הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השפעות טיפוליות של נוסחת Shengdu Pingmu על עצירות הנגרמת על ידי לופרמיד בעכברים באמצעות איתות PI3K/AKT וויסות מיקרוביוטה במעי

124 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70470

⸱

12 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, 2Guangzhou University of Chinese Medicine,, 3Shenzhen Luohu Hospital of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מראה כי נוסחת פנגמו של שנגדו מפחיתה עצירות בעכברים על ידי הגברת תכולת מי הצואה והנעת המעי. ההשפעות קשורות להפעלת מסלול PI3K/AKT, להגברת AQP3 ו-AQP8, ולוויסות הרכב המיקרוביום במעי.

תקציר

עצירות היא הפרעה נפוצה במערכת העיכול, והטיפולים הנוכחיים לעיתים קרובות מוגבלים. נוסחת שננגדו פינגמו (SDPF), נוסחה מותאמת שמקורה ברפואה הסינית המסורתית, שימשה קלינית לטיפול בעצירות, אך מנגנון הפעולה שלה נותר לא ברור. מחקר זה השתמש בניתוח UPLC-Q/TOF-MS לזיהוי 188 תרכובות ב-SDPF, מתוכן 50 אושרו באופן סופי. בניסויים בבעלי חיים, טיפול ב-SDPF שיפר משמעותית את ההנעה של המעיים, הגדיל את תכולת מי הצואה וקיצר את הזמן עד לצואה שחורה ראשונה. פרמקולוגיה רשתית וניתוחי עגינה מולקולרית הצביעו על מעורבות מסלול PI3K/AKT, אשר אומת לאחר מכן על ידי הגברת המסלול והגברת הביטוי של AQP3 ו-AQP8 ברקטום. יתרה מזאת, ריצוף גנים של 16S rRNA גילה כי SDPF שיקם את ההומאוסטזיס של מיקרוביוטי המעי על ידי הגברת חיידקים מועילים כמו לקטובצילוס ובקטרואידים תוך הפחתת חיידקים הקשורים לדלקת. ביחד, SDPF מקל ביעילות על עצירות באמצעות מנגנונים שמווסתים את מסלול PI3K/AKT ומווסתים את המיקרוביום במעי.

מבוא

עצירות היא הפרעה במערכת העיכול נפוצה המתאפיינת ביציאות לא תכופות, מאמץ וצואה קשה, המשפיעה על כ-20% מהאוכלוסייה העולמית עם השלכות חברתיות-כלכליות משמעותיות1. עצירות כרונית לא רק גורמת לסיבוכים פיזיים כמו טחורים, סדקים פי הטבעת והחסימה בצואה, אלא גם תורמת למצוקה נפשית, כולל חרדה ודיכאון, ופוגעת קשות באיכותהחיים של המטופלים. טיפולים קונבנציונליים, כולל משלשלים אוסמוטיים ותוספי סיבים תזונתיים, לעיתים קרובות מניבים תוצאות לא אופטימליות בשל יעילות מוגבלת, תופעות לוואי פוטנציאליות וסיכון לתלות3. הרפואה הסינית המסורתית (TCM) מציעה גישה הוליסטית, תוך שימוש בנוסחאות צמחיות ובדיקור סיני לוויסות תנועתיות המעיים על ידי שיקום זרימת הצ'י וההומאוסטזיס הוויזרלי4. עם זאת, היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים ובהירות מכנית מגבילים את האימוץ הקליני הרחב יותר. מחקרים מתפתחים מדגישים את הפוטנציאל של התערבויות חדשניות, כגון מודולציה של מיקרוביום במעי ותרכובות ביואקטיביות שמקורן ב-TCM, אשר עשויות לשפר באופן סינרגטי את תפקוד המעי עם מינימום תופעות לוואי5. כתוצאה מכך, פיתוח טיפול אינטגרטיבי מבוסס ראיות המשלב עקרונות הרפואה הסינית הסינית עם תרופות מודרניות מבטיח מהפכה בניהול עצירות.

עצירות במעבר איטי (STC) היא מודל פתולוגי חיוני במחקר בסיסי, המדמה ביעילות את הפרעת התנועתיות המרכזית של עצירות אנושית — מעבר מעי גס מאוחר משמעותית6. היא משמשת כ"מפענח" להבהרת המנגנונים המולקולריים של עצירות, ומאפשרת לחוקרים לבחון ישירות שינויים פתולוגיים ברקמה הרקטלית7, במערכת העצבים האנטרית8, בתאי האינטרסטיציאליים של קחל9 ובמסלולי איתות מרכזיים10, ובכך לגשר בין תסמינים מקרוסקופיים לחריגות תאיות ומולקולריות שמעבר להישג ידם של מחקרים קליניים11. ברמה הבינלאומית, שיטות מבוססות לפיתוח מודלים של חולדות STC כוללות בעיקר גישות כימיות12, במיוחד שימוש בלופרמיד — אגוניסט קולטני אופיאטים היקפיים שמדכא פעילות נוירונית ושחרור אצטילכולין כדי לגרום למעבר מאוחר בעקביות בתוך 5–7 ימים — ואסטרטגיות מחקות אתיולוגיה13, כגון מתן משלשל ממריץ במינון גבוה לטווח ארוך, המוביל לפגיעה בעצב המעי הגס, מלנוזה קולי, ואינרציה המעי הגס התלויה במשלשלים. לכן, מודל העכברים של STC לא רק מציע חלון לאתיולוגיה המורכבת של עצירות, אלא גם משמש כגשר חיוני שמחבר בין תובנות מכניות בסיסיות ליישומים קליניים.

נוסחת שנגדו פינגמו (SDPF), הכוללת את Radix Paeoniae Alba (ביישאו), Curcuma longa (ג'יאנגחואנג), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) ו-Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian), היא תכשיר בית חולים מותאם שמקורו בתיאוריה של הרפואה הסינית המסורתית ומשמש כבר זמן רב במחלקה שלנו לטיפול בהפרעות קשורות. תצפיות קליניות ראשוניות מבית החולים שלנו הצביעו על כך ש-SDPF עשוי להקל על תסמיני עצירות (נתונים שלא פורסמו). מחקרים הראו כי מסלול האיתות PI3K/AKT מעורב בוויסות תנועתיות המעי הגס14, שבו מיקרוביום המעי והמטבוליטים שלהם עשויים למלא תפקיד קריטי על ידי ויסות פעילות עצבית ושריר חלק15. עם זאת, המנגנונים הרגולטוריים המדויקים נותרו לא מובנים במלואם. אנו מציעים שמסלול PI3K/AKT ומיקרוביוטת המעי יחד יוצרים ציר חיוני לוויסות תנועתיות המעי הגס. ישנה השערה כי ההשפעות הטיפוליות של נוסחאות TCM על דיסמוטיליות המעי הגס עשויות להיות קשורות למודולציה של מסלול PI3K/AKT ולאיזון מחדש של ציר המיקרוביוטה-מעי. מחקר זה פותר פער זה על ידי הצעת ובדיקת השערה חדשה ומשולבת: שמסלול PI3K/AKT ומיקרוביום המעי פועלים כציר קריטי ותלוי זה בזה לתנועתיות המעי הגס. המטרה העיקרית של עבודה זו היא לקבוע האם ההשפעה הטיפולית של SDPF על עצירות איטית מתווכת דרך המודולציה הכפולה של ציר זה. באופן ספציפי, באמצעות מודל עכברוש, חקרנו את השפעות SDPF על חלבוני איתות PI3K/AKT מרכזיים, שינויים בהרכב המיקרוביוטה במעי ותפקוד תנועתיות המעי הגס. על ידי הבהרת מנגנון משולב זה, מחקר זה מספק, למיטב ידיעתנו, את הראיות הניסיוניות הראשונות לציר מיקרוביוטה-PI3K/AKT כמטרה מאוחדת של התערבות מבוססת TCM, ובכך מציע בסיס מולקולרי מקיף יותר לטיפול בהפרעות תנועתיות המעי הגס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (המכונים הלאומיים לבריאות, עדכון 2011) ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת שאנדונג לרפואה סינית מסורתית (מספר רישיון אתיקה לרווחה: SDUTCM20250421238).

הכנת SDPF
תערובת הצמחים מורכבת מ-Radix Paeoniae Alba (ביישאו) 20 גרם, Curcuma longa (ג'יאנגחואנג) 10 גרם, Rhizoma Cibotii (Tanggouji) 10 גרם, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 גרם, ו-Clematis chinensis Osbeck (ויילינגשיאן) 30 גרם. יחס השילוב הזה נקבע על סמך ניסיון קליני. הנוסחה הופקה תחילה על ידי השרייה במים דה-יוניים ביחס מוצק לנוזל של 1:9 (גרם/מ"ל) למשך 30 דקות, ולאחר מכן הרתיחה למשך 60 דקות. התמיסה שהתקבלה עברה סינון מיידי דרך גזה וצונטריפוגה ב-4,500 × גרם למשך 5 דקות לאיסוף הסופרנטנט. השאריות נלקחו פעמיים באותם תנאים (יחס של 1:9, מים דה-יוניים) עם זמן רתיחה מופחת של 30 דקות בכל חילוץ נוסף. הסופרנטנטים מכל שלוש ההוצאות שולבו, רוכזו ויובשו בוואקום במשך 5–7 ימים כדי לקבל את אבקת SDPF, שנשמרה בקירור לשימוש נוסף.

ניתוח רכיבים של SDPF
להכנת דגימות מוצקות, כמות מתאימה של חומר הומוגני הועברה לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל, שולבה עם 1 מ"ל של 70% מתנול במים וחרוזי פלדת אל-חלד בקוטר 3 מ"מ, ואז עובדה במטחנה אוטומטית למשך 3 דקות, ולאחר מכן 10 דקות של מערבולות. דגימות נוזליות דוללו במתנול טהור והופנו למערבולת במשך 10 דקות. לאחר מכן, כל הדגימות צנטריפוגות ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנטים שהתקבלו סוננו דרך מסנן של 0.22 מיקרון. לפני ניתוח אינסטרומנטלי, 2-כלורופנילאלנין (תקן פנימי, 100 מיקרוגרם/מ"ל) שולב בסינון להשגת ריכוז סופי של 1 מ"ג/ליטר. הפרדה כרומטוגרפית בוצעה במערכת LC-MS המצוידת בעמוד C18 (1.8 מיקרון × 2.1 מ"מ × 100 מ"מ), שנשמרה בטמפרטורה של 30°C, עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה. השלב הנייד כלל 0.1% חומצה פורמית במים (A) ואצטוניטריל נקי (B). נפח ההזרקה הוגדר ל-2 מיקרוליטר, והאוטוסופלר נשמר על 4 מעלות צלזיוס. זיהוי ספקטרומטריית מסה בוצע הן במצב יוניזציה חיובי והן שלילי בתנאים הבאים: טמפרטורת מחמם ב-325 מעלות צלזיוס, גז מעטפת ב-45 יחידות שרירותיות, גז עזר ב-15 ארב, גז סוויפ ב-1 ארב, מתח אלקטרוספריי ב-3.5 קילו-וולט, טמפרטורת קפילרי ב-330 מעלות צלזיוס, ורמת RF של עדשת S ב-55%. הנתונים נאספו בטווח m/z של 100–1500 במצב MS סריקה מלאה ברזולוציה של 120,000, בעוד שפיצול MS/MS בוצע במצב רכישה תלוי נתונים (dd-MS2, TopN=5) ברזולוציה של 60,000 באמצעות דיסוציאציה התנגשתית באנרגיה גבוהה יותר.

ניסוי בעלי חיים
שבעים ושתיים זכרים של חולדות ספרג-דולי (בגיל 6 שבועות, משקל גוף ראשוני 180–200 גרם; RRID: IMSR_JAX:000664) התגוררו בתנאי SPF (24 ± 1 °C, 12 שעות מחזור אור/חושך) עם גישה חופשית למזון ולמים. לאחר שבוע של הסתגלות, הם חולקו באקראי לשש קבוצות (n=12/קבוצה) בהתבסס על משקל הגוף: (1) קבוצת ביקורת ריקה (סליין תקין), (2) קבוצת מודל עצירות (10 מ"ג/ק"ג לופרמיד הידרוכלוריד), (3) נמוכה (SDPF-L)-, (4) בינונית (SDPF-M)-, ו-(5) קבוצות SDPF במינון גבוה (SDPF-H) (6, 9 ו-12 גרם לק"ג, בהתאמה), ו-(6) קבוצת ביקורת חיובית (2 מ"ג/ק"ג מוזפריד ציטראט). SDPF הוכן טרי כמתלה במים מזוקקים בריכוזים של 3, 4.5 ו-6 גרם למ"ל וניתן באמצעות גאווג' דרך הפה בנפח קבוע של 2 מ"ל/ק"ג, המתאימים למינונים של 6, 9 ו-12 גרם לק"ג, בהתאמה. הידרוכלוריד לופרמיד הוכן טרי כתסעיף במים מזוקקים בריכוז של 5 מ"ג/מ"ל וניתן על ידי גוואג' דרך הפה בנפח קבוע של 2 מ"ל/ק"ג (שווה ערך ל-10 מ"ג/ק"ג). לאחר שבוע של הסתגלות, הושרה עצירות בקבוצות (2) – (6) על ידי גאווג לופראמיד הידרוכלוריד פעם ביום במשך שבוע. קבוצת הביקורת הריקה קיבלה נפח דומה של מי מלח רגילים. בהמשך, בשבוע הבא, חולדות בקבוצות (3)–(5) קיבלו טיפול ב-SDPF באמצעות גאווג' אורלי פעם ביום, קבוצת הביקורת החיובית (6) קיבלה בנוסף מוזפריד ציטראט (2 מ"ג/ק"ג) במקביל, בעוד שחולדות בקבוצות (2) – (6) המשיכו לקבל לופרמיד הידרוכלוריד (10 מ"ג/ק"ג) פעם ביום לשמירה על מודל העצירות. קבוצת הביקורת הריקה המשיכה לקבל סליין רגיל. בסיום תקופת הטיפול, כל החולדות היו בצום לילה עם גישה חופשית למים. לאחר מכן הורדמו בעלי חיים בהזרקה תוך-פריטוניאלית של נתרן פנטוברביטל (40 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאחר הרדמה עמוקה שאושרה בהיעדר רפלקסים בפדלים, חולדות הושמד בעקבות פריקת צוואר הרחם. מיד לאחר מכן, רקמות רקטליות נקטפו במהירות. לניתוחים היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים, מקטעי הרקמה נקבעו ב-4% פאראפורמלדהיד. לצורך ניתוח ביטוי חלבון, דגימות רקמה הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי ונשמרו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.

הכיסא השחור הראשון
זמן ההפרשה של הצואה השחורה הראשונה נרשם עבור שלושה חולדות בכל קבוצה. לפני הניסוי, כל העכברים היו בצום של 12 שעות עם גישה חופשית למים. כל בעל חיים קיבל לאחר מכן מתן תוך-קיבתי של תליית דיו מוכנה (5% פחם פעיל ו-5% גומי ערבי) במינון של 10 מ"ל לקילוגרם משקל גוף, עם זמן מדויק של מתן הטיפול. לאחר הגוואג', העכברים הוחזקו בכלובים נפרדים עם גישה חופשית למזון ולמים. הופעת הצואה השחורה הראשונה מכל עכברוש נצפתה ותועדה בקפידה כדי לחשב את זמן המעבר במעי.

תכולת מי הצואה
לאחר הקמת מודל מוצלחת ובסוף הטיפול, נאספו דגימות צואה טריות שהופרשו בתוך שעתיים מכל קבוצת חולדות (n = 6) והונחו בצינורות EP יבשים שנשקלו מראש. משקל הצואה הרטוב נרשם מיד. לאחר מכן, הדגימות הועברו לתנור ייבוש והתייבשו בטמפרטורה של 60°C למשך 36 שעות. לאחר תקופת הייבוש הראשונית, הדגימות נשקלו והוחזרו לתנור, כאשר מדידות המשקל חזרו על עצמן כל שעתיים עד להשגת משקל קבוע (מה שמעיד על התייבשות מלאה). אחוז תכולת מי הצואה חושב לאחר מכן באמצעות הנוסחה הבאה:

תכולת מי הצואה (%) = [(משקל רטוב - משקל יבש) / משקל רטוב] × 100%

קצב הנעה מעיים
לאחר תקופת צום של 12 שעות (עם גישה חופשית למים), חולדות מכל קבוצה (n = 6) קיבלו מינון תוך-קיבתי (10 מ"ל/ק"ג) של תליית דיו שהכילה 5% פחם פעיל ו-5% גומי ערבי. עשרים וחמש דקות לאחר מכן, בעלי החיים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של 5% כלורל הידראט. אזור הבטן חוטא על ידי ניקוי של 75% אתנול לפני איסוף הרקמות, והגפיים הוצמדו ללוח חיתול. חלל הבטן נחשף בזהירות באמצעות מספריים כירורגיים, ומערכת העיכול מהפילוס ועד החיבור האילאוצקלי נחתכה. המעי המבודד יישר על נייר סינון סטרילי, ונרשמו שתי מדידות: (1) אורך המעי הדק הכולל, ו-(2) המרחק שעבר חזית הדיו. יחס ההנעה המעי חושב לאחר מכן באמצעות הנוסחה הבאה:

קצב ההנעה המעי (%) = (מרחק נדידת דיו / אורך מעי כולל) × 100%

הוא מכתים
עבור קבוצות הביקורת, המודל, SDPF-M ו-Mos (n = 3 לכל קבוצה), נאספו ועובדו דגימות רקטליות לצביעת המטוקסילין ואאוזין (HE). הדגימות היו מקובעות ב-4% פאראפורמלדהיד, יובשו באתנול מדורג, והוטמעו בבלוקים של פרפין. חתכים דקים, בעובי 4–5 מיקרון, הוכנו והוצמדו על שקופיות זכוכית לפני צביעת המטוקסילין ואאוזין קונבנציונליות. ההליך החל בדה-פרפיניזציה באמצעות קסילן, ואחריו הידרציה מחדש דרך סדרת ריכוזי אתנול יורדים. הגרעינים נצבעו על ידי חשיפת חלקים להמטוקסילין למשך 5–8 דקות. לאחר התמיינות באלכוהול חומצי 1% והתכלות במי אמוניה של 0.2%, הציטופלזמה והמטריצה החוץ-תאית צובעו ב-אאוזין למשך 1–2 דקות. לבסוף, החלקים המוכתמים יובשו, נוקו והותקנו עם כיסויי כיסוי לתצפית מיקרוסקופית. גישה זו אפשרה הערכה מפורטת של מורפולוגיית רירית המעי, כולל מבנה הסעלים והקריפטות, מצב תאי האפיתל ונוכחות חדירות דלקתיות בתוך הלמינה פרופריה.

ניתוח העשרת מסלול KEGG ו-GO
בהסתמך על הפרופיל הכימי שנקבע קודם לכן של SDPF, בוצעו תחזיות סיליקו של מטרות חלבון לכל רכיב באמצעות פלטפורמת SwissTargetPrediction. מטרות משוערות הרלוונטיות לעצירות סיננו ונחשפו להערות פונקציונליות באמצעות מאגר DAVID 6.8, עם סף מובהקות של P < 0.05. קבוצת הגנים שהתקבלה עברה לאחר מכן סיווג GO כדי להבהיר את תפקידיה בתהליכים ביולוגיים, תפקודים מולקולריים ורכיבים תאיים. כדי להבהיר עוד יותר את מעורבותם בפתוגנזה של המחלה, מטרות אלו מופו לאחר מכן למסלולי KEGG, וחשפו מספר מפלי איתות שהועשרו משמעותית ועלולים להיות מעורבים בהופעתה ובהתפתחותה של עצירות.

בניית רשת "רכיב-יעד-נתיב"
רשת "רכיב-יעד-נתיב" הורכבה ב-Cytoscape (גרסה 3.6.1) על ידי שילוב שיטתי של המרכיבים הכימיים של SDPF, היעדים הטיפוליים המתאימים לעצירות והמסלולים המועשרים הרלוונטיים. בתוך המודל הגרפי הזה, נעשה שימוש בגאומטריות צמתים שונות לייצוג שלושת סוגי הנתונים: מעגלים לתרכובות, משולשים למטרות, ומלבנים לנתיבים. עוצמת הקשרים בין הצמתים הללו נמדדה באמצעות שקילת קצוות, מה שסיפק מבט הוליסטי על האינטראקציות הפרמקולוגיות המורכבות והרב-שכבתיות.

עגינה מולקולרית
לניתוח העגינה המולקולרי, נבחרו ארבע תרכובות ביואקטיביות — כלומר ציקלוכורכומין, אלביפלורין, חומצה כלורוגנית וקורצטין — כמולקולות ליגנטיות, כאשר המבנים שלהן הורדו ממסד הנתונים של PubChem באמצעות מספרי רישום CAS תואמים. להכנת קולטני החלבון, התייעצה עם בסיס הידע של UniProt לאישור חלבוני המטרה PI3K ו-AKT, ומבניה התלת-ממדיים נאספו לאחר מכן מבנק נתוני החלבונים של RCSB. מבני החלבון והתרכובות הללו עובדו לאחר מכן ב-Discovery Studio 2019, שם נוספו אטומי מימן, הוקצו מטענים והוגדרו סוגי אטומים; בנוסף, זוהו כיסי קישור פוטנציאליים בקולטנים. הליגנדים והקולטנים שהוכנו נשמרו לאחר מכן בפורמט PDBQT לסימולציות עגינה. הליך העגינה בוצע עם התצורה הבאה: רדיוס אשכול תנוחה של 0.5, יצירת 10 קונפורמציות ליגנד אקראיות, ו-10 כיווני עידון. לאחר סיום ריצות העגינה, קומפלקסים מועמדים הוערכו ודורגו בהתאם לאנרגיות החופשיות של הקישור החזויות. תנוחות הקישור האנרגטיות החיוביות ביותר נבחרו בסופו של דבר והוצגו באמצעות PyMOL להמחשת אינטראקציות בין-מולקולריות מרכזיות.

אימונוהיסטוכימיה
דגימות רקטליות מוטמעות, שנחתכו בעובי של 4 מיקרון והתקבלו מקבוצות הטיפול בקרה, מודל ו-SDPF-M, נוקו תחילה מפרפין ונשתה בהדרגה הידרציה. אתרים אנטיגניים נחשפו על ידי חימום השקופיות בבופר ציטראט מותאם ל-pH 6.0. כדי לדכא פרוקסידאזות אנדוגניות, הרקמות טופלו בתמיסת מי חמצן של 3%, ולאחר מכן דגירה עם סרום עזים תקין כדי להפחית את הקשירה לנוגדנים לא ספציפיים. החתכים הוגדרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים שמכוונים ל-PI3K ו-AKT מפוספורילטים; חתכים מקבילים עם PBS שימשו כבקרות שליליות. לאחר שטיפה יסודית, הוחלו נוגדנים משניים מצומדים פרוקסידאז עם חזרת, ופותחה צביעת חיסון באמצעות כרומוגן DAB תחת תצפית מיקרוסקופית לשליטה בזמן התגובה. לבסוף, הרקמות נצבעו קלות בהמטוקסילין, יובשו באמצעות אלכוהולים מדורגים, נוקו והורכבו. רמות הביטוי של p-PI3K ו-p-AKT הוערכו באופן איכותני על ידי שני חוקרים עצמאיים שהיו עיוורים לקבוצות הניסוי, ונבחרו תמונות מייצגות כדי להמחיש הבדלים בין הקבוצות.

בלוט מערבי
דגימות רקמה רקטלית מחולדות נשטפו פעמיים עם מי מלח מקוררים עם בופר זרחן לפני שהומוגנו על קרח במשך 10 דקות בנפח מתאים של בופר ליזיס RIPA. לאחר ההומוגניזציה, התערובת עברה צנטריפוגה ב-15,000 × גרם, והסופרנטנט נשמר לניתוח. כימות חלבון בוצע באמצעות שיטת חומצה ביצינכונינית. לאחר מכן, הדגימות שולבו עם בופר עומס SDS ודנוטרציה באמצעות דגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כמויות חלבון שוות ערך נפתרו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-פוליאקרילאמיד והועברו לאלקטרומורציה על ממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד בגודל נקבוביות של 0.45 מיקרון. לאחר ההעברה, הממברנות התייבשו באוויר לפני שנחסמו עם חלב יבש דל שומן של 5% ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת הסביבה. לאחר שלב זה, הממברנות נשטפו ב-TBST ואז דגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-AQP3 (RRID: AB_2837708) ו-AQP8 (RRID: AB_605941). למחרת, לאחר שטיפות נוספות עם TBST, הממברנות נדגרו עם הנוגדן המשני המתאים פרוקסידאז פרוקסידאז למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות אימונוריקטיביות זוהו בסופו של דבר ונלכדו באמצעות מערכת הדמיה.

אימונופלואורסצנציה
הליך צביעת האימונופלואורסצנציה בוצע על חתכי רקמה רקטליים מחולדות שטופלו ב-Control, Model ו-SDPF-M, כך: לאחר הקריו-סקציה, הרקמות קיבעו ב-4% פאראפורמלדהיד, חודרו ב-0.1% Triton X-100, וחסמו באמצעות בופר חסימה מתאים למניעת קשירה לא ספציפית. החתכים נדגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם תערובת של נוגדנים ראשוניים נגד AQP3 ו-AQP8, ולאחר מכן נוגדנים לא קשורים נשטפו והרקמות נדגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך עם תערובת של נוגדנים משניים—בפרט, IgG אנטי-ארנב לעזים שמחובר ל-Alexa Fluor 594 (אדום) לסימון AQP3 ו-IgG אנטי-עכבר לעזים שמחובר ל-Alexa Fluor 488 (ירוק) לסימון AQP8. לאחר דגירה משנית של נוגדנים ושטיפות שלאחר מכן, גרעיני התאים צוברו נגד DAPI, והשקופיות כוסו עם מדיום התקנה מימי לפני הדמיה ורכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי.

ריצוף 16S rRNA של מיקרוביום צואה
לכל קבוצת ניסוי (n = 8), DNA גנומי חיידקי בודד מחומר צואה של חולדות באמצעות ערכת חילוץ DNA קרקע מסחרית, כאשר כל ההליכים פועלים בקפדנות לפי הפרוטוקול של הספק. הגברת PCR שהתמקדה באזורים ההיפר-משתנים V3–V4 של גן 16S rRNA בוצעה על מחזור תרמי באמצעות זוג הפריימר 338F/806R. ריצוף אמפליקונים בוצע בפלטפורמת Illumina MiSeq בהתאם להנחיות היצרן, ויצר עומק ריצוף מספק להשגת רוויה בעקומת ההתפצלות ולהבטחת ניתוח אמין של גיוון מיקרוביאלי. עם סיום הריצוף, הקריאות הגולמיות עברו סינון איכות, הוסרו באמצעות מתאמים ואוחדו באמצעות Trimmomatic ו-FLASH. רצפים איכותיים אוחדו לאחר מכן ליחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) בסף דמיון של 97% באמצעות UPARSE, ורצפים כימריים פוטנציאליים זוהו והוסרו באמצעות UCHIME. הקצאה טקסונומית של רצפים מייצגים בוצעה באמצעות מסווג RDP מול מאגר הייחוס SILVA, עם סף אמון של 70%. כדי להעריך גיוון אלפא בקהילות מיקרוביאליות, חושבו אומדן העושר של Chao1 ומדד הגיוון של שאנון באמצעות חבילת התוכנה Mothur (v.1.30.2). לניתוח בטא-דיברסיטי, בוצע ניתוח קואורדינטות עיקריות כדי להמחיש אי-דמיון קומפוזיטורי בין קבוצות. נבנתה דיאגרמת ון כדי להמחיש את התפלגות ה-OTUs הייחודיים והמשותפים בתנאים ניסיוניים שונים. זיהוי טקסונים בשפע שונה בין קבוצות בוצע באמצעות ניתוח ליניארי מבחין בגודל אפקט. לבסוף, בוצעה פרופיל חיזוי של פונקציות קהילות מיקרוביאליות באמצעות PICRUSt2, שהסיק פוטנציאל תפקודי מהערות אורתולוגיה של KEGG.

סטטיסטיקות
כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות SPSS 23.0 ו-GraphPad Prism 8.0. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). נורמליות התפלגות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן שפירו–וילק. להשוואות בין שתי קבוצות, מבחן ה-t של סטודנט בדגימות בלתי תלויות שימש לנתונים מבוזרים נורמלית, ומבחן מאן–וויטני U שימש לנתונים שאינם מבוזרים נורמלית. בהשוואות של שלוש קבוצות או יותר, נעשה שימוש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן הפוסט-הוק של טוקי עבור נתונים מבוזרים נורמליים, בעוד שמבחן קרוסקל–ווליס ואחריו מבחן הפוסט-הוק של דאן שימש לנתונים שאינם מבוזרים נורמלית. לניתוחי מיקרוביום, זוהו טקסונים בשפע דיפרנציאלי באמצעות אנליזה ליניארית (LEfSe) עם סף ברירת המחדל (ציון LDA > 2.0), ותיקון בדיקות מרובות יושם באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg fse discovery rate (FDR). ניתוחים סטטיסטיים של מיקרוביום בוצעו באמצעות Mothur (v.1.30.2), LEfSe (כלי מקוון, מעבדת Huttenhower) ו-PICRUSt2 (v.2.5.0). ערך p של פחות מ-0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפקת SDPF וליופיליזציה
SDPF היא נוסחה רב-צמחית הכוללת חמישה צמחים רפואיים: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao), ו-Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (איור 1A). התערובת הופקה במים מטוהרים והפכה לאבקה לניתוח נוסף (איור 1B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עצירות כרונית היא הפרעה רב-גורמית הכוללת אינטראקציות מורכבות בין דיסביוזיס מיקרוביוטי במעי, פגיעה בתפקוד הנוירומוסקולרי והפרשה מעיים משתנה. תסמינים אלו נמשכים למעלה משישה חודשים ופוגעים משמעותית באיכות החיים שלהמטופלים. עצירות יכולה להיות מסווגת למספר תת-סוגים, כולל מעבר איטי, מעבר רגיל, הפרעת הצואה וסוגיםמעורבים 20. למרות שהפתוגנזה המדויקת של עצירות כרונית עדיין לא ידועה במלואה, היא מיוחסת בדרך כלל לאינטראקציה של גורמים רבים, כולל דיסביוזי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

מימון: מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של שנזן (מענק מס' JCYJ20220531092203007).

אנו מודים עמוקות לד"ר ליקון צ'ו מאוניברסיטת שאנדונג לרפואה סינית מסורתית על ההנחיות הטכניות בהקמת מודל עצירות העכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מטחנה אוטומטיתהומוגניזר רקמות בעל תפוקה גבוהה לטחינת דגימותJXFSTPRP-48
מערכת LC-MSתרמו פישר סיינטיפיקQ מערכת HF LC-MS אקסטרטיביתכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-גבוהים– מערכת ספקטרומטריית מסה
ספקטרומטר מסהתרמו פישר סיינטיפיקQ אקסקטיבי HFספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה של אורביטראפ
עמודת C18אג'ילנט טכנולוגיותZorbax Eclipse Plus C18 (2.1 & 100 מ"מ, 1.8 & mu; m)עמודת פאזה הפוכה להפרדה מורכבת
מערכת סריקת הדמיהGE HealthcareImageQuant LAS 4000מערכת הדמיית ג'ל וכתמים
תרמוקלרמערכות ביולוגיות יישומיות (תרמו פישר סיינטיפיק)מערכת GeneAmp PCR 9700מכשיר הגברה ל-PCR
ערכת חילוץ DNA קרקעאומגה ביו-טקD5625ערכת חילוץ DNA מיקרוביאלי מדגימות צואה/קרקע

מקורות

  1. Xu, X., Wang, Y., Long, Y., Cheng, Y. Chronic constipation and gut microbiota: current research insights and therapeutic implications. Postgrad Med J. 100 (1190), 890-897 (2024).
  2. Ong, S. S., et al. Global research trajectories in gut microbiota and functional constipation: a bibliometric and visualization study. Front Microbiol. 15, 1513723(2024).
  3. Kilgore, A., Khlevner, J. Functional constipation: pathophysiology, evaluation, and management. Aliment Pharmacol Ther. 60, S20-S9 (2024).
  4. Wang, K., Qiu, H., Chen, F., Cai, P., Qi, F. Considering traditional Chinese medicine as adjunct therapy in the management of chronic constipation by regulating intestinal flora. Biosci Trends. 18 (2), 127-140 (2024).
  5. Shahrajabian, M. H., Sun, W. The importance of traditional Chinese medicine in the intervention and treatment of HIV, while considering its safety and efficacy. Curr HIV Res. 21 (6), 331-346 (2023).
  6. Wang, Y., et al. Integrated analysis of slow transit constipation and colorectal cancer reveals the co-pathogenic targets and their potential clinical value. Cancer Invest. 43 (5), 337-354 (2025).
  7. Li, D., et al. Tongbian formula alleviates slow transit constipation by increasing intestinal butyric acid to activate the 5-HT signaling. Sci Rep. 14, 17951(2024).
  8. Tian, G., et al. Stereoscopic quantitative analysis of enteric nervous system in patients with slow transit constipation. Neurogastroenterol Motil. , e70128(2025).
  9. Hannigan, K. I., et al. Modulation of intracellular calcium activity in interstitial cells of Cajal by inhibitory neural pathways within the internal anal sphincter. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 327 (3), G382-G404 (2024).
  10. Liu, L., et al. Therapeutic effects of three-strain probiotic combination on slow transit constipation: mechanistic insights into MAPK signaling pathway and gut microbiota restoration. Front Pharmacol. 16, 1684442(2025).
  11. Jiang, J. G., et al. Cinnamic acid regulates the intestinal microbiome and short-chain fatty acids to treat slow transit constipation. World J Gastrointest Pharmacol Ther. 14 (2), 4-21 (2023).
  12. Gao, Z., Fu, L., Bai, W., Liang, J. Protective effects of medicinal plant-derived metabolites on slow transit constipation via the ENS-ICC-SMC pathway. Front Pharmacol. 16, 1598806(2025).
  13. Zou, S., et al. Olive oil solution of volatile oil from Citri Reticulatae Pericarpium Viride alleviates slow-transit constipation via regulating SCF/c-Kit signaling pathway and intestinal flora. Drug Des Devel Ther. 19, 4275-4295 (2025).
  14. Wang, L., et al. Electroacupuncture alleviates functional constipation in mice by activating enteric glial cell autophagy via PI3K/AKT/mTOR signaling. Chin J Integr Med. 29 (5), 459-469 (2023).
  15. Han, K., Kuo, B., Khalili, H., Staller, K. Metagenomics analysis reveals unique gut microbiota signature of slow-transit constipation. Clin Transl Gastroenterol. 15 (10), e1(2024).
  16. Zhai, Y., et al. Network pharmacology: a crucial approach in traditional Chinese medicine research. Chin Med. 20 (1), 8(2025).
  17. Madhagi, H. A., Nassar, H. Harnessing network pharmacology and in silico drug discovery to uncover new targets and therapeutics for Alzheimer's disease. Comput Biol Med. 187, 109781(2025).
  18. Liu, J., et al. Tongbian decoction inhibits cell autophagy via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway to treat constipation rats. J Ethnopharmacol. 339, 119139(2025).
  19. Wlodarczyk, J., et al. Current overview on clinical management of chronic constipation. J Clin Med. 10 (8), 1738(2021).
  20. Bharucha, A. E., Lacy, B. E. Mechanisms, evaluation, and management of chronic constipation. Gastroenterology. 158 (5), 1232-1249.e3 (2020).
  21. Liu, N., et al. The mechanism of secretion and metabolism of gut-derived 5-hydroxytryptamine. Int J Mol Sci. 22 (15), 7931(2021).
  22. Wang, H., Lee, J. W. Pharmacologic treatment of chronic constipation. Korean J Gastroenterol. 83 (5), 184-190 (2024).
  23. Kochen, M. A., et al. Dynamics and sensitivity of signaling pathways. Curr Pathobiol Rep. 10 (2), 11-22 (2022).
  24. Bang, W. Y., et al. Therapeutic modulation of the gut microbiome by supplementation with probiotics (SCI microbiome mix) in adults with functional bowel disorders: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Microorganisms. 13 (10), 2283(2025).
  25. Tang, L., et al. Rosmarinic acid improves intestinal barrier integrity through PI3K/AKT/Nrf2-mediated regulation of tight junction protein expression. Int Immunopharmacol. 164, 115380(2025).
  26. Yin, N., et al. Farrerol alleviates microbiota dysbiosis-associated osteoporosis in IBD by inhibiting PI3K-AKT/MAPK signaling pathways. Phytomedicine. 148, 157279(2025).
  27. Liu, L., et al. Rotenone induces parkinsonism with constipation symptoms in mice by disrupting the gut microecosystem, inhibiting the PI3K-AKT signaling pathway and gastrointestinal motility. Int J Mol Sci. 26 (5), 2079(2025).
  28. Lin, L. W., et al. Efficacy of traditional Chinese medicine for the management of constipation: a systematic review. J Altern Complement Med. 15 (12), 1335-1346 (2009).
  29. Yan, L., et al. Effect of traditional Chinese medicine external therapy for functional constipation: a meta-analysis. Am J Transl Res. 15 (1), 13-26 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

16S rRNAAQP3
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.