נשימה בסיסית בקרקע כשיטה לקביעת השפעת ניהול הקרקע ופעילות מיקרוביאלית

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הנשימה הבסיסית של הקרקע באמצעות מנתח גזים אינפרא-אדום (IRGA) המאפשר ניטור מבוקר רציף של דינמיקת CO₂ בקרקע בתנאים מבוקרים והערכה שחזרה של פעילות מיקרוביאלית.

תקציר

נשימת קרקע מייצגת את העברת CO₂ מהקרקע לאטמוספרה והיא אחת מהזרימות הפחמן היבשתיות הגדולות ביותר לאחר ייצור ראשוני גולמי. מכיוון שהוא מונע בעיקר על ידי פעילות מטבולית של אורגניזמים בקרקע, הוא מוכר באופן נרחב כאינדיקטור רגיש לפעילות ביולוגית בקרקע, מחזור פחמן והשפעות של הפרעות סביבתיות או קשורות לניהול. נשימת הקרקע משלבת מקורות CO₂ מרובים, כולל נשימה אוטוטרופית משורשי צמחים ומיקרואורגניזמים בריזוספירה, ונשימה הטרוטרופית הקשורה לפירוק מיקרוביאלי של חומר אורגני. כאשר נמדדת בהיעדר מצעים חיצוניים או קלטים של חומרים מזינים עדכניים, הנשימה המיקרוביאלית נקראת נשימת בסיס קרקע (SBR).

מאמר זה מציג פרוטוקול מבוסס מנתח גזים אינפרא-אדום (IRGA) לכימות SBR בתנאי מעבדה מבוקרים. כדי לבודד את הרכיב ההטרוטרופי המיוחס למטבוליזם מיקרוביאלי בלבד, זרמי CO₂ שמקורם בצמחים מודרגים באמצעות דגימות קרקע מותנות מראש, מסננות והומוגניזות שדגרו בתנאי לחות וטמפרטורות סטנדרטיים, מה שמאפשר כימות של אבולוציית C-CO₂ המצטברת לאורך זמן, ומספקת תקן חזק לביומסה, פעילות ובריאות הקרקע המיקרוביאלית. הפרוטוקול כולל הכנת קרקע, התאמת לחות, דגירה עם בקבוקונים אטומים, מדידת CO₂ מבוססת IRGA, וחישוב הנשימה המצטברת.

במחקר זה, הערכנו SBR באמצעות מנתח גזים אינפרא-אדום (IRGA), המאפשר ניטור דינמיקת CO₂ בקרקע בתנאים מבוקרים. תוצאות מייצגות הראו כי הוספת קומפוסט שיפרה את הנשימה המיקרוביאלית בקרקעות צחיחות ממדבר טברנס, מה שמעיד על גירוי חזק של תהליכים מיקרוביאליים בעקבות תיקון אורגני. ממצאים אלו מדגישים את השימושיות של SBR כאינדיקטור להשפעות ניהול הקרקע על פעילות מיקרוביאלית, במיוחד בסביבות מדורדות ומדלדרות. מבחינה מתודולוגית, הפרוטוקול המבוסס IRGA מציע כלי מעשי למחקר ולימוד יישומים הקשורים לדינמיקת פחמן הקרקע.

מבוא

נשימת קרקע היא תהליך ביוגאוכימי מרכזי הכולל את שטף הפחמן הדו-חמצני (CO₂) מפני הקרקע אל האטמוספירה. ההערכה היא שזהו זרם הפחמן היבשתי השני בגודלו אחרי הייצור הראשוני הגולמי¹ ותורם משמעותית למחזור הפחמן העולמי². תהליך זה הוא מפתח למחזור הפחמן במערכות אקולוגיות יבשתיות ומשמש יותר ויותר כמדד רגיש לפעילות ביולוגית בקרקע ודינמיקת קליטת פחמן בקרקע ^3,4.

נשימת הקרקע נגזרת ממקורות רבים ומסווגת בדרך כלל לשני מרכיבים ביולוגיים עיקריים: נשימה אוטוטרופית, שמקורה במטבוליזם של שורשי הצמח ומיקרואורגניזמים הקשורים לריזוספירה, ונשימה הטרוטרופית, הקשורה לפירוק מיקרוביאלי של חומר אורגני בקרקע ^5,6. מקורות לא ביולוגיים כמו בליה פחמתית⁷ ופירוק פוטו-8 עשויים גם הם לתרום בתנאים מסוימים. כדי לבודד את הרכיב ההטרוטרופי המיוחס למטבוליזם מיקרוביאלי בלבד, יש להוציא את זרמי CO₂ שמקורם בצמחים.

בהקשר זה, נשימה מיקרוביאלית מוגדרת כייצור CO₂ או ספיגת O₂ על ידי מיקרואורגניזמים — כולל חיידקים, פטריות, פרוטוזואה ואצות — כתוצאה מתהליכים מטבוליים אירוביים או אנאירוביים⁹. כאשר נמדדים בהיעדר סובסטרטים חיצוניים או קלטים עדכניים של חומרים מזינים חדשים, הנשימה המיקרוביאלית נקראת נשימה^{בסיסית 10}. הנשימה הבסיסית משקפת את הפעילות המטבולית האנדוגנית של הקהילה המיקרוביאלית המקומית ולעיתים משמשת כמדד לביומסה, פעילות ורגישות להפרעות סביבתיות או אנתרופוגניות^11,12.

כדי להעריך במדויק את הנשימה הבסיסית, מתבצעות מדידות מעבדתיות על דגימות קרקע מותנות מראש, מסננות והומוגניות. טיפול מקדים זה מסיר ביעילות שורשים ומקרופאונה, ובכך מבטל את הנשימה האוטוטרופית ומאפשר התמקדות בפעילות מיקרוביאלית הטרוטרופית. למרות שסינון משנה את מבנה הקרקע המקורי, הוא משפר את ההומוגניות של הדגימה ואת השכפול, ומקל על חקר תהליכים מונעים מיקרוביאלית בבידוד⁹. הדגירה מתבצעת בדרך כלל בתנאי סביבה מבוקרים, כגון 25 מעלות צלזיוס ו-60% מקיבולת שדה הקרקע, כדי למקסם את הפעילות המיקרוביאלית מבלי להעדיף קבוצות פונקציונליות ספציפיות^13,14. בהקשר זה, לחות הקרקע וקיבולת השדה הם פרמטרים קריטיים, שכן נשימה מיקרוביאלית רגישה מאוד לזמינות מים, שמווסתת את דיפוזיית המצע, אספקת החמצן והמטבוליזם המיקרוביאלי. מסיבה זו, מדידות נשימה בסיסיות מתבצעות בדרך כלל בתנאי לחות סטנדרטיים המובעות כפרופורציה מקיבולת השדה. ה-C-CO₂ שהתפתח במהלך תקופת דגירה נמדד כמדד לנשימה בסיסית¹⁵.

פרוטוקול זה מתאים במיוחד למחקרי דגירה מבוקרת במעבדה, שמטרתם להעריך פעילות מיקרוביאלית באמצעות נשימה בסיסית בקרקעות מתוכננות מראש. הוא שימושי במיוחד להשוואת קרקעות שעברו שיטות ניהול שונות, כגון תיקון אורגני או הפרעות אחרות, באמצעות דגימות הומוגניות בתנאי טמפרטורה ולחות סטנדרטיים. מכיוון שקלטי CO₂ שמקורם בצמח אינם כלולים, השיטה מתאימה ביותר להערכת המרכיב ההטרוטרופי של נשימת הקרקע ולא את כל הנשימה בתנאי שדה.

פותחו מספר טכניקות אנליטיות לכמת נשימת הקרקע, שכל אחת מהן משתנה ברגישות, קצב העברה^{ומורכבות} תפעולית ^9,16. גישות קלאסיות כוללות ספיגת אלקלי ואחריה טיטרציה, מערכות מוליכות, כרומטוגרפיית גז וניתוח גזים אינפרא-אדום. שיטות מבוססות אלקלי הן עמידות וזולות יחסית, אך הן מספקות רזולוציה זמנית מוגבלת ועלולות להיות מושפעות מספיגה או דליפה לא שלמה של CO₂. שיטות הולכה מאפשרות מדידות רציפות, אם כי הן עשויות להיות מושפעות מטמפרטורה וחוזק יוני. כרומטוגרפיית גז מספקת כימות מדויק של CO₂ במרחב ראש ומאפשרת קביעה סימולטנית של גזים אחרים, אך היא דורשת מכשור מיוחד וכוח אדם מיומן, והתפוקה עשויה להיות מוגבלת. לעומת זאת, מנתחי גזים אינפרא-אדומים (IRGA) מאפשרים ניטור מהיר וחוזר של ריכוז CO₂ בתנאי דגירה מבוקרים, מה שהופך אותם לשימושיים במיוחד למדידות זמן של נשימה מיקרוביאלית. עם זאת, מדידות IRGA דורשות גם כיול מתאים ושליטה מדויקת בתנאי הדגירה כדי להבטיח שחזוריות, ועלולות להיות מושפעות מהסחפת אותות, הפרעות אדי מים וירידה באמינות בריכוזי CO₂ גבוהים. פיתוחים אחרונים הרחיבו את זמינות מערכות נשימת קרקע מבוססות אינפרא-אדום ו-NDIR, כולל פלטפורמות מבוססות תא וחיישנים זולות ^{ליישומים} מעבדתיים ^{ושטחיים.} בדגירות עם בקבוקונים סגורים, יש להתאים את יחס מרחב הראש לקרקע ואת המרווח בין המדידות בהתאם לקצב הנשימה הצפוי כדי למנוע הצטברות מופרזת של CO₂ במהלך הדגירה. פורסמו גם פרוטוקולים עדכניים מבוססי IRGA לתמיכה במדידות מעבדה סטנדרטיות של נשימת קרקע בתנאי דגירה^{מבוקרת 26,27}, והנחות מתודולוגיות סטנדרטיות למדידות נשימה בקרקע הוצעו גם בפרוטוקול^{FAO 28 העדכני.} בהקשר רחב יותר זה, נשימה בסיסית יכולה להיחשב גם כמרכיב אחד מהערכת בריאות הקרקע בניסויים חקלאיים ארוכי טווח. הוא משקף פעילות מטבולית מיקרוביאלית ומינרליזציה של C, בעוד שמדדים כמו שטיפת CO₂, פחמן הניתן לחמצון פרמנגנאט, ולכידת פחמן אורגנית בקרקע משלימים את תפקוד הקרקע²⁹. במחקר זה השתמשנו ב-IRGA כדילכמת את קצב הנשימה הבסיסי מדגימות קרקע שדגרו. שיטה זו מאפשרת ניטור חוזר של פליטת CO₂ במהלך תקופת הדגירה, ומקלה על הערכת פעילות מטבולית מיקרוביאלית בתנאי לחות ותרמיים מוגדרים. הפרוטוקול הבא מתאר את הליך המעבדה המשמש למדידת נשימת קרקע בסיסית בקרקעות הנחשפות לתנאי ניהול שונים.

פרוטוקול

1. הכנות

1. אוסף דגימות:
   1. אסוף דגימות לכל אופק קרקע או בין 0-10 ס"מ למקרה של מחקרים שטחיים.
      הערה: השתמש בכלים וכפפות חיטויים כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.
   2. הניחו דגימות בשקיות איזותרמיות והעבירו למעבדה בקופסה מקוררת.
   3. אם לא ניתן לבצע את עיבוד הקרקע באופן מיידי, יש לשמור על דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (עדיף לא יותר מ-48 שעות).
   4. אפשר לדגימות להתאזן לטמפרטורת החדר לפחות שעתיים לפני העיבוד והדגירה.
2. הכנת חומרים ועיבוד מקדים של הקרקע:
   1. חיטוי חומרי מעבדה על ידי טבילה ב-10% אקונומיקה או 70% אתנול למשך 30 דקות, ואז שטפו היטב במים מזוקקים ותנו להם להתייבש באוויר לפני השימוש.
      זהירות: השתמש בכפפות, חלוק מעבדה ומשקפיים בעת הפעלת חומרים כימיים אלו.
   2. השאירו דגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים לייצוב.
   3. דגימות מסננת עד 2 מ"מ. השליכו שורשים ופסולת גסה באמצעות פינצטה.
   4. נקה את המסננת אחרי כל דגימה עם תמיסת החיטוי וייבשו עם מגבת נייר.
3. קבעו את לחות הקרקע (כמות המים הקיימת) ואת קיבולת השדה (מים שיכולים לשמור על הקרקע)¹⁷.
   1. חישוב לחות הקרקע: קבעו את לחות הקרקע על ידי ייבוש בתנור (105ºC) של 20 גרם דגימה בקפסולה קרמית במשך 24 שעות¹⁸ [Eq 1].
      [איקוויל 1]
   2. קבעו קיבולת שדה באמצעות מכשיר לחץ-ממברנה מסוג "ריצ'רדס"¹⁹.
      1. הניחו דגימות קרקע מעל לוחות הקרמיקה של המכשיר המוגדרות על ידי טבעות פלסטיק.
      2. הוסיפו מים מטושטשים עד לרוויה והשאירו מינימום של 24 שעות. לאחר מכן, יש להפעיל לחץ של −0.33 בר (−33 קילופסקל) עבור 24 שעות נוספות. לאחר מכן קבעו שוב את לחות הקרקע לפי משוואה 1.
4. קבעו צפיפות קרקע (g·^mL-1). מלאו צנצנת מזופת ונפח ידוע בדגימת אדמה מיובשת בתנור ורשמו את משקל האדמה. צפיפות הקרקע היא יחס משקל לנפח של הצנצנת.
5. הכנת דגימה לדגירה:
   1. כוון את טמפרטורת האינקובטור ל-25 מעלות צלזיוס. תקן UNE-EN ISO 16072:2002 (איכות הקרקע: שיטות מעבדה לקביעת נשימה מיקרוביאלית, https://www.iso.org/standard/32096.html) מציע טמפרטורה להשוואה בין מחקרים).
   2. הערכת תנאי הלחות: חשב את נפח הלחות המזוקק הנדרש לכל דגימה כדי להגיע ל-60% מקיבולת השדה מתוך תכולת הלחות הראשונית^{בקרקע 20,21}. זו תהיה רמת הלחות בתחילת הניסוי ואין צורך בהתאמת מים במהלך תקופת הדגירה.
   3. בחירת כמות הקרקע: כמות הקרקע עשויה להשתנות בהתאם לתכולת החומר האורגני (ככל שתכולת החומר האורגני גבוהה יותר, כך נדרשת פחות אדמה לניסוי^). עם זאת, 20 גרם מוצע ככמות ייחוס.
   4. הניחו דגימות בבקבוקי זכוכית של 100 מ"ל והוספו מים מוקשים עד ל-60% של לחות קיבולת השדה. אטום את המבחנות עם ספטאום והניח אותם באינקובטור.

2. מדידות ריכוז CO₂

1. מרווח מדידה:
   1. בצע מדידות_CO2 במרווחים נבחרים בהתאם לקצב הנשימה הצפוי של הקרקע, כדי למנוע הצטברות עודפת של CO₂ בראש הבקבוקון.
   2. הימנעו מריכוזים מעל 10% (100,000 ppm) כדי למנוע עיכוב פעילות מיקרוביאלית. קצרו את מרווחי המדידה אם הריכוזים עולים על סף זה. בצע מדידות יומיות במהלך השבוע הראשון וכל 3 או 4 ימים לאחר מכן בדוגמה המייצגת שתוצג בהמשך.
2. מדידות של ריכוזי CO2 (%) באמצעות מנתח גז אינפרא-אדום (IRGA)
   1. כיילן את ה-IRGA לפני כל סשן מדידה לפי הוראות היצרן או באמצעות תקן אפס (אוויר או חנקן ללא CO) ולפחות תקן טווח אחד בריכוז CO₂ ידוע בטווח המדידה. בדוק את יציבות המכשירים ותקן סטייה בסיסית לפי הוראות היצרן. רשמו פרמטרי כיול לפני מדידות דגימה.
   2. במכשיר IRGA המתואר ברשימת החומרים, מחברים מחט עם קפילר אחד למכשיר..
   3. הכנס את הנדדל דרך המחיצה לתוך הבקבוקון כדי להוציא אליקו של גז ולרשום את ריכוז ה-CO₂ (%).
   4. בצע קריאות חוזרות על כל דגימה עד שהאות מתייצב.
3. שיקום דגימות
   1. השאירו את הבקבוקונים פתוחים באזור נקי ומוגן מפני אבק ואוויר (רצוי בתא זרימה למינרי) למשך חצי שעה לאחר כל מדידה כדי לחדש את האוויר ולמנוע מצבים אנאירוביים. אין לערבב או לערבב את הקרקע במהלך שלב האוורור הזה.
   2. אטום מחדש את המבחנות באמצעות המחיצה והחזר אותם לתא הדגירה.
4. תיקון CO₂
   1. הוסיפו בקבוקון ללא אדמה אך עם אותם תנאי פעולה כדי להתחשב בריק.
   2. החסר את ערכי הריק לדגימות כדי להסיר את תנאי_CO2 הסביבתיים.
      הערה: יש להיזהר מלנשוף קרוב לבקבוקונים הפתוחים. זה עלול להטות את התוצאות.

3. חישוב הנשימה הבסיסית של הקרקע (SBR)

1. קבעו את נפח מרחב הראש בבקבוקון (Vhs) על ידי חיסור הנפח שתופס על ידי הקרקע (צפיפות נפחית) ומים מוסיפים מנפח המבחנה הכולל [Eq 2].
2. הערכת נפח הקרקע באמצעות מדידות צפיפות תפזורת וחישוב נפח מים מהלחות המוספת. השתמש בנפח הראש המתוקן הזה בכל החישובים הבאים.
3. קביעת נפח מרחב הראש בבקבוקון (Vhs): היא מתייחסת לנפח הבקבוקון פחות נפח הקרקע ותכולת המים [Eq 2].
   [Eq 2]
4. הערכת נפח CO₂ בבקבוקון
   1. קבל נפח CO₂ בבקבוקון מקריאות IRGA של ריכוז_CO2 (%), בהתחשב בנקודת הראש האפקטיבית של נפח הבקבוקון [Eq 3].
      
      [משוואה 3]
5. הערכת מולים של CO₂ שננשפו מדגימות הקרקע:
   1. השגת מולות CO₂ שננשפו מדגימות הקרקע על ידי פתרון עבור n במשוואת חוק הגז האידיאלית (P ∙ V = n ∙ R ∙ T) [Eq 4], לאחר החלפת ה-V שחושב קודם ב-[Eq 3].
      [משוואה 4]
6. הערכת שטף CO₂ (mg C-CO₂ ק"^ג-1 קרקע ^{יבשה ביום 1})
   1. יש להוסיף מדידות בודדות של %CO₂ והערכת שטף ה-CO_{הסופי של CO2} באמצעות [Eq 5] עם השיקולים הבאים: i) משקל הדגימה הנכון בהתחשב בלחות הקרקע; ii) לשקול שמול אחד של_CO2 מסביר 12 גרם C (12000 מ"ג C).
      
      [משוואה 5]
      כאשר:
      P = לחץ גז בתוך הבקבוקון. זה אמור להיות שווה ערך לאטמוספירה (אטמוספירית). תתקן את ערכי המיקום שלך.
      Vhs = נפח מרחב הגז בבקבוקון (L)
      [% CO₂ ]= ריכוז CO₂ שנמדד באמצעות IRGA
      R = קבוע גז = 0.082 L·atm· K⁻¹·mol⁻¹
      T = טמפרטורת דגירה בקלוין
      אדמה יבשה = מסת קרקע יבשה בקילוגרם
      t = זמן הדגירה בימים
      סיכום תהליך העבודה של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

איור 1: תהליך העבודה של פרוטוקול הנשימה הבסיסית של הקרקע מבוסס IRGA, החל מדגימת קרקע והכנה מוקדמת ועד לדגירה, מדידת IRGA וחישובים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

התוצאות שהוצגו במאמר זה תואמות לניסוי אחד שבו קרקעות דלות פוריות שונו עם קומפוסט כדי להגדיל את פרמטרי הפוריות והפעילות המיקרוביולוגית. הקרקעות המקוריות נמדדו ב"מדבר טברנס" (דרום-מזרח ספרד), אזור עם אקלים חצי-צחיח וקרקעות מפותחות דלות²². כ-40 ק"ג מתוך 30 הס"מ העליונים של שדה חקלאי אחד נלקחו, נלקחו למעבדה ונסננו 2 מ"מ כדי לקבל את שבר האדמה הדק. זה חולק ב-6 עציצים (נפח של 10 ליטר) ושלושה מהם תוקנו במינון של 10% (w:w) עם קומפוסט שמקורו בבוצה שפכית ושאריות גידול.

<...

דיון

נשימת הקרקע היא אינדיקטור רגיש לפעילות מיקרוביאלית ופירוק חומר אורגני, ומספקת מידע ראוי לציון על השפעות ניהול הקרקע ^23,24. הגישה הניסויית המתוארת במאמר זה מספקת מסגרת פשוטה ועוצמתית לכימות פעילות מיקרוביאלית בקרקע באמצעות מדידות פליטת CO₂ בתנאי מעבדה מבוקרים²⁵, והיא מבוססת ועדכנה על פי García ואח' (2003)²¹. מערכת הדגירה עם מדידות חוזרות מאפשרת ניתוח זרמי CO₂ מצטברים ויומיים, המספקים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מנפה 2 מ"מ
בקבוקים אטומים או בקבוקונים עם ספטה (100 מ"ל)
מאזניים אנליטיים
מוצץ לוח לחץ בר	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	לחישוב קיבולת שדה
מים דיוניזיים או מים מזוקקים מעוקרים
ציוד דגירה	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
עט קבוע
מד ריכוז IRGA CO2	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
שקיות ותיבת זרימה איזוטרמית			להובלת קרקעות למעבדה
תנור מעבדה			הוא חייב לאפשר הגדרה של 105ºC
תא זרימה למינרית	CRUMA	HZ-1	אופציונלי בשלב 2.3
פקק ספטום לאיטום הדוק של בקבוקונים
דגימות קרקע			נלקחו בצורה מייצגת מהאזור הנחקר.
חומרי עיקור			ניתן להשתמש בלבנה (10%) או אתנול (70%)