מאמר שיטה

חקירת המנגנונים הרשתיים של גירוי מוח עמוק פלידלי באמצעות מערכי מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה

212 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70507

⸱

16 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להקלטות מערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה מחוץ לחיים מפרוסות מוח מוחון חריפות של מודל אוגר דיסטוני שקיבל גירוי עמוק רציף של מוח פאלידל למשך 11 ימים.

תקציר

דיסטוניה היא הפרעת תנועה נוירולוגית המאופיינת בשליטה לא תקינה בשרירים המשפיעה על תנועות רצוניות ויציבות מתמשכות. למרות שדיסטוניה קשורה לתפקוד לקוי של הגנגליונים הבסיסיים, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהמוחון מעורב בפתופיזיולוגיה שלו. פרוטוקול זה מציג גירוי מוחי עמוק פאלידל ( DBS) במודל אוגר דיסטוני (dtsz hamster) בשילוב עם הקלטות מערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה (HD-MEA) מחוץ לחי כדי לחקור פעילות מוחון. הפרוטוקול כולל (1) ניתוח DBS להשתלת אלקטרודות ומגרים, (2) הכנת פרוסות חריפות למוחון, (3) הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ברזולוציה גבוהה, ו-(4) ניתוח נתונים. תוצאות מייצגות מצביעות על כך ש-11 ימים של DBS פלאידלי החזירו את פעילות הקוצים לרמות תקינות בשכבות המולקולריות, פורקינג'ה והגרגריות, בהתאם למעורבות רשת המוחון בדיסטוניה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מפורט של פעילות המוחון והמודולציה שלה על ידי DBS, ומספק פלטפורמה לחקר מנגנונים ברמת הרשת העומדים בבסיס טיפולי נוירומודולציה.

מבוא

דיסטוניה היא הפרעת התנועה השלישית השכיחה1, המאופיינת בסימנים ותסמינים קליניים מובחנים 2,3, אם כי לעיתים היא עלולה להתבלבל עם הפרעות מוטוריות אחרות 4,5,6. המאפיינים הקליניים הבולטים ביותר כוללים התכווצויות שרירים לא רצוניות, תנועות חזרתיות, ויציבה לא תקינה ו/או מעוותת7. מאפיינים אלו עשויים להיות מלווים בתסמינים כמו כאב, פגיעה בביצועים מוטוריים ועייפות, אשר עלולים להחמיר בתקופות של לחץ, חרדה או תשישות פיזית 8,9,10,11. הפתופיזיולוגיה של דיסטוניה עדיין לא מובנת במלואה 12,13. למרות שמחקרים התמקדו באופן מסורתי בגנגליונים הבסיסיים, עדויות הולכות וגוברות תומכות במושג ברמת הרשת של ההפרעה, הכולל מספר אזורים במוח, כולל המוחון 14,15,16,17. פרוטוקול זה נועד לחקור פעילות רשת חוץ-תאית בשכבות שונות של קליפת המוח המוחונית כדי להבהיר את תפקידן בפתופיזיולוגיה של דיסטוניה ולהבין את המנגנונים הרשתיים של גירוי מוח עמוק (DBS).

גירוי מוח עמוק (DBS) המיועד ל-globus pallidus internus (GPi) או לגרעין הסובטלמי (STN) משמש לעיתים קרובות לטיפול בצורות מסוימות של דיסטוניה18,19, במיוחד כאלה העמידות לתרופות. בנוסף, תוצאות הטיפול הן הטרוגניות ובלתי צפויות, שכן מטופלים עם ביטויים קליניים דומים עשויים להגיב באופן שונהלאותה גישה טיפולית. הבנה מקיפה יותר של הרשת העצבית שמאחורי הדיסטוניה יכולה לשפר את תוצאות הטיפול21. לכן, נדרשות גישות רחבות היקף וניסיוניות, שניתן להשיג רק באמצעות מחקרים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים. שילוב ניסויי DBS ב-vivo עם הקלטות מערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה (HD-MEA) מאפשר ניטור ברזולוציה גבוהה של פעילות הרשת הנוירונית (כמעט) פיזיולוגית, כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של דיסטוניה ואת מנגנוני DBS.

הגנגליונים הבסיסיים והמוחון משפיעים כל אחד על שליטה מוטורית, לפחות בחלקו, דרך הקשרים שלהם לקורטקס המוטורי הראשי (M1)22. מחקר אנטומי עם נגע סטריאטלי והסרה כירורגית של המוחון תומך ברעיון זה23. במחקר שלנו אנו משתמשים במודל החי של האוגר הדיסטוני dtsz 24,25, שמציג חריגות מוחניות הקשורות לדיסטוניה26. באמצעות מערכי מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה (HD-MEAs), חקרנו את פעילות רשת הקורטקס המוחיונית אצל אוגרים דיסטוניים ובריאים. עם זאת, גישות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות חסרות רזולוציה מרחבית ללכוד דינמיקת רשת ייחודית לשכבה, בעוד ששיטה זו מתמודדת עם מגבלה זו. מצד שני, חקרנו את השפעת הגירוי העמוק של המוח בגלובוס פאלידוס אינטרנוס על רשתות הקורטקס המוחי.

מערכת HD-MEA מציעה את היתרון של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מפורטות במקביל, המאפשרת ניתוח על שכבות הקורטקס המוחון (שכבות גרגריות, פורקינג'ה ומולקולריות), כאשר כל שכבה ממלאת תפקיד חיוני בעיבוד רצפי תנועה27. שכבת הגרגירים, הצפופה, מלאה בתאי גרנול, מקבלת ומעבירה מידע חושי ומוטורי מסיבי טחב, ומאפשרת אינטגרציה ראשונית של האות לפני המשך העיבוד27. שכבת פורקינז'ה, המכילה תאי פורקינז'ה, משדרת אותות מעכבים לגרעיני המוחון העמוקים, שם השכבות הגרגריות והמולקולריות מווסתות את האות היוצא. השכבה המולקולרית, העשירה בדנדריטים ונוירונים בין-נוירונים, תומכת במודולציה מורכבת דרך אינטראקציות סינפטיות עם תאי פורקיניה, תוך כיוונון עדין של פלט מוטורי28. HD-MEA, בניגוד לטכניקות הקלטה אחרות, אינו מוגבל ברזולוציה מרחבית או בשטח דגימה, מה שמאפשר לתרומות הייחודיות של כל שכבה ללעד בדינמיקה העצבית המשתנה שנראית בדיסטוניה15. גישה זו מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ויכולות הקלטה מקבילית בהשוואה לשיטות הקלטה עם אלקטרודה בודדת או בצפיפות נמוכה. קיימות מערכות HD-MEA המבוססות על טכנולוגיית CMOS29,30 משלימה של מתכת-תחמוצת-למחצה, בשילוב עם קונספט Active Pixel Sensor (APS), המספקות דימות פונקציונלי להצגת פעילות חשמלית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים לאורך זמן31,32. באמצעות טכניקה זו, ניתן לעקוב אחרי הדינמיקה של כל שכבה בקורטקס המוחון, וניתן לחקור תהליכי העברה סינפטיים ספציפיים על ידי שטיפה עם חומרים שונים. שיטה זו מתאימה במיוחד למחקרים החוקרים פעילות רשת עצבית מורכבת ושינויים ספציפיים לשכבה במודלים נוירולוגיים של מחלה.

עבודה זו מתמודדת עם אתגרים טכניים הנוגעים לכיסוי מערכת הגירוי וכן להכנת רקמות, איסוף נתונים וניתוח של מאגר נתונים אלקטרופיזיולוגי גדול. בעבודה זו, אנו מציגים אפשרות לחקר במבחנה של עיבוד עצבי מורכב מאוד, אשר במקרה שלנו, מצד אחד, תורם להבנה מובחנת יותר של הדינמיקה הפתופיזיולוגית ברשתות עצביות דיסטוניות, ומצד שני מספק ידע על מנגנון הפעולה הטיפולי של DBS.

פרוטוקול

השתמשו באוגרים דיסטוניdt sz ושלוט באוגרים זהובים סוריים לניסויים26. בסך הכול נבדקו ארבע קבוצות ניסוי במחקר הנוכחי: (1) אוגרי ביקורת לא-דיסטוניים (סוג פראי, WT), (2) אוגרי dtsz טבעיים לא מטופלים, (3) dtsz-Sham (עברו השתלה, אך ללא גירוי פעיל), ו-(4) dtsz-DBS (עם DBS רציף ב-vivo במשך 11 ימים לפני הכנת פרוסה). כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי ולחוקים הפדרליים להגנת בעלי חיים, תחת רישיון 7221.3-1-029/20.

1. בעלי חיים

  1. יש לאחסן את החיות בתנאים סטנדרטיים של GV Solas33 במחזור אור של 14 שעות/10 שעות חושך, ועם גישה חופשית למים ומזון (אוגר דיאט סטנדרטי, אלטרומין).
  2. בדקו את האוגרים המוטנטים שלDT SZ לתסמינים דיסטוניים באמצעות טכניקת הגירוי המשולש26, בגילאים 20 ± 1 ו-27 ± 4 ימים
    הערה: הליך סטנדרטי זה ללחץ קל כולל הוצאת האוגר מהכלוב הביתי והעברתו לכלוב ריק חדש, ולאחר מכן הזרקה תוך-פריטונית או תת-עורית של מי מלח, ומניעת שינה קצרה. רצף זה של גירויים קלים שמעוררי חרדה גורם באופן אמין להתקפי דיסטון עם השהיה שחזורית, ולכן משמש לסינון פנוטיפי לפני הכללה בקבוצות ניסוי. אוגרי בקרה לא-דיסטוני עוברים את אותו הליך כדי להבטיח תנאים ניסיוניים דומים בין הקבוצות.
  3. לצורך הקלה בכאבים, יש לטפל בבעלי החיים מקבוצות dtsz-Sham ו-dtsz-DBS במטאמיזול פרול של 100 mg·kg-1 . השתל שתי הקבוצות בהתאם להליך הכירורגי המתואר להלן.

2. כיסוי מערכת הגירוי STELLA

  1. מערכות הגירוי של STELLA מכוסות בגישה ביוקומפטיבית כדי להגן על המכשירים מפני חדירת נוזלים במהלך השתלה כרונית. האלקטרוניקה מאוחסנת בקפסולת PETG מותאמת אישית עם הדפסה תלת-ממדית.
    1. אטום בין המכסה לקפסולה באמצעות סיליקון.
    2. בנוסף, אטום את המארז עם סיליקון ביציאת הכבל.
    3. אם ניכרים רווחים בסיליקון אחרי הייבוש, חזור על השלבים 1 ו-2.
    4. לאחר התגבשות מלאה של הסיליקון, יש להכין את שרף האפוקסי ביחס ערבוב (משקל) של 100:35.
    5. הסר בועות אוויר מהשרף בוואקום (Vevor RS-1.5).
    6. לפני הרכבת התבנית, יש להניח שכבה דקה של וזלין על משטח ההתחברות של תבנית הסיליקון המותאמת אישית כדי לשפר את האיטום ולהקל על הסרת התבנית לאחר התייבשות אפוקסי. הניחו את קפסולת הממריץ בתוך תבנית הסיליקון וממלאים את התבנית בהדרגה בשרף אפוקסי עד שהחיבורים בין הממריץ לכבל מכוסים במלואם. הימנע מבועות אוויר בזמן המילוי.
    7. לאחר שהשרף התייבש, הסר את הקפסולה מהתבנית והחליק את פני האפוקסי באמצעות פצירה עדינה או כלי ליטוש כדי להסיר קצוות חדים.
    8. מרחו ציפוי סיליקון דק אחרון על קפסולת האפוקסי המבוססת על ידי טבילה בסיליקון נוזלי. השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי למרוח סיליקון נוסף סביב הכבל ליד אזור החיבור. יש להסיר את הצטברות הסיליקון העודפת עם מקל לפני הקיבוש כדי למנוע עובי ציפוי.
    9. לבסוף, יש לבצע בדיקת פונקציונליות לאחר הקיפוזה כדי לאמת את תפוקת הגירוי הנכונה לפני ההשתלה או שימוש ניסיוני. הנח את מערכת הגירוי של STELLA בתמיסת רינגר והפעיל את פונקציית ה-BIST המגנטית. אשר את דפוס ההבהוב הנכון של ה-LED (2 × 2), המצביע על יציאת גירוי תקינה והיעדר קצר חשמלי, מעגלים פתוחים או מצבי סוללה חלשים34.

3. הליך כירורגי להשתלת מערכת גירוי

  1. הכינו כלים כירורגיים (איור 1) ומערכת הגירוי STELLA (פלטפורמה מודולרית מושתלת מוגדרת תוכנה)34.
    1. סטריליזציה של כלי המתכת מהאיור 1 למשך כ-5 דקות בטמפרטורה של 200°C, לדוגמה, עם FST Strailizer 250. שימו לב שהכלים חמים כשמסירים אותם.
    2. חטא את מערכת הגירוי של STELLA עם שתי אלקטרודות DBS עם 70% אתנול. הניחו את מערכת הגירוי היבשה בצינור פלקון (צינור קוני בנפח 50 מ"ל) שמלא בתמיסת רינגר במהלך הלילה.
  2. הכינו את החיה (בגיל 25–32 ימים)
    1. הניחו את תא ההרדמה (בעצמכם) בכלוב האוגר. האוגר ייכנס לצינור מרצונו לאחר זמן קצר (איור 2A).
    2. כאשר האוגר בתוך הצינור, סגרו את הצינור בקצה וחברו אותו לפלט האיזופלורן הנדיף למשך 1-2 דקות (השראה של הרדמה עם 4% איזופלורן) (איור 2B).
    3. הוציאו את החיה מהצילינדר בעדינות. הנח את החיה על הטמפרטורה המבוקרת
      משטח (כ-38 מעלות צלזיוס) ומותאם עם מסכת נשימה (GM-4; תחזוקת הרדמה עם איזופלורן 3%; עומק ההרדמה בבדיקת רפלקס בין-דיגיטלי).
    4. גלח את אזור הניתוח בראש עם מכונת תספורת מתאימה (איור 2C). נקה את האזור עם מטוש רטוב והזריק 500 מיקרוליטר של 0.25% בופיבקאין תת-עורית (s.c.) לקרקפת להרדמה מקומית נוספת של הפריוסטאום. חכה לפחות 5 דקות לפני שפותחים את הקרקפת.
    5. העבר את החיה בזהירות למסגרת הסטריאוטאקסית וקבע אותו עם מוטות האוזניים כך שהברגמה והלמדה יהיו באותו גובה (הפחתת איזופלוראן ל-1.5–2.5% לשמירה על ההרדמה).
    6. הגן על העיניים עם תחליף לדמעות (TVM Ocry-Gel).

4. השתלת מערכת הגירוי של STELLA

  1. עשה חתך עור באורך 2 ס"מ במרכז הקרקפת. רטרקטור (איור 1, מס' 14 ואיור 2D) מושך את העור החוצה. הכינו את הגולגולת על ידי הסרת הפריאוסטאום מקומית עם הלהב על ידי גירוד. עצור דימום אפשרי עם מטושים.
  2. מרחו 3% H2O2 עם אפליקטור עם קצה כותנה למחוספסות.
  3. קח את מערכת הגירוי מהתמיסה של רינגר והגן על האלקטרודות של DBS עם פאראפילם.
  4. הכנס זוג מספריים קהה דרך החתך בעור שנעשה זה עתה בראש וצור כיס עור באורך 5 ס"מ תת-עורית לכיוון הצוואר והצד.
  5. הכנס את הממריץ, שהוסר מהפלקון והושרה בחיטוי דרמלי.
  6. מרחו כ-500 מיקרוליטר אנטיביוטיקה (10 mg·g-1 חומצה פוזידית) על כיס העור באמצעות מכשיר מריחת כותנה.
  7. קדחו שני חורים בקוטר 7 מ"מ (עם FST#19007-07) בגולגולת עבור אלקטרודות DBS ב-AP: −0.6 מ"מ ו-ML: ± 2.2 מ"מ לפי הברגמה.
  8. קדחו עוד שני חורים (9 מ"מ; FST#19007-09) לרוחב בכל חור אלקטרודה. הברג ארבעה ברגים (DIN 84 A2 M1x2) לתוך החורים המוכנים (איור 2D).
  9. השתיל שתי אלקטרודות DBS (SNEX-100) עם DV: 6.0 מ"מ לפי הברגמה. שימו לב שמחזיק האלקטרודות של המסגרת הסטריאוטקטית הספציפית שלך קובע באיזה צד האלקטרודה תושתל תחילה (המרחק בין האלקטרודות הוא 4.4 מ"מ).
  10. מקבע את האלקטרודה עם חיבור לקימור UV-light (הליובונד) לשני הברגים. כאשר שתי האלקטרודות מושתלות, מונחת ביניהם שכבה אחרונה עם קשר מתקשן באור UV. לבסוף, האלקטרודות מחוברות בזרימת קומפוגלס (איור 2E).
  11. הפעל את הממריץ של קבוצת DBS באופן מגנטי לאחר לפחות שלושה ימי התאוששות למשך 11 ימים רצופים של DBS. במחקר זה השתמשנו בפרמטרי גירוי דומים לאלו שבקליניקות (130 הרץ, 50 מיקרואמא ו-60 מיקרושניות).
  12. בדוק את דפוס האור של הממריץ על ידי החלקה יומית עם מגנט על צידו של האוגר (איור 2F).

5. הכנת פרוסות מוחון חריפות

  1. הכינו ליטר של נוזל מוח-שדרה מלאכותי (ACSF) ו-0.5 ליטר סוכרוז לכל בעל חיים (ראו טבלאות 1 וטבלה 2 לפרטים).
  2. השתמש בתמיסת סוכרוז בטמפרטורה של כ-4 מעלות צלזיוס במהלך חילוץ וחיתוך המוח, עם קרבוגנציה רציפה. בנוסף, יש להכין סוכרוז קר לקרח כדי לשמור על טמפרטורת רקמה נמוכה במהלך ניתוח מהיר.
  3. הכינו את מקום העבודה עם כלי ניתוח, תמיסת סוכרוז, צלחות פטרי והגדרת ויברטום (ראו איור 3A).
  4. הקרבה של בעלי חיים חייבת להתבצע בתוך כ-15 דקות לאחר הפסקת DBS, ויש להתחיל מיד לאחר מכן. ערפו את ראש החיה בהרדמה עמוקה המושרת עם איזופלורן נדיף. הניחו את הראש בצלחת פטרי גבוהה יותר מלאה בסוכרוז קר וקר.
  5. נתח את המוח על ידי הימנעות מחתכים מדיאליים בתעלת השדרה כדי להגן על רקמת המוח מפני נזק.
  6. העבר את המוח לצלחת פטרי חדשה מלאה בסוכרוז קר כקרח, עם נייר סינון בתחתית כדי למנוע מהמוחון להחליק במהלך החתך.
  7. ראשית, הסר את המוחון באמצעות חיתוך קורונלי דרך הפונס עם להב (איור 3B). לאחר מכן, הסר את חצאי המוחון באמצעות חתכים פאראסגיטליים עם להב (איור 3C).
  8. הכינו את צלחת הויברטום עם טיפה של דבק סופר. הסר בזהירות את הוורמיס המוח מהצלחת פטרי. טפחו את מישור החתך הפראז'יטלי על נייר סינון לייבוש לפני הדבקת הצד הזה (איור 3D).
  9. הכניסו את צלחת הויברטום למגש ומלאו אותה בכמות סוכרוז (חצי בוץ חצי תמיסה) כדי לטבול לחלוטין את הוורמיס. אל תשכח להדלק עם קרבוגן (CB).
  10. חתכו פרוסות מוחון פאראסגיטליות בעובי 200 מיקרון במהירות קבועה של 0.08 מ"מ·שנייה-1 (איור 3E). אחסן את הפרוסות ב-ACSF בבקבוק שמקבל גזים קבועים עם CB בטמפרטורת החדר (איור 3F).
  11. אפשר לפרוסות להתאושש ב-ACSF מוגז בטמפרטורת החדר למשך כ-40 דקות לפני העברה ל-HD-MEA, שמשמש כתקופת החימום והייצוב לפני ההקלטה. במהלך תקופה זו, שמרו על ACSF בטמפרטורת החדר.

6. הכנת הבאר היחידה CorePlateTM של מערכת BioCAM DupleX MEA להקלטה

  1. הפעל את מערכת ההקלטה של BioCAM DupleX עם תוכנת Brainwave 5 (BW5) לפחות 30 דקות לפני תחילת הניסויים.
  2. לפני שמניחים את פרוסת הרקמה עלCorePlate TM Single-Well להקלטה, העריכו את רמת רעש הרקע על ידי הכנסת הבאר היחידה למערכת ההקלטה. רמת הרעש האופטימלית להקלטה איכותית צריכה להיות 9-20 מיקרו-וולט.
  3. נקה את הרפידות המצופות זהב עם 100% אתנול (איור 4A-1), את מערך האלקטרודות עם 70% אתנול, ומברשת רכה (איור 4A-2). לבסוף, שטוף את מערך האלקטרודות במי MilliQ.
  4. חבר את ה-HD-MEA/CorePlateTM למערכת ההקלטה (איור 4D-1).
  5. פיפטה כ-2 מ"ל ACSF לתוך הבאר. ודאו שאין בועות אוויר על האלקטרודות או על הקרקע (איור 4D-2).
  6. התחילו רכישה חיה והקליטו לפחות 30 שניות עם BW5.

7. ניתוח משרעת שיא לשיא

  1. כדי לנתח את ממשק הרעש, פתח את קובץ *.bxr המוקלט, המכיל 30 שניות של הקלטת רעש פנימי (הנוצר על ידי רכיבי ההתנגדות של האלקטרודות ומעגלי המגבר).
  2. בחר ב"מפת פעילות" ותחת "Metric" בחר משרעת שיא לשיא. הסקאלה מוגדרת ל-500 מיקרו-וולט, מה שמאפשר המחשת שונות האות בין מערך האלקטרודות (איור 5A).
  3. בחלון "מפת פעילות", מקם את מצביע העכבר מעל האלקטרודה המוקלטת כדי להציג את ערך המשרעת "Well Wide Mean".
  4. חלופה נוספת היא לקבוע את ערך המשרעת הממוצע על ידי יצירת קובץ אקסל (*.xlsx) תחת "ייצוא גרפי". לאחר מכן פתח את קובץ האקסל וחשב את ערך המשרעת הממוצעת [=ממוצע(מספר 1; מספר 2;...)].

8. ניתוח רעש הבסיס (סטיית תקן של אות)

  1. נתח את רעש הבסיס על ידי לחיצה על "השמעה" כדי ליצור את קובץ *.brw. לאחר מכן, בחר "מפת פעילות" ותחת "מטריקה" בחר "סטיית תקן". הקנה מידה מוגדר אוטומטית ל-30 מיקרו-וולט, ומאפשר המחשה של שונות האות בין מערך האלקטרודות (איור 5B).
  2. בחלון "מפת פעילות", העבר את מצביע העכבר מעל האלקטרודה המוקלטת כדי להציג את סטיית התקן "Well Wide Mean".
  3. חלופה נוספת היא לקבוע את סטיית התקן הממוצעת באמצעות "ייצוא תרשים" וליצור את קובץ האקסל *.xlsx. לאחר מכן, פתח את קובץ האקסל וחשב את סטיית התקן הממוצעת [=ממוצע(Number1; מספר 2;...)].

9. להערכת איכות האות:

  1. חישוב יחס אות לרעש (SNR)
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5: איכות טובה
    SNR בין 2 ל-5: איכות בינונית
    SNR < 2: איכות ירודה

10. מיקום slice בבאר אחת של CorePlate לרכישת נתונים

  1. בעזרת פיפטת פסטר, ממקמים את הפרוסה במערך האלקטרודות כך שהאזור הרצוי מכוסה על ידי אלקטרודות הקלטה (איור 4 B-1). הסר את התמיסה מהבאר (איור 4 B-2). צלם תמונה עם מיקרוסקופ זקוף.
  2. קבע את הרקמה עם עוגן החתך (איור 4C).
  3. באמצעות פיפטת פסטר של 3 מ"ל, הוסיפו טיפה אחת של ACSF לפרוסה.
  4. הסר את הנוזל באמצעות פיפטת פסטר בנפח קטן יותר. הסר את הנוזל שנותר עם חתיכת נייר מפותל (חזור על כך 7-10 פעמים) (איור 4C-2).
  5. לצורך פרפוזיה במהלך ההקלטות, השתמש ב-ACSF בטמפרטורת החדר והגדר את הקצב ל-2 מ"ל-דקה-1. מיקום הזרימה הנכנסת נמצא מעל פרוסת הרקמה, והזרימה היוצאת נמצאת בדופן הבאר (איור 4D).
  6. מומלץ הארקה נוספת של הזרימה הנכנסת והיוצאת כדי למזער רעש שנגרם מהזרימה, שניתן להשיג על ידי חיבורם למערכת ההקלטה באמצעות חוט (איור 4D-1).
  7. כדי להפחית הפרעות, כבו את המיקרוסקופ ואת אורות החדר.

11. הקלטות פעילות רשת עם CorePlateTM Single-Well

  1. הגדר את פרמטרי ההקלטה לתדר דגימה של 20,000 הרץ עם מסנן מעבר גבוה ב-100 הרץ.
    1. בתוכנת BrainWave 5, עבור לקובץ ופתח סשן הקלטה חדש.
    2. לחץ על "מקור".
    3. פתח: צ'יפ פיילוט, ובחר את ההתאמות הבאות:
      הקלטת פעילות עצבית ספונטנית בקצב דגימה: 20,000 הרץ/אלקטרודה.
      חיתוך מסנן חומרה עם מעבר גבוה: 100 הרץ.
      קצב פיצוי אור: קצר (גירוי ישיר של אור).
  2. לבחור את ערוץ כיול השבב ואת סוג העקבה הגולמית.
    1. פתח: שליטה באות, ובחר: בכיול שבב פנימי, בחר ערוץ יציאה: 1.1.
    2. לחץ על "+" ו"ציור".
    3. פתיחה: הגדרת תרשים.
    4. בחר עקבות גולמיות: גולמי וקוצים.

12. הכנסת ויישור תמונת המיקרוסקופ במפת הפעילות

  1. לחץ על "+".
  2. "שכבות והערות" להכנסת תמונת המיקרוסקופ למפת הפעילות ב-BW5:
  3. שכבות ל-Go to Well:
    1. בחר בניהול שכבות ותמונת מוחון.
    2. יישור שכבת תמונה נבחרת: לחץ על התחל.
    3. לחצו על ארבע הפינות של התמונה אחרי הרצף המספרי והגשו מועמדות.

13. הגדרת דחיסת נתונים לפני ההקלטה

  1. כדי לדחוס את הנתונים, עבור לעמוד הראשון של RECORDER:
    1. מצב תא טייס: מתקדם
    2. שמור גולמי דחוס: דחיסת גלים + אירועים: קפיצות.
    3. נגן 10 דקות לפני תחילת ההקלטה.
  2. נקה את הפדים מצופים זהב עם 100% אתנול אחרי סיום ההקלטות. לאחר מכן, מלא את הבאר במים טהורים ומבריש אותו במשך 30 שניות.
  3. לאחר מכן, מלאו את הבאר ב-70% אתנול ומברישים בעדינות את מערך האלקטרודות למשך כ-30 שניות. לבסוף, מלא את הבאר במים טהורים וצחצח בעדינות במשך 30 שניות (חזור על השלב הזה 2 או 3 פעמים).
  4. שמור על ה-CorePlateTM יבש בבאר אחת במיכל המתאים.

14. ניתוח לא מקוון של נתונים מוקלטים

  1. פתח את הקובץ הרצוי עם ה-BW5.
  2. חלק את קליפת המוח לשלוש קבוצות על ידי בחירת אלקטרודות לפי הקצאת השכבה האנטומית (שכבה מולקולרית, שכבת תא פורקינג'ה, שכבת תא גרנול).
    הערה: מספר האלקטרודות באזורים הרלוונטיים (ROIs) בכל שכבה תלוי בפעילות הספונטנית שזוהתה בכל שכבה ולכן השתנה בין ההקלטות. בדרך כלל, נותחו 25-250 אלקטרודות לכל ROI מפרוסה אחת. אלקטרודות הממוקמות באזורים המשתרעים על פני שתי שכבות אנטומיות הוצאו כדי למנוע עמימות בהקצאת השכבות. רק אלקטרודות שמיוחסות בבירור לשכבת מוחון מסוימת אחת נכללו להערכה נוספת.
    1. בחירה וקבוצות: לך לקבוצות יחידות.
    2. בניהול קבוצות יחידות, לחץ על "+" כדי ליצור קבוצה אחת ולקרוא לה.
    3. כדי לכלול יותר אלקטרודות בקבוצה, בחרו את האלקטרודות ולחצו על "הוסף או הסרה של יחידות נבחרות".
  3. ניתחו עקבות גולמיים באמצעות שיטת זיהוי קפיצות, הידועה כזיהוי קוץ תזמון מדויק (PTSD). הוא מתמקד בזיהוי מקסימום ומינימום יחסיים עם אמפליטודות שיא לשיא העולות על סף מוגדר מראש, ומבטיח זיהוי דיוק ומדויק של קפיצות.
    1. עיבוד נתונים: עבור לזיהוי Spike והגדר את המצב למתקדם.
    2. השתמש בנתונים מ: Raw.
    3. אלגוריתם: PTSD (זיהוי קפיצות מדויקות בתזמון).
    4. מקדם סטיית תקן: 8.0.
    5. תקופת חיים שיא: 2.0 מילישניות.
    6. תקופת עמידה: 1.0 מילישניות.
    7. הקצאת קפיצה: שיא שלילי.
    8. משך הגל לפני השיא: 1.0 מילישניות.
    9. משך הגל לאחר השיא: 1.5 מילישניות.
  4. לך למיון Spike וקבע את המצב למתקדם. כוון את הפרמטר הבא:
    1. משך הגל לפני השיא: 0.5 מילישניות.
    2. משך זמן לאחר גל השיא שנלקח: 1.0 מילישניות.
    3. אלגוריתם חילוץ תכונות: רגעי לג'נדר.
    4. מספר הפיצ'רים: 3.
    5. אלגוריתם אשכולות: K-Means & Silhouette.
    6. מספר הזינוקים המינימלי לכל אשכול: 20.
    7. מספר מקסימלי של אשכולות: 3.
    8. סף המתאר: 2.
  5. מייצא נתונים ל-Excel.
    1. לחצו על "תרווה".
    2. עבור לייצוא תרשימים.
    3. בחר את הגיליון האלקטרוני וייצא.

תוצאות

DBS פאלידל הגדיל את מספר הקפיצות לרמות תקינות בשכבות הקורטקס בין הקבוצות.

ניתחנו את מספר הקפיצות הכולל בשלוש שכבות של קליפת המוח — שכבת המולקולה (ML), שכבת התא פורקיניה (PL) ושכבת התא הגרגרית (GL) — בארבע קבוצות ניסוי: סוג בר (WT, N = 8), dtsz (N = 8), dtsz-Sham (N = 7), ו-dtsz-DBS (N = 7), עם ניתוחים על פרוסות שהתקבלו מבעלי חיים אלו.

בעוד שהרקמה הדיסטונית (dtsz) יצרה פחות קפיצות משמעותית, DBS הפאלידי הגדיל את מספר הזינוקים לרמות השוות לאלו של ביקורת בריאה (טבלה 3). מבחן Kruskal-Wallis H אישר זאת עוד יותר, והראה עלייה מובהקת סטטיסטית במספר הקפיצות ב-ML עבור קבוצת dtsz DBS בהשוואה לשתי קבוצות dtsz ו-dtsz-Sham (χ2(3) = 20.728, p = 0.001; איור 6A). קבוצתdt sz-DBS גם הראתה עלייה דומה בקפיצות ב-PL (χ2(3) = 16.855, p = 0.001; איור 6B) ו-GL (χ2(3) = 13.164, עמ' = 0.004; איור 6C), והגיע לערכים הניתנים להשוואה לאלו של קבוצת WT (טבלה 3).

figure-results-1
איור 1. סקירה של כלי ניתוח. התמונה מציגה מגש מסודר המכיל סט של כלים כירורגיים ומיקרוכירורגיים שתוכננו במיוחד להליכים הכוללים השתלת אלקטרודות עמוקות ומגרים. הכלים מאורגנים לפי סדר שימוש רציף, מה שמשפר את היעילות הפרוצדורלית. הם מונחים על טישו כדי לשמור על ניקיון ולהבטיח נגישות קלה במהלך ההליך. סידור זה מתמקד בדיוק, סטריליות ומוכנות לתהליכים ניתוחיים מורכבים. (1) מספריים קהה/קהה, (2) מספריים עם תפירה, (3) מספריים חדים/חדים, (4) מחזיק מחט, (5) מלקחיים לקשירת תפרים, (6) מלקחיים קשועים/מעוקלים, (7) מלקחיים משוננים, (8) מלקחיים קצרים סטנדרטיים, (9) מלקחיים סטנדרטיים, ארוכים, (10) מרית מיקרו, (11) אלקטרודה משומשת מחדש, (12) ברגים, (13) אביזרי קידוח, (14) קצה/מהדק רטרקטור, (15) בלוק חלל זכוכית שימלא ב-0.9% NaCl וקסילוקאין. למידע נוסף, בדקו את רשימת החומרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2. התקנה ניסיונית להרדמה ומיקום החיה במכשיר הסטריאוטאקסי להשתלת אלקטרודות DBS והמגרה. (א) החיה מונחת בעדינות בתוך תא אינדוקציה מותאם אישית כדי להתחיל הרדמה. (ב) תא ההשראה מחובר למסכת נשימה כדי להבטיח מתן נכון של הרדמה (השראה עם איזופלוראן ב-4%) תוך שמירה על בטיחות במהלך הטיפול. (ג) לאחר ההרדמה, בעל החיים מועבר ללוח חימום עם מסכת נשימה מחוברת (תחזוקה עם איזופלוראן ב-3%) כדי למנוע היפותרמיה ולהבטיח הרדמה רציפה במהלך הגילוח. (ד) החיה ממוקמת בקפידה במסגרת הסטריאוטקסית. נעשית חתך לאורך זמן, ומשתמשים במהדקים כדי למשוך את העור. ארבע נקודות מציינות את מיקום הברגים. הברגים מוכנסים לאזורים המסומנים, ושתי נקודות נוספות מסומנות למיקום האלקטרודות. (ה) האלקטרודה מוכנסת ל-GPi ומאובטחת בדבק לפני שהמחזיק הסטריאוטקסי מוסר ממנו. לקיבוע טוב יותר, מורחים מלט סביב האלקטרודות. תפרים אורכיים מוקטעים משמשים לסגירת אתר הניתוח, ו-(ו) המגרה ממוקם באזור הצדדים התת-עוריים של בעל החיים. החיה נשארת בחיים לאחר הניתוח, והחץ מציין את מיקום המגירה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3. איור של חתך וחיתוך מוח. (א) כלים כירורגיים להליך הניתוח. (1*) צלחת אגר פטרי ביתית, (2*) צלחת אגר פטרי, (3*) מהדק לקיבוע צינור הקרבוגן, (4*) פילטר נייר, (5*) להב, (6*) סופר-דבק, (7*) צלחת/מחזיק ויברטום, (8*) מלקחיים מעוקלים, (9*) מספריים, חד/קהה. (ב) הכנת דגימת מוח: לאחר הניתוח, המוח נחתך, והקווים המקווקו מציינים את כיוון החתך במישור הקורונלי. (ג) חתך פאראסאגיטלי: המוח נחתך לאורך המישור הפראז'יטלי שנקבע. (ד) קיבוע רקמות: רקמת המוח המתקבלת מוצמדת לפלטה/מחזיק עם דבק כדי לאבטח אותה לחתך מדויק. (ה) חתך ויברטום: הפלטה עם הרקמה המחוברת מועברת לויברטום, שם מתקבלות פרוסות דקות במיוחד (200 מיקרון). (ו) פרוסות סופיות: פרוסות מוחון פארסגיטליות מדויקות מיוצרות, מוכנות לרישום אלקטרופיזיולוגי35. למידע נוסף, בדקו את רשימת החומרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4. דוגמה לשלבים לקבלת פעילות תא טובה. (א) ניקוי: שלב זה כולל הכנת ה-HD-MEA על ידי ניקוי פני השטח כדי לוודא שאין לכלוך מפריע לחיבור (משטח מגע, A-1) או לתהליך ההקלטה (שטח שטוח, A-2). (B) מיקום חיתוך: פרוסת הרקמה ממוקמת בזהירות על HD-MEA (B-1), כדי להבטיח יישור נכון למגע יעיל עם האלקטרודות (B-2). קצה דק של הפיפטה (חץ) משמש להסרת שארית ה-ACSF, ומאפשרת להכניס את העוגן. (ג) חיבור הפרוסה: הפרוסה ממוקמת היטב על ה-HD-MEA באמצעות העוגן. בשלב זה, חשוב להניח טיפה של ACSF ואז להסיר בזהירות את הנוזל העודף באמצעות פיפטה (C-1; חץ) וחתיכת נייר ניגוב מדויקת מפותלת (C-2). זה מבטיח שהפרוסה תישאר יציבה ומחוברת היטב לאלקטרודות להקלטה מדויקת. (ד) פרפוזיה: לבסוף, מערכת פרפוזיה מחוברת ומפעילה כדי לשמור על חיוניות פרוסת הרקמה במהלך הניסוי, כאשר הזרימה הנכנסת חייבת להיות מעל הפרוסה והזרימה היוצאת קרובה לקיר (D-2). חשוב גם להסיר את כל הבועות מהקרקע כדי למזער רעש במהלך ההקלטה (כפי שמצוין על ידי החץ). הארקה נוספת מחוברת גם לצינור הזרימה וגם לצינור היציאה (D-1). פסי הקשקשים האדומים הם באורך 1.5 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5. מדדים למשרעת וסטיית תקן בהקלטות HD-MEA באמצעות תוכנת Brain Wave 5 (BW5) להערכת איכות האות. (א) מדד משרעת שיא לשיא שנבחר כדי להפיק ערכי משרעת אלקטרודה פנימיים (בקנה מידה: 500 מיקרו-וולט). (B) מדד סטיית תקן שנבחר לכימות רעש בסיסי בין אלקטרודות (בקנה מידה: 30 מיקרו-וולט). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: השפעות DBS פלידלי על פעילות הקוצים בשכבות הקורטקס המוחון: (A) שכבת מולקולרית (ML), (B) שכבת תא Purkinje (PL), ו-(C) שכבת גרגיר (GL). גרפים של Box-Whisker מציגים את הממוצע והחציון עם קו צולב ואופקי, בהתאמה, יחד עם האחוזון ה-25 וה-75. הקבוצות המתאימות הן סוג פראי (WT, n = 22 פרוסות), dtsz ללא ניתוח (n = 20 פרוסות), dtsz DBS לא פעיל (שאם, n = 20 פרוסות), ו-dtsz-DBS פעיל (n = 20 פרוסות). המובהקות הסטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן קרוסקאל-ווליס, ואחריו השוואות זוגיות של דאן (*p.< 0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

שםמשקל מולקולרי [g/ mol]ריכוז סופי [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
גלוקוז180.160.01
CaCl2 (ללא מים)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH2PO4119.980.00125
pH7.35 עד 7.40 (מתכוונן עם HCl)
אוסמוליות [מוסמול/ק"ג]290 עד 300

טבלה 1: תמיסה מלאכותית לנוזל מוח-שדרה (ACSF): הרכב וריכוזי המולר הסופיים של רכיבים ששימשו להכנת ACSF לניסויי פרוסות מוחון. ה-pH הותאם ל-7.35–7.40 עם HCl, והאוסמולליות נשמרה בין 290–300 mOsm·kg-1.

שםמשקל מולקולרי [g/mol]ריכוז סופי [mol/L]
סאכרוזה342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (ללא מים)110.980.0005
MgCl295.210.007
גלוקוז180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH2PO4119.980.00125
pH7.35 עד 7.40 (מתכוונן עם HCl)
אוסמוליות [מוסמול/ק"ג]320 עד 330

טבלה 2: תמיסת סוכרוז. הרכב וריכוזים מולריים סופיים של תמיסת הסוקרוז ששימשה במהלך הכנת פרוסות המוחון. ה-pH הותאם ל-7.35–7.40, והאוסמולליות נשמרה בין 320–330 mOsm·kg-1.

קבוצות:WTDTSZ dtsz-שאםdtsz-DBS
n22202020
מקדם שונות
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
מספר הקוצים
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

טבלה 3: סיכום מדדי הקוצים בין שכבות המוחון וקבוצות ניסוי. WT – אוגרי שליטה מסוג פראי, לא דיסטוניים; DTSZ - אוגרים ילידי DTSZ; dtsz-DBS - dtsz אוגרים במגורה רציפה במשך 11 ימים; dtsz-שאם - dtsz אוגרים שעוברים ניתוח, עם זאת, ללא DBS פעיל; ML – שכבת מולקולר; PL – שכבת תאי פורקינז'ה; GL. – שכבת תאים גרגיריים.

דיון

תיארנו גישה מתודולוגית לחקר המנגנונים של גירוי מוח עמוק (DBS) ברשת הנוירונים הדיסטונית הפתופיזיולוגית באוגרdt sz . שלבים קריטיים כוללים השתלת אלקטרודות מדויקות, הכנה מהירה לחתיכת המוחון, ותנאי רישום HD-MEA יציבים להבטחת איסוף נתונים אמין. אנו מדגימו את הליך הניתוח, הכנת פרוסות המוחון, הקלטה וטכניקות ניתוח כדי לחקור את פעילות המוחון מחוץ לחי ואת הווידולציה שלה על ידי DBS. המדידות האלקטרופיזיולוגיות באמצעות HD-MEA סיפקו תיעוד בזמן אמת של פעילות ספונטנית במוחון ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה36, שלדעתנו נחוצה לחקירת מנגנוני הגירוי המוחי העמוק הפלידל בטיפול בדיסטוניה.

דיסטוניה ידועה כיום כהפרעת רשת המאופיינת בתפוקה מוטורית לא תקינה הנובעת מאינטראקציות לקויות בין הגנגליונים הבסיסיים, המוחון והמעגלים הקורטיקליים37,38. הוכח כי חריגות במוחון ממלאות תפקיד משמעותי בדיסטוניה, כפי שנתמך הן על ידי מחקרים קליניים והן ניסיוניים 15,22,39. יתרה מזאת, מחקר אנטומי שכלל הזרקת נגיף כלבת רטרוגרדי (RV) לקורטקס המוחון של קופי Cebus מראה כי הגרעין התת-תלמוסי של הגנגליונים הבסיסיים בעל בליטה משמעותית לקורטקס40 של המוחון. ממצאים אלו מדגישים את החשיבות של חקר מעגלים מוחיים לצד רשתות הגנגליונים הבסיסיים בעת חקר המנגנונים הטיפוליים של DBS 40,41,42. שיטה זו מתאימה במיוחד למחקרים החוקרים אינטראקציות נוירונליות והשפעות נוירומודולציה בהפרעות תנועה.

לגבי המנגנונים הרשתיים של DBS הפאלידלי, מחקרים הראו כי DBS של המקטע הפנימי של הגלובוס פאלידוס (GPi) גורם לשינויים נרחבים בפעילות המוח, לא רק בתוך הגנגליונים הבסיסיים אלא גם באזורים מקושרים כמו רשת הקורטיקו-סטריאטל43, התלמוס44 והמוחון15. תצפיות אלו תומכות בהשערה ש-DBS פלידלי יכול לווסת את הפעילות לאורך רשת הגנגליונים הבסיסיים-מוחון, ותורמים ליעילותו הטיפולית בדיסטוניה. דבר זה מדגים את הצורך במחקרים פרה-קליניים לחקור מנגנוני DBS ואת היתרון של הקלטות HD-MEA ללכידת שינויים אלקטרופיזיולוגיים ברחבי הרשת. יתרה מזאת, המחקר של Kotyra ואחרים (2025) תומך בקיומו של עיצוב נוירופלסטי ארוך טווח שנגרם על ידי GPi-DBS ארוך טווח בתוך רשת המוטוריקה הדיסטונית45. ממצאי In Vivo הראו שגירוי פלידלי הפחית בהדרגה את חומרת הדיסטוניה אצל אוגריםdt sz וכי ההשפעה המועילה נמשכה גם לאחר הפסקת הגירוי, מה שמרמז שההשפעות הנגרמות על ידי DBS אינן מוגבלות לגירוי אקוטי בלבד45. בנוסף, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים עדכניים הראו מודולציה רחבת הרשת של פלסטיות סינפטית ודפוסי קפיצות לאחר DBS ארוך טווח, כולל עלייה בפעילות המוחון15, קלט מעורר מוגבר לנוירונים תלמיים מוטוריים, וקלט מעורר מקובץ יותר ל-M146 הקורטיקלי.

תוצאות מייצגות מצביעות על השפעה רחבת הרשת של גירוי מוח עמוק (DBS), כפי שניתן לראות בנורמליזציה של פעילות הקוצים בשכבות המולקולריות, תא הפורקינג'ה והתא הגרגירי של קליפת המוח באוגרים דיסטוניים (איור 6). פעילות הקוצים המוגברת שנצפתה בקבוצת DBS של dtsz הגיעה לרמות דומות לאלו של קבוצת הביקורת מסוג הבר. נורמליזציה זו של פעילות הקוצים תומכת בפוטנציאל הטיפולי של DBS לטיפול בדיסטוניה. ראוי לציין כי קבוצתdt sz-Sham הראתה ערכי קפיצות ביניים בהשוואה לקבוצת WT בכל שכבות המוחון, מה שמרמז כי השתלת אלקטרודות בלבד עשויה להשפיע על פעילות רשת המוחון. פרשנות זו תואמת את אפקט המיקרו-נגע המתוארת קלינית בדיסטוניה, שבה השתלת האלקטרודות עצמה עשויה לשפר תסמינים באופן זמני לפני תחילת הגירוי47. למרות שהאוגרdt sz משחזר תכונות מרכזיות של דיסטוניה מוכללת פרוקסיסמלית, הוא אינו משקף במלואו את ההטרוגניות הקלינית שנצפתה בין תסמונות דיסטוניה אנושיות. לכן, יש לנקוט זהירות בעת תרגום ממצאים אלה לדיסטוניה אנושית.

עבודה זו מתמודדת עם אתגרים טכניים הקשורים לעיטוף ממריצי, ניתוח DBS, הכנת פרוסות וניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים בקנה מידה רחב. השילוב של טכנולוגיית HD-MEA מבוססת CMOS מספק פלטפורמה איתנה לחקר פנימי של אינטראקציות נוירוניות מורכבות מאוד48. התוצאות שלנו תורמות להבנה מעמיקה יותר של הדינמיקה הפתופיזיולוגית שמאחורי דיסטוניה, ומציעות תובנות חשובות לגבי מנגנוני הטיפול ברמת הרשת של DBS. הקלה על ניתוח תפקודי מפורט של אזורים ספציפיים במוח והאינטראקציות ביניהם תורמת להבנה מובחנת יותר של הדינמיקה הפתופיזיולוגית ברשתות עצביות דיסטוניות, ומצד שני מספקת תובנות לגבי מנגנון הפעולה הטיפולי של DBS.

במחקר זה, בעיות טכניות הובילו לרעש רקע מוגבר ושיבוש רכישת אות יציבה במהלך הקלטות HD-MEA. צעדי פתרון תקלות נפוצים כוללים טיפול במקורות רעש, הבטחת הארקה נכונה ושמירה על מגע יציב בין רקמות אלקטרודות. במקרים של רמות רעש גבוהות או מדידות לא יציבות, יש לבדוק תחילה הארקה, חיבורי כבלים ומכשירים חשמליים סמוכים. בועות אוויר על מערך האלקטרודות עלולות גם לפגוע במגע רקמות ויציבות ההקלטה ויש להסירן בזהירות (איור 4). בנוסף, יש להבטיח העברת נתונים יציבה מהמגבר למחשב באמצעות כבל USB-C ל-USB-C איכותי. יש להוציא אלקטרודות עם רעש מתמשך בניתוח נוסף. בעוד שהקלטת אותות חוץ-תאיים באמצעות HD-MEA מאפשרת רזולוציה מרחבית גבוהה של פעילות הרשת, וביחד עם התמונה המיקרוסקופית המונחת, הקצאה לשכבות הבודדות של הקורטקס המוחון, לא ניתן לשלול שהפעילות החוץ-תאית שזוהתה נוצרה על ידי חציית אקסונים משכבה שאינה זו שהוקצתה. יתרה מזאת, בוצעו ניתוחים סטטיסטיים ברמת הפרסה, שכן כל פרוסה ייצגה רישום אלקטרופיזיולוגי עצמאי בתנאים ניסיוניים סטנדרטיים, אף על פי שחלק מהפרוסות הגיעו מאותו בעל חיים.

במהלך DBS, עלולות להתרחש בעיות נוספות עקב שחרור האלקטרודות או פגם טכני במגרה. כדי למזער בעיות אלו, יש לוודא קיבוע נכון של אלקטרודות ולשמור על תנאי טיפול סטריליים לאורך כל התהליך. זה קרה ב-5% מכלל הניסויים במחקר הנוכחי. כדי למזער את התרופפות האלקטרודות, יש לייבש את פני הגולגולת לפני קיבוע האלקטרודה בדבק או דבק דנטלי כדי לשפר את ההידבקות ולמנוע החלקה. כדי להבטיח סטריליות ולמנוע זיהום מכני, יש לטפל במגרה, קצה האלקטרודה ובחוט המונופילמנט רק באמצעות מלקחיים או מלקחיים של המוסטזיס. בנוסף, יש לחטא כפפות באתנול ולייבש אותן לפני הטיפול בבעל החיים כדי למזער את הסיכון לזיהום. הכנה מהירה של פרוסות מוח מוחון חיונית להקלטות אלקטרופיזיולוגיות איכותיות. עם זאת, משמעות הדבר היא שלא ניתן היה לאמת את מיקום אלקטרודות ה-DBS המושתלות לאחר היום. במחקר נוסף שחקר את השפעת פרמטרי גירוי שונים על חומרת הדיסטוניה ב-dtsz-Hamster, נעשה שימוש באותם אלקטרודות גירוי וטכניקות ניתוח. כאן הצלחנו לאשר את מיקום האלקטרודה הנכוןב-94% מהניסויים 37.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה עוצמתית לחקר המנגנונים האלקטרופיזיולוגיים של DBS ותורם תובנות חשובות לגבי מנגנון הפעולה שלו. האוגרdt sz מאפשר באופן ייחודי מחקרים פרה-קליניים של השפעות DBS הפאלידי על הפנוטיפ הדיסטוני, יחד עם הקלטה ברזולוציה גבוהה של פעילות רשת הנוירונים מחוץ לחיים. התוצאות שלנו תומכות ברעיון המעורבות המוחלית בדיסטוניה ומדגישות את חשיבות הניתוח ברמת הרשת בהבנה ואופטימיזציה של טיפולי נוירומודולציה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הגרמנית למחקר (DFG) במסגרת מרכז המחקר השיתופי (SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3% H2O2Caelo15301730
50 ml conical tubeGreiner Bio-OneFalcon-type conical tube
Agar Petri dishHandmade 
Anaesthesia UnitBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Blade (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersion 5CMOS-HD-MEA platform
Breathing maskNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195For cement
Capsule Dispenser Gun Dentsply Sirona296-0003For cement
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (House system)
Cavity Block GlassAIMAIM40 mm x 40 mm
Clamp (3*)DIEFFENBACH12-1003-04stainless steel 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
Drill accessory (13)FST19007-07Tip: 7mm
Drill accessory (13)FST19007-09Tip: 9mm
Eco wipes - wipe dispenserDr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco wipes - wipe rollsDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElectrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Excavator (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Forceps (5)FST18025-10Stainless Steel 10cm
Forceps (6)AesculapBD311R9cm
Forceps (7)FST91100-12Stainless Steel 12cm
Forceps (8)FST11231-20Stainless Steel 11cm
Forceps (8*) Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Heated surgical table+integrated gas exhaustBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
Ice MachineScotsmanAF 80 AS / WS
Inflow and outflow needlesBD Microlance 1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluraneSedana medicalN001254
Mili-Q Water FilterElgaPURELAB flex 3
Needle Holder (4)FST12501-13Tungsten Carbide 13cm
OcteniseptSchülke & MayrAntiseptic solution 
Paper Filter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum anchor3Brain3Brain
Retractor Tip (14)FST18200-102.5mm
Reused Electrode (11)MicroprobesSNEX-100For Coordinates
RingerB. Braun3570030
Scissor (1)FST14078-10Stainless Steel 10cm
Scissor (2)AesculapBC144R
Scissor (3)FST14058-09Stainless Steel 9cm
Scissor (9*)FST91401-12Stainless Steel 12cm
Screw (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
ShaverExactaGT415
STELLA (software defined implantable modular platform) stimulation systemnon-commercial; developement of the University of Rostockopen source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)battery-driven DBS stimulator
Sterelizer 250FST18000-45
StereotaxicNarishigeModel SR-AR
Super glueUHU64212
Tear cream (Panthenol Nose Cream)Jenapharm5541249
Vibratome LaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
Weigh BoatCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WeigherVoltcraftTS-5000/1
Compounds used for solutions preparation
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glucose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Potassium Chloride(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-80-7
SucroseSigma-Aldrich57-50-1

מקורות

  1. Beylergil, S. B., et al. Tremor in cervical dystonia. Dystonia. , (2024).
  2. Stephen, C. D., et al. Dystonias: Clinical recognition and the role of additional diagnostic testing. Semin Neurol. , (2023).
  3. Fung, V. S. C., Jinnah, H. A., Bhatia, K., Vidailhet, M. Assessment of the patient with isolated or combined dystonia: An update on dystonia syndromes. Mov Disord. , (2013).
  4. Klepitskaya, O., Neuwelt, A. J., Nguyen, T., Leehey, M. Primary dystonia misinterpreted as Parkinson disease. Neurol Clin Pract. , (2013).
  5. Drivenes, B., et al. A child with myoclonus-dystonia (DYT11) misdiagnosed as atypical opsoclonus myoclonus syndrome. Eur J Paediatr Neurol. , (2015).
  6. Valeriani, D., Simonyan, K. A. Microstructural neural network biomarker for dystonia diagnosis identified by a DystoniaNet deep learning platform. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2020).
  7. Albanese, A., et al. Definition and classification of dystonia. Mov Disord. , (2025).
  8. Balint, B., et al. Dystonia. Nat Rev Dis Primers. , (2018).
  9. Bohne, P., et al. Cerebellar α1D-adrenergic receptors mediate stress-induced dystonia in totteringtg/tg mice. Cell Mol Life Sci. , (2025).
  10. Gwinn-Hardy, K. A., et al. Effect of hormone variations and other factors on symptom severity in women with dystonia. Mayo Clin Proc, , (2000).
  11. Kim, J. E., et al. Cerebellar 5HT-2A receptor mediates stress-induced onset of dystonia. Sci Adv. , (2021).
  12. Vitek, J. L. Pathophysiology of dystonia: A neuronal model. Mov Disord. , (2002).
  13. Rissardo, J. P., et al. Neurobiology of dystonia: Review of genetics, animal models, and neuroimaging. Brain Sci. , (2025).
  14. Bologna, M., Berardelli, A. The cerebellum and dystonia. Handb Clin Neurol. , (2018).
  15. Kragelund, F. S., et al. Network-wide effects of pallidal deep brain stimulation normalised abnormal cerebellar cortical activity in the dystonic animal model. Neurobiol Dis. , (2025).
  16. Löscher, W., Hörstermann, D. Abnormalities in amino acid neurotransmitters in discrete brain regions of genetically dystonic hamsters. J Neurochem. , (1992).
  17. Lüttig, A., et al. Short-term stimulations of the entopeduncular nucleus induce cerebellar changes of c-Fos expression in an animal model of paroxysmal dystonia. Brain Res. , (2024).
  18. Yousef, O., et al. Subthalamic nucleus versus globus pallidus internus deep brain stimulation in the treatment of dystonia: A systematic review and meta-analysis of safety and efficacy. J Clin Neurosci. , (2025).
  19. Lin, S., et al. Globus pallidus internus versus subthalamic nucleus deep brain stimulation for isolated dystonia: A 3-year follow-up. Eur J Neurol. , (2023).
  20. Liker, M. A., et al. Stereotactic awake basal ganglia electrophysiological recording and stimulation (SABERS): A novel staged procedure for personalized targeting of deep brain stimulation in pediatric movement and neuropsychiatric disorders. J Child Neurol. , (2024).
  21. Hock, A. N., et al. A randomised double-blind controlled study of deep brain stimulation for dystonia in STN or GPi: A long-term follow-up after up to 15 years. Parkinsonism Relat Disord. , (2022).
  22. Shakkottai, V. G., et al. Current opinions and areas of consensus on the role of the cerebellum in dystonia. Cerebellum. , (2017).
  23. Neychev, V. K., et al. The basal ganglia and cerebellum interact in the expression of dystonic movement. Brain. , (2008).
  24. Fredow, G., Löscher, W. Effects of pharmacological manipulation of GABAergic neurotransmission in a new mutant hamster model of paroxysmal dystonia. Eur J Pharmacol. , (1991).
  25. Löscher, W., et al. The sz mutant hamster: A genetic model of epilepsy or of paroxysmal dystonia? Mov Disord. , (1989).
  26. Richter, A., Löscher, W. Pathophysiology of idiopathic dystonia: Findings from genetic animal models. Prog Neurobiol. , (1998).
  27. Hull, C., Regehr, W. G. The cerebellar cortex. Annu Rev Neurosci. , (2022).
  28. van der Heijden, M. E., Sillitoe, R. V. Interactions between Purkinje cells and granule cells coordinate the development of functional cerebellar circuits. Neuroscience. , (2021).
  29. Emery, B. A., et al. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. , (2023).
  30. Viswam, V., et al. Impedance spectroscopy and electrophysiological imaging of cells with a high-density CMOS microelectrode array system. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. , (2018).
  31. Imfeld, K., et al. Large-scale, high-resolution data acquisition system for extracellular recording of electrophysiological activity. IEEE Trans Biomed Eng. , (2008).
  32. Berdondini, L., et al. Extracellular recordings from locally dense microelectrode arrays coupled to dissociated cortical cultures. J Neurosci Methods. , (2009).
  33. Busch, M., et al. Species-appropriate housing of laboratory rats. , GV-SOLAS Committee for Laboratory Animal Husbandry. (2019).
  34. Plocksties, F., et al. The software defined implantable modular platform (STELLA) for preclinical deep brain stimulation research in rodents. J Neural Eng. , (2021).
  35. Kragelund, F. S. Illustration of brain sectioning and slicing. , BioRender. (2026).
  36. Schröter, M., et al. Advances in large-scale electrophysiology with high-density microelectrode arrays. Lab Chip. , (2025).
  37. Paap, M., et al. Deep brain stimulation by optimized stimulators in a phenotypic model of dystonia: Effects of different frequencies. Neurobiol Dis. , (2021).
  38. Takada, M., et al. Two separate neuronal populations of the rat subthalamic nucleus project to the basal ganglia and pedunculopontine tegmental region. Brain Res. , (1988).
  39. Filip, P., Lungu, O. V., Bareš, M. Dystonia and the cerebellum: A new field of interest in movement disorders? Clin Neurophysiol. , (2013).
  40. Bostan, A. C., Strick, P. L. The basal ganglia and the cerebellum: Nodes in an integrated network. Nat Rev Neurosci. , (2018).
  41. Bostan, A. C., Dum, R. P., Strick, P. L. The basal ganglia communicate with the cerebellum. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2010).
  42. Middleton, F. A., Strick, P. L. Basal ganglia and cerebellar loops: Motor and cognitive circuits. Brain Res Rev. , (2000).
  43. Heerdegen, M., et al. Mechanisms of pallidal deep brain stimulation: Alteration of cortico-striatal synaptic communication in a dystonia animal model. Neurobiol Dis. , (2021).
  44. Pralong, E., et al. Effect of deep brain stimulation of GPI on neuronal activity of the thalamic nucleus ventralis oralis in a dystonic patient. Neurophysiol Clin. , (2003).
  45. Kotyra, M., et al. Effects of longer-term pallidal stimulation on the severity of dystonia in a phenotypic animal model. Exp Neurol. , (2026).
  46. Franz, D., et al. Network-wide modulation of synaptic plasticity and spike patterns in motor circuits after pallidal deep brain stimulation in a dystonia model. Neurobiol Dis. , (2025).
  47. Cersosimo, M. G., et al. Micro lesion effect of the globus pallidus internus and outcome with deep brain stimulation in patients with Parkinson disease and dystonia. Mov Disord. , (2009).
  48. Blotter, M. L., et al. High-quality seizure-like activity from acute brain slices using a complementary metal-oxide-semiconductor high-density microelectrode array system. J Vis Exp. (211), e67065(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DBS
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים