גירוי מגנטי לכל הגוף מפחית אכילה דמוית אכילה במודל של עכברים עם אכילה לא מסודרת

סיכום

גירוי מגנטי לכל הגוף (WB-MS) שימש במודל האכלה דמוי התקף הכולל גישה לסירוגין לתזונה טעימה. WB-MS הפחיתה באופן זמני את הצריכה במהלך הסימולציה מבלי לשנות את צריכת האוכל. עם זאת, ההשפעות לא נמשכו, שכן התנהגות דמוית התקף חזרה לאחר הטיפול, ללא שינויים במשקל, בהשומן או בביטוי אקומבנס c-Fos.

תקציר

גירוי מגנטי לכל הגוף (WB-MS) שימש במודל האכלה דמוי התקף הכולל גישה לסירוגין לתזונה טעימה. WB-MS הפחיתה באופן זמני את הצריכה במהלך הסימולציה מבלי לשנות את צריכת האוכל. עם זאת, ההשפעות לא נמשכו, שכן התנהגות דמוית התקף חזרה לאחר הטיפול, ללא שינויים במשקל, בהשומן או בביטוי אקומבנס c-Fos.

מבוא

אכילה כפייתית היא דפוס תזונה לא מבוקר, המאופיין בצריכה מהירה של כמויות גדולות של מזון טעים במיוחד בהיעדר רעב פיזיולוגי. זהו מאפיין מרכזי של הפרעת אכילה התקפית (BED), מצב הקשור באופן חזק להשמנה ולבעיות מטבוליות ^1,2. עדויות הולכות וגדלות מדגישות את תפקידם של מעגלי תגמול מזולימביים באובדן שליטה על התנהגות האכלה ^3,4. BED נתפסת יותר ויותר כהפרעה של שינוי באיתות קורטיקוסטריאטל, שבה תקשורת לקויה בין מערכות בקרה הקשורות לתגמול למערכת בקרה ניהולית מעודדת צריכה כפייתית של מזון. ברמה הנוירוביולוגית, איתות דופמינרגי במסלול המזולימבי, יחד עם קלטים גלוטמטרגיים, תורמים לשינוי בבליטות התמריץ ולמוטיבציה מופרזת למזון טעים ^5,6. בנוסף, אותות מטבוליים היקפיים כמו GLP-1, אינסולין וגרלין מתקשרים עם מעגלים אלו כדי לווסת את הערכת התגמול והתנהגות האכילה⁷. עדויות עדכניות נוספות מצביעות על כך שהתנהגות דמוית התקף קשורה לשינויים בדינמיקה העצבית בתוך ה-NAc, כולל תנודות בתדר נמוך בטווחי הדלתא והתטא (2–8 הרץ), אשר נקשרו לציפייה לתגמול ולמצבי תשוקה שקדמו לאובדן שליטה⁸.

ה-NAc פועל כמרכז אינטגרטיבי המקשר בין מערכות לימביות, קורטיות ומוטוריות, ומתרגם אותות מוטיבציה להתנהגות מכוונת מטרה. הפרעה למערכת זו, במיוחד תחת חשיפה חוזרת למזון טעים, מעודדת דפוסי צריכה כפייתיים ודמויי הרגל ^9,10. מודלים ניסיוניים המשתמשים בגישה לסירוגין למזון טעים ומעוררים באופן אמין אכילה מופרזת קשורים להפעלה מוגברת של ה-NAc, מה שתומך בתפקידו בהתנהגות האכלה כפייתית^11–14. נוירומודולציה לא פולשנית מתייחסת לטכניקות שמשנות את פעילות המוח ללא התערבות כירורגית, כולל גישות מבוססות שדה מגנטי כגון גירוי מגנטי טרנס-גולגולתי¹⁵. אסטרטגיות אלו זכו לרלוונטיות קלינית בשל יכולתן לווסת את ההתעוררות העצבית ופעילות הרשת בהפרעות נוירופסיכיאטריות^16,17. בבני אדם, הוכח כי נוירומודולציה מפחיתה תסמיני אכילה כפייתית ומשפרת שליטה התנהגותית, וכן משפיעה על ויסות מטבולי^18,19.

בהתבסס על ראיות אלו, גירוי מגנטי לכל הגוף (WB-MS) עשוי לייצג גישה טיפולית לא פולשנית המסוגלת לווסת מעגלים המעורבים בהזנה כפייתית. בניגוד לטכניקות מוקד, שדות מגנטיים בתדר נמוך יכולים להשפיע על התעוררות הנוירונים ורשתות מוח מבוזרות, מה שמרמז על השפעה פוטנציאלית על מבנים תת-קורטיקליים כמו^{NAc 8}. מחקרים ניסיוניים הראו כי שדות כאלה מווסתים את העברה עצבית דופמינרגית וגלוטאמטרגית 6,7,8,19, ומספקים מנגנון סביר להשפעה על מעגלים הקשורים לתגמול. עם זאת, ההשפעות שלו על התנהגות דמוית אכילה כפייתית נותרות לא ידועות. לכן, המחקר הנוכחי העריך את השפעות ה-WM-MS בתדירות נמוכה במודל עכבר של אכילה מופרזת שנגרמה מגישה לסירוגין למזון טעים, תוך הערכת צריכת מזון, משקל גוף, שומן וביטוי c-Fos ב-NAc.

פרוטוקול

כל ההליכים בוצעו בהתאם לתקן הרשמי המקסיקני לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (NOM-062-ZOO-199) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (CICUAL) באוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו (UNAM), תחת פרוטוקול מספר 035-CIC-2023. כל החומרים ששימשו במחקר מוזכרים בטבלת החומרים.

הגדרת אוכלוסייה ורכישה

בסך הכל נעשה שימוש ב-30 עכברים מסוג C57BL/6 (9 נקבות ו-21 זכרים) ביום ה-30 לאחר הלידה (P30), עם משקל גוף התחלתי של 15–18 גרם. העכברים הוחזקו בכלובים ביתיים בתנאים סביבתיים מבוקרים: מחזור אור-חושך של 12:12 שעות (אורות דלוקים ב-6:00 בבוקר), טמפרטורת סביבה של 23 ± 2 מעלות צלזיוס, ולחות יחסית של 70 ± 10%.

הרגל

ב-P30, בעלי החיים הוחזקו בכלובים ביתיים עם גישה חופשית למים ולמזון סטנדרטי. כל הכלובים הועשרו סביבתית בצינורות קרטון, ושבבי עץ שימשו כמצעים. במהלך תקופת ההרגל של 7 ימים, משקל גוף, צריכת מזון וצריכת מים נרשמו כל 24 שעות.

אכילה מופרזת

המודל הניסיוני ששימש במחקר זה מבוסס על פרדיגמת האכילה ההתקפית לסירוגין שתוארה על ידי חוקרים¹⁴. לפני חלוקת הקבוצה, כל בעלי החיים הובאו למשקל גוף ממוצע דומה (17 גרם) כדי להפחית את השונות הבסיסית. הבעלי חיים (N = 30) חולקו באקראי לקבוצות ניסוי באמצעות כלי דיגיטלי "סיבוב הגלגל", שבו נבדקים בודדים נרשמו והוקצו ברצף לאחת משלוש הקבוצות. הקבוצה הסטנדרטית כללה נשים (קבוצת נשים סטנדרטית, SFG; n = 3) וגברים (קבוצת גברים סטנדרטית, SMG; n = 7), שהיו להם גישה רציפה לאוכל ומים סטנדרטיים. קבוצת הגישה הרציפה כללה נקבות (קבוצת נשים רציפה, CFG; n = 3) וזכרים (קבוצת גברים רציפה, CMG; n =7) עם גישה רציפה לאוכל סטנדרטי, מים ומזון טעים (M&M's). קבוצת הגישה לסירוגין כללה נשים (קבוצת נשים לסירוגין, IFG; n =3) וגברים (קבוצת גברים לסירוגין, IMG; n = 7), שהיו להם גישה חופשית לאוכל ומים סטנדרטיים, וקיבלו גישה למזון טעים שלוש פעמים בשבוע (שני, רביעי ושישי) למשך שעתיים (16:00 עד 18:00). תנאי ההאכלה הללו נשמרו במשך 35 ימים.

גירוי מגנטי לכל הגוף (WB-MS)

פרדיגמת הגירוי הזו נבחרה בהתבסס על מחקרים קודמים שהשתמשו בשדות אלקטרומגנטיים בתדר נמוך (50 הרץ, 1 mT) בעכברים C57BL/6 בתנאים ניסיוניים דומים^20,21. WB-MS בוצע באמצעות מכשיר מגנטותרפיה פולסי (Dhan 1000, יחידת מגנטותרפיה) שיצר שדה מגנטי סינוסואידלי מתחלף של 10 גאוס (1 mT) בתדר 50 הרץ. במפגשי גירוי, העכברים נשארו מאוחסנים בכלובים הביתיים שלהם, שהונחו בין שני לוחות אלקטרומגנטיים בצדדים מנוגדים של כל כלוב. כדי למנוע הפרעות שדה מגנטי, רכיבים מתכתיים, כולל כלוב החוט, הרשת ובקבוק המים, הוסרו זמנית במהלך הגירוי. ההגדרה הזו אפשרה לבעלי חיים לנוע בחופשיות במהלך ההליך ללא הגבלה או לחץ נוסף.

כדי להבטיח עקביות ניסיונית, נשמרו תנאי טיפול וסביבה זהים הן במהלך מפגשי הגירוי והן במהלך אי-גירוי. במהלך מפגשי בקרה (ימים 15–21), הלוחות המגנטיים הוצבו באותו אופן אך נשארו לא פעילים, ובכך שלטו בהשפעות אפשריות של טיפול, מניפולציה בכלוב, רעש סביבתי או מיקום לוחות אלקטרומגנטיים.

WB-MS כללה חשיפות יומיות של 20 דקות בין השעות 15:40 ל-16:00 במשך שבעה ימים רצופים (ימים 22–28 של הפרוטוקול הניסוי), מיד לפני תקופת ההערכה של אכילה מופרזת (16:00–18:00). מהימים ה-29 עד ה-35, העכברים שוב עברו טיפולים ללא גירוי, ולאחר מכן הוערכה כמות המזון שלהם.

איסוף רקמות שומן

בסיום הפרוטוקול הניסויי (יום 36, 8:00 בבוקר), נאספה רקמת שומן מכל קבוצות הניסוי. ה-SG כללה שלוש נקבות ושני זכרים (n = 5), ה-CG כללה שלוש נקבות ושלושה זכרים (n = 6), וה-IG שלוש נקבות וארבעה גברים (n = 7). כל בעלי החיים הורדמו בקטמין (60 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג)²², והיעדר תגובה נוציספטיבית לגירוי צביטת אצבעות אישר עומק הרדמה מספק. לאחר מכן בוצע חתך בטן במרכז באמצעות להב סכין מס' 3, שהשתרע דרך אזורי הבטן התת-צלעיים, המפשעה והאמצעית, ואחריו משיכה עדינה לרוחב העור כדי לחשוף את חלל הבטן.

מחסני רקמת שומן גונדלית, רטרופריטוניאלית ותת-עורית זוהו, נותחו והוצאו בתנאים סטנדרטיים כדי למזער שונות בין דגימות. מיד לאחר הניתוח, הרקמות נשקלו באמצעות איזון אנליטי מכויל (קיבולת מקסימלית 220 גרם, קריאות 0.1 מ"ג), כפי שאושר קודם לכן לפי מפרט היצרן²³. כל הדגימות עובדו בתנאים זהים בין קבוצות שונות כדי להבטיח עקביות ניסויית.

הכנת רקמות מוח ואימונופלואורסצנציה

עכברים הושמתו 90 דקות לאחר סשן צריכת המזון האחרון²⁴. המוחות נאספו לאחר פרפוזיה תוך-לבבית עם 4% פרפורמלדהיד ועובדו לאחר מכן לניתוח היסטולוגי. חתכים קורונליים במוח (30 מיקרון) הושגו באמצעות קריוסטט שנשמר בטמפרטורה של −18 מעלות צלזיוס ואוחסן ב-PBS המכיל אזיד נתרן עד לעיבוד. תת-קבוצה של זכרים מכל קבוצת ניסוי הוקצתה להכנת רקמות מוח לניתוחי אימונופלואורסצנציה (SG, n = 4; CG, n = 4; IG, n = 4), בעוד שהחיות הנותרות שימשו לאיסוף רקמות שומן. הקצאה דיפרנציאלית זו נקבעה מראש על פי דרישות מתודולוגיות, שכן פרפוזיה תוך-לבבית עם פרפורמלדהיד גורמת לקיבוע רקמה שאינו תואם לאיסוף רקמת שומן לאחר מכן עקב פגיעה בשלמות רקמת השומן. לכן, התפלגות המדגם הונעה אך ורק על ידי מגבלות טכניות והייתה בלתי תלויה בהקצאת קבוצות ניסוי או בתוצאות ביולוגיות.

באימונופלואורסצנציה של c-Fos, קטעים דגרו במשך 72 שעות עם נוגדן אנטי-C-Fos מונוקלונלי לעכבר (1:1000, sc-166940) מדולל ב-PBS המכיל 0.25% ג'לטין עור חזיר ו-0.5% טריטון X-100, ששימש כפתרון לחסימה ולחדירה. דגירה ראשונית של נוגדנים בוצעה במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר, ואחריה 48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, החתכים נשטפו היטב ב-PBS ונדגרו במשך שעתיים עם נוגדן משני אנטי-עכבר פוליקלונלי (Alexa Fluor 488-conjugated, 1:500, AB_2338840) מדולל באותו תמיסה. לבסוף, החלקים הותקנו על שקופיות זכוכית באמצעות מדיום הרכבה.

רכישת תמונה וכימות

הדמיה קונפוקלית בוצעה באמצעות מיקרוסקופ המצויד בלייזר 488 ננומטר ועדשה אובייקטיבית של 20x. תמונות Z-stack נרכשו באמצעות תוכנת NIS-Elements C ונשמרו תחת מזהים מקודדים לניתוח עיוור. כימות גרעיני c-Fos חיוביים בוצע באמצעות ImageJ (ImageJ 2.9.0 / 1.53t). רק גרעינים כלואים במלואם נכללו בספירה, ויושמה גישה מבוססת רבע למניעת ספירה כפולה של תאים בודדים. לכל בעל חיים, נלקחה תמונה אחת מכל אחד משלושה חלקים עצמאיים עם צבעי חיסון באמצעות פרמטרי רכישה זהים בכל קבוצות הניסוי. מספר הגרעינים החיוביים של c-Fos נמדד בנפרד עבור כל תמונה, והערכים שהתקבלו משלושת החלקים המתאימים לאותו בעל חיים סוכמו. ערך זה נורמל לאחר מכן לשטח הכולל שנבדק ובוטא כצפיפות c-Fos (גרעינים חיוביים/מ"^{מ 2}). הסכימה הכוללת של ההליכים הניסיוניים מוצג באיור 1A–H.

איור 1: עיצוב ניסוי וציר זמן של פרוטוקול האכילה ההתקפית וההתערבות WB-MS. (A) מציג תמונה מייצגת של עכבר המציינת את תנאי המגורים הראשוניים. בסך הכל 30 עכברים (9 נקבות ו-21 זכרים) הוחזקו בכלובים ביתיים החל מ-P30 ועברו תקופת התרגלות של שבוע. (ב) ממחישה את תנאי התזונה שהופעלו לאורך פרוטוקול האכילה ההתקפית מהיום הניסיוני הראשון ועד היום ה-35. לקבוצת הביקורת הייתה גישה חופשית לאוכל ומים סטנדרטיים. קבוצות גישה רציפה קיבלו גישה חופשית לאוכל סטנדרטי, מים ואוכל טעים. קבוצות גישה לסירוגין יכלו גישה חופשית לאוכל ומים סטנדרטיים. באותו זמן, אוכל טעים סופק רק בימי שני, רביעי ושישי בין השעות 16:00 ל-18:00 (C). זה מצביע על כך שמימים 15 עד 21, בעלי החיים המשיכו לחיות באותם תנאים תזונתיים כאשר לוחות גירוי מגנטי הונחו מתחת לכלובים מבלי לספק גירוי (חשיפה מזויפת). (D) מראה שבין הימים 22 ל-28, WB-MS ניתנה 20 דקות לפני החשיפה למזון טעים תוך שמירה על תנאי התזונה המתאימים לכל קבוצה. (ה) מציין כי מימים 29 עד 35, WB-MS הופסקה, אם כי תנאי התזונה נותרו ללא שינוי. (F) מראה שהמוחות נאספו ביום 72 לאחר הלידה (P72), ואחריו איסוף רקמת שומן ביום 73 לאחר הלידה (P73). (G) מדגים חתך מוח באמצעות קריוסטאט והליכים אימונוהיסטוכימיים. לבסוף, (H) מראה ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של אימונוריאקטיביות c-Fos. התמונות נוצרו על ידי המחברים באמצעות Biorender, וקיבל רישיון מתאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות גרסה 25 של SPSS. מכיוון שלא ניתן היה להניח התפלגות נורמלית, נעשה שימוש במבחנים לא-פרמטריים לאורך כל המחקר. ההבדלים בין SG, CG ו-IG הוערכו באמצעות מבחן Kruskal–Wallis. השוואות חוזרות בתוך כל קבוצת ניסוי נותחו באמצעות מבחן פרידמן, ואחריהן בדיקות השוואה מרובות כאשר הדבר מתאים. עקב גודל מדגם מוגבל עבור נקודות קצה ניסיוניות מסוימות, במיוחד אצל נקבות (n = 3 לקבוצה), אוחדו נתונים מעכברים זכרים ונקבות C57BL/6 לניתוחים שהוצגו באיור 2, איור 3 ואיור 4 , כדי לשפר את החוסן הסטטיסטי ולתמוך בהערכה חקרנית של תוצאות הניסוי. בנוסף, נתוני אכילה משותפים דמויי התקפי עכברים זכרים ונקבות C57BL/6 נותחו באמצעות אנובה דו-כיוונית, ואחריה בדיקות השוואות מרובות להערכת השפעות קבוצת הניסוי וזמן הטיפול לאורך פרוטוקול ההאכלה, כולל שבוע גירוי WB-MS. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p ≤ 0.05.

תוצאות

במהלך ההתקף, נבדקים בקבוצות הגישה לסירוגין (IMG לגברים, IFG לנקבות) הראו צריכת קלוריות גבוהה משמעותית לעומת אלו שבקבוצות הסטנדרטיות (SFG ו-SMG) והרציפות (CFG ו-CMG) בימים 15, 17 ו-19 (מבחן Kruskal-Wallis; עמוד < 0.05; איור 2A–B). WB-MS ניתן בעוצמה של 1 mT ובתדירות של 50 הרץ במשך 20 דקות ביום במשך שבעה ימים רצופים, כפי שמצוין על ידי הפס האפור. במהלך שלב הגירוי הזה, זוהתה מגמת ירידה ניכרת בצריכת הקלוריות ביום ה-26 לאחר הגירוי (מבחן Kr...

דיון

הממצאים הנוכחיים מצביעים על כך ש-WB-MS עשוי לווסת באופן זמני התנהגות אכילה דמוית אכילה במודל עכברים הנגרמת מגישה לסירוגין למזון טעים. למרות שלא זוהו שינויים משמעותיים בפעילות הנוירונית ב-NAc, צריכת המזון הטעים ירדה בהדרגה במהלך מפגשי הגישה לסירוגין בתקופת הגירוי, והגיעה לירידה משמעותית במהלך ההתפרצות האחרונה. תצפיות אלו מצביעות על כך שגירוי מגנטי עשוי להשפיע על תהליכי חיזוק או מוטיבציה הבסיס להתנהגות האכלה דמוית כפייתיות. עם זאת, המחקר הנוכחי לא נועד לאפיין ישירות את המנגנונים העצביים שמ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ImageJ	imagej.net	Public Domain, BSD-2	תוכנה. תוכנית עיבוד תמונה מבוססת Java. פותחה במכונים הלאומיים לבריאות ובמעבדה לציוד אופטי ומחשוב (LOCI, אוניברסיטת ויסקונסין)
Coverslips	Corning	2935	זכוכית כיסוי 24 x 50 ממ (עובי 0.13–0.17)
Secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	AB_2340758	נוגדן משני פוליקלוני פרה-עכבר
Laboratory Rodent Diet 5001	LabDiet	1320	מזון סטנדרטי. https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
Leica CM1510 S	Leica	CM1510 S	קריופור להיסטולוגיה שגרתית.
M&Ms 43.8g (Brown packaging)	M&M´s	NA	מזון טעים. תכולת תזונה לכל 100 : 480 קק"ל, 19 גרם שומן, 70 גרם פחמימות, 5.1 גרם חלבון, 0.13 גרם מלח. רכיבים: סוכר, מסת קקאו, אבקת חלב מושחת, חמאת קקאו, לקטוז, עמילן, שומן חלב, שומן דקל, סירופ גלוקוז, שומן שיאה, מייצב (גומי ערבי), דקסטרין, חומרים מבריקים (שעוות דבורים, שעוות קרנאובה), צבעים (E100, קרמין, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), תרכיז סלק, מתחלבים (לציטין סויה, E445), מלח, חומרי טעם, שמן גרעיני דקל, נוגד חמצון (E306). (עשוי להכיל: בוטנים, אגוזי לוז, שקדים). שוקולד חלב מכיל חומר חלב מינימלי 14%. שוקולד חלב מכיל שומנים צמחיים בנוסף לחמאת קקאו.
Dhan 1000	Magnetoterapia SA de CV	MAG1000	מכשיר מגנטותרפיה פולסרית
PBS	MEYER	Monobasic 2415. Dibasic 2410.  NaCl S3014	מונופספט נתרן מונו הידרטי. דיפספפט נתרן הפטה הידרטי. נתרן כלורידי קריסטלי דרגת ביולוגיה מולקולרית.
Nikon Microscope	Nikon Instruments, Inc	A1R+ STORM	מיקרוסקופ קונפוקלי
Polycarbonate mice cage	Orchid Scientific	EM01	כלוב פוליקרבונט לא פרומגנטי המשמש לחשיפת WB-MS, שקוף לחלוטין וניתן לחיטוי (373 x 190 x 138 ממ).
Anesket	Pisa	040.000.0226.00	תמיסת קטמין להזרקה
Procin Equus	Pisa	Q-7833-111	תמיסת קסילאזין להזרקה
c-Fos antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-166940	נוגדן מונוקלונלי עכבר נגד c-Fos
Laboratory balance	Sartorius		מאזניים אנליטיים
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10	מדיום הרכבה נגד דהייה מיוחד לשמירה על אותות פלואורסצנטיים במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה (IF) על ידי מיזעור דהיית הפלואורסצנציה.
Glass slides	VELAB	VE-P30	שקופיות זכוכית מיקרוסקופיות מלוטשות מצד אחד 26 x 76 ממ (עובי 0.8–1.1 ממ)
Sodium azide		K 6048.0100	99% נתרן אזיד