Method Article

בידוד ואפיון של וזיקולות חוץ-תאיות קטנות מתוך כריות שומן תת-ראשיות של חולי אוסטיאוארתריטיס

DOI:

10.3791/70518

⸱

April 3rd, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, the First Hospital of Hebei Medical University, 2Department of Orthopedic Surgery, Hebei Medical University Third Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיכום: פרוטוקול זה מציג תהליך עבודה סטנדרטי לבידוד ואפיון של ווסיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) מרקמות כריית שומן תת-ראשית אצל חולי אוסטיאוארתריטיס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs), במיוחד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) המוגדרות כווזיקולות קטנות מ-200 ננומטר, משמשות כמתווכים חיוניים לתקשורת בין-תאית ומשתחררות כמעט מכל סוגי התאים לנוזלים ביולוגיים שונים. כרית השומן התת-ראשית (IPFP) קשורה קשר הדוק להתפתחות והתקדמות של אוסטיאוארתריטיס בברך (OA). עם זאת, שיטות סטנדרטיות לבידוד sEVs ישירות מ-IPFP explants נותרות מוגבלות. אנו מציגים פרוטוקול שניתן לשחזר לבידוד ואפיון של sEVs שמקורם ברקמות IPFP שנלקחו מחולי OA. מדיום מותאם שנאסף מתרביות רקמות IPFP מנוקה ברצף מתאים ופסולת באמצעות צנטריפוגציה במהירות נמוכה, ואחריה אולטרה-צנטריפוגציה להעשיר ווסיקולות בטווח גודל ה-sEV. הוזיקולות המתקבלות מאופיינות על פי מידע מינימלי למחקרים על המלצות על שלפיות חוץ-תאיות (MISEV2023) באמצעות סט של סמנים מייצגים של חלבונים בקטגוריות פונקציונליות שונות: CD63 כטטראספנין הקשור לממברנה, ALIX ו-TSG101 כחלבונים ציטוזוליים המעורבים בביוגנזה המתווכת על ידי מכונות ESCRT (קומפלקס מיון אנדוסומלי נדרש להובלה (ESCRT), וקלנקסין כחלבון תושב רשתית אנדופלזמית לניטור פוטנציאל זיהום לא-וזיקולרי. תהליך עבודה זה מניב הכנות מוגדרות היטב ל-sEV המתאימות ליישומים במורד הזרם כגון בדיקות פונקציונליות או פרופילינג פרוטאומי במחקר אוסטיאוארתריטיס.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן תת-סוג הטרוגני של וזיקולות חוץ-תאיות, שלפי הסיווג התפעולי שהוצע על ידי החברה הבינלאומית לווסיקולות חוץ-תאיות (ISEV) במידע מינימלי ללימודי וזיקולות חוץ-תאיות (MISEV2023), מוגדרות כווזיקולות שבדרך כלל בקוטר קטן מ-200 ננומטר1. sEVs משתחררים כמעט מכל סוגי התאים לנוזלים ביולוגיים וזכו לתשומת לב גוברת בשל תפקידם החיוני כמתווכים בתקשורת בין-תאית בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים 2,3.

הממברנה של sEVs מועשרת במספר חלבונים פונקציונליים. ביניהם, טטראספנינים כמו CD63 קשורים לארגון ממברנת הווסיקולות ומיזוג4. יתרה מזאת, חלבונים ציטוזוליים הקשורים לקומפלקס המיון האנדוזומלי הנדרש להובלה (ESCRT), כגון ALIX ו-TSG101, הם חלק בלתי נפרד מהביוגנזה וההפרשה של sEV. כתוצאה מכך, הם משמשים כסמנים אמינים לאישור המקור האנדוזומלי של הוזיקולות המבודדות 5,6.

כרית השומן התת-ראשית (IPFP) זוהתה כרקמה פעילה הקשורה למפרקים, הקשורה קשר הדוק להתחלה ולהתקדמות של אוסטיאוארתריטיס (OA)7,8. בתנאים דלקתיים וניווניים, sEVs שמקורם ב-IPFP משוערים כנושאים מתווכים דלקתיים ואותות פתוגניים, ובכך תורמים לדלקת סינוביאלית ופירוק סחוס9. אפיון ה-sEVs המשתחררים מרקמות IPFP מחולי OA עשוי לספק תובנות קריטיות לגבי רשתות תקשורת בין-תאיות הקשורות למחלה.

בהתחשב בעניין הגובר ב-sEVs כמתווכים מולקולריים וסוכנים טיפוליים פוטנציאליים, חשוב להקים גישת בידוד בעלת תפוקה גבוהה, טוהר גבוה וניתנת לשחזור. למרות שאולטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית נותרה אחת מאסטרטגיות הטיהור הנפוצותביותר 10, פרוטוקולים מותאמים לסופרנטנטים של תרביות תאים או נוזלים ביולוגיים עשויים שלא להיות רלוונטיים ישירות לרקמות מוצקות שמקורן בשומן כמו IPFP. תכולת השומנים הגבוהה, המטריצה החוץ-תאית הצפופה ותנאי העיכול האנזימטיים המשתנים יכולים להשפיע על התאוששות וטוהר הוזיקולות.

תרבית פריסת רקמה מספקת גישה פיזיולוגית רלוונטית השומרת על הארכיטקטורה התאית הטבעית והאינטראקציות בין תאים, תוך מזעור הפרעות אנזימטיות מופרזות, ובכך מאפשרת איסוף של sEVs המשתחררים בתנאים קרובים למקומיים. עם זאת, כרגע חסרה זרימת עבודה סטנדרטית המותאמת במיוחד לבידוד רכבי חשמל חשמליים מתרביות אקספלנט IPFP.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד ואפיון וזיקולות חוץ-תאיות קטנות מתרביות פרח שומן אינפרת-פיטלרי של חולי אוסטיאוארתריטיס באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית, ומספק מסגרת מתודולוגית שחזורית למחקרים פונקציונליים ותרגומיים במורד הזרם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש ברקמות IPFP של חולי אוסטיאוארתריטיס במחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הראשון של אוניברסיטת הרפואה חביי (אישור מס' [2024] 018). איסוף הדגימה בוצע בתוך התקופה המאושרת, והתקבלה הסכמה בכתב מדעת מכל המשתתפים לפני רכישת הרקמה.

1. הכנת מדיום ותמיסות

  1. הכינו 500 מ"ל של מדיום DMEM/F12 מלא עם אקזוזום על ידי ערבוב 445 מ"ל מדיום בסיסי DMEM/F12, 50 מ"ל סרום בקר עוברי ללא אקזוזום (10%), ו-5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין B (100 U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל, ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה). חיטוי באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון.
  2. הכינו בופר ריצה של ווסטרן בלוט על ידי ערבוב 950 מ"ל מים מזוקקים (dH2O) עם 50 מ"ל של בופר ריצה של 20x (Tris/MOPS/SDS).
  3. הכינו בופר העברת כתם מערבי על ידי ערבוב 800 מ"ל dH2O עם 100 מ"ל של בופר העברה פי 10 ו-100 מ"ל אתנול אבסולוטי.
    הערה: בופר ההעברה המהירה הזה מותאם במיוחד להעברה רטובה בזרם גבוה (400 מ״אמפר) בטמפרטורת החדר. בשל ייצור חום נמוך, אמבטיית קרח אינה נדרשת למשך זמן העברה מתחת ל-45 דקות, מה שהוכח כיעיל העברה גבוה לחלבונים בטווח של 10–250 קילו-דלטון.
    זהירות: אתנול מוחלט דליק. לטפל באזור מאוורר היטב ולהתרחק ממקורות חום.
  4. הכינו בופר שטיפה על ידי ערבוב 50 מ"ל של 20 x TBS (200 מ"מ טריס ו-3 מ' NaCl ב-pH 7.5–7.6) ו-2 מ"ל Tween-20 עם 950 מ"ל dH2O.
  5. הכינו תמיסת עבודה כימלומינסנטית על ידי ערבוב נפחים שווים של תמיסת לומינול/משפר ובופ פרוקסיד (נדרש כ-0.1 מ"ל תמיסת עבודה לכל סנטימטר רבוע של ממברנה).
    זהירות: תת-קרקעי כימילומינסצנטי עלולים להיות מגרדים. תלבש כפפות והגנה על העיניים. סילוק פסולת כימית בהתאם לתקנות מוסדיות מקומיות.

2. הכנת רקמת IPFP ואיסוף מדיום מותנה

  1. שטוף רקמת IPFP טרייה (כ-10 גרם) שלוש פעמים עם 50 מ"ל PBS מקורר מראש בכל שטיפה באמצעות ערבוב ידני עדין בצינור הצנטריפוגה להסרת שאריות דם ביסודיות.
  2. קצצו את רקמת ה-IPFP לחתיכות בגודל של בערך 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ באמצעות מספריים סטריליים או סכין מנתח.
  3. העבר חתיכות רקמת IPFP לבקבוקי T175. הוסף 50 מ"ל של מדיום מלא עם דלדלת אקזוזום DMEM/F12. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ במשך 48 שעות עם ערבוב עדין.
  4. אסוף את המדיום המלא של DMEM/F12 (כלומר, מדיום מותכן) בצינורות של 50 מ"ל על קרח. לסנן דרך מסננת של 70 מיקרון כדי להסיר פסולת רקמה.

3. בידוד של יחידות אלטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח.

  1. צנטריפוגציה ראשונית במהירות נמוכה להסרת שאריות רקמה
    1. צנטריפוגה את המדיום המותאם ב-300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אסוף בזהירות את הסופרנטנט והעבר אותו לצינורות צנטריפוגה חדשים בנפח 50 מ"ל.
    2. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-3,000 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט והעבר אותו לצינורות חדשים, כדי לוודא שהכדור לא יופרע.
  2. צנטריפוגציה וסינון ביניים.
    1. צנטריפוגה של הסופרנטנט בעוצמה של 10,000 x g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. אספו את הסופרנטנט וסיננו דרך מסנן ואקום של 0.22 מיקרון כדי להסיר וזיקולות ומזהמים גדולים יותר.
  3. אולטרה-צנטריפוגציה ראשונה: כדורי sEV.
    1. העבר את הסופרנטנט המסונן לצינורות צנטריפוגה פוליקרבונט בנפח 40 מ"ל.
    2. אולטרה-צנטריפוגה של הדגימות בעוצמה של 110,000 x g למשך 70 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור בזווית קבועה (מקדם k = 70). הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה.
    3. תלה את הכדור ב-10 מ"ל של PBS סטרילי מקורר מראש. מסננים את התמיסה המושפעת דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון כדי להבטיח הסרת כל אגרגט שנותרו.
  4. אולטרה-צנטריפוגציה שנייה: טיהור sEV
    1. אולטרצנטריפוגה שוב במתלה ב-110,000 x g למשך 70 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור בזווית קבועה (מקדם k = 70).
    2. השליכו בזהירות את הסופרנטנט, והשאירו את כדור ה-sEV בתחתית הצינור. החזירו את הכדור הסופי של sEV ל-200 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
    3. חלק את מתלה ה-sEV ל-20 מיקרוליטר אליקווטים כדי למנוע נזק ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים. אחסן את האליקוטים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.

4. אפיון של sEVs באמצעות ניתוח ווסטרן בלוט

  1. הכינו את דגימות החלבון של sEV.
    1. מערבבים את כדור ה-sEV (מהשלב 3.5.2) עם 80–120 מיקרוליטר של בופר ליזיס RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז.
      הערה: שאפו ליחס של כ-1 מיקרוליטר של בופר RIPA לכל 0.5–1.0 מיקרוגרם של חלבון מוערך. מומלץ ריכוז חלבון סופי של לפחות 1.0 מיקרוגרם/מיקרוליטר כדי להבטיח הפרדה אלקטרופורטית יעילה וזיהוי אותות איכותי במהלך ניתוח ווסטרן בלוט.
      זהירות: בופר RIPA מכיל חומרי ניקוי ומגרים. השתמש בציוד מגן אישי.
    2. מערבוב את התערובת לזמן קצר ודוגר את הדגימות על הקרח במשך 15–30 דקות עם נדנוד עדין.
      הערה: ערבוב יסודי בשלב זה הוא קריטי להפרעה מלאה של הממברנה ולשחרור חלבון מיטבי. מערבולות לא מספקות עלולות לגרום לליזיס לא שלם ולריכוזי חלבון לא עקביים בין השכפולים.
    3. צנטריפוגה את הליזאט בעוצמה של 12,000–14,000 x g למשך 10–15 דקות. אסוף בזהירות את הסופרנטנט.
    4. קבעו את ריכוז החלבון הכולל של ליזאט sEV באמצעות בדיקת חלבון חומצה ביצינכונינית (BCA) ברגישות גבוהה.
      הערה: מומלץ לבצע בדיקת BCA ברגישות גבוהה על פני בדיקת BCA סטנדרטית לדגימות ווסיקולות חוץ-תאיות בשל טווח הגילוי הנמוך יותר שלה (0.5–20 מיקרוגרם/מ"ל), מה שמאפשר כימות מדויק של ריכוזי החלבון הנמוכים בדרך כלל המתקבלים מתכשי sEV מטוהרים. בצע את הבדיקה לפי פרוטוקול הערכה.
  2. ניתוח כתם מערבי.
    1. ערבבו את דגימות החלבון עם 5 x בופר טעינה לדגימה SDS-PAGE.
      הערה: לצורך זיהוי CD63, יש להכין דגימות באמצעות בופר טעינה לא מפחית פי 5 (ללא β-מרקפטואנול) ולדגור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. תנאים אלו שומרים על אפיטופים קונפורמציונליים ומונעים הצטברות של חלבון טטראספנין זה המושרה על ידי חום. לסמנים נוספים, כולל ALIX (חלבון X האינטראקטיבי ALG-2), TSG101 (גן רגישות גידול 101) וקלנקסין, יש להכין דגימות באמצעות בופר העמסה מפחית פי 5 המכיל 10% β-מרקפטואנול וחמם ב-95°C למשך 5 דקות כדי להבטיח דה-נאטורציה מלאה של חלבון.
    2. העמיסו את הדגימות המוכנות (בדרך כלל 20–40 מיקרוגרם חלבון כולל) לג'ל גרדיאנט מוקדם (4%–12%).
    3. טעין את סמן המשקל המולקולרי של החלבון לבאר שהוקצתה לפי המלצות היצרן.
    4. הרץ את הג'ל בבופר רץ במתח קבוע של 100 וולט.
    5. ממשיכים את הריצה במשך 1–1.5 שעה, או עד שצבע הטעינה מגיע לתחתית הג'ל.
      הערה: זמן הריצה עשוי להשתנות בהתאם למערכת האלקטרופורזה ולאחוז הג'ל.
    6. העבירו את החלבונים מהג'ל לממברנות PVDF באמצעות מערכת העברה רטובה ב-400 mA למשך 30 דקות.
      הערה: משך ההעברה עשוי להשתנות בהתאם למותג בופר ההעברה בו משתמשים.
    7. חסמו את הממברנות בבופר חסימה ללא חלבון המוכן במי מלח טריס-בופר המכיל 0.2% Tween-20 (TBS-T) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין. הבופר החוסם מנוסח ללא חלבוני סרום, ביוטין או חלבונים מזורחנים כדי למזער קשירה לא ספציפית והפרעות רקע.
    8. דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים ספציפיים המדוללים בבופר דילול נוגדנים ללא סרום המכיל מייצבים מבוססי חלבון ותוספי שימור נוגדנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (12–16 שעות) עם ערבוב עדין.
    9. שטפו את הממברנות בבופר כביסה (TBST שמכיל 0.2% Tween-20) תחת ערבוב עדין על שייקר.
    10. דגרו את הממברנות בנוגדנים משניים מתאימים בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ערבוב עדין.
    11. שטפו את הממברנות שוב בבופר כביסה תחת ערבוב עדין על שייקר.
    12. הדמיינו את רצועות החלבון באמצעות מצע כימילומינסנטי.
      אזהרה: מצעי כימילומיננצנטיים עלולים לגרום לגרות לעור ולעיניים. לבש כפפות מתאימות ומשקפי מגן. להשליך את המצע בהתאם להנחיות מוסדיות לפסולת מסוכנת.

5. אפיון של sEVs באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA)

  1. הפעל את מנתח מעקב הננו-חלקיקים ואת מודול משאבת המזרק לפי הוראות היצרן, ואפשר למערכת להתאזן לפחות 30 דקות לפני המדידה.
  2. הפשיר בעדינות את דגימות ה-EV על קרח ודילל אותן במי מלח סטריליים וללא חלקיקים עם בופר פוספט (PBS) כדי להשיג ריכוז חלקיקים אופטימלי בטווח המדידה המומלץ (בערך 1 x10 עד 109 חלקיקים למ"ל).
  3. טעין 1 מ"ל מהדגימה המדוללת לתוך מזרק סטרילי והזריק לאט את הדגימה לתא המדידה, כדי לוודא שלא יוכנסו בועות אוויר.
  4. כוון את רמת המצלמה והפוקוס כדי לדמיין בבירור חלקיקים בודדים המציגים תנועה בראוניאנית.
  5. הקליטו שלושה סרטונים של 60 שניות לכל דגימה בתנאי זרימה קבועה באמצעות משאבת המזרק כדי להבטיח התפלגות חלקיקים עקבית.
  6. נתח את הסרטונים המוקלטים באמצעות תוכנת NTA עם סף זיהוי מוגדר ל-12, גודל הטשטוש מוגדר לאוטומטי, ומרחק קפיצה מקסימלי מוגדר לאוטומטי.
  7. יצר פרופילי התפלגות וריכוז גודל חלקיקים באמצעות פונקציית הניתוח האוטומטית של התוכנה.
  8. ייצוא את הנתונים הגולמיים, גרפים של התפלגות גודל חלקיקים ומדידות ריכוז לניתוח סטטיסטי נוסף.
  9. נקה היטב את תא המדידה במים סטריליים ללא חלקיקים ואחריהם 70% אתנול, ושטף שוב במים סטריליים ללא חלקיקים כדי למנוע זיהום צולב בין הדגימות.

6. אפיון של sEVs באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני העברת (TEM)

  1. השתמש ברשתות נחושת מצופות פחמן עם 200 רשתות. בצע פריקת זוהר על הרשתות למשך 30 שניות באמצעות מערכת פריקת זוהר, אם זמינה.
  2. מרח 10 מיקרולטר של מתלה ה-sEV (תלוי מחדש ב-PBS סטרילי ומסנן) על הרשת ודגר במשך 2–5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר נוזלים עודפים על ידי נגיעה עדינה בקצה הרשת עם נייר סינון.
  4. שטוף את הרשת על ידי הנחת המשטח העמוס בדגימה ברצף על שלוש טיפות מים אולטרה-טהורות נפרדות.
  5. מרחו 10 מיקרוליטר של תמיסת חומצה פוספוטונגסטית 2% (pH 7.0) על הרשת ודגרו במשך 1–2 דקות בטמפרטורת החדר.
    זהירות: חומצה פוספוטונגסטית היא מגיב חומצי קורוזיבי שעלול לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובדרכי הנשימה. לטפל בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות והגנה מפני עיניים. השלכת פסולת מוכתמת וחומרים מזוהמים בהתאם להליכים מאושרים לפסולת כימית מסוכנת.
  6. הסירו את הכתם העודף באמצעות נייר פילטר ותנו לרשת להתייבש באוויר לחלוטין בטמפרטורת החדר לפחות 10 דקות.
  7. בחן את הרשתות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור הפועל במתח מואץ של 80 קילו-וולט.
  8. לרכוש תמונות מייצגות בהגדלות מתאימות להערכת מורפולוגיית הווסיקולות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידוד המוצלח של וזיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) מרקמות רפידות שומן תת-ראשיות (IPFP) של האדם אושר באמצעות אפיון רב-מודלי.

מיקרוסקופ אלקטרוני העברה (TEM) גילה כי הווסיקולות המבודדות הציגו את המורפולוגיה האופיינית בצורת עם ממברנות דו-שכבתיות שומן מוגדרות בבירור, בהתאם לתכונות המבניות של sEVs (איור 1)11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה שניתן לשחזר ולבצע פרקטיקה מעשית לבידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) מרקמות רפידת שומן אינפרת-פאטלרית (IPFP) אנושיות באמצעות תרבית אקסטרפלנט ואחריה אולטרה-צנטריפוגציה דיפרנציאלית. הוזיקולות המבודדות אומתו באמצעות שיטות אפיון משלימות, כולל מיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית (TEM), ניתוח מעקב אחרי ננו-חלקיקים (NTA), וזיהוי כתמים מערביים של סמנים מבוססים של EV1. TEM אישר את קיומם של וזיקולות קשורות לממברנה עם מורפולוגיה אופיינית, NTA הראה הת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית הלאומית (מספרי מענק 2023YFC3604905), משרד האוצר של חביי (מענקים מספרים: ZF2024132 ו-ZF2024143), תוכנית שיתוף הפעולה הרפואי לחדשנות ופיתוח של הנגרוי-חביי-HR2002048

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות צנטריפוגה PET בנפח 40 מ"לHIMAC (אפנדורף הימאק טכנולוגיות)5720411148פוליאתילן טרפתלט, 26 על 90 מ"מ
70 ומיקרו; מסננת תאי mטכנולוגיית בייג'ינג לנג'יקה560049לצורך הסרת פסולת רקמה
נוגדן אנטי-אליקסביוטכנולוגיה של שנחאי אבווייזCY7215סמן חיובי sEV
נוגדן אנטי-קלנקסיןביוטכנולוגיה של שנחאי אבווייזCY5839סמן שלילי (זיהום ב-ER)
נוגדן אנטי-CD63אפיניטי ביוסיינססDF2305סמן טטראספנין
נוגדן אנטי-TSG101ביוטכנולוגיה של שנחאי אבווייזCY5985סמן חיובי sEV
ערכת בדיקת חלבון BCAביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייZJ102לכימות חלבונים
בקבוק תרבית תאים (T175)ביוטכנולוגיה NEST560229לגידול צמח של IPFP
צינור צנטריפוגה (50 מ"ל)BIOFIL560041לצעדים ראשוניים במהירות נמוכה
סרום בקר עוברי מדולל מאקזוזוםסייגן ביוסיינסFBSNE-01061לתרבית רקמות
HRP Goat נגד Cricket IgGביוטכנולוגיה של שנחאי אבווייזAB0101נוגדן משני ל-WB
בופר טעינת חלבון מיידית (שינוי, הפחתה, 5&פי;)ביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייLT101לדנטורציה של חלבון
ערכת בדיקת חלבון מיקרו-BCAתרמו-סיינטיפיק23235לכימות חלבונים
יחידת סינון Millex-GP (0.22 & מיקרו; m)טכנולוגיית בייג'ינג לנג'יקה560360סטרילי, לסינון ווסיקולות
מנתח מעקב ננו-חלקיקיםמלוורן אנליטיNanoSight NS300לניתוח גודל וריכוז
בופר העברה מהיר ללא קרח אומני-פלאשביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייPS201Sלהעברת חלבון ווסטרן בלוט
חומצה פוספוטונגסטית (2%)סיגמא-אלדריץ'P4006לצביעת TEM שלילית
בופר טעינת חלבון (דנטורציה, לא מפחית, 5&פעמים;)ביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייLT103לדנטורציה של חלבון
בופר חסימה מהיר ללא חלבון (5&;)ביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייPS108לחסום את הממברנות
מאגר ניתוק RIPAבייג'ינג סולארביו סיינס & טכנולוגיה בע"מR0010להפקת חלבון sEV
TBS(20×)בייג'ינג סולארביו סיינס & טכנולוגיה בע"מT1080להכנת בופר כביסה
מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת חשמלהיטאצ'יHT7800לצורך אפיון מורפולוגי
בופר אלקטרופורזה Tris/MOPS/SDSביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייPS120להפרדת חלבונים
טווין-20בייג'ינג סולארביו סיינס & טכנולוגיה בע"מT8220להכנת בופר כביסה
אולטרה-צנטריפוגהHIMAC (אפנדורף הימאק טכנולוגיות)CP100NXמערכת בידוד במהירות גבוהה
ערכת זיהוי כימילומינסצנטי רגישה במיוחדביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייSQ201להמחשת רצועות חלבון
בופר דילול נוגדנים אוניברסליביוטכנולוגיה של שנגחאי יאמייPS119Lלנוגדנים ראשוניים/משניים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. Journal of Extracellular Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Zhao, R., et al. Adipose tissue-derived exosome maintains metabolic balance of extracellular matrix in rat nucleus pulposus cells. International Journal of Nanomedicine. 20, 2411-2425 (2025).
  4. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 4389(2021).
  5. Larios, J., Mercier, V., Roux, A., Gruenberg, J. ALIX- and ESCRT-III-dependent sorting of tetraspanins to exosomes. Journal of Cell Biology. 219 (3), e201904113(2020).
  6. Ferreira, J. V., et al. LAMP2A regulates the loading of proteins into exosomes. Science Advances. 8 (12), eabm1140(2022).
  7. Tang, S., et al. Single-cell atlas of human infrapatellar fat pad and synovium implicates APOE signaling in osteoarthritis pathology. Science Translational Medicine. 16 (731), eadf4590(2024).
  8. Peters, H., et al. Cell and transcriptomic diversity of infrapatellar fat pad during knee osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 84 (2), 351-367 (2025).
  9. Cao, Y., et al. Extracellular vesicles in infrapatellar fat pad from osteoarthritis patients impair cartilage metabolism and induce senescence. Advanced Science. 11 (3), e2303614(2024).
  10. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  11. Pascucci, L., Scattini, G. Imaging extracellular vesicles by transmission electron microscopy: coping with technical hurdles and morphological interpretation. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1865 (4), 129648(2021).
  12. Kowal, E. J. K., Ter-Ovanesyan, D., Regev, A., Church, G. M. Extracellular vesicle isolation and analysis by western blotting. Methods in Molecular Biology. 1660, 143-152 (2017).
  13. Han, Y., Ye, M., Ye, S., Liu, B. Comparison of lung tissue-derived extracellular vesicles using multiple dissociation methods for profiling protein biomarkers. Biotechnology Journal. 19 (9), e202400329(2024).
  14. Xue, J., Huang, D., Zhou, H., Qin, T., Liu, Y., Chen, J. Tissue-derived extracellular vesicles: comparing Ts-EVs and Te-EVs in extraction, characteristics and research trends. Cancer Cell International. 26 (1), 82(2026).
  15. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 1039(2020).
  16. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), e12238(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesInfrapatellar Fat PadOsteoarthritis PatientsVesicle IsolationVesicle CharacterizationUltracentrifugationProtein MarkersCD63 MarkerFunctional AssaysProteomic Profiling
Video Coming Soon

Related Articles