חבילת R "glmmTMB". המודלים בחנו את שיעורי הגילוי הממוצעים לשעה או 8 שעות לאחר יישום חומרי הדברה וכיצד הם משתנים בהשוואה בין חלקות מטופלות לחלקות בקרה (מצב "מרוסס"), שלב צמיחת הסויה, שעת היום שבה הוטלה החומר הוטלה, או שלב גדילה ומונח אינטראקציה של שעת היום. ההשוואה בין גרפים מטופלים לגרפים מבוקרים מוזכרת על ידי המשתנה "מרוסס" הן בנוסחאות של שעה אחת והן במודל של 8 שעות.
במודל חלון של שעה, ההשפעות הקבועות היו מצב "ריסוס", שלב הצמיחה, שעת היום, ושלב גדילה ומונח אינטראקציה של שעת היום. המודל כלל גם מונח אינטראקציה שנה וגם שנה לפי אתר שהותאמו כאפקטים אקראיים. נוסחת המודל המלאה הייתה:
(1)
קצב הגילוי המשתנה משקף את ממוצע גילויי הדבורים שנצפו יחסית לחלון התצפית הכולל — במקרה זה, שעה. המשתנה שריסוס מתאים לשאלה האם חלקה קיבלה חומר הדברה או שמדובר בחלקת בקרה לא מטופלת. המשתנה time_of_day מתאים לשאלה האם הזיהוי נלקח לאחר יישום חומרי ההדברה באמצע הבוקר או לאחר שעות הבוקר הרצויות. השלב המשתנה מתאים לשלב הצמיחה שבו נלכדו הזיהויים.
במודל החלון של 8 שעות, ההשפעות הקבועות היו שלב הצמיחה ומצב ה"ריסוס". הדגם של 8 שעות כולל שעות לילה לזמן הריסוס באמצע היום, מה שיוצר השוואה לא הוגנת בין זמני הריסוס באמצע הבוקר לצהריים. הסיבה לכך היא שזמני היישום בצהריים אינם בודקים את כל 8 השעות של רעילות שאריתית, עקב חוסר פעילות של דבורים בערבים, שהם חלק גדול מהחלונות של 8 השעות הללו. לכן, בקשות בצהריים הוצאו מהמודל, כמו גם "שעת היום" ו "שעת היום:שלב". המונחים. הנוסחה המלאה למודל זה הייתה:
(2)
קצב גילוי המשתנים, הריסוס והשלב נושאים את אותן משמעויות בנוסחה זו כמו בנוסחה המשמשת לחלונות של שעה. ההבדל היחיד הוא שקצב הגילוי המשתנה מחושב עבור חלון זמן של 8 שעות. נתוני התפוקה נותחו באמצעות מודל ליניארי עם השפעות מעורבות. המודל בחן את הבושל לדונם בכל חלקה וכיצד התפוקה משתנה לפי טיפול. האפקט הקבוע במודל היה הטיפול, והאתר והשנה הותאמו כאפקטים אקראיים. נוסחת המודל המלאה נכתבת כך:
(3)
התעלמות עלי הסויה נמדדה כאחוז הממוצע של שטח הפנים החסר של עלים לכל חלקה. מודל ליניארי של השפעות מעורבות שימש להשוואת השפעת שעת היום של יישום חומרי ההדברה על אחוז ההתעלמות. האפקט הקבוע במודל היה השעה ביום שבה המגרשים רוססו. האתר והשנה הותאמו כאפקטים אקראיים. נוסחת המודל המלאה היא:
(4)
כל הפרוטוקולים בהם השתמשו במחקר זה נאספו בקובץ המשלים 1.