כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילות הסינרגטית של פוספומיצין בשילוב עם ספטריאקסון, מרופנם וגנטמצין נגד בודדים של אשריכיה קולי עמידים לקרבפנם באמצעות שיטת דילול אגר. סינרגיה נצפתה עם מרופנם וגנטאמיצין, אך לא עם צפטריאקסון.
מאמר סקירה
פרוטוקול לניתוח לוח שחמט של דילול אגר של שילובים אנטיביוטיים מבוססי פוספומיצין נגד אשריכיה קולי עמידה לקרבפנם
נפתח בלשונית חדשה
במאמר זה
סיכום
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
תקציר
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
עקב אפשרויות הטיפול המוגבלות באנטרובקטראלים עמידים לקרבפנם, משטרי טיפול משולבים זכו לחשיבות גוברת. מחקר זה נועד לחקור את שיעורי עמידות הפוספומיצין ולהעריך את האינטראקציות הסינרגטיות במבחנה של פוספומיצין בשילוב עם מרופנם, ג'נטמיצין וצפטריאקסון נגד מבודדי אשריכיה קולי עמידים לקרבפנם. שישים זנים עמידים לקרבפנם של E. coli שבודדו מדגימות קליניות שונות (שתן, דם, שאיפה, פצע, נוזל מוחי שדרתי, שאיפת אנדוטרכיה) שנאספו ממטופלים במחלקות קליניות וביחידות טיפול נמרץ בבתי החולים של הפקולטה הרפואית של אוניברסיטת דיצ'ל, נכללו במחקר. זיהוי המינים בוצע באמצעות מערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית. בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה ואישור עמידות לקרבפנם בוצעו באמצעות דיפוזיית דיסק עם ארטפנם, אימיפנם ומרופנם. עמידות לפוספומיצין והאינטראקציות בין אנטיביוטיקות הוערכו באמצעות דילול אגר. בנוסף, שילובי אנטיביוטיקה הוערכו על פני גרדיאנטים מרוכזים דו-כיביים סדרתיים באמצעות פרוטוקול דילול אגר, וחושבו אינדקסי ריכוז מעכבים חלקיים (FICI) כדי לקבוע סינרגיה, אדישות או אנטגוניזם. שיעורי העמידות היו 76.6% לפוספומיצין, 61.6% למרופןם, 85.0% לגנטמיצין ו-98.3% לצפטריאקסון. אינטראקציות סינרגיסטיות נצפו ב-35% מהבודדים לשילוב פוספומיצין–מרופןם, 33.4% בשילוב פוספומיצין–גנטמיצין, ו-1.7% בשילוב פוספומיצין–צפטריאקסון. אנטגוניזם זוהה רק בבודד אחד בשילוב הפוספומיצין–מרופנם. שילובים של פוספומיצין עם מרופנם וגנטמצין הראו פעילות סינרגטית במבחנה נגד E. coli עמיד לקרבפנם. נדרשים מחקרים נוספים במבחנה כדי לאשר ממצאים אלו.
מבוא
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
משפחת Enterobacterales כוללת קבוצה מגוונת מאוד של חיידקים גרם-שליליים, רבים מהם בעלי חשיבות קליניתמשמעותית 1. ביניהם, אשריכיה קולי היא המין המבודד השכיח ביותר במעבדות מיקרוביולוגיה קלינית ומקושרת באופן נרחב לזיהומים הכוללים כמעט את כל מערכות האיברים, כולל זיהומים בדרכי השתן, זיהומים בפצעים, דלקת ריאות אצל חולים עם מערכת חיסון מוחשת, דלקת גסטרואנטריטיס ודלקת קרום המוח התינוקת. הוא גם גורם עיקרי לספסיס גראם שלילי ולשוק ספטי המתווך על ידי אנדוטוקסין. מעבר לרפואה האנושית, E. coli הוא גם פתוגן וטרינרי חשוב, הגורם לזיהומים נשימתיים ומערכתיים במינים שונים של בעלי חיים, כולל סוסים, ומרחיב את תחום הפונדקאי של פתוגנזה של E. coli בין בני אדם ובעלי חיים2,3,4.
אנטרובקטרלים המייצרים בטא-לקטמאז (ESBL) בספקטרום מורחב, במיוחד E. coli ו-Klebsiella pneumoniae, נקשרו לעלייה בתמותה, אשפוז ממושך ועלויות בריאות גבוהות יותר. השימוש הנרחב באנטיביוטיקה הוא גורם מרכזי לעמידות לרב-תרופות (MDR) בקרב אורגניזמים אלו1. מנגנוני העמידות כוללים ייצור קרבפנמזים, ESBLs, אנזימים משנים אמינוגליקוזידים (AMEs), מוטציות המעניקות עמידות לקווינולון, ושינויים במערכות הפורין והפליטה. ב-E. coli וב-Klebsiella pneumoniae, העמידות היא בעיקר באמצעות פלזמיד, ומסייעת בהעברת גנים אופקית. תכונות עמידות כאלה מדווחות גם יותר ויותר ב-E. coli שמקורו בבעלי חיים, כולל מבודדים של בקר, התומכים במושג בריאות אחת ומצביעים על סיכון העברה זואונוטיפוטנציאלי 2,3.
קרבפנמים נחשבים לסוכנים קו אחרון לזיהומים עמידים לרב-תרופות חמורים. עם זאת, אנטרובקטרים עמידים לקרבפנם (CRE) הפכו לדאגה בריאותית עולמית מרכזית4. עמידות זו מתווכת בעיקר על ידי קרבפנמאזות, כולל מטאלו-בטא-לקטמאזות מחלקה B, התורמת לפנוטיפים עמידים לתרופות ועמידות לפאן-5.
זני MDR E. coli מגבילים משמעותית את אפשרויות הטיפול ומסבכים את ניהול הזיהומים. דבר זה מדגיש את הצורך באסטרטגיות טיפול חלופיות כגון טיפולים משולבים לשיפור התוצאות הקליניות. יתרה מזאת, זנים עמידים אלו מדווחים יותר ויותר לא רק בסביבות קליניות אלא גם ממקורות מזון כמו מוצרי חלב. דבר זה מרחיב את ההקשר האפידמיולוגי של הפצת עמידות לאנטימיקרוביאליות ותומך בטיפול משולב כאסטרטגיה פוטנציאלית להפחתת התפשטותו והשפעתה הקלינית 6,7. אמינוגליקוזידים, טיגציקלין ופולימיקסינים הם חומרים טיפוליים נפוצים בזיהומי MDR8. פוספומיצין גם הוכיח פעילות נגד E. coli שמייצר ESBL, במיוחד בזיהומים בדרכי השתן9.
פוספומיצין, שהתגלה לראשונה ב-1969, מעכב את סינתזת דופן התא החיידקיים המוקדמת וחזר לסוכן מבטיח בטיפול משולב10. השפעות סינרגטיות בין פוספומיצין לאמינוגליקוזידים או β-לקטמים דווחו באורגניזמים MDR11,12. בנוסף, פוספומיצין הוערך בקבוצות קליניות גדולות, והראה יעילות בזיהומים חמורים כאשר משתמשים בו לבד או במשטרי שילוב13. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים כוללים אוכלוסיות חיידקים הטרוגניות, והנתונים העוסקים במיוחד ב-E. coli עמיד לקרבפנם נותרו מוגבלים.
שיטות הסטנדרטיות לבדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית כוללות דילול אגר, דילול מרק ודיפוזיית דיסק. בדיקות שילוב מבוססות דילול אגר מאפשרות הערכה כמותית של אינטראקציות אנטימיקרוביאליות על ידי קביעת MICs וחישוב FICIs. שיטות חלופיות כמו השמדת זמן ודיפוזיה גרדיאנטית מספקות נתוני אינטראקציה דינמיים או מפושטים, אך עשויות להיות שונות בשחזוריות ובסטנדרטיזציה13,14. פרוטוקול זה מתאים במיוחד להערכה מבוקרת במבחנה של שילובי אנטיביוטיקה מוגדרים. עם זאת, הוא אינו משקף במלואו מצבים פרמקוקינטיים ב-vivo15. מתוכן, דילול אגר נחשב לשיטת ייחוס לקביעת MIC; עם זאת, השימוש בו בהערכת פעילות השילוב של פוספומיצין נגד E. coli עמיד לקרבפנם נותר מוגבל.
מחקר זה מספק הערכה שיטתית של שילובים מבוססי פוספומיצין מול מבודדי E. coli עמידים לקרבפנם מאומתים קלינית. שיטת לוח משבץ סטנדרטית לדילול אגר, שיצרה נתוני אינטראקציה השוואתית ישירה בתנאי מבחנה מבוקרים.
לכן, המחקר הנוכחי בוחן את ההשערה כי פוספומיצין בשילוב עם מרופנם, ג'נטמיצין או ספטריאקסון מפגין פעילות סינרגטית חוץ גופית נגד מבודדי CRE E. coli.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
סקירה ופרספקטיבה
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
האישור למחקר זה התקבל מוועדת האתיקה למחקר קליני לא-התערבותי של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת דיצ'לה (החלטה מס' 100, תאריך: 01.01.2021).
הפרוטוקול למטה מתאר שיטת לוח משבץ סטנדרטית לדילול אגר להערכת סינרגיה משולבת של פוספומיצין נגד מבודדי E. coli עמידים לקרבפנם.
אוסף מבודדים
בין 15.02.2021 ל-15.12.2021, נכללו בסך הכל 60 זנים עמידים לקרבפנם של E. coli שבודדו מדגימות קליניות שונות (שתן, דם, שאיפה, פצע, נוזל מוח-שדרה ושאיפת אנדוטרכיה) שהתקבלו מאושפזים בבתי החולים של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת דיקל. הזיהוי בוצע באמצעות מערכת ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF. כאשר נמצאו מספר מבודדים מאותו מטופל, נכלל רק הבודד הראשון. דגימות ממרפאות אמבולטוריות ומטופלים שאושפזו פחות מ-48 שעות הוצאו. כל מבודדי E. coli עמידים לקרבפנם שעמדו בקריטריוני הכללה מוגדרים מראש במהלך תקופת המחקר נכללו ברצף; לכן, גודל המדגם נקבע לפי מספר המבודדים הזכאים הקיימים, ולא בוצע חישוב גודל מדגם מראש. E. coli ATCC 13846 ו-E. coli ATCC 25922 שימשו כזני בקרת איכות. זני בקרת איכות נבדקו במקביל לבידוד קליני בתנאי דילול אגר זהים. כל הריצות הוערכו על ידי שני צופים עצמאיים. תוצאות זני בקרת האיכות הראו דפוסי עיכוב צמיחה צפויים בכל הניסויים, ולא נצפו תוצאות מחוץ לטווח או לא תקפות.
כל ההליכים שכללו בידוד קליני בוצעו בתנאי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2). נעשה שימוש בציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה לעיניים), וכל הטיפולים בוצעו בארון בטיחות ביולוגית מוסמך.
זיהוי מינים ובדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית
בוצעו בדיקות עמידות לקרבפנם ורגישות אנטימיקרוביאלית באמצעות מערכת אוטומטית לזיהוי ובדיקת רגישות מיקרוביאלית. התנגדות לקרבפנם שזוהתה על ידי המערכת אושרה באמצעות בדיקות דיפוזיה בדיסקים של ארטפנם, אימיפנם ומרופנם. קוטרי האזורים פורשו לפי נקודות ההפסקה של EUCAST16,17 (טבלה 1). כל הבודדים נשמרו במרק סויה טריפטי שמכיל 20% גליצרול ואוחסן בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
טבלה 1: נקודות שבירה בקוטר אזור בקרבפנמים שנקבעו עבור E. coli באמצעות בדיקת דיפוזיה דיסקית (DDT). קריטריונים פרשניים לדיפוזיית דיסק המשמשים לבדיקת רגישות לקרבפנם. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.
בקבוקי תרבית דם המתאימים לדגימות ילדים ואירוביות הוטמעו במערכת תרבית דם אוטומטית. בקבוקים חיוביים הושתלו בתת-תרבית על אגר EMB, אגר דם כבשים 5% ואגר דקסטרוז סבורו.
דגימות שתן ושאיבת אנדוקטרכאל גודלו בשיטות כמותיות, בעוד שדגימות אחרות עובדו בשיטות חצי-כמותיות. דגימות שאיבת האנדוטרכיה הוערכו באמצעות צביעת גרם, ורק דגימות עם ציון ברטלט > 0 וציון מארי > 3 נחשבו משמעותיות וכללו18.
לדגימות פצע, בוצעה הערכת צביעת גראם לפי מערכת הדירוג Q; מדגמים עם ציון Q גבוה מ-0 נכללו19.
בודדי חיידקים זוהו באמצעות ספקטרומטריית מסה בלייזר בעזרת מטריצה/יינון בזמן טיסה. ציון של ≥2.0 נחשב לאמין לזיהוי ברמת הסוג והמין, בעוד שציונים בין 1.7 ל-2.0 הצביעו על זיהוי אמין ברמת הסוג20,21. רק מבודדים עם ציונים של ≥2.0 נכללו.
קביעת רגישות לפוספומיצין באמצעות שיטת דילול אגר
לפי הוועדה האירופית לבדיקות רגישות אנטימיקרוביאלית (EUCAST), שיטת דילול האגר מומלצת לקביעת רגישות לפוספומיצין אצל בני משפחת Enterobacterales16.
הכנת פוספומיצין ותמיסות אנטיביוטיות נוספות
לשיטת דילול האגר השתמשו באבקת מלח דו-נתרן פוספומיצין הידראט, והשתמשו במים מזוקקים סטריליים ליצירת הדילול. תוכננו שמונה דילולים שונים לכל אנטיביוטיקה, בטווח של פי 4 מתחת ל-3 מעל ערך הגבול MIC שנקבע על ידי EUCAST.
תמיסת מלאי פוספומיצין (המכילה 2560 מיקרוגרם/מ"ל פוספומיצין) הוכנה על ידי המסה של 51.2 מ"ג דיזודן פוספומיצין סטרילי, שחושבה באמצעות נוסחת נפח/משקל/עוצמה (נפח (מיליטר) = משקל (מ"ג) × עוצמה (מיקרוגרם/מ"ג)/ ריכוז (מיקרוגרם/מ"ל)) ונשקלה בתנאים סטריליים, ב-20 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. הריכוז הסופי תוכנן להיות 256 מיקרוגרם/מ"ל, כתוצאה מדילול פי 10 של תמיסת המאגר בעת הוספת MHA.
בהתאם לכך, נקבעו טווחי דילול עבור פוספומיצין (2-256 מיקרוגרם/מ"ל), מרופנם וגנטמצין (0.125–16 מיקרוגרם/מ"ל), וצפטריאקסון (0.0625–8 מיקרוגרם/מ"ל).
הדילול הוכן באמצעות דילול דו-שכבי סדרתיים בצינורות חרוטיים סטריליים המכילים 10 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. בסך הכול בוצעו 7 דילול דו-כיפי סדרתיים בצינורות עד שהגיע לריכוז של 2 מיקרוגרם/מ"ל. ה-10 מ"ל הנותרים בצינור האחרון נזרקו. כתוצאה מכך נוצרו שמונה ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 ו-2 מיקרוגרם למ"ל.
אותה שיטה ששימשה לפוספומיצין שימשה גם לאנטיביוטיקות אחרות להכנת תמיסת המלאי הראשונית. 1.6 מ"ג אנטיביוטיקה אבקתית נשקלה עבור צפטריאקסון ו-3.2 מ"ג עבור מרופנם וגנטמצין באמצעות משקל מדויק. עבור כל אנטיביוטיקה, בוצעו שבעה דילולים. כך הושגו שמונה ריכוזים שונים של דילול אנטיביוטי עבור מרופנם, ג'נטמיצין וספטריאקסון (איור 1).
איור 1: שלבי הכנה של תמיסות דילול פוספומיצין. שלבי דילול סדרתיים המשמשים להשגת ריכוזי עבודה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
הכנת מדיום אגר
מכשיר Mueller-Hinton Agar (CAMHA) מותאם לקטיון הוכן בהתאם להוראות היצרן. הוא עובר חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ו-1 אטמוספירה למשך 15–20 דקות באמצעות אוטוקלאב, ואז נשמר בטמפרטורה של 45–55 מעלות באמבט מים.
כל החומרים הביולוגיים עברו עיקור באמצעות אוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15–20 דקות לפני ההשלכה. פסולת המכילה אנטיביוטיקה הושלכה בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדית ופסולת כימית.
שלב קריטי: שמור על טמפרטורת אגר בין 45–55 מעלות צלזיוס לפני הוספת אנטיביוטיקה. חום מופרז עלול להפחית את פעילות הפוספומיצין ולהשפיע על תוצאות ה-MIC.
הוספת G6P למדיה
כדי לקבוע את רגישות הפוספומיצין, EUCAST ממליצה להוסיף 25 מיקרוגרם/מ"ל גלוקוז-6-פוספט (G6P) לאגר ולמדיום מרק5. לכל ליטר אגר, 25 מ"ג G6P הומסו ב-20 מ"ל MHA, סיננו לעיקור, ואז התערבבו באצווה הראשית של האגר.
הכנת לוחות דילול אגר
כדי לקבוע את ערכי ה-MIC המונותרפיים עבור פוספומיצין, מרופנם, ג'נטמיצין וצפטריאקסון, נעשה שימוש בלוח פטרי אחד לכל דילול (למשל, 8 דילול לפוספומיצין, בטווח של 2–256 מיקרוגרם/מ"ל). ריכוזי האנטיביוטיקה נרשמו על הלוחות.
במחקר המשולב, נרשמו ריכוזי הפוספומיצין והאנטיביוטיקה האחרת שנבדקה על הלוחות (למשל, פוספומיצין 256 מיקרוגרם/מ"ל ומרופנם 32 מיקרוגרם/מ"ל). לכן, הוכנו 64 פלטות לכל שילוב, וריכוז הפוספומיצין והאנטיביוטיקה האחרת ששימשה נרשם על הצלחות. בסך הכל הוכנו 32 לוחות מרופנם-גנטיצינטרי לטיפול מונותרפי ו-192 לשילוב. שרטוט סטנדרטי שכלל 56 ריבועים קטנים בקוטר 1 ס"מ נוצר על משטח שיש. כל הלוחות חוסנו ישירות על ציור זה. לכן, הקריאה והחיסון הפכו לסטנדרטיות (איור 2 ואיור 3).
איור 2: דיאגרמה סטנדרטית שנוצרה לצורכי חיסון וקריאה. שיטה סטנדרטית המשמשת לחיסון והערכה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 3: שיטת הערכה של לוחות דילול אגר. הערכת גידול חיידקים לקביעת MIC. F = פוסומיצין; M = מרופנם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
שני מיליליטרים של תמיסת אנטיביוטיקה עורבבו עם 18 מ"ל של CAMHA מותך כדי לקבל את ריכוז העבודה הסופי. מדיום זה, שהוכן לפי תוספת האריזה של היצרן, קורר ל-45−55 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים. חלק אחד (2 מ"ל) מתערובת האנטיביוטיקה שימש, ו-9 חלקים (18 מ"ל) של MHA מעורבבים בצלחות הפטרי (האנטיביוטיקה דוללה 1/10). נפח צלחת האגר הסופית הוגדר לכ-20 מ"ל לכל צלחת (18 מ"ל אגר + 2 מ"ל תמיסת אנטיביוטיקה), וריכוזי האנטיביוטיקה הסופיים חושבו לאחר הדילול. כך הושגו ריכוזי אנטיביוטיקה בלוחות דילול האגר (2–256 מיקרוגרם/מ"ל לפוספומיצין, 0.0625–8 מיקרוגרם/מ"ל לספטריאקסון, ו-0.125–16 מיקרוגרם/מ"ל למרופנם וגנטמיצין). לוחות שהוכנו מהמדיום ללא תמיסת אנטיביוטיקה שימשו כאמצעי בקרת גדילה (איור 4). התערובות שכללו תמיסת מדיום ואנטיביוטיקה הורשו להתקשות בטמפרטורת החדר.
איור 4: מדיום ביקורת ללא תמיסת אנטיביוטיקה. מדיום ללא אנטיביוטיקה משמש לאישור חיוניות חיידקים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
שלב קריטי: עומק אגר לא אחיד או ערבוב לא מספק של אנטיביוטיקה עלולים להוביל לפרשנות לא מדויקת של MIC ולתוצאות אינטראקציה שגויות.
הכנה וחיסון של מבודדים
זנים טהורים שאוחסנו קודם הועברו לאגר דם כבשים של 5% בטמפרטורת החדר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16–24 שעות. מושבות מתרביות טריות הושעו בתמיסת מלח סטרילית, והושגה עכירות של 0.5 מקפרלנד באמצעות קורא אופטי.
שיטת דילול האגר דרשה חיסון חיידקי של כ-104 CFU לכל כזה. ערך של 0.5 מקפרלנד מכיל כ-108 CFU/מ"ל של חיידקים. צפיפות חיידקים של 107 CFU/mL הושגה על ידי דילול התמיסה ביחס 1:10 עם מי מלח סטריליים.
2 מיקרוליטר מכל מתלה חיידקי נאספו מהצינור באמצעות פיפטה אוטומטית. נפח זה מתייחס לכ-2 × 104 CFU לכל נקודה. החיסון בוצע באזורים ממוקדים במשטח האגר, החל מהפלטה המכילה את ריכוז הפוספומיצין הנמוך ביותר והתקדמה לגבוהה.
לכן, החיסון הוגדר כ-CFU לכל נקודה, כאשר כל נקודת חיסון מכילה כ-104 CFU. החיסון של כל תחום חיידקי הושלם תוך 15 דקות.
לפני החיסון לפלטות המכילות פוספומיצין, חוסן לוח בקרה לצמיחה כדי לבדוק זיהום. החיסון התייבש בטמפרטורת החדר. הדגירה בוצעה בטמפרטורה של 35–37 מעלות צלזיוס למשך 16–24 שעות בתנאים אירוביים, והעכירות נמדדה באמצעות מד צפיפות מכויל.
צפיפות אינקולום מופרזת עלולה לגרום לצמיחה מאוחרת ולקושי בקביעת נקודת קצה. כוונו מחדש את העכירות ל-0.5 מקפרלנד וחזרו על החיסון אם מתרחשת צמיחה מתקרבת.
בדיקות משולבות
נעשה שימוש באנטיביוטיקה אבקתית מרופנם, פוספומיצין, גנטמיצין, צפטריאקסון וגלוקוז-6-פוספט.
כמויות האנטיביוטיקה חושבו באמצעות נוסחת נפח/משקל/עוצמה. לאחר הכנת תמיסות המלאי, הוכנו תמיסות אנטיביוטיות בריכוזים של שלוש דילול כפול מעל וארבע דילול כפול מתחת לטווח הרגיש של MIC. טווחי הדילול חושבו כ-2–256 מיקרוגרם/מ"ל עבור פוספומיצין, 0.0625–8 מיקרוגרם/מ"ל עבור צפטריאקסון, ו-0.125–16 מיקרוגרם/מ"ל לגנטמצין ומרופנם (טבלה 2, טבלה 3 וטבלה 4).
טבלה 2: הכנת תמיסות אנטיביוטיות לשילוב פוספומיצין-גנטמיצין. שלבי הכנה וריכוזים המשמשים לתמיסות מלאי ועובדות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.
טבלה 3: הכנת תמיסות אנטיביוטיות לשילוב פוספומיצין-מרופנם. שלבי הכנה וריכוזים המשמשים לתמיסות מלאי ועובדות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.
טבלה 4: הכנת תמיסות אנטיביוטיות לשילוב פוספומיצין-ספטריאקסון. שלבי הכנה וריכוזים המשמשים לתמיסות מלאי ועובדות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.
במחקר זה, הוכנו תמיסות נפרדות של מלאי פוספומיצין לניסויים מונותרפיים ומשולבים כדי לפצות על הבדלים בגורמי הדילול הסופיים במהלך בדיקות מבוססות אגר. תמיסה סטנדרטית שימשה בניסויים מונותרפיים, בעוד שתמיסת סטוק מותאמת בריכוז גבוה יותר שימשה לניסויים משולבים כדי לפצות על הדילול הנוסף במהלך ערבוב אנטיביוטיקה.
פתרונות סטנדרטיים הוכנו כשלב הראשוני לדילול סדרתי. עבור פוספומיצין, 256 מ"ג אבקה נשקלו במדויק באמצעות איזון אנליטי בתנאים סטריליים והומסים ב-50 מ"ל מים מזוקקים סטריליים עם ערבוב רציף (ערבוב מגנטי) עד שהושגה התמוססה מלאה, מה שהוביל לריכוז סופי של 5120 מיקרוגרם/מ"ל פוספומיצין דיזודיום. הוכנו תמיסות נפרדות של ג'נטמיצין, מרופנם וצפטריאקסון.
לדילול כפול סדרתיים, הוכנו שבעה צינורות חרוטיים סטריליים המכילים 25 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. מהתמיסה המקורית, 25 מ"ל הועברו לצינור הראשון באמצעות פיפטה מתכווננת, ואחריה העברה רציפה לצינורות הבאים להשגת דילול סדרתי כפול. כל צינור עורבב היטב עם מערבל מערבולת למשך 5–10 שניות לאחר כל שלב העברה. מהצינור הסופי, 25 מ"ל הושלכו כדי לשמור על נפחים שווים. בדרך זו התקבלה סדרת דילול, שהניבה ריכוז נמוך ביותר של 40 מיקרוגרם/מ"ל, וסך הכל הוכנו שמונה ריכוזי פוספומיצין שונים.
אותו הליך הוחל גם על ג'נטמיצין, מרופנם וצפטריאקסון. עם זאת, בשל הבדלים בטווחי הריכוז היעד, 16 מ"ג גנטמצין ומרופנם (לטווח של 0.125–16 מיקרוגרם/מ"ל) ו-8 מ"ג צפטריאקסון (בטווח של 0.0625–8 מיקרוגרם/מ"ל) נשקלו והוססו בנפרד במים מזוקקים סטריליים בנפח 50 מ"ל בתנאים אספטיים בטמפרטורת החדר. בוצעו דילול כפול סדרתי כפי שתואר לעיל. הריכוזים הנמוכים ביותר הסופיים היו 2.5 מיקרוגרם/מ"ל לגנטמצין ומרופנם, ו-1.25 מיקרוגרם/מ"ל עבור ספטריאקסון. לכל אנטיביוטיקה הוכנו שמונה שפופרות המכילות 25 מ"ל בריכוזים שונים. מכיוון שנבדק פוספומיצין בשילוב עם שלוש אנטיביוטיקה, הוכנו בסך הכל 24 חצוצרות דילול פוספומיצין (8 × 3).
להכנת אגר, 18 מ"ל אגר מולר–הינטון בתוספת גלוקוז-6-פוספט (25 מיקרוגרם/מ"ל) קיררו מראש ל-45–50 מעלות צלזיוס וחולקו לצלחות פטרי סטריליות. לאחר מכן נוספו 1 מ"ל תמיסת פוספומיצין ו-1 מ"ל מהתמיסה האנטיביוטית השנייה באמצעות פיפטות סטריליות. הלוחות ערבבו בעדינות בסיבוב מעגלי כדי להבטיח פיזור הומוגני ואפשרו להם להתגבש בטמפרטורת החדר. עקב ערבוב בנפח שווה והוספת אגר, ריכוזי האנטיביוטיקה ירדו בכ-9 פעמים.
לצורך בדיקות משולבות, 1 מ"ל מהריכוז הנמוך ביותר של הפוספומיצין (40 מיקרוגם/מ"ל) שולב עם 1 מ"ל מכל אחד משמונה דילול הגנטמיצין (2.5–320 מיקרוגרם/מ"ל), ואז נוסף לצלחות פטרי נפרדות וערבב בעדינות. אותו הליך חזר על עצמו בריכוז הפוספומיצין הבא (80 מיקרוגרם/מ"ל), והמשך שלב בשלב עד 5120 מיקרוגרם/מ"ל, כדי להבטיח שכל שילובי הריכוז האפשריים נבדקו. קצה פיפטה סטרילי חדש שימש בכל העברה כדי למנוע זיהום צולב. בסך הכל הוכנו 64 מנות פטרי (8 × 8 שילובים) לשילוב פוספומיצין–ג'נטמיצין (טבלה 5).
אותו הליך הוחל על פוספומיצין בשילוב עם מרופנם וצפטריאקסון, וכתוצאה מכך נוצרו 64 פלטות לכל שילוב אנטיביוטי (טבלה 6 וטבלה 7).
טבלה 5: סידור השילוב של פוספומיצין-ג'נטמיצין על מדיום MHA. סידור ריכוזי האנטיביוטיקה על אגר מולר–הינטון. FF = פוספומיצין; GN = ג'נטמיצין. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.
טבלה 6: סידור שילוב פוספומיצין-מרופנם על מדיום MHA. סידור ריכוזי האנטיביוטיקה על אגר מולר–הינטון. FF = פוספומיצין; MEM = מרופנם. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.
טבלה 7: סידור השילוב של Fosfomycin-Ceftriaxone על מדיום MHA. סידור ריכוזי האנטיביוטיקה על אגר מולר–הינטון. FF = פוספומיצין; CRO = צפטריאקסון. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.
לאחר הכנת תערובות האנטיביוטיקה, נוספו 18 מ"ל אגר מולר–הינטון מותך (45–50 מעלות צלזיוס) לכל צלחת שהכילה 1 מ"ל תערובת האנטיביוטיקה, כדי להבטיח שתנאי הטמפרטורה לא יפגעו בפעילות האנטיביוטיקה. כתוצאה מכך, התבצעה דילול של תמיסת האנטיביוטיקה הראשונית בכ-9 פעמים.
להערכה שיטתית, הלוחות סודרו בפורמט לוח שחמט (דילול דו-ממדי). ריכוזי הפוספומיצין אורגנו לאורך הציר האנכי (שורות A–H), כאשר הריכוז הגבוה ביותר בשורה A וריכוזים יורדים לכיוון שורה H. האנטיביוטיקה השנייה סודרה לאורך הציר האופקי (עמודות 1–8), עם ריכוזים הולכים וגדלים מעמודה 1 לעמודה 8. לכן, כל מיקום שקול היטב ייצג שילוב ייחודי של שני ריכוזי אנטיביוטיקה, מה שאפשר הערכה מקיפה של השפעות האינטראקציה.
הערכת תוצאות
תוצאות ריכוז מעכב מינימלי הוערכו בהתאם להמלצות EUCAST v.11. לוחות בקרת צמיחה הראו צמיחה נראית לעין, בעוד שפלטות בקרת סטריליות (לא מחוסנות) לא הראו צמיחה. ה-MIC הוגדר כרכוז הנמוך ביותר שבו לא התרחש גדילה נראית לעין. לצורך בדיקות שילוב, השפעות האינטראקציה פורשו באמצעות ערכי FICI. הסינרגיה הוגדרה כ-FICI ≤ 0.5, אדישות > 0.5–4, ואנטגוניזם כ-> 4. עבור פוספומיצין, ערכי MIC ≤ 32 מיקרוגרם/מ"ל נחשבו רגישים, וערכי > 32 מיקרוגרם/מ"ל נחשבו עמידים. עבור גנטמצין ומרופנם (בזיהומים בדלקת קרום המוח), ערכי MIC ≤ 2 מיקרוגרם/מ"ל נחשבו רגישים, וערכי > 2 מיקרוגרם/מ"ל נחשבו עמידים. עבור מרופנם (בזיהומים שאינו מנינגיטיס), ערכי MIC ≤ 2 מיקרוגרם/מ"ל נחשבו רגישים. ערכים > 8 מיקרוגרם/מ"ל נחשבו עמידים, MIC ≤ 1 מיקרוגרם/מ"ל לצפטריאקסון (לזיהומים שאינם מנינגיטיס) נחשבו לרגישים, ≤ MIC של 2 מיקרוגרם/מ"ל לצפטריאקסון (לזיהומים בדלקת קרום המוח) נחשבו לרגישים, ו-MIC > 1 מיקרוגרם/מ"ל לצפטריאקסון (לזיהומי מנינגיטיס) נחשבועמידים 16.
ניתוח סטטיסטי של נתוני המחקר בוצע באמצעות תוכנה סטטיסטית.
סטטיסטיקה: משתנים קטגוריים הוצגו כמספרים ואחוזים. מבחן החי-ריבוע של פירסון שימש להשוואות שבהן כל ספירות התאים הצפויות היו ≥5. המבחן המדויק של פישר שימש לניתוחים עם גודל מדגם קטן או כאשר ספירת התאים הצפויה הייתה <5. באופן ספציפי, מבחן החי-ריבוע שימש להשוואות כלליות של שיעורי עמידות לפוספומיצין, בעוד שמבחן מדויק של פישר שימש לניתוחי תת-קבוצות של קצבי אינטראקציה סינרגטיים, מצטברים ואנטגוניסטיים הנובעים מהתפלגויות בתדירות נמוכה בשילובים מסוימים. ערך P ≤ 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
הערת פרשנות: מושבות זעירות בודדות בתוך אזורי עיכוב לא נחשבו כגדלות אלא אם כן הן מתחברות או ניתנות לשחזור בבדיקות חוזרות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מסקנות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
בסך הכול נכללו במחקר 60 בודדים עמידים לקרבפנם של E. coli. כל הבידודים התקבלו ממטופלים שאושפזו ביחידות טיפול נמרץ או במחלקות קליניות של בתי החולים של הפקולטה הרפואית של אוניברסיטת דיצ'לה. מטופלים מבוגרים היוו 83.3% מהמקרים, בעוד שילדים היו 16.7% (טבלה 8 וטבלה 9). עמידות לרב-תרופתית נצפתה ב-80% (n = 48) מבודדים.
טבלה 8: התפלגות מבודדי E. coli לפי מיקום אשפוז וגיל. טיפול נמרץ = יחידת טיפול נמרץ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
המחברים מצהירים שאין ביניהם ניגוד עניינים.
תודות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
מחקר זה נתמך על ידי יחידת תיאום פרויקטי מחקר מדעי של אוניברסיטת דיצ'לה (DÜBAP) עם מספר פרויקט SBE.21.004.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה