פרוטוקול זה מעריך ניקוז לימפה לאחר שבר על ידי שילוב הדמיה אינדוציאנית ירוקה (ICG) קרובה לאינפרא-אדום עם אולטרסאונד, כדי לכמת את ניקוי ה-ICG הפלנטרי ואת הגדלת בלוטות הלימפה הפופליטאלית בעכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מעריך ניקוז לימפה לאחר שבר על ידי שילוב הדמיה אינדוציאנית ירוקה (ICG) קרובה לאינפרא-אדום עם אולטרסאונד, כדי לכמת את ניקוי ה-ICG הפלנטרי ואת הגדלת בלוטות הלימפה הפופליטאלית בעכברים.
שברים טראומטיים מלווים לעיתים קרובות בפגיעה בתפקוד הניקוז הלימפתי. ירידה בניקוז הלימפה ובהתרחבות בלוטות הלימפה לאחר השבר מעידים על תהליכים דינמיים מתמשכים של תגובה דלקתית חריפה וגיוס תאי חיסון. מאמר זה מתאר שיטה שבה הוזרק 6 מיקרוליטר של 0.2 מ"ג/מ"ל אינדוציאנין גרין באופן תוך-עורי לאזור כף הרגל של עכברים שעברו ניתוח מזויף או שבר טיביה. הדמיית פלואורסצנציה קרובה באינפרא-אדום כמותה את אות ה-ICG הפלנטרי ב-0 ו-24 שעות כדי לחשב את קצב הניקוי של 24 שעות כקריאה של ניקוז לימפה של עכברים. אולטרסאונד שימש במקביל לשחזור תלת-ממדי של בלוטות הלימפה הפופליטאליות (PLNs), השוואת נפחי השלטון והערכת הגדלה הנגרמת משבר. התוצאות הראו כי לאחר השבר, קצב הפינוי הלימפה ירד משמעותית, עוצמת הפלואורסצנציה של ICG באזור כף הרגל הייתה גבוהה משמעותית, ונפח ה-PLNs גדל משמעותית. בהשוואה לשיטות קודמות למדידת מערכת הלימפה, כגון חתכים היסטופתולוגיים או לימפוסינטיגרפיה, שלרוב לא מצליחות להשיג תצפית חי, דינמית ורציפה, שיטה זו מראה יציבות ושחזור גבוהות. ראוי לציין כי הוא מאפשר ניטור דינמי בחיים של תפקוד ניקוז לימפה, ומספק תמיכה טכנית איתנה לחקירת שינויים בריפלוקס לימפתי במודלים של שברים.
שברים טראומטיים גורמים לעיתים לנזק משמעותי לנפיחות ברקמות, ומגבירים את הסיכון לסיבוכים כמו זיהום, נמק ואי-איחוד עצם 1,2. Grzegorz Szczesny ואחרים הראו כי תפקוד לקוי של ניקוז לימפה, המוביל לבצקת רקמה, קשור לעיכוב בהחלמה3. מחקרים מראים שבמהלך תהליך ההחלמה של השבר, בנוסף לתיקון רקמת העצם, מערכת הלימפה באתר השבר ממלאת גם תפקיד חשוב. כלי הלימפה אחראים לא רק לניקוז נוזל אינטרסטיציאלי ולמניעת נפיחות, אלא גם על ויסות נדידת תאי מערכת החיסון וניקוי פסולת מטבולית. עם זאת, בשלבים המוקדמים של השבר, גורמים פרו-דלקתיים כגון TNF-α, IL-1, IL-6 ופקטור מגרה מושבת מקרופאגים (MCSF) עלולים לפגוע בתאי אנדותל לימפהיים5, מה שמוביל לשינויים פתולוגיים כגון נייוון, בצקת ופיברוזיס6. מחקרים רלוונטיים הראו נוכחות של תאי אנדותל לימפה בעצם ובפריאוסטאום, וכן ברקמות השומן והשרירים הסובבות. בנוסף, ניקוז לימפה משתתף גם בוויסות המיקרו-סביבה של המטומה לאחר שבר; ניקוז לימפה יעיל מסייע להישרדות האוסטאובלסטים ולהתרבות תאי גזע מזנכימליים של מח עצם (BMSCs)7. במהלך שבר, הגורמים הפרו-דלקתיים (TNF-α, IL-1 ו-IL-6) וגורמי הגדילה (TGFβ1 ו-PDGF) המיוצרים על ידי תאי מערכת החיסון באתר הפגוע הם גורמים רגולטוריים חשובים לאפופטוזיס של האוסטאובלסט ולהתרבות BMSC8. חוסיין ארסלאן וחוקרים נוספים אישרו את ההשפעה השלילית של בצקת לימפה על האוסטאובלסטים. ממצאי מחקר אלו מדגישים את התפקיד החשוב של ניקוז הלימפה בריפוי שברים. התקדמות אחרונה בהדמיית פלואורסצנציה של ICG באינפרא-אדום קרוב (NIR) אפשרה תצפית לא פולשנית בזמן אמת על דינמיקת זרימת הלימפה במודלים של בעלי חיים ובבני אדם 9,10,11. טכניקה זו מאפשרת הערכה כמותית של התכווצות כלי הלימפה, מהירות הניקוז ושלמות המסלול10,11. מחקר שהשתמש במודלים של עכברים של דלקת מפרקים ודלקת הראה כי הדמיה ב-ICG-NIR יכולה להבחין בין תגובות לימפה חריפות וכרוניות, ולהדגיש דפוסי ניקוז מובחנים במהלך פגיעת רקמות והחלמה. יתרה מזאת, הוכח כי דימות לימפה של NIR יעיל במעקב אחר התאוששות תפקודית לאחר ניקוז לימפתי ידני ולהערכת יעילות טיפולים ממוקדי לימפה. אולטרסונוגרפיה מספקת שיטה כמותית משלימה להערכת המורפולוגיה והנפח של בלוטות הלימפה המנקזות, וכן בצקת רקמה הקשורה לפגיעה בניקוז לימפתי. השילוב של הדמיית פלואורסצנציה של NIR עם אולטרסאונד מאפשר הערכה מקבילה של תפקוד הלימפה ושינויים אנטומיים, ומספק גישה רב-מודלית לחקר דינמיקת הלימפה ב-vivo. למרות ההכרה הגוברת בתפקיד הקריטי של תפקוד לקוי לימפה בריפוי פוסט-טראומטי, שיטות סטנדרטיות וניתנות לשחזור להערכת ניקוז לימפה לאחר שברים עדיין חסרות. רבות משיטות ההדמיה הנוכחיות הן פולשניות, חסרות רזולוציה מרחבית מספקת, או אינן מצליחות לעקוב דינמית אחר זרימת הלימפה. לכן, פיתוח פרוטוקול המשלב ICG-NIR ודימות אולטרסאונד צפוי לטפל בחסרון המתודולוגי הזה ולספק כלי יעיל להערכת התאוששות לימפה ותרומתה לתיקון העצם.
מחקר זה מציג מסגרת חדשנית המשלבת הדמיית פלואורסצנציה של ICG-NIR עם אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה להערכת ניקוז לימפה לאחר שברים בשוק העכברים. גישה זו מאפשרת ניתוח חצי-כמותי של יעילות הניקוז ומודדת את נפח בלוטות הלימפה במהלך תהליך החלמת השבר. יש לו גם כמה מגבלות. ראשית, ICG-NIR משמש בעיקר להערכת כלי לימפה שטחיים, ויכולת ההדמיה שלו למבנים עמוקים יותר מוגבלת. שנית, למרות ששינויים בנפח בלוטות הלימפה מספקים מידע מסוים, הם חסרי ספציפיות ואינם יכולים להחליף באופן מלא מדידות פונקציונליות ישירות. לשיטה זו יש פוטנציאל תרגומי משמעותי ומשפרת את הבנתנו את תפקוד הלימפה בהתחדשות העצם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של מרכז האורגניזמים המודלים של שנגחאי (אישור מס' NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). עכברים זכרים מסוג C57 עם מודל שבר (גיל 6–8 שבועות) שימשו במחקר זה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.
1. טיפול טרום-ניתוחי
2. הליך ניסויי
הערה: יש לאחד את הגדרות ההרדמה, מינון ונפח ICG, אתר ועומק ההזרקה, זמן החשיפה, הגדרת ROI ופרמטרי סריקת אולטרסאונד בכל המפגשים כדי למזער שונות בין בעלי חיים.
3. טיפול לאחר ניתוח
4. הערכה
הערה: בקש חוקר עיוור להקצאת קבוצות לבצע רכישת תמונות וניתוחים כמותיים, ולשמור על כל מערכי הנתונים מקודדים עד להשלמת הניתוחים הסטטיסטיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בימים 1, 7 ו-14 לאחר הקמת מודל השבר, עוצמת הפלואורסצנציה של כף הרגל של 24 שעות (FI24h) בקבוצת השבר הייתה גבוהה בעקביות מזו שבקבוצת הניתוח המזויף (איור 3). ניתוח כמותי יחסי של עוצמת הפלואורסצנציה של ICG מתמונות כף הרגל שנאספו הראה כי שיעור ניקוי ה-ICG הלימפתי בקבוצת השבר היה נמוך משמעותית מזה שבקבוצת הניתוח המדומה (p < 0.05) (איור 4). בינתיים, אולטרסונוגרפיה תלת-ממדית במצב B גילתה שנפח בלוטות הלימפה הפופיליטאל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הפרוטוקול כולל כמה פרטים שקל להתעלם מהם. לדוגמה, זמן החשיפה אינו קבוע ויש לקבוע אותו על פי עוצמת הפלואורסצנציה הספציפית. עם זאת, זמן החשיפה של אותה קבוצת עכברים ב-0 ו-24 שעות חייב להישאר עקבי; אחרת, התוצאות עלולות להיות לא אמינות. כאשר משתמשים באולטרסאונד לתצפית, חשוב לכסות במלואם את הגפיים התחתונות של העכבר בחומר קישור, שכן כל אזור חשוף יגרום לעיוות בתמונות המתקבלות כאשר הגשוש סורק את האזורים הללו. במהלך הסריקה, הגפיים התחתונות של העכבר אמורות להישאר יציבות. המפעיל יכול לייצב את העכבר ע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע (82174407 ל-YJZ), תוכנית הכשרת מנהיגי דיסציפלינר של ועדת הבריאות החדשה של שנחאי פודונג (PWRd2020-05), פרויקט מנהיגי המשמעת של ועדת הבריאות החדשה של פודונג (PWRq2020-56), ופרויקט הרפואה סאנמינג של שנזן (מס' SZZYSM202311006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10 מיקרוליטר מזרק מיקרו | חברת המילטון | 80330/00 | המזרק המיקרו Hamilton 80330/00 הוא מכשיר מדויק עם קיבולת של 10 L, הכולל מחט מידה 26s, אורך 51 מ"מ, וסגנון נקודה 2. הוא מיועד למסירה מדויקת של נפחים קטנים בכרומטוגרפיה, הזרקת דגימות ויישומי כימיה אנליטית. |
| מערכת הדמיית אולטראסאונד תלת-ממדית Vevo 3100 | Vevo 2100 | ה- Vevo 2100 הוא מערכת הדמיית אולטראסאונד בתדר גבוה למחקר פרה-קליני, המספקת ויזואליזציה בזמן אמת של בעלי חיים קטנים. היא מציעה רזולוציה עליונה למחקרים בקרדיולוגיה, אונקולוגיה וביולוגיה התפתחותית, המשולבת עם תוכנת Vevo LAB לניתוח נתונים. | |
| 75% אתנול | חברת Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | G73537O | אתנול 75% הוא תמיסת חיטוי המשמשת באופן נרחב במעבדות לעיקור משטחים, ניקוי ציוד ואנטיספסיס. הוא הורג ביעילות חיידקים, וירוסים ופטריות באמצעות דנטורציה של חלבונים ונפוץ בהגדרות ביולוגיות וקליניות. |
| מטלית כותנה | חברת Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd. | 20250303 | מטליות כותנה הן אפליקטורים סטריליים וסופגים המשמשים לאיסוף דגימות מדויק, יישום פתרונות או ניקוי בהליכים רפואיים, אבחוניים ומעבדתיים. הם כוללים מקלות עץ או פלסטיק עם קצות כותנה לטיפול היגייני. |
| חומר צימוד | חברת Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd. | 20241029 | חומר צימוד, המכונה בדרך כלל ג'ל אולטראסאונד, הוא מדיום מבוסס מים המשמש לשיפור העברת האקוסטיקה בין מתמר האולטראסאונד לעור. הוא מבטל כיסי אוויר לצורך הדמיה ברורה, אינו מעצבן, מסופק במיכל של 250 מ"ל לשימוש רפואי ואבחוני. |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | Prism 10 | תוכנת גרפים סטטיסטית מדעית המשמשת לניתוח נתונים, הדמיה והצגת נתונים. |
| Image J | המכונים הלאומיים לבריאות | ImageJ 1.54d | תוכנית עיבוד ואנליזה של תמונות מבוססת Java ברשות הציבור המשמשת באופן נרחב לניתוח תמונות ביולוגיות ורפואיות. |
| אינדוציאנין ירוק | חברת Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd. | 8305128 | אינדוציאנין ירוק הוא צבע אניוני מסיס במים המשמש באבחון רפואי לקביעת תפוקת הלב, תפקוד הכבד, זרימת דם בכבד ואנגיוגרפיה עינית. הוא מסופק בבקבוקונים של 25 מ"ג למתן תוך ורידי ומציג פלואורסצנציה בספקטרום האינפרא-אדום הקרוב לצורך הדמיה. |
| איזופלוראן | RWD | R650-IE | איזופלוראן הוא הרדמה כללית נשמפת. יש לו מקדם חלוקת דם/גז קטן. כאשר משתמשים בו להרדמת בעלי חיים, הוא יכול לגרום להרדמה בצורה חלקה, מהירה ונוחה, עם התאוששות מהירה, הרפיה שרירים טובה וללא השפעה מרגשת על מערכת העצבים הסימפתטית. קצב חילוף החומרים של איזופלוראן בכבד הוא נמוך, כך שיש לו מעט רעילות לכבד, ואין תופעות לוואי ברורות אפילו עם שימוש חוזר. כדי למנוע את ההשפעות השליליות של גז פסולת הרדמה על הסביבה ועל אנשי המעבדה, מומלץ להשתמש בו יחד עם מערכת התאוששות גז. |
| מיקרו-איזון | חברת Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd. | FA1004B | המיקרו-איזון FA1004B הוא מכשיר ניתוח דיוק גבוה המיועד לשקילה מדויקת של דגימות קטנות, המציע קריאות עד 0.0001 גרם ומתאים ליישומים במעבדה הדורשים מדידות מדויקות במחקר ובקרת איכות. |
| מערכת הדמיה אינפרא-אדום קרובה | אולימפוס | MVX10 | ה- Olympus MVX10 הוא מערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגדילה מאקרו המותאמת להדמיה אינפרא-אדום קרובה. הוא מציע ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של דגימות גדולות עם טווח זום רחב, אופטיקה מתקדמת לחדירה עמוקה לרקמות ותאימות עם טכניקות פלואורסצנטיות במחקר ביולוגי וחומרים. |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.