מאמר שיטה

סינתזה, קיפוזציה של המוגלובין ו-PEGylation ביאורתוגונלית בננו-חלקיקי UiO-66 היררכיים נקבוביים ליישומי אספקת חמצן

DOI:

10.3791/70445

⸱

8 במאי 2026

 , 
1Department of Health Technology, Technical University of Denmark

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את הסינתזה, עטיפת ההמוגלובין ו-PEGylation פני השטח של ננו-חלקיקי UiO-66 הנקבוביים היררכית המיועדים לאספקת חמצן. ההליך משלב הנדסת פגמים עם קונוגציה ביאורתוגונלית מעודדת על ידי עיוות, ליצירת נשאים חדירים ויציבים פיזיולוגית המתאימים ליישומים ביורפואיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נשאי חמצן מבוססי המוגלובין (HBOCs) הם פלטפורמה חשובה לאספקת חמצן להפחתת היפוקסיה בהקשרים ביו-רפואיים שונים. עם זאת, המוגלובין החופשי (Hb) אינו יציב וכלי דם מחוץ לתאי הדם האדומים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב שניתן לשכפול וניתן להרחבה לייצור ננו-חלקיקי UiO-66 (HP-UiO-66 NPs) המכילים את Hb ומיוצבים על ידי קליפות פוליאתילן גליקול (PEG) ביואורתוגונליות. מזופורוסיות היררכית מוכנסת על ידי מודולציה של חומצה דודקנואית ושטיפת חומצה לאחר מכן, ומניבה NPs HP-UiO-66-NH₂ עם גבישיות נשמרת ואיזותרמים משולבים מסוג I/IVN2 . אמינים שטחיים מומרים לאזידים (HP-UiO-66-N₃ NPs), מה שמאפשר SPAAC (SPAAC) המעודדת אלקין-אזיד (SPAAC) ללא עיוות ללא קטליזטורים לייצר NPs Hb@HP-UiO-66-PEG. תהליך העבודה כולל: i) הנדסת פגמים של NPs של UiO-66-NH₂, ii) הסרת מודולטורים, iii) התקנת אזיד, iv) טעינת Hb במדיה מימית ממוגנת, ו-v) PEGylation בתיווך SPAAC. פרמטרים קריטיים לניסוי, מצבי כשל סטנדרטיים ואסטרטגיות פתרון תקלות מפורטים בכל שלב כדי לשפר את השחזור בין המעבדות. הפרוטוקול מתאים לייצור בקנה מידה גראם של NPs HP-UiO-66-NH₂ לכל אצווה. יעילות הכיסוי של ~35% (תכולת העומס ~24% משקל) עבור Hb מתקבלות בתנאים מתונים, עם NPs מפזרים בקוטר הידרודינמי ~140 ננומטר ופולידיספיסיות נמוכה לאחר PEGylation. אפיון פיזיקוכימי מקיף מאשר את שלמות המסגרת, המזופורוזיות, הכימיה המוצלחת של פני השטח, וקורונה PEG מפוזרת עד ~12 ננומטר. בדיקות פונקציונליות מראות חמצון/דה-חמצון הפיכה של Hb בכיסוי, מה שמעיד על קיבולת נשיאת חמצן נשמרת. PEGylation משפרת משמעותית את היציבות הקולואידלית והמבנית במי מלח, HEPES וסרום, ומונעת התדרדרות הנגרמת על ידי פוספט אצל מקבילים שאינם PEGylated. על ידי שילוב הנחיות מפורטות לפתרון תקלות, הדמיה בסיוע וידאו של שלבים קריטיים ושיקולי הגדלה, פרוטוקול מודולרי זה מספק מסלול עמיד ונגיש ל-HBOC מבוססי מסגרת מתכת-אורגנית. האסטרטגיה ניתנת להתאמה בקלות לביומאקרומולקולות או אנזימים אחרים הדורשים מיקרוסביבות מגנות אך נגישות למתן טיפול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חמצון מספק הוא קריטי לטיפול יעיל ולריפוי רקמות במגוון סביבות ביו-רפואיות1. בטראומה ודימום כירורגי, אובדן חמצן חמור עלול להיות מסכן חיים, ומדגיש את הצורך בתחליפי דם בטוחים כאשר דם תורם אינו זמין2. באונקולוגיה, אזורי גידול היפוקסיים מגבילים את יעילות הטיפולים התלויים בחמצן, ואספקת חמצן משלים יכולה לשפר משמעותית את היעילות הטיפולית 3,4,5,6. החמצן ממלא גם תפקיד מרכזי בריפוי הפצעים, כאשר זמינות חמצן מוגברת מקדמת אנגיוגנזה ותיקון רקמות7. באופן דומה, במצבים איסכמיים והשתלות איברים, נשאי חמצן יכולים להפחית פגיעה היפוקסית ולשפר את חיוניות הרקמהוההחלמה 8,9.

נשאי חמצן סינתטיים מבוססי המוגלובין (Hb) מהווים גישה מבטיחה להפחתת היפוקסיה10. עם זאת, Hb מחוץ לתאי הדם האדומים (RBC) הוא מטבעו לא יציב ומתנתק במהירות לדימרים שיכולים לגרום לנפרוטוקסיות, נזק חמצוני והתכווצות כלי דם כתוצאה מאיסוף תחמוצת חנקן11. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחו אסטרטגיות קיפוזציה לייצוב Hb בתוך ננו-נשאים ביוקואמיטיביים כגון ליפוזומים12, פולימרזומים13, וננו-חלקיקים פולימריים (NPs)14,15,16,17. למרות שמערכות אלו משפרות את יציבות ה-Hb, השגת יעילות עטיפה גבוהה תוך שמירה על פונקציית קשירת החמצן הטבעית נותרת אתגר18. בנוסף, המרה חמצונית למתומוגלובין ודליפת ההם עלולה לפגוע בביצועי נשיאת חמצן19. ניקוי מהיר ודליפה מוקדמת של Hb מגבילים עוד יותר את זמן זרימת הדם ואת התרגום הקליני20.

מסגרות מתכת-אורגניות (MOFs) הופיעו לאחרונה כפלטפורמות ננו-גמישות להעברת תרופות וביומקרומולקולות בזכות הארכיטקטורה הגבישית שלהן, שטח הפנים הגדול והנקבוביות הניתנת לכיווןשלהן. ה-MOFs מורכבים מצמתים מתכתיים המתואמים עם מקשרים אורגניים, ומאפשרים דיפוזיה מולקולרית והתאמה מבנית, מה שהופך אותם לאטרקטיביים ליישומים ביו-רפואיים. עם זאת, לרוב ה-MOFs יש בעיקר חללים מיקרו-נקבוביים (<2 ננומטר), שמגבילים מאוד את הכיסוי הפוסט-סינתטי של מקרומולקולות כמו חלבונים, חומצות גרעין או אנזימים 22,23,24,25. גישה אחת להתגבר על מגבלה זו היא מינרליזציה ביומימטית במקום, שבה ביומולקולות פועלות כמרכזי גרעין במהלך גדילה של MOF, כפי שהודגם ב-ZIF-8 ו-ZIF-90 26,27,28. למרות יעילותה, אסטרטגיה זו דורשת תנאי סינתזה קלים, שמגבילים את טווח כימיות MOF תואמות29,30.

UiO-66, MOF מבוסס זירקוניום שנבנה מקשרים אוקטהדרליים Zr6O4(OH)4 ומקשרי BDC (1,4-בנזנדיקרבוקסילאט), מתבלט ביציבותו הכימית יוצאת הדופן ובביוקומפיציה31. המסגרת החזקה שלה עמידה בפני פירוק בסביבות מימיות ופיזיולוגיות, מה שהופך אותה לאידיאלית ליישומים ביורפואיים32. עם זאת, המבנה המיקרו-נקבובי הפנימי שלו מגביל את השימושיות שלו לכיסוי ביומקרומולקולות. Hb, עם מימד מולקולרי ~5 ננומטר, אינו יכול להיות ממוקם בתוך הנקבוביות הפנימיות של UiO-66 הנקי. בהתאם לכך, רק מספר מוגבל של מחקרים חקרו את UiO-66 במערכות הקשורות ל-Hb, שבהן ה-MOFs משמשים בעיקר לחישה מבוססת משטח Hb ולא לכיסוי מסגרת33,34. כתוצאה מכך, פלטפורמות מבוססות UiO-66 לכיסוי Hb נשארות יחסית לא מפותחות.

לאחרונה מאוד הצגנו UiO-66 NP (HP-UiO-66 NP) היררכית נקבובית, שמתגבר על הגבלת גודל הנקבוביות על ידי שילוב דומיינים מזופוריים המסוגלים להכיל Hb, ובכך הרחיב את תחום התפקוד של UiO-66 לפיתוח HBOC35. נקבוביות היררכית מוכנסת דרך הנדסת פגמים, במיוחד על ידי שימוש בחומצות מונוקרבוקסיליות ארוכות שרשרת, כגון חומצה דודקנואית (DA), כמודולטורים במהלך סינתזה36,37. מודולטור זה מתחרה עם ליגנד BDC על תיאום עם Zr4+, מה שמוביל להיווצרות פגמים ולהגדלת המזופורים. הסרה מאוחרת יותר של המודולטור מניבה NPs HP-UiO-66 המכילים דומיינים מיקרו-ומזופוריים קיימים יחד, עם גודל נקבובית ניתן לכוונון באמצעות ריכוז מודולטור או אורך שרשרת36.

למרות שהכנסת המזופורוסיות משפרת את הנגישות המולקולרית, היא עלולה גם לפגוע בשלמות המסגרת במאגרים המכילים פוספט. יוני פוספט יכולים לתאם עם אשכולות Zr, מה שמוביל להתפרקות מבנית חלקית או מלאה38,39. בהתאם לכך, אסטרטגיות ייצוב פני השטח חיוניות לשמירה על יציבות קולואידית וכימית בתנאים פיזיולוגיים40. באופן כללי, ניתן להשיג ייצוב משטח MOF באמצעות אינטראקציות לא-קוולנטיות (למשל, אינטראקציה של ואן דר ואלס וקשרי מימן)41, אינטראקציות תיאום עם אתרי מתכת חשופים42, או הייצמדות קוולנטית למקשרים אורגניים43. מבין מקשרים שונים, פוליאתילן גליקול (PEG) אטרקטיבי במיוחד בזכות זמינותו הרחבהומורכבותו הסינתטית המינימלית. חשוב לציין כי שינוי משטח PEG, המכונה בדרך כלל PEGylation, מעניק מספר תכונות חיוביות למערכות אספקת תרופות, כולל תאימות ביולוגית מצוינת, הפחתת ספיגת חלבונים לא ספציפית, והפחתת זיהוי חיסוני וספיגה של מקרופאגים45,46. ביחד, השפעות אלו מפחיתות תגובות אימונוגניות ומאריכות את מחזור הדם המערכתי47.

טכניקות PEGylation מסורתיות מתבססות לעיתים קרובות על כימיה של קרבודימיד או מאלימיד, אשר בדרך כלל דורשות קטליזטורים או ביניים תגובתיים שיכולים להזיק לביומולקולות רגישות, כגון Hb. כדי לעקוף מגבלה זו, אנו משתמשים ב-SPAAC, תגובה ביואורתוגונלית ללא קטליזטורים וללא קטליזטורים בין מינים תפקודיים של אזיד ודיבנזילציקליקלואוקטין (DBCO), המאפשרת קונוגציה ספציפית לאתר בתנאים מימיים מתונים35,48. גישה זו מבטיחה שינוי יעיל של פני השטח מבלי לפגוע בתפקוד ה-Hb הסגור.

בהתבסס על HP-UiO-66 NPs35 שדווח קודם לכן, שהתמקד בתכנון מבני ובאימות ביופונקציונלי, הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שקיפות מתודולוגית ושחזוריות על ידי מתן תהליך ניסויי מפורט שלב אחר שלב עם טווחי פרמטרים מוגדרים ושיקולים קריטיים לטיפול. הנחיות לפתרון תקלות כלולות בשלבים מרכזיים של סינתזה, קיפוזציה של Hb ו-PEGylation באמצעות כימיה של SPAAC, ובסופו של דבר מניבים NPs יציבים Hb@HP-UiO-66-PEG (ראו איור 1).

תהליך העבודה כולל: (i) הנדסת פגמים תוך שימוש ב-DA כמודולטור לסינתזתNPs HP-UiO-66-NH 2 שעברו התאמה אמינית; (ii) פונקציונליזציה של אזיד של קבוצות אמינים שטחיות; (iii) קיפוזציה של Hb בתנאים מתונים ומימיים; (iv) הצמדת PEG קוולנטית דרך SPAAC.

לכל שלב עיקרי, פרוטוקול זה מזהה אתגרים ניסיוניים נפוצים, כגון הצטברות חלקיקים, קריסת נקבוביות או פונקציונליזציה לא יעילה של פני השטח, ומספק אסטרטגיות פתרון תקלות מעשיות לשיפור השחזוריות בין המעבדות. חשוב לציין, מאמר זה מדגים בהרחבה כי הסינתזה של NPs HP-UiO-66 ניתנת להרחבה בקלות, ומאפשרת ייצור אמין בקנה מידה גראם לכל אצבה.

הננו-נשאים הסופיים של PEGylated מציגים יציבות קולואידית גבוהה במלח, 4-(2-הידרוקסיתיל)-1-פיפרזינית-סולפוני חומצה (HEPES) וסרום, תוך שמירה על יכולת הקישור והשחרור של Hb לחמצן35. שיטות אנליטיות כגון ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום בטרנספורם פורייה (FTIR), תהודה מגנטית גרעינית (NMR), דיפרקציית קרני רנטגן אבקתיות (PXRD), ספיגת חנקן (N2), ניתוח פוטנציאל זטה (ζ), פיזור אור דינמי (DLS), מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) ומיקרוסקופיית אלקטרונים משדרת (TEM) מאשרות טרנספורמציה כימית, שלמות מסגרת, נקבוביות, מורפולוגיה בקנה מידה ננומטרי והצלחה של פונקציונליזציה של פני השטח.

על ידי הדגשת שחזוריות, יכולת הרחבה ובהירות תפעולית, הנתמכת על ידי ויזואליזציה מבוססת וידאו של שלבים רגישים טכנית, שיטה זו מספקת מסלול שניתן לשחזר, חזק ונגיש לייצור נשאי חמצן יציבים מבוססי MOF. חשוב לציין שהגישה מודולרית וניתנת להתאמה בקלות לביומאקרומולקולות או אנזימים אחרים שדורשים מיקרוסביבה מוגנת אך חדירה לחמצן כדי לשמור על תפקוד. בהתאם לכך, NPs Hb@HP-UiO-66-PEG מהווים צעד מבטיח לקראת יצירת HBOCs המסוגלים לספק חמצן ביעילות תוך עמידות להתדרדרות בנוזלים ביולוגיים.

מבחינה מעשית, אסטרטגיה זו ניתנת להרחבה לביומאקרומולקולות אחרות מעבר ל-Hb, בתנאי שיש להן ממדים מתחת לכ-20 ננומטר, התואמים לגודל המזופור המרבי הנגיש, ומציגים אחד או יותר מהמאפיינים הבאים: (i) רגישות לתנאים כימיים קשים, המעדיפה סינתזה קלה ושינוי משטח; (ii) דרישה למיקרוסביבה הידרטית, חדירה לחמצן לשמירה על פעילות פונקציונלית; ו-(iii) רגישות לפירוק MOF המושרה על ידי פוספט, המחייבת ייצוב פני השטח. הגישה מתבססת על צפיפות פגמים מתונה כדי לאזן בין נגישות המזופורים לשלמות המסגרת. כאשר נדרש שינוי שטח ללא קטליזטורים וספציפי לאתר לשימור תפקוד הביומולקולה, PEGylation מבוסס SPAAC מציע יתרונות ברורים. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מתאים היטב לעומס ביומקרומולקולות יעיל, שימור פונקציונלי ויציבות קולואידית ארוכת טווח בתנאים פיזיולוגיים, בעוד שמולקולות ביולוגיות גדולות בהרבה או מערכות הדורשות יציבות תרמית או חומצית קיצונית עשויות לדרוש פלטפורמות MOF חלופיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הוצאת Hb (משך צפוי: 2 ימים)

הערה: הפקת Hb מדם בקר זמין מסחרית (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) מתבצעת בהתאם לפרוטוקול49 שדווח קודם.

  1. העבר דם בקר (בדרך כלל 10 מ"ל לכל חילוץ) לצינור צנטריפוגה חרוטי בקוטר 50 מ"ל. הוסיפו נפח שווה של 0.9% (עם תמיסת מלח) כדי לדלל את הדם ולהפחית צמיגות. הפוך בעדינות מספר פעמים עד שמתקבלת השעיה הומוגנית.
  2. צנטריפוגה את הדם המדולל ב-1,500 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, מופיע סופרנטנט צהוב ברור (פלזמה) מעל כדור אדום צפוף (RBCs). אם לא הושג כדורים מלאים, המשך בצנטריפוגה לפי הצורך.
  3. דפנט בזהירות והשליך את שכבת הפלזמה מבלי להפריע לכדור. הוסיפו סליין טרי (10 מ"ל), החזירו את כדור ה-RBC בהיפוך עדין, וחזרו על שלב הצנטריפוגה בתנאים זהים. בצע שני מחזורי שטיפה בסך הכל כדי להסיר חלבוני פלזמה וטסיות.
    הערה: תהליך השטיפה קריטי להשגת תאי דם תאי דם טהורים נקיים מזיהומי פלזמה שעלולים להפריע להפקת הטולואן במורד הזרם.
  4. לאחר השטיפה השנייה, יש להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את כדור ה-RBC הנקי לתערובת של טולואן, מים אולטרה-טהורים ומלח ביחס נפח של 1:0.4:1. לדוגמה, ערבב 10 מ"ל טולואן, 4 מ"ל מים אולטרה-טהורים ו-10 מ"ל סליין במשפך הפרדה של 50 מ"ל לפני הוספת הכדור.
  5. אטום את המשפך והפך בעדינות כמה פעמים כדי לערבב את הפאזות. הנח את המשפך בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה (~12-16 שעות) כדי לאפשר הפרדה מלאה בפאזה. שלב הטולואן מחלץ את ממברנות השומן, ומשאיר שלב מימי ברור מועשר ב-Hb.
  6. ביום הבא, אספו בזהירות את השכבה המימית התחתונה באמצעות העצירה של משפך ההפרדה. השכבה הזו נראית שקופה ואדומה כהה.
  7. העבר את תמיסת ה-Hb המימית לצינורות צנטריפוגות וסובב בעוצמה של 8,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות תא או חומר אמולסיפי.
  8. סנן את הסופרנטנט דרך סדק אדמה דיאטומי באמצעות מערכת סינון ואקום. יש להשתמש בוואקום עדין בלבד (הימנע מלחץ שלילי גבוה שעלול לגרום לקצף או לדנאטורציה של חלבון).
  9. אסוף את הסינון המכיל Hb ללא סטומה. אחסן את המלאי על קרח אם משתמשים בו מיד, או הקפיא ב-80°C- לשימוש ארוך טווח.
    הערה: אליקווט Hb עשויים להישמר קפואים במשך מספר חודשים ללא התדרדרות ניתנת לזיהוי.
  10. כמת את ריכוז ה-Hb באמצעות בדיקת חלבון חומצה ביצינכונית לפי פרוטוקול היצרן, תוך שימוש ב-Hb פר טהור כסטנדרט כיול. כוונן את מלאי ה-Hb הסופי לריכוז העבודה הרצוי (בדרך כלל 20 מ"ג-1 במאגר HEPES, pH 7.4).
    הערה: צפו לתמיסת Hb אדומה שקופה, ללא חומר תאי.
  11. אופציונל: למדוד את ספקטרום הספיגה של UV-vis (375-700 ננומטר) של Hb שהופקו כדי להעריך את יכולת הקשירה והשחרור של חמצן. הקלט את ספקטרום ה-UV-vis ההתחלתי. הוסף נתרן דיתיוניט וטהר עםN2 גז למשך 10 דקות לשחרור חמצן, ולתעד את ספקטרום ה-Hb המנותק מחומצן. לאחר מכן, ניקו עם אוויר במשך 10 דקות כדי לאפשר חמצון מחדש ולהקליט מחדש את הספקטרום.
    הערה: נוכחות פסים אופייניים של סורט ו-Q של תחומי מחומצן (~412 ננומטר לרצועת סורט; ~541 ו-~577 ננומטר לתחום Q) ומנוטר (~430 ננומטר לרצועת סורת; ~557 ננומטר לפס Q) Hb לאחר טיהור עם אווירו-N2, בהתאמה, מצביעה על כך ש-Hb נשאר פונקציונלי (איור משלים 1).
    זהירות: לטפל בטולואן בזהירות עם קפוצ'ון אדים תוך כדי לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל חלוק מעבדה, משקפי בטיחות וכפפות. במחקר הנוכחי, כל נוזלי הפסולת המכילים טולואן נאספו והושלכו כפסולת כימית אורגנית במיכלים ייעודיים (קבוצה C), המסומנים כ"טולואן ותערובת", בהתאם להנחיות משרד הסביבה הדני. התיעוד המתאים לסילוק פסולת מסופק בקובץ המשלים 1.

2. ייצור HP-UiO-66-NH2 NPs (משך צפוי: 3 ימים)

אזהרה: HCl (37%) הוא קורוזיבי; ידית בתוך קפוצ'ון אדים עם מעיל מעבדה, כפפות עמידות לחומצה והגנה מתאימה לעיניים. הוסיפו חומצה לאט והימנעו משאיפת אדים.

  1. שקלו את ZrCl4 (400 מ"ג, 1.715 מ"מ) לתוך בקבוק תחתית עגול בנפח 250 מ"ל. הוסף לאט DMF (80 מ"ל) ואולטרסוניקט ל-5 דקות כדי להמיס לגמרי את ZrCl4. הוסף DA (12 גרם, 60 מ"מ) ואולטרסוניקט למשך 30 דקות נוספות עד שמתקבל תמיסה שקופה והומוגנית. מדדו את נפח התמיסה הכולל באמצעות גליל מדורג והוסיפו DMF לפי הצורך כדי לכוון את הנפח הסופי ל-100 מ"ל. DA פועל כמודולטור תחרותי, ומציג פגמים בסריג מבוקר.
    הערה: הוסף DMF לאט בעת המיס ZrCl4, שכן תהליך התיאום הוא אקסותרמי ועלול לגרום לאדמה קלה; לבצע את כל הפעולות במכסה אדים. יש לקחת בחשבון את העלייה בנפח שנגרמה משילוב DA על ידי שימוש בנפח התחלתי של 80 מ"ל DMF להפשרת ZrCl4 ו-DA, וכיוון את הנפח הסופי ל-100 מ"ל רק לאחר המסה מלאה כדי להבטיח שליטה מדויקת בריכוז.
  2. הוסף 2-אמינו-1,4-בנזנדיקרבוקסילית (BDC-NH2, 155 מ"ג, 0.857 מ"מ) לאותו בקבוק וסוניקאט למשך 30 דקות נוספות. המשיכו עד שמתקבל תמיסה צהובה חיוורת הומוגנית.
  3. העבר את התערובת לאוטוקלאב מצופה טפלון בנפח 150 מ"ל או לכלי לחץ עגול-תחתית המתאים לסינתזה סולותרמית. אטום היטב ומניח בתנור מופלה מחומם מראש בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. אין להפריע לכור בזמן החימום כדי למנוע היווצרות גרעין בלתי נשלטת.
  4. לאחר התגובה, כבו את התנור ואפשרו לכלי להתקרר באופן טבעי לטמפרטורת החדר (~2 שעות). שימו לב לתלייה צהובה עדינה שמופיעה באופן אחיד לאורך כל המדיום.
  5. אספו את המוצר באמצעות צנטריפוגה (11,000 x גרם, 10 דקות, טמפרטורת החדר) והשליכו את הסופרנטנט. שטוף את הכדור עם DMF (100 מ"ל) שלוש פעמים באותם תנאי צנטריפוגה כדי להסיר את הליגנד העודף ו-DA שלא הגיב. אם המוצר לא מצופה לגמרי, האריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך.
  6. הכינו תמיסת הסרת חומצה המורכבת מ-DMF (100 מ"ל) המכילה 0.5 מ"ל HCl מרוכז (37%). טבלו את הכדור השטוף לחלוטין בתמיסה זו וחממו אותו בתנור משתיק בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. שלב זה מסיר את מודולטור ה-DA, ויוצר מזופורים בתוך המבנה.
  7. אחרי 12 שעות, צנטריפוגה (11,000 x גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר) וזרקו את הסופרנטנט. חזור על הטיפול בחומצה עם אצווה טרייה של DMF המכילה 0.5 מ"ל HCl כדי להבטיח הסרה מלאה של DA. אם המוצר לא מצופה לגמרי, האריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך.
  8. שטוף את הכדור ברצף עם DMF, אצטון ואתנול (100 מ"ל, 11,000 x גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר) כדי להסיר שאריות חומצה וממס. אם המשקעים אינם מתפוצצים לחלוטין, יש להאריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך. בין כל שטיפה, הפזר בעדינות את הכדור באמצעות מערבולת או סוניקציה קלה.
  9. ייבשו את המוצר בתנור ואקום (140 מעלות צלזיוס) למשך הלילה לאחר ייבוש סביבתי בתוך מכסה אדים. החומרים הסופיים (HP-UiO-66-NH2 NPs) נראים כאבקה צהובה דקה. צפו לתפוקה טיפוסית של ~428 מ"ג.
  10. אשר כי שיאי PXRD ב-2θ = 7.3°, 8.4°, 25.7° נשארים חדים (איור 2A), מה שמעיד על שמירה על טופולוגיית UiO-66 הגבישית. בדוק הסרה מלאה של DA ב-1H NMR לאחר עיכול אלקליני (2 M KOHב-D2O) (ללא שיאי מתילן ב-1.2 ppm) (איור 2B).
  11. אפיין נקבוביות על ידי N2 ספיחה-ספיחה ב-77 K50. העקומה מציגה איזותרם משולב מסוג I/IV עם לולאת היסטרזיס (איור 2C), המאשר היווצרות מזופורים.
    הערה: ייבוש לא מלא בטמפרטורות גבוהות או מסה לא מספקת של הדגימה מובילים למדידות נקבוביות לא מדויקות באמצעות איזותרמים שלN2 ספיחה-דה-ספיחה; חזור על תהליך הייבוש בוואקום בטמפרטורה של 140 מעלות צלזיוס וודא שמשקל הדגימה עולה על 100 מ"ג אם שטח ברונואר−אמט−טלר (BET) הוא < 1,000 מ'2 גרם-1.
  12. אופציונלי: העריך את המורפולוגיה של NPs באמצעות SEM. NPs HP-UiO-66-NH2 מציגים מורפולוגיה כדורית עם התפלגות גודל צרה של ~100 ננומטר (איור 2D).
    הערה: צפו ל-HP-UiO-66-NH2 NPs המכילות גם מיקרו וגם מזופורים, המתאימים לכיסוי Hb מאוחר יותר.
  13. ניתן להגדיל את הסינתזה של NPs HP-UiO-66-NH2 על ידי הגדלת כל המגבים והממסים בשלבים 2.1 - 2.9 וביצוע מספר תגובות סולותרמיות מקבילות. על ידי שמירה על אותם יחסי מולר, ריכוזים, טמפרטורת תגובה וזמן תגובה, והגדלת כמויות המגיב והממס פי 1.5, ניתן להפעיל בו-זמנית שני אוטוקלבים או יותר של 150 מ"ל טוקלון או כלי לחץ עגולים-תחתית, מה שמאפשר ייצור בקנה מידה גרמי של NPs מסוג HP-UiO-66-NH2 (איור 3).
    הערה: יש לטפל בכל הממסים האורגניים בתוך קפוצ'ון אדים תוך כדי לבישת חלוק מעבדה, כפפות עמידות לחומצה והגנה מתאימה לעיניים. אספו את כל נוזלי הפסולת המכילים DMF והשליכו אותם כפסולת אורגנית כימית נוזלית במיכלים ייעודיים (קבוצה C) המסומנים כ"DMF ותערובת" בהתאם להנחיות משרד הסביבה הדני. תמיסות פסולת המכילות כמויות זעירות של ZrCl4 ו-HCl טופלו בהתאם. התיעוד המתאים לסילוק פסולת מסופק בקובץ המשלים 1.

3. תפקוד אזיד של HP-UiO-66-NH2 NPs (HP-UiO-66-N3 NPs) (משך צפוי: יום אחד)

אזהרה: טרימתילסיל אזיד (TMSN₃) וטרט-בוטיל ניטריט (tBuONO) הם רעילים ונדיפים. בצע את כל השלבים עם קפוצ'ון אדים, עם חלוק מעבדה, כפפות ניטריל והגנה על עיניים.

  1. שקלו בדיוק את HP-UiO-66-NH2 NPs (50 מ"ג) לתוך בקבוק תחתית עגול בנפח 25 מ"ל. מוסיפים THF (10 מ"ל) ומעבירים אולטרסוניקט במשך 5 דקות כדי לפזר את החלקיקים במלואם. המתלה הופך לאטום אך אחיד.
    הערה: פיזור אחיד של NPs לאחר סוניקציה הוא קריטי למגע יעיל עם מגיבים. אם הפיזור אינו שלם, הגדילו את נפח התמיסה וחזרו על סוניקציה.
  2. הנח את הבקבוק באמבט מים קרים (0 מעלות צלזיוס) על ערבוב מגנטי מכוון ל-400 סל"ד. באמצעות מזרק זכוכית, הוסיפו אתBuONO (0.4 מ"ל) בזריקה במשך 5 דקות תוך שמירה על טמפרטורה מתחת ל-5 מעלות צלזיוס.
  3. מיד הוסיפו TMSN₃ (0.35 מ"ל) מנקודת טיפה באותם תנאי קור. עלולה להופיע התפרצות קלה, המצביעה על התקדמות חנקן. עטוף את האמבטיה בנייר אלומיניום כדי להגן על התגובה מהאור..
  4. המשך ערבוב תערובת התגובה למשך הלילה (~16 שעות) באמבט המים הקרח כדי לאפשר החלפת אזיד מלאה של קבוצות אמין על פני שטח ה-MOF.
  5. הסר את אמבט הקרח ותן לתלייה להגיע לטמפרטורת החדר. צנטריפוגה (11,000 x גרם, 5 דקות, טמפרטורת חדר) לאיסוף ה-NPs המותאמים. אם המשקעים אינם מתפוצצים לחלוטין, יש להאריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך.
  6. שטפו את הכדור היטב עם THF (10 מ"ל) שלוש פעמים, ואספו אותו בצנטריפוגה (11,000 גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר) אחרי כל כביסה. לאחר מכן יש שלוש שטיפות נוספות באמצעות אצטון (10 מ"ל), בצנטריפוגות באותם תנאים, להסרת שאריות תגובות ותוצרי לוואי. אם המשקעים אינם מתפוצצים לחלוטין, יש להאריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך.
  7. ייבשו את המוצר (HP-UiO-66-N3 NPs) בתנור (140 מעלות צלזיוס) בוואקום למשך הלילה לאחר ייבוש סביבתי בתוך מכסה אדים. צפו לתפוקה טיפוסית של ~45 מ"ג.
  8. אמת את הטרנספורמציה הכימית באמצעות ספקטרוסקופיית FTIR: מתיחה חדה אסימטרית של אזיד מופיעה ב-~2122 ס"מ-1 (איור 4A). עוצמת הרצועה מתואמת עם יעילות החלפת פני השטח.
    הערה: המרה לא שלמה עלולה לפגוע בהטיית הקליק הבאה. אם רצועת האזיד חלשה, חוזרים על הפונקציונליזציה באמצעות כמויות דו-ממדיות של tBuONO ו-TMSN₃. צפו ל-HP-UiO-66-N3 עם אטימיות אזידו עם גבישיות משומרת וארכיטקטורה מזופורית (איור 4B-D), מוכנים לכיסוי Hb ול-PEGylation של SPAAC.
    אזהרה: לאסוף את כל נוזלי הפסולת המכילים TMSN₃, כולל תערובות עם חומרים אחרים (למשל, tBuONO ו-THF), במיכלי פסולת מסוכנת מסוכנים מקבוצת O בהתאם להנחיות משרד הסביבה הדני. סמנו בבירור את כל המיכלים כדי לציין את נוכחות TMSN₃ והתערובות שלו. תיעוד הטיפול בפסולת הרלוונטי מסופק בקובץ משלים 1.

4. טעינת Hb וכימות (משך צפוי: 2 ימים)

  1. העבר HP-UiO-66-N3 NPs (5 מ"ג) לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל ואחריו ~2 דקות סוניקציה ב-0.5 מ"ל של בופר HEPES (20 מ"מ, pH 7.4). הוסף 0.5 מ"ל של בופר HEPES המכיל Hb (20 מ"ג-1) והפך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי לפזר את ה-NPs במלואו.
  2. הנח את הצינור על תרמושייקר ודוגר בטמפרטורת החדר (22-25 מעלות צלזיוס) מתחת ל-1,000 סל"ד, תוך ניעור במשך שעתיים.
  3. לאחר הדגירה, צנטריפוגה 13,500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפרום את ה-Hb@HP 99-UiO-66-N3 NPs המתקבלים. אספו בקפידה את הסופרנטנט לצורך כימות ה-Hb הלא כלוא. אם המשקעים אינם מתפוצצים לחלוטין, יש להאריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך.
  4. שטפו את הכדור בעדינות במים אולטרה-טהורים (1 מ"ל) על ידי פיפסט למעלה ולמטה כדי להסיר את ה-Hb שנספג ברפיון, וחזרו על השטיפה פעמיים. אסוף בזהירות את הסופרנטנט של כל שטיפה לצורך כימות של Hb לא לכוד. החזיר את הכדור הסופי למים אולטרה-טהורים של 0.5 מ"ל לצורך אפיון. שמור דגימות במקרר (4 מעלות צלזיוס) כדי למנוע חמצון.
  5. קבעו Hb לא כלוא בסופרנטנטים שנאספו באמצעות בדיקת סודיום לאוריל סולפט (SLS)-Hb51. פיפט 10 מיקרוליטר מכל סופרנטנט למיקרופלטה בת 96 בארות והוספת 100 מיקרוליטר של תגובת SLS (0.6 מ"ג-1 מ"ל-1 במים אולטרה-טהורים). דגרו 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ואז קראו את הספיגה ב-412 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.
  6. הכינו עקומה סטנדרטית באמצעות תמיסות Hb (0-10 mg-mL-1) בבופר HEPES להמרת ערכי הספיגה לריכוז.
  7. חשב יעילות הקפסולציה (EE) ותוכן הטעינה (LC) כך:
    EE (%) = [(Hb התחלתי - סופרנטנט Hb)/Hb התחלתי] × 100
    LC (%) = [(Hb במעטפת)/(Hb במעטפת + NP מסת)] × 100
  8. כדי להגדיל את קיפוזציית ה-Hb, דגרו 100 מ״ג NPs עם 20 מ״ל תמיסת Hb (10 מ״ג מ״ל⁻¹). כדי להעריך את הנקבוביות לאחר הכיסוי, טבלו את ה-NPs המתקבלים באתנול במשך 24 שעות, ואז ייבשו ללילה בתנור ואקום בטמפרטורה של 140 מעלות צלזיוס, ורשמו את איזותרם הספיחה-ספיחה שלN2 להערכת הנקבוביות. הצבע האדום של האבקה מצביע על הצלחת הקפסולציה של Hb (איור 5A), וירידה משמעותית בספיגתN2 מאשרת את המילוי המוצלח של המזופורות ב-Hb (איור 5B).
  9. מדדו פוטנציאל ζ באמצעות Zetasizer Nano ZS. מטען פני השטח יורד מ-~+40 mV (HP-UiO-66-N3 NPs) ל~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N3 NPs), בהתאם לספיחת Hb (איור 5C).
  10. אופציונלי: רכישת מיקרוגרף SEM (איור 5D) ודיפרקטוגרם PXRD (איור 5E) כדי להבטיח שלמות מורפולוגית ויציבות מבנית.
  11. הקלט ספקטרום UV-vis (375-700 ננומטר) להערכת קישור חמצן הפיך של ה-NPs. הוסף נתרן דיתיוניט וטהר עםN2 למשך 10 דקות לשחרור חמצן, רשם את הספקטרום, ואז טיהר עם אוויר במשך 10 דקות כדי לאפשר קשירה מחדש, ולרשום שוב את הספקטרום (איור 5F).
    הערה: נוכחות תחומי סורט ו-Q אופייניים של פס מחומצן (~412 ננומטר לתחום סורט; ~541 ו-~577 ננומטר לתחום Q) ומנוטר (~430 ננומטר לרצועת סורת; ~557 ננומטר לתחום Q) Hb לאחר טיהור עם אווירו-N2, בהתאמה, מצביעה על כך ש-Hb נשאר פונקציונלי.
  12. צפו ל-NPs אדומים אחידים Hb@HP-UiO-66-N3 המכילים Hb פעיל פונקציונלית עם התנהגות חמצון הפיכה.

5. ייצור NPs של Hb@HP-UiO-66-PEG: PEGylation באמצעות SPAAC (משך צפוי: 2 ימים)

  1. הכן צינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs (10 מ"ג) המפוזר במים אולטרה-טהורים של 0.5 מ"ל. הוסיפו DBCO-PEG (מגה-וואט ~2,000, 20 מ"ג במים אולטרה-טהורים ב-0.5 מ"ל) כדי להשיג יחס של 2:1 (במשקל ללבן) של PEG ל-NPs. מערבולת עדינה עד לערבוב מלא.
  2. דגרו את התערובת על תרמושייקר בטמפרטורת החדר ו-1,000 סל"ד למשך שעה, ואז העבירו למקרר (4 מעלות צלזיוס) לתגובה לילית (~16 שעות). תגובת SPAAC ללא קטליזטורים זו מחברת באופן קוולנטי את DBCO לקבוצות האזיד, ויוצרת קישורים יציבים של טריאזול.
  3. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפלוט את ה-PEGylated Hb@HP-UiO-66-PEG NPs. אם המשקעים אינם מתפוצצים לחלוטין, יש להאריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך. השליכו את הסופרנטנט המכיל PEG שלא הגיב.
  4. שטפו את הכדור שלוש פעמים במים אולטרה-טהורים (2 מ"ל כל אחד על ידי פיפטינג למעלה ולמטה) בתנאי צנטריפוגה זהים. דבר זה מבטיח הסרת שרשראות PEG חופשיות ותוצרי לוואי מולקולריים קטנים.
  5. השעתי מחדש את ה-NPs המטוהרים Hb@HP-UiO-66-PEG במים אולטרה-טהורים של 2 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הקולואיד נראה הומוגני ומעט אופלסנטי, מה שמעיד על יציבות פיזור טובה.
  6. אישור הצלחה של PEGylation באמצעות ספקטרוסקופיית FTIR (איור 6A): היעלמות רצועת האזיד ב-2122 ס"מ-1 והופעת אותות מתילן (−CH2−) וקשר אתר (−O−) שמקורו ב-PEG ב-2883 ו-1097 ס"מ-1, בהתאמה.
  7. אימות על ידי 1H NMR (איור 6B) לאחר עיכול בסיסי ב-2 מטר KOH/D2O; דגימות PEGylated מציגות אות נוסף ב-δ = 3.53 ppm התואם לפרוטוני האוקסיתילן של PEG.
  8. מדדו קוטר הידרודינמי ומדד פולידיספיסיות (PDI) באמצעות DLS (איור 6C).
    עלייה מ-~115 ננומטר (PDI ~0.1) ל-~140 ננומטר (PDI ~0.17) מאשרת את הציפוי פני השטח בשכבת פולימר דקה.
  9. אופציונלי: למדוד את פוטנציאל ζ פני השטח באמצעות Zetasizer Nano ZS כדי לאמת את ההשפעה הזניחה של PEGylation משטח על מטען פני השטח (איור 6D). שינוי קטן לאחר PEGylation (מ-~+20 mV ל-~+17 mV) מצביע על השפעה מינימלית על מטען פני השטח.
  10. התבוננו במורפולוגיה לפי TEM (איור 6E). TEM חושף שפה מפוזרת של ~10-12 ננומטר סביב קצה החלקיקים המייצגת את קורונה PEG.
  11. בצע בדיקת שחרור חמצן באמצעות אלקטרודת חמצן (איור 6F) כדי להראות שתפקוד ה-Hb נשאר שלם לאחר PEGylation, בדומה לצורה הלא-PEGylated. צפו ל-NPs יציבים, מפוזרים בצבע חום-אדמדם Hb@HP-UiO-66-PEG שמפגינים יציבות קולואידית חזקה ויכולת קשירה של חמצן, מתאימים לבדיקות פיזיולוגיות ארוכות טווח.
  12. אופציונלי: להוליך עקומות פירוק חמצן (ODCs) של Hb ו-Hb חופשיים הכלולים ב-Hb@HP-UiO-66-PEG NPs כדי לזהות את לחץ החמצן החלקי ברוויית חמצן של 50% Hb (p50) ומקדם גבעה (הגבעה-n) (איור 7).

6. הערכת יציבות ה-NP (משך צפוי: 7 ימים)

  1. פזר Hb@HP-UiO-66-PEG NPs (~5 מ"ג) לשבעה צינורות צנטריפוגות בקוטר 2 מ"ל. הוסיפו 2 מ"ל מכל מדיום: מים אולטרה-טהורים, תמלח (0.9% NaCl), HEPES (20 מ"מ), סרום עכברים, פלזמה אנושית, גלוקוז Eagle's בינונית-גבוהה (DMEM) של Dulbecco's מותאם, ומלח מפוזר-פוספט (PBS). ודאו שפקקי צינורות הצנטריפוגה סגורים היטב כדי למנוע אידוי בינוני במהלך הדגירה. סרום עכבר CD-1 ופלזמה אנושית נרכשים מ-Innovative Research (נובי, מישיגן, ארה"ב).
  2. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמושייקר במהירות 1,000 סל"ד למשך עד 7 ימים.
  3. לאחר 3 ו-7 ימים, אוספים חלקיקים בצנטריפוגה (12,000 גרם, 10 דקות, טמפרטורת החדר), שטפו פעם אחת במים אולטרה-טהורים, וייבשו ל-PXRD (איור 8A). אם המשקעים אינם מתפוצצים לחלוטין, יש להאריך את זמן הצנטריפוגה לפי הצורך.
  4. ב-0, 24, 72 ו-168 שעות, משוך אליקווטים (~50 מיקרוליטר) ומדלל אותם פי 20 לניתוח DLS (גודל ו-PDI) (איור 8B).
  5. אופציונלי: להכין דגימות SEM לאחר 48 שעות ב-PBS כדי לבדוק את המורפולוגיה (איור 8C).
    הערה: דילול תליית ה-NPs (ב-PBS) במים אולטרה-טהורים הוא חיוני לניתוח SEM, שכן הוא מפחית הפרעות רקע מרכיבי בופר ומקל על הדמיה ברורה של ה-NPs.
  6. השווהל-NPs Hb@HP-UiO-66-N 3 שאינם PEGylated בתנאים זהים; היעלמות מהירה של השתקפויות גבישיות אופייניות והופעת תכונות פיזור אמורפיות רחבות מעידות על חוסר יציבות ללא ציפוי PEG.
    הערה: דגימות PEGylated נשארות שלמות מבנית לאחר 7 ימים בכל המדיה, בעוד שדגימות שאינן PEGylated מתפרקות תוך 24 שעות ב-PBS או DMEM.

7. אפיון פיזיקוכימי (משך צפוי: ~15 ימים)

הערה: סעיף זה מתאר את השיטות האנליטיות הנדרשות לאישור מורפולוגיה, הרכב, נקבוביות ושלמות ה-Hb של NPs. טכניקות אפיון אלו מאשרות יחד את השחזוריות של תהליכי הסינתזה והשינוי.

  1. PXRD
    1. ייבשו ~5 מ״ג מכל דגימת NP במייבש מקפיא למשך הלילה לפני המדידה כדי להסיר את הלחות שנספגה.
    2. העמיסו את הדגימה על מחזיק סיליקון שטוח עם רקע אפס ושטחו בעדינות באמצעות סלייד זכוכית נקי ליצירת שכבה דקה ואחידה.
      הערה: הימנעו מלחיצה חזקה מדי, מה שעלול לגרום להשפעות כיוון מועדפות.
    3. תיעוד דפוסי PXRD באמצעות דיפרקטומטרי שולחן המצויד בקרינת Cu Kα (λ = 1.5418 Å). הגדר את פרמטרי הסריקה ל-2θ = 4-50°, גודל צעד = 0.02°, השהיי = 1 שנייה לכל שלב.
    4. השווה את הדפוסים שהושגו למבנה המדומה של UiO-66 שנוצר באמצעות תוכנת מרקורי בהתבסס על נתוני הגביש שדווחו קודםלכן 31. נוכחות פסגות חדות ב-7.3°, 8.4° ו-25.7° מצביעה על שלמות גבישית.
  2. N2 ספיחה-ספיחה (התפלגות שטח הפנים וגודל הנקבוביות ב-BET)
    1. דגז ~100 מ"ג מכל דגימת NP בטמפרטורה של 140°C תחת ואקום למשך 24 שעות באמצעות מערכת Micromeritics Smart VacPrep עם ניקוי N2 טהור במיוחד.
    2. העבר מיד את הדגימות המפורקות לנמל הניתוח של מנתח שטח הפנים Micromeritics Tristar. רשוםN2 איזותרמים ב-77 קלווין בטווח לחץ יחסי (P/P₀) של 0-1.
    3. חשב שטחי פנים באמצעות שיטת BET לפי קריטריון רוקרולהמורחב 52. חשב התפלגות גודל הנקבוביות באמצעות תורת פונקציונליות הצפיפות הלא-מקומית המיושמת בתוכנת המיקרומריטיקה.
    4. צור את עקומות הספיחה/דה-ספיחה וגרפי התפלגות גודל הנקבוביות באמצעות Origin 2022. ייבא את נתוני הספיחה/דה-ספיחה לתוכנה, עם לחץ יחסי (P/P₀) בציר ה-X ונפח הספיחה N2בציר Y.
    5. שרטט נתוני התפלגות גודל הנקבוביות עם רוחב נקבוביות כציר X ונפח נקבוביות נוסטלגי כציר Y. הצג את התוצאות כגרפים של "קו + סמל". בצע את כל הניתוחים באמצעות הגדרות ברירת המחדל של התוכנה.
  3. ספקטרוסקופיית FTIR
    1. טחנו ~5 מ״ג מכל דגימה מיובשת לאבקה דקה באמצעות טיט אגט נקי. הניחו את האבקה על גביש ה-ATR של ספקטרומטר ברוקר ALPHA-P53.
    2. אסוף ספקטרום בטווח של 4,000-400 ס"מ-1 ברזולוציה של 2 ס"מ-1 .
    3. זיהוי פסגות אופייניות: הופעת מתיחהN3 בעומק ~2122 ס"מ-1 מאשרת את היווצרות האזיד (איור 4A). לאחר PEGylation, יש לצפות ברצועות −CH2− ו-C-O-C ב-~2883 ס"מ-1 ו~1097 ס"מ-1, בהתאמה, יחד עם היעלמות מתיחהN3 (איור 6A). צפו להיעלמות רצועת האזיד ולהופעתם של אותות מתילן (−CH2−) ומעצם אתר (−O−) שמקורם ב-PEG מאשרים את השלמת תגובת SPAAC.
    4. צייר את עקומות FTIR באמצעות Origin 2022. ייבא את הנתונים הגולמיים לתוכנה עם ערכי X (מספר גל) ו-Y (שיעור). צור גרפים בפורמט "Line" באמצעות הגדרות ברירת המחדל של התוכנה.
  4. 1H NMR
    1. הוסף ~10 מ"ג NPs ל-0.5 מ"ל של 2 M KOH ב-D2O שמונח בבקבוקון זכוכית, וחמם ב-80 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות לעיכול המסגרת.
    2. צנטריפוגה (12,000 x גרם, 10 דקות, טמפרטורת החדר) כדי לסובב את השאריות הבלתי מומסות. העבר את הסופרנטנט לצינור NMR בקוטר 5 מ"מ.
    3. להקליט ספקטרום NMR של 1H על ספקטרומטר Bruker Avance בתדר 400 מגה-הרץ.
    4. הקצו את ההזזות הכימיות האופייניות, כולל הפרוטונים הארומטיים של BDC-NH2 (δ = 6-8 ppm) ואותות PEG (δ = ~3.53 ppm, איור 6B), באמצעות תוכנת MestReNova. נתחו את נתוני ה-NMR באמצעות מודול עיבוד ה-NMR של התוכנה עם ההגדרות ברירת המחדל.
  5. SEM
    1. הפקדת ~5 מיקרוליטר של תליית NP על וופ סיליקון; אפשר להתייבש באוויר בארון ללא אבק. אם מתרחשת טעינה, יש לצפות בזהב 5 ננומטר.
    2. תמונה על SEM FEI Quanta 200 במתח האצה של 10-20 קילווולט.
    3. נתח את התמונות באמצעות ImageJ. ייבא את תמונות TIFF המקוריות עם מידע בקנה מידה מוטמע לתוכנה ומתאים את הבהירות והניגודיות רק לצורך ויזואליזציה. אל תיישם עיבוד נוסף שעשוי להשפיע על המידע הממדי. יצר את פסי הסקאלה באמצעות פונקציית הניתוח של התוכנה.
  6. TEM
    1. הנח ~5 מיקרוליטר של פיזור NP על רשת Cu תחרה-פחמן (300 רשת). לטשטש עודף בנייר פילטר ולייבש בתנאים סביבתיים.
    2. בדקו תחת מנוע FEI Tecnai T20 G2 TEM בעוצמה של 200 קילו-וולט.
    3. נתח את התמונות באמצעות ImageJ. עיבוד תמונה פועל לפי הנהלים המתוארים בסעיף 7.5.3.
  7. DLS ופוטנציאל ζ
    1. מדלל NPs ~20 פעמים במים אולטרה-טהורים לצורך גודל וניתוח PDI; עבור פוטנציאל ζ, מדולל בבופר HEPES (20 מ"מ', pH 7.4).
    2. למדוד באמצעות Zetasizer Nano ZS בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. מוכנים לפחות שלושה דגימות עצמאיות (n = 3), וכל דגימה נמדדת בשלושה עותקים.
    3. שרטט את נתוני DLS ונתוני פוטנציאל ζ באמצעות Origin 2022. הצג את התפלגות גודל החלקיקים המשוקללת בעוצמה כגרפים של "קו + סמל" ואת תוצאות הפוטנציאל ζ כגרפים של "עמודות". דווח את הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ± (n = 3). בצע את כל הניתוחים באמצעות הגדרות ברירת המחדל של התוכנה.
  8. ספקטרוסקופיית UV-vis לפונקציונליות Hb
    1. פזר 3 מ״ג Hb חופשי או כמות מתאימה של NPs (כלומר, המכילים כמות שווה ערך של Hb מכוסה) במים אולטרה-טהורים של 3 מ״ל. העבר את המתלים לקובט קוורץ. רשמו ספקטרום UV-vis מ-375-700 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV−vis של UV-2600.
    2. הוסיפו קמצוץ של נתרן דיתיוניט לתמיסת ה-Hb או לתליית ה-NP וניקו עםN2 למשך 10 דקות כדי להפחית את הדגימה. הקליטו את המעבר של רצועת סורט מ-412 ל-430 ננומטר ואת מיזוג רצועות ה-Q. חמצן מחדש את הדגימה על ידי בועות אוויר למשך 10 דקות כדי לצפות בהיפוך (איור 5F ואיור משלים 1).
    3. השרטט את הנתונים באמצעות Origin 2022. הציגו את הספקטרום כגרפים "קוויים", עם אורך גל על ציר ה-X וספיגה בציר ה-Y.
  9. כימות של חמצן משתחרר
    1. פזר 1 מ"ג Hb חופשי או כמות מקבילה של Hb@HP-UiO-66-N3 ו-Hb@HP-UiO-66-PEG NPs (המכילים כמות שווה ערך של Hb בכיסוי) במים אולטרה-טהורים של 600 מיקרולטר. העבר את המתלים לבקבוקי זכוכית של 2 מ"ל ואטום אותם היטב עם פקקי גומי.
    2. הכנס בזהירות את גלאי המחט של אלקטרודת החמצן דרך מכסה הגומי אל המתלה כדי לנטר את רמת החמצן המומס באמצעות מטר O2 מסוג מחט.
    3. הוסף במהירות את תמיסת K3[Fe(CN)6] (10% משקל במים אולטרה-טהורים של 100 מיקרולטר) לתלייה באמצעות מחט מזרק, ומקליט באופן רציף את השינוי ברמת החמצן.
    4. חשב את החמצן המשתחרר על ידי הפחתת הערך המרבי שנצפה לאחר הוספת K3[Fe(CN)6] מהערך ההתחלתי לפני ההוספה שלו. נרמל את הערכים שהתקבלו לחמצן שמשתחרר מאותה כמות של Hb חופשי (איור 6F) באמצעות Origin 2022. מדוד שלוש דגימות בלתי תלויות (n = 3) עבור Hb חופשי או כל NP.
      הערה: NPs של Hb@HP-UiO-66-N3 ו-Hb@HP-UiO-66-PEG מציגים שחרור חמצן דומה, כאשר כל אחד משחרר ~60% מהחמצן שמשתחרר מה-Hb החופשי.
  10. מדידת ODCs וחישוב p50 וגבעה-n
    1. הכינו NPs חופשיים של Hb בקר או Hb@HP-UiO-66-PEG בריכוז סופי של ~1 מ"ג מ"ל-1 בבופר HEPES-מלח של 3 מ"ל (20 מ"מ HEPES, 0.9% (עם זכויות) NaCl, pH 7.4). העבר את הדגימה לקובטה קוורץ המצוידת במוט ערבוב מגנטי.
    2. הכניסו את הקובטה למנתח המוקס. הגדר את טמפרטורת המדידה ל-37 מעלות צלזיוס ואפשר למערכת להתאזן תחת ערבוב רציף עד להשגת קו בסיס יציב.
    3. רשמו ODCs באמצעות דה-חמצון מדורג בטווח לחץ חלקי של 1-148 מ"מ כספית. השתמש בתוכנת מנתח Hemox המותקנת מראש כדי למדוד ODC ולחשב p50 ו-Hill-n באמצעות הגדרות הניתוח ברירת המחדל. מדוד שלוש דגימות בלתי תלויות (n = 3) עבור כל דגימה.
    4. ייצא את הנתונים המעובדים ושרטט את ה-ODCs באמצעות Origin 2022 בפורמט גרף ברירת המחדל "Line".

8. שחזוריות וניתוח סטטיסטי

  1. בצע את כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה לפחות שלוש פעמים בלתי תלויות. דווח על התוצאות כתוצאות טיפוסיות שנצפו בחזרות אלו. לשמור על הפרמטרים הניסיוניים המרכזיים, כגון זמני תגובה וטמפרטורות, בטווח סביר כדי להבטיח שחזוריות ואמינות עבור משתמשים אחרים.
  2. אפיון מבני נוכח (PXRD, N2 ספיחה-דספיחה, FTIR, 1H NMR, SEM, UV-vis) כנתונים מייצגים לאישור איכותני ללא ביצוע ניתוח סטטיסטי.
  3. דווח על מדידות כמותיות (DLS, פוטנציאל ζ, p50, Hill-n) כממוצע ± SD (n ≥ 3). קבעו מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-זנבי של וולש או ANOVA חד-כיווני, לפי הצורך. מציינים רמות מובהקות כ-ns (ללא מובהקות), * = p < 0.05, ** = p < 0.005, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזה מוצלחת של NPs HP-UiO-66-NH2 אושרה על ידי PXRD (איור 2A), שהציג את שיאי הדיפרקציה האופייניים ב-2θ = 7.3°, 8.4° ו-25.7°, בהתאמה טובה למבנה המדומה UiO-6636. ההרחבה הקלה של השיא ביחס לדפוס המדומה יוחסה למידות הננומטריות של חלקיקים ולשימור שלמות גבישית מאושרת לאחר סינתזה54. הסרה מלאה של DA אושרה על ידי ספקטרוסקופיית 1H NMR לאחר עיכול אלקליני, כפי שניתן לראות בהיעדר אות פרוטון מתילן אופיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מהווה מסלול חזק וניתן לשחזור לסינתזה, תפקוד ואפיון NPs של HP-UiO-66 שתוכננו למעטפת Hb וליישומי אספקת חמצן. על ידי אימוץ גישה הנדסית פנימית החוצה, עבודה זו יוצרת מסגרת הכללה לעיצוב NPs של MOF ליישומים ביו-רפואיים, כולל אספקת ביומקרומולקולות ותרופות. בעוד שהקונספט הבסיסי של החומר והביצועים הפונקציונליים דווחו בעבר, הפרוטוקול הנוכחי מרחיב משמעותית את העבודות הקודמות על ידי הדגשת בהירות תפעולית, שחזוריות ויכולת הרחבה. מספיקים שלבי טיפול מפורטים, הנחיות לפתרון תקלות לשלבים רגישים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס פיננסי מתחרה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בהכרת תודה על התמיכה מהמועצה האירופית למחקר במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (מענק מס' 101002060).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-אמינו-1,4-בנזנדיקרבוקסילית חומצה  מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)381071-25G
4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפראזין-1-אתאנסולפוניק חומצהמרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)H3375-100G
אצטון (99%)VWR אינטרנשיונל (Sø בורג, DK)23J244030
בדיקת חלבון חומצה ביצינכונינית  תרמו פישר סיינטיפיק (רוסקילדה, DK)23235
דם בקר SSI Diagnostica A/S (הילר ואוסלאש; d, DK)77667
צינור צנטריפוגה
צנטריפוג'ר Thermo Fisher Scientific Inc (מסצ'וסטס, ארה"ב)75009903סדרת Megafuge ST Plus  
תחמוצת דויטריוםמרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)151882
דיבנזוציקלואוקטין-פוליאתילן גליקולברודפארםBP-23949
חומצה דודקנואית מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)L556-1KG
דולבקו' S Modified Eagle' s בינוניים ומינוס; רמות סוכר גבוהות  מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)11965092
אתנול (100%)VWR אינטרנשיונל (Sø בורג, DK)24L044013
ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום בטרנספורמציה פורייה  ברוקר (בילריקה, ארה"ב)
מנתח המוקס  TSC Scientific Crp (פנסילבניה, ארה"ב)
פלזמה ציטראטית אנושיתטבוביוSER-PLP25
חומצה כלורית (37%)מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)320331-500ML
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (ארה"ב)גרסה 1.47t
רשת Cu תחרה-פחמן (300 רשתות)אגר סיינטיפיק בע"מ, (סטנסטד אסקס, בריטניה)AGS166-3H
מערבל מגנטיIKA-Werke GmbH & פלוגה KG (,DE)זהה. מספר: 0010011496
MestReNova sofewareMestrelab Research (ספרד)גרסה 12
מיקרומריטיקה מנתח שטח פנים טריסטארתרמו פישר סיינטיפיק בע"מבהקדם האפשרי 2020 פלוס
מיני-צנטריפוגהאפנדורף נורדי (Hø רשולם, DK)מספר קטלוג   5452000010
סרום עכברמחקר חדשני (נובי, מישיגן, ארה"ב)IGMSCD1SER10ML
תנור ההשתקה  נאברתרם GmbH (ברמן, דלאוור)תנור מפל LE 6/11
N,N&פריים;-דימתילפורמיד (99.9%)VWR אינטרנשיונל (Sø בורג, DK)250131a008
ציוד Nanodrop 2000c תרמו פישר
תהודה מגנטית גרעינית ברוקר (בילריקה, ארה"ב)
O2 meter PreSens (רגנסבורג, גרמניה)
תוכנת Origin 2022OriginLab Corporation (מסצ'וסטס, ארה"ב)גרסה 2022 
חיישן חמצןPreSens (רגנסבורג, דלאוור)עקבות ST של OXY-1
מלח מוגן בפוספט מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)P4417-50TAB
קורא לוחותTecan Group Ltd.  (Mä ננדורף, CH)
אשלגן הקסאציאנופרטמרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)60299-100G
אשלגן הידרוקסידמרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)221473-500G
דיפרקציית קרני רנטגן אבקתי Malvern Panalytical Ltd., (מלברן, בריטניה)מודל: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD למדידות אבקה (שוחרר ב-2020)
כלי לחץ תחתית עגול מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)SYNP170004-1EA
מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת  חברת FEI (הילסבורו, ארה"ב)ה-FEI Helios Nanolab 600 עם קרן כפולה
נתרן קלוריד מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)71376
נתרן דיתיוניט  מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)71699-250G
נתרן דודציל סולפט מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)L4509-100G
סינתוור וטרייד; כלי לחץ עגול בתחתיתמרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)SYNP170003
טרט-בוטיל ניטריט  מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)20370-100 מ"ל-F
טטרהידרופורן (99.7%)VWR אינטרנשיונל (Sø בורג, DK)201022A004
תרמושייקרגרנט אינסטרומנטס (קיימברידג') בע"מ (בריטניה)PHMT-PSC18 (01012015020119)
מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכת חברת FEI (הילסבורו, ארה"ב)FEI Tecnai T20
טרימתילסיליל אזיד  מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)155071-10G
מערכת DAQ של TSC HEMOXTSC Scientific Crp (פנסילבניה, ארה"ב)תוכנת מנתח Hemox  
אולטרוסאונד סוניקאטור חברת ברנסון אולטרסוניקס (דנברי, ארה"ב)SKU: 2410240003
ספקטרופוטומטר UV-Vis  שימדזו (קיוטו, יפן)
תנור ואקום Thermo Fisher Scientific Inc (מסצ'וסטס, ארה"ב)
זטייזר ננו ZSMalvern Panalytical Ltd., (מלברן, בריטניה)מספר סידורי MAL1188530
כלוריד זירקוניום(IV)מרק לייף סיינס A/S (Sø בורג, DK)357405-100G

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sen Gupta, A., Doctor, A. Oxygen Carriers. Damage Control Resuscitation. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2020).
  2. Sen Gupta, A. Bio-inspired nanomedicine strategies for artificial blood components. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1464(2017).
  3. Ding, L., et al. Engineered Red Blood Cell Biomimetic Nanovesicle with Oxygen Self-Supply for Near-Infrared-II Fluorescence-Guided Synergetic Chemo-Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (44), 52435-52449 (2021).
  4. Sang, W., et al. Oxygen-Enriched Metal-Phenolic X-Ray Nanoprocessor for Cancer Radio-Radiodynamic Therapy in Combination with Checkpoint Blockade Immunotherapy. Advanced Science. 8 (4), 2003338(2021).
  5. Kim, H., et al. Upconverting nanoparticle-containing erythrocyte-sized hemoglobin microgels that generate heat, oxygen and reactive oxygen species for suppressing hypoxic tumors. Bioactive Materials. 22, 112-126 (2023).
  6. Wang, Y., et al. Highly Penetrable and On-Demand Oxygen Release with Tumor Activity Composite Nanosystem for Photothermal/Photodynamic Synergetic Therapy. ACS Nano. 14 (12), 17046-17062 (2020).
  7. Liu, L., et al. Hemoglobin based oxygen carrier and its application in biomedicine. Coordination Chemistry Reviews. 532, 216508(2025).
  8. Mohanto, N., Mondal, H., Park, Y. -J., Jee, J. -P. Therapeutic delivery of oxygen using artificial oxygen carriers demonstrates the possibility of treating a wide range of diseases. Journal of Nanobiotechnology. 23 (1), 25(2025).
  9. Cao, M., et al. Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Potential Applications in Solid Organ Preservation. Frontiers in Pharmacology. 12, 760215(2021).
  10. Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Recent and prominent examples of nano- and microarchitectures as hemoglobin-based oxygen carriers. Advances in Colloid and Interface Science. 260, 65-84 (2018).
  11. Coll-Satue, C., Bishnoi, S., Chen, J., Hosta-Rigau, L. Stepping stones to the future of haemoglobin-based blood products: clinical, preclinical and innovative examples. Biomaterials Science. 9 (4), 1135-1152 (2021).
  12. Taguchi, K., Maruyama, T., Otagiri, M. Pharmacokinetic properties of hemoglobin vesicles as a substitute for red blood cells. Drug Metabolism Reviews. 43 (3), 362-373 (2011).
  13. Rameez, S., Alosta, H., Palmer, A. F. Biocompatible and Biodegradable Polymersome Encapsulated Hemoglobin: A Potential Oxygen Carrier. Bioconjugate Chemistry. 19 (5), 1025-1032 (2008).
  14. Pacheco, M. O., et al. Silk Fibroin Particles as Carriers in the Development of Hemoglobin-Based Oxygen Carriers. Advanced NanoBiomed Research. 3 (9), 2300019(2023).
  15. Taguchi, Y., Cu, Y., Fei, J., Dai, L., Li, J. Yang Construction and Evaluation of Hemoglobin-BasedCapsules as Blood Substitutes. Advanced Functional Materials. 22, 1446-1453 (2012).
  16. Coll-Satue, C., Jansman, M. M. T., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Optimization of Hemoglobin Encapsulation within PLGA Nanoparticles and Their Investigation as Potential Oxygen Carriers. Pharmaceutics. 13 (11), 1958(2021).
  17. Jansman, M. M. T., et al. Hemoglobin-based oxygen carriers camouflaged with membranes extracted from red blood cells: Optimization and assessment of functionality. Biomaterials Advances. 134, 112691(2022).
  18. Liu, X., Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Haemoglobin-loaded metal organic framework-based nanoparticles camouflaged with a red blood cell membrane as potential oxygen delivery systems. Biomaterials Science. 8 (21), 5859-5873 (2020).
  19. Grzegorzewski, W., et al. Hemoglobin-Based Oxygen Carriers: Selected Advances and Challenges in the Design of Safe Oxygen Therapeutics (A Focused Review). International Journal of Molecular Sciences. 26 (19), 9775(2025).
  20. Zhu, K., et al. Nanomaterial-related hemoglobin-based oxygen carriers, with emphasis on liposome and nano-capsules, for biomedical applications: current status and future perspectives. Journal of Nanobiotechnology. 22 (1), 336(2024).
  21. Lawson, H. D., Walton, S. P., Chan, C. Metal-Organic Frameworks for Drug Delivery: A Design Perspective. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (6), 7004-7020 (2021).
  22. Lian, X., Chen, Y. -P., Liu, T. -F., Zhou, H. -C. Coupling two enzymes into a tandem nanoreactor utilizing a hierarchically structured MOF. Chemical Science. 7 (12), 6969-6973 (2016).
  23. Jin, W., et al. Surface engineering of metal-organic framework nanoparticles-based miRNA carrier: Boosting RNA stability, intracellular delivery and synergistic therapy. Journal of Colloid and Interface Science. 677, 429-440 (2025).
  24. Wang, Q., et al. Hemoglobin coated oxygen storage metal-organic framework as a promising artificial oxygen carrier. Journal of Materials Chemistry B. 9 (19), 4002-4005 (2021).
  25. Jin, W., et al. Small RNA stabilization via non-covalent binding with a metalloporphyrin nanocage to accomplish synergistic gene and photodynamic therapy. Cell Reports Physical Science. 3 (12), 101187(2022).
  26. Douka, D., et al. Hemoglobin-loaded ZIF-8 nanoparticles functionalized with human serum albumin as stealth, stable, and biocompatible oxygen carriers. Nanoscale Advances. 7 (24), 8058-8073 (2025).
  27. Liang, K., et al. Biomimetic mineralization of metal-organic frameworks as protective coatings for biomacromolecules. Nature Communications. 6 (1), 7240(2015).
  28. Douka, D., Jin, W., Cantallops-Iglesias, C., Dieste-Izquierdo, A., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Optimization and Investigation of Hemoglobin-Loaded ZIF-90 Metal-Organic Framework Nanoparticles as Artificial Oxygen Carriers. Particle & Particle Systems Characterization. 42 (3), 2400189(2025).
  29. Noori, R., Maarof, N. N. N., Alshatteri, A. H. High-efficiency encapsulation and pH-triggered release of docetaxel from folic acid-functionalized ZIF-90 nanocarriers. RSC Advances. 15 (53), 45347-45358 (2025).
  30. Poryvaev, A. S., et al. Guest Leakage from ZIF-8 Particles under Drug Delivery Conditions: Quantitative Characterization and Guest-Induced Framework Stabilization. The Journal of Physical Chemistry C. 125 (28), 15606-15613 (2021).
  31. Valenzano, L., et al. Disclosing the Complex Structure of UiO-66 Metal Organic Framework: A Synergic Combination of Experiment and Theory. Chemistry of Materials. 23 (7), 1700-1718 (2011).
  32. Jarai, B. M., Stillman, Z., Attia, L., Decker, G. E., Bloch, E. D., Fromen, C. A. Evaluating UiO-66 Metal-Organic Framework Nanoparticles as Acid-Sensitive Carriers for Pulmonary Drug Delivery Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (35), 38989-39004 (2020).
  33. Hou, T., Huang, Y., Wang, X., Hu, X., Guan, P. Preparation of lysozyme-imprinted mesoporous Zr-based metal-organic frameworks with remarkable specific recognition. Talanta. 265, 124896(2023).
  34. Parvizifard, G., Alipour, E., Soltani, S., Hosseini, M. G. Development of a novel voltammetric aptasensor for highly sensitive detection of cardiac troponin I, utilizing ciprofloxacin-loaded UIO-66 metal-organic frameworks. Talanta. 296, 128471(2026).
  35. Jin, W., et al. Biorthogonal PEGylation of Hierarchical Porous Metal-Organic Frameworks as Robust, Functional Nanocarriers for Hemoglobin-Based Oxygen Delivery. Journal of the American Chemical Society. 147 (47), 43400-43414 (2025).
  36. Cai, G., Jiang, H. -L. A Modulator-Induced Defect-Formation Strategy to Hierarchically Porous Metal-Organic Frameworks with High Stability. Angewandte Chemie International Edition. 56 (2), 563-567 (2017).
  37. Wen, S., Fu, Q., Yan, L., Zhao, X. Hierarchically porous three-dimensional-ordered macro-microporous metal-organic frameworks: Design, precise synthesis, and applications. Coordination Chemistry Reviews. 517, 215996(2024).
  38. Bunzen, H. Chemical Stability of Metal-Organic Frameworks for Applications in Drug Delivery. ChemNanoMat. 7 (9), 998-1007 (2021).
  39. Bůžek, D., Adamec, S., Lang, K., Demel, J. Metal-organic frameworks vs. buffers: case study of UiO-66 stability. Inorganic Chemistry Frontiers. 8 (3), 720-734 (2021).
  40. Chen, X., Argandona, S. M., Melle, F., Rampal, N., Fairen-Jimenez, D. Advances in surface functionalization of next-generation metal-organic frameworks for biomedical applications: Design, strategies, and prospects. Chem. 10 (2), 504-543 (2024).
  41. Sanità, G., Carrese, B., Lamberti, A. Nanoparticle Surface Functionalization: How to Improve Biocompatibility and Cellular Internalization. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 587012(2020).
  42. Chen, X., et al. Formulation of Metal-Organic Framework-Based Drug Carriers by Controlled Coordination of Methoxy PEG Phosphate: Boosting Colloidal Stability and Redispersibility. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13557-13572 (2021).
  43. Wang, S., McGuirk, C. M., d'Aquino, A., Mason, J. A., Mirkin, C. A. Metal-Organic Framework Nanoparticles. Advanced Materials. 30 (37), 1800202(2018).
  44. Abánades Lázaro, I., Haddad, S., Sacca, S., Orellana-Tavra, C., Fairen-Jimenez, D., Forgan, R. S. Selective Surface PEGylation of UiO-66 Nanoparticles for Enhanced Stability, Cell Uptake, and pH-Responsive Drug Delivery. Chem. 2 (4), 561-578 (2017).
  45. Verhoef, J. J. F., Anchordoquy, T. J. Questioning the use of PEGylation for drug delivery. Drug Delivery and Translational Research. 3 (6), 499-503 (2013).
  46. Sheffey, V. V., Siew, E. B., Tanner, E. E. L., Eniola-Adefeso, O. PLGA's Plight and the Role of Stealth Surface Modification Strategies in Its Use for Intravenous Particulate Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 11 (8), 2101536(2022).
  47. Suk, J. S., Xu, Q., Kim, N., Hanes, J., Ensign, L. M. PEGylation as a strategy for improving nanoparticle-based drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 28-51 (2016).
  48. Siegel, N., et al. Universal Click-Chemistry Approach for the DNA Functionalization of Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 146 (25), 17250-17260 (2024).
  49. Chen, J., Liu, X., Jansman, M. M. T., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Metal-Phenolic Networks as Broad-Spectrum Antioxidant Coatings for Hemoglobin Nanoparticles Working as Oxygen Carriers. Chemistry of Materials. 34 (20), 9200-9211 (2022).
  50. Evans, T. G., Salinger, J. L., Bingel, L. W., Walton, K. S. Determining Surface Areas and Pore Volumes of Metal-Organic Frameworks. Journal of Visualized Experiments. (205), e65716(2024).
  51. Coll-Satue, C., Jansman, M. M. T., Hosta-Rigau, L. Comparative Evaluation of UV-Vis Spectroscopy-Based Approaches for Hemoglobin Quantification: Method Selection and Practical Insights. Biomolecules. 14 (9), 1046(2024).
  52. Osterrieth, J. W. M., et al. How Reproducible are Surface Areas Calculated from the BET Equation. Advanced Materials. 34 (27), 2201502(2022).
  53. Drenchev, N. L., et al. In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework. Journal of Visualized Experiments. (156), e60285(2020).
  54. Li, F., Zheng, K., Zhang, H., Duan, C., Xi, H. Nanoscale Hierarchically Porous Metal-Organic Frameworks: Facile Synthesis, Mechanism Research, and Application. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 7 (13), 11080-11087 (2019).
  55. Liu, G., Luo, Q., Wang, H., Zhuang, W., Wang, Y. In situ synthesis of multidentate PEGylated chitosan modified gold nanoparticles with good stability and biocompatibility. RSC Advances. 5 (86), 70109-70116 (2015).
  56. Ben-Haim, A. E., et al. DNA Delivery to Intact Plant Cells by Casein Nanoparticles with Confirmed Gene Expression. Advanced Functional Materials. 34 (16), 2314756(2024).
  57. Gourianov, N., Kluger, R. Conjoined Hemoglobins. Loss of Cooperativity and Protein−Protein Interactions. Biochemistry. 44 (45), 14989-14999 (2005).
  58. Doustkhah, E., Hassandoost, R., Khataee, A., Luque, R., Assadi, M. H. N. Hard-templated metal-organic frameworks for advanced applications. Chemical Society Reviews. 50 (5), 2927-2953 (2021).
  59. Li, C., et al. Metal Organic Framework Cubosomes. 62 (11), Angewandte Chemie International Edition. e202215985(2023).
  60. Peng, S., et al. Metal-Organic Framework Encapsulating Hemoglobin as a High-Stable and Long-Circulating Oxygen Carriers to Treat Hemorrhagic Shock. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (39), 35604-35612 (2019).
  61. Gu, X., Palmer, A. F. ZIF-8 Metal-Organic Framework Nanoparticles Loaded with Hemoglobin as a Potential Red Blood Cell Substitute. ACS Applied Nano Materials. 5 (4), 5670-5679 (2022).
  62. Pullen, S., Clever, G. H. Mixed-Ligand Metal-Organic Frameworks and Heteroleptic Coordination Cages as Multifunctional Scaffolds-A Comparison. Accounts of Chemical Research. 51 (12), 3052-3064 (2018).
  63. Pastore, V. J., Cook, T. R., Rzayev, J. Polymer-MOF Hybrid Composites with High Porosity and Stability through Surface-Selective Ligand Exchange. Chemistry of Materials. 30 (23), 8639-8649 (2018).
  64. Obeso, J. L., Huxley, M. T., De Los Reyes, J. A., Humphrey, S. M., Ibarra, I. A., Peralta, R. A. Low-Valent Metals in Metal-Organic Frameworks Via Post-Synthetic Modification. Angewandte Chemie International Edition. 62 (49), e202309025(2023).
  65. Zhang, X., Malhotra, S., Molina, M., Haag, R. Micro- nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chemical Society Reviews. 44 (7), 1948-1973 (2015).
  66. Biscarat, J., Charmette, C., Masquelez, N., Sanchez, J., Pochat-Bohatier, C. Crosslinking of gelatin membranes with ferulic acid or glutaraldehyde: Relationship between gas permeability and renaturation level of gelatin triple helices. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics. 53 (4), 280-287 (2015).
  67. Kurian, P., et al. Synthesis, permeability and biocompatibility of tricomponent membranes containing polyethylene glycol, polydimethylsiloxane and polypentamethylcyclopentasiloxane domains. Biomaterials. 24 (20), 3493-3503 (2003).
  68. Liu, X., Jansman, M. M. T., Li, W., Kempen, P., Thulstrup, P. W., Hosta-Rigau, L. Metal-organic framework-based oxygen carriers with antioxidant protection as a result of a polydopamine coating. Biomaterials Science. 9 (21), 7257-7274 (2021).
  69. Srinivasu, B. Y., Bose, B., Mitra, G., Kurpad, A. V., Mandal, A. K. Adsorption Induced Changes of Human Hemoglobin on Ferric Pyrophosphate Nanoparticle Surface Probed by Isotope Exchange Mass Spectrometry: An Implication on Structure-Function Correlation. Langmuir. 33 (32), 8032-8042 (2017).
  70. Chen, K., et al. Low Modulus Biomimetic Microgel Particles with High Loading of Hemoglobin. Biomacromolecules. 13 (9), 2748-2759 (2012).
  71. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  72. Coll-Satue, C., et al. A novel PEG-mediated approach to entrap hemoglobin (Hb) within ZIF-8 nanoparticles: Balancing crystalline structure, Hb content and functionality. Biomaterials Advances. 163, 213953(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MOFs

מאמרים קשורים