פרוטוקול סטנדרטי להערכת רעילות קדמיום באורגנואידים במעי הגס האנושיים באמצעות בדיקת היתכנות מבוססת לוציפראז

סיכום

הפרוטוקול שואף לזהות אורגנואידים במעי הגס האנושי ולהעריך בדיקת ביולומינסציה ATP מבוססת לוסיפראז לזיהוי רעילות הנגרמת על ידי קדמיום. הוא מעריך את היתכנות ורגישות הבדיקה על ידי כימות שינויים תלויי מינון וזמן בחיוניות האורגנידים.

תקציר

קדמיום (Cd) מסווג כמסרטן קבוצה 1 ומהווה בעיה סביבתית עולמית חמורה. מחקר זה נועד להקים מודל אורגנואידי של המעי הגס האנושי ולהעריך את היתכנות ורגישות של בדיקת ביולומינסציה ATP מבוססת לוסיפראז לזיהוי תגובות רעילות של אורגנואידים במעי הגס (COs) לחשיפה ל-Cd. תאי גזע בודדו מרקמת המעי הגס האנושית וגודלו במטריצת ממברנת הבסיס תלת-ממדית ליצירת COs. אורגנואידים טופלו בסדרה מדורגת של ריכוזי Cd למשך חשיפה שונים. נוסף תגובת חיוניות זוהרת ביחס נפח שווה, מעורבב בעדינות על ידי נדנוד בטמפרטורת החדר לקידום ליזיס וחדירת תגובה, ולאחר מכן דוגר כדי לאפשר לתגובה ביולומינצנטית להתקדם. זוהר נרשם במצב זוהר על קורא מיקרופלט רב-מצב. התאמת עקומת מינון-תגובה שימשה לחישוב ריכוז המעכב החצי-מקסימלי ולהערכת שינויים בחיוניות או בחיוניות היחסית. תאי גזע ראשוניים בודדו בהצלחה מרקמת המעי הגס האנושית ושימשו ליצירת COs. חשיפה ל-Cd גרמה לירידה תלויה במינון ובזמן בפעילות מטבולית אורגנואידית; ניתוח מינון-תגובה הניב עקומות הישרדות וערכי IC50 עבור האורגנואידים. מחקר זה מספק הנחיות מתודולוגיות ותובנות מעשיות לשימוש ב-COs אנושיים במחקרי טוקסיקולוגיה סביבתית של מתכות כבדות.

מבוא

Cd הוא מתכת כבדה טבעית המסווגת כמסרטן קבוצה 1 והפך לדאגה סביבתית עולמית¹. חשיפה אנושית ל-Cd מתרחשת בעיקר דרך שאיפה וצריכת תזונה. למרות שחשיפה כרונית במינון נמוך קשורה למגוון תוצאות בריאותיות שליליות, הפחתה משמעותית של השימוש בו ושחרור הסביבה נותרת אתגר ^2,3. תרביות דו-ממדיות מסורתיות גדלות על מצעים שטוחים וחסרות ארכיטקטורת רקמה, קוטביות תא ומיקרוסביבה של הגידול. כתוצאה מכך, יש להם יכולת מוגבלת לחזור על הטרוגניות ב-vivo ותגובות טוקסיקולוגיות אותנטיות לחשיפה לקדמיום⁴. מערכות כאלה אינן יכולות למודל כראוי אינטראקציות בין תאים, גדילה תלויה במטריצה, או התהליכים הביולוגיים שמאחורי התפתחות עמידות לתרופות⁵. מערכות אורגנואידיות תלת-ממדיות שמקורן ברקמות המטופל מציעות פלטפורמה פיזיולוגית רלוונטית יותר בהשוואה לקווי תאים דו-ממדיים קונבנציונליים⁶. אורגנואידים שומרים על התכונות הגנומיות, הארגון ההיסטולוגי והמצבים התפקודיים של הרקמה הראשונית. דבר זה מאפשר מידול מדויק יותר של צמיחת גידול, התפתחות ורגישות לרעילות קדמיום, ומספק יתרונות ברורים למידול מחלות ומחקר טוקסיקולוגיה⁷. ל-COs יש ארכיטקטורה תלת-ממדית מורכבת, הטרוגניות תאית ויכולות פנימיות להתחדשות עצמית וארגון עצמי ^8,9. השתלת COs לעכברים המקבלים יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי הגזע במעי ולווסת את המיקרו-סביבה החיסונית של המארח, וליצור השפעות הגנה⁴. בשנת 2009, סאטו ועמיתיו הראו לראשונה שתא גזע מעי בוגר בודד מסוג Lgr5⁺ יכול להתארגן ולהתמיין באופן ספונטני וליצור מבני קריפט-וילוס הכוללים את כל שושלות תאי המעי¹⁰.

האפיתל המעי מהווה את קו ההגנה הראשון מפני רעילות ל-Cd לאחר בליעה. למעשה, זמינות ביולוגית דרך הפה של Cd בדרך כלל נמוכה מ-5%. רעילות מעיים הנגרמת על ידי Cd מאופיינת בהפרעה של מפגשים בין-תאיים, הגברת החדירות הפרתאית והשראת תגובות דלקתיות. יתרה מזאת, Cd מפריע לתפקוד מערכת החיסון של המעי ומשנה את הרכב וההומאוסטזיס של מיקרוביום המעי¹¹. בהתאם למינון החשיפה ומשך החשיפה, Cd עלול לגרום לחוסר ויסות במחזור התאים, לקדם פנוטיפים אונקוגניים בהקשרים מסוימים בעוד שגורם לאפופטוזיס באחרים. Cd יכול בעקיפין לעורר ייצור ROS (מיני חמצן תגובתי), ולגרום ללחץ חמצוני ולחוסר איזון חמצון אדום. תפקוד הקולטנים, הקינאזות, הפוספטאזות, הפרוטאזות, מולקולות ההידבקות וגורמי השעתוק עשוי להיות מווסת באמצעות איתות רדוקס. Cd גם מפריע למפלי איתות, ומשנה את מצב ההפעלה של ERK1/2, JNK (קינאז סופי N-Jun) ו-p38 MAPK (קינאז חלבון מופעל על ידי מיטוגן p38) במספר סוגי תאים¹². על ידי הפעלת ERK1/2 בתוך מפל MAPK, Cd יכול לקדם התרבות והישרדות תאים, לדכא מוות תאי מתוכנת, ולתרום להיפררבולציה חריגה. Cd יכול לווסת ישירות או בעקיפין את הביטוי והפעילות של חלבוני אפקטור מרכזיים. לדוגמה, הוא מוריד את המדכא p53 ומעלה את החלבונים האנטי-אפופטוטיים כמו Bcl-2 ו-Bcl-xL, ובסופו של דבר משבש את האפופטוזיס וההומאוסטזיס במחזור התאים.

במודלים של CO המשמשים להערכת השפעות הציטוטוקסיות של Cd, מדידת תכולת ATP משמשת באופן נרחב להערכת הקיימות האורגנית. ATP, המולקולה המרכזית של חילוף החומרים של האנרגיה, משקפת ישירות את המצב המטבולי הכללי והחיוניות של אורגנואידים. לאחר חשיפה לקדמיום ב-COs, Cd גורם בעיקר לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מחמיר לחץ חמצוני ומפריע להמאוסטזיס של אנרגיה אורגנואידית. אירועים אלו פוגעים יחד בייצור ATP ובסופו של דבר מפחיתים את החיוניות האורגנית. לכן, שינויים ברמות ה-ATP משמשים כקריאה תפקודית חזקה של ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי קדמיום. בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות כוללות בדיקות MTT/CCK-8 צבעוניות, צביעה חיה/מתה, וניתוחים מבוססי ציטומטריית זרימה. בהשוואה לשיטות אלו, בדיקות מבוססות ATP מציעות יתרונות ברורים במערכות אורגנואידיות תלת-ממדיות. עקב המורכבות המבנית וההטרוגניות המרחבית הבולטת של אורגנואידים, גישות צביעה ודימות מסורתיות מוגבלות לעיתים קרובות עקב חדירת רקמה לקויה ודיוק כמותי ירוד. לעומת זאת, בדיקות ATP מתבססות על תגובה ביולומינצנטית המתווכת בלוציפראז, המאפשרת כימות ישיר מבלי להפריע למבנה האורגני. מדידת ATP מציגה רגישות גבוהה וטווח דינמי רחב. זה מאפשר זיהוי תגובות ביולוגיות רציפות, החל מדיכוי מטבולי מוקדם ועד מוות אורגנואידי, ומקל על ניתוחי מינון-תגובה מדויקים בריכוזי קדמיום משתנים. רמות ה-ATP משקפות באופן מקיף את המצב התפקודי הכללי של האורגנידים, ועולות על גישות התלויות בהערכה מורפולוגית או בסמנים מולקולריים בודדים. כתוצאה מכך, בדיקה זו מתאימה במיוחד לסריקת רעילות בתפוקה גבוהה, ומציעה יציבות ושחזור משופרות.

העיקרון המרכזי שמאחורי השימוש בביולומינסציה של ATP להערכת הרגישות של COs לחשיפת Cd הוא שלוציפראז של גחליליות מזרז את החמצון של D-לוסיפרין בנוכחות ATP, Mg²⁺ ו-O₂ כדי לייצר אוקסילוציפרין ופולט פוטונים. עוצמת האור הנפלט פרופורציונלית לתכולת ה-ATP המדידה בדגימה בתוך טווח ליניארי מוגדר. לכן, זוהר משמש כתחליף כמותי עקיף לפעילות מטבולית תאית או לחיוניות. אורגנואידים מוטמעים במטריצה חוץ-תאית ובעלי מבנה תלת-ממדי רב-שכבתי. כדי להתאים לכך, מגיבים לבדיקת ATP כוללים הרכבים ופרוצדורות אופטימליות של בופר ליזיס. אופטימיזציות אלו משפרות את ההפרעה של תאים אורגנואידים פנימיים, מעודדות שחרור ATP ומייצבות את אות הביולומינסנטי¹⁵. חשוב לציין שביולומינסצנציה של ATP מדווחת על פעילות מטבולית ולא ספירת תאים מדויקת. לדוגמה, מעכבי מיטוכונדריה יכולים להפחית משמעותית את רמות ה-ATP התאים בפרקי זמן קצרים גם כאשר התאים נשארים חיים. לעומת זאת, חלק מהצורות המוקדמות של מוות תאי עשויות לשמר באופן זמני רמות ATP גבוהות יחסית.

למרות שהדגים רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה יותר בהערכות רעילות קדמיום (Cd), מודלים אורגאנואידים במעי הגס מציגים מספר מגבלות מעשיות. בהשוואה לקווי תאים דו-ממדיים מסורתיים (דו-ממדיים), גידול אורגנואידים גוזל זמן רב יותר ודורש עלות. יתרה מזאת, התלות שלהם במטריצות שמקורן בבעלי חיים מכניסה שונות בין אצווה, מה שמגביל את השימושיות שלהן בסקר רעילות בקנה מידה גדול ובתפוקה גבוהה. בעוד שמודלים אלו מתאימים מאוד להערכת ההשפעות הטוקסיקולוגיות הישירות של מתכות כבדות על אפיתל המעי, הם עדיין אינם יכולים להחליף לחלוטין מודלים ב-vivo להערכת רעילות מערכתית או תהליכים טוקסיקוקינטיים מורכבים.

במחקר זה, רקמת המעי הגס האנושית שימשה כחומר מקור לבידוד תאי גזע במעי הגס ולהקמת COs במבחנה. אורגנואידים נחשפו ל-Cd בריכוזים שונים ובזמני חשיפה שונים. לאחר מכן נמדדה הזוהר באמצעות קורא מיקרופלט רב-מצבי במצב זיהוי זוהר. ערכי הקיימות של תאים או IC50 חושבו והוצגו באמצעות תוכנה תפעולית לקורא מיקרופלט ספציפי.

פרוטוקול

הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה של המכללה לבריאות מקצועית בסוז'ואו (אישור מס' SWYXLL202516) והתבצע בהתאם לסטנדרטים אתיים רפואיים. כל הנבדקים במחקר זה סיפקו הסכמה מדעת בכתב.

1. בידוד רקמת המעי הגס האנושית והקמת COs

1. הובלה ושימור דגימות רקמה
   1. לפני הניסוי, יש להפשיר את מטריצת ממברנת הבסיס באיטיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאזן את המדיום הנדרש לטמפרטורת החדר.
   2. יש להניח מיד את רקמת המעי הגס האנושית שהושגה מההליכים הקליניים לתמיסת שימור רקמה מקוררת מראש (2–8 מעלות צלזיוס).
      הערה: ודאו שהרקמה נשארת שקועה לחלוטין במהלך ההובלה. העבר את הדגימות למעבדה.
2. מתחת לארון בטיחות ביולוגית, הניחו את הרקמה בצלחת תרבית בגודל 6 ס"מ לבדיקה. הסר בזהירות רקמת שומן ושכבות שרירים נראות לעין באמצעות סכין מלמדים ומלקחיים, תוך שמירה על רכיבי האפיתל הנראות.
3. העבר את הרקמה לצלחת בגודל 6 ס"מ המכילה 3 מ"ל של תמיסת פוספאט (PBS) בתוספת 300 מיקרוליטר אנטיביוטיקה. חתוך את הרקמה לחתיכות של 2 מ"מ × 5 מ"מ.
4. העבר את שברי הרקמה לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
5. הוסף 10 מ"ל של PBS מקורר מראש ו-200 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA (ריכוז סופי ~10 מ"מ) לצינור.
6. הנח את הצינור על שייקר בטמפרטורת החדר וערבב אותו בעדינות ב-0.072 גרם למשך 15 דקות.
7. השתמש במלקחיים כדי להעביר את הרקמה לצלחת התרבית ולבדוק אותה תחת מיקרוסקופ. המשך לשלב הבא ברגע שמבני הקריפטה נראים או מתחילים להתנתק.
   הערה: כאשר מבני הקריפטה נראים תחת תצפית מיקרוסקופית לאחר טיפול ב-EDTA, העיכול בדרך כלל הגיע לרמה מספקת לבידוד הקריפטה, והקריפטות מתחילות להתנתק מחלקי רקמת אפיתל רפויים. קריפטות שלמות שומרות בדרך כלל על מורפולוגיה בבלוטית או צינורית מוגדרת היטב עם לומן מרכזי ברור, בעוד שעיכול יתר מייצר מספר רב של תאים בודדים מפורקים ופסולת נקרוטית.
8. סיימו את העיכול כאשר מספר קריפטות שלמות נראים וחלקי הרקמה נראים רפויים ושקופים, מה שמאפשר לפיפט עדין לשחרר בקלות קריפטות.
   הערה: דגירה ממושכת של EDTA משבשת את שלמות הקריפטה, מגבירה את הצטברות פסולת התאים ומפחיתה את חיוניות תאי הגזע במעי, ובכך מפחיתה את יעילות היווצרות האורגנידים בהמשך.
9. הוסף 15 מ"ל של PBS עם תוספים אנטיביוטיים כדי לעצור את עיכול EDTA. ערבב בעדינות.
10. צנטריפוגה את הדגימה ב-300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
11. הסר את הסופרנטנט.
12. הוסיפו 1 מ"ל מדיום תא שלם והעבירו את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
13. צנטריפוגה את המתלים ב-300 × גרם למשך 3 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
14. הוסף 500 מיקרוליטר ממטריצת ממברנת הבסיס לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וערבב היטב.
15. למזער חשיפה לטמפרטורת החדר במהלך הערבוב ולשמור על מטריצת ממברנת הבסיס על קרח כדי למנוע התמצקות מוקדמת.
16. הוסיפו 25 מיקרו-ליטר מהתערובת בזריזות לכל באר של צלחת 24 בארות ליצירת טיפה.
17. הפוך את לוח ה-24 בארות ודגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 20 דקות.
18. הוסיפו 600 מיקרול מדיום תרבית CO לכל באר.
19. השגת מדיום תרבית אורגנואידים של המעי הגס ותגובות דיסוציאציה ממקורות מסחריים והשתמשו בהם בהתאם בקפדנות להוראות היצרן.
20. להכנת תווך תרבית תאים מלא, יש להוסיף 500 מ"ל של מדיום בסיס DMEM עם 50 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) ו-5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין. ערבבו את התמיסה היטב באמצעות היפוך עדין.

2. בדיקת רגישות של COs החשופים ל-Cd

1. ציפוי ועיבוד COs בלוחות 96 בארות
   1. השליכו את מדיום התרבית מכל באר והוסיפו 500 מיקרול של תמיסת פירוק אורגנואידית. הפיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לפזר את מטריצת הממברנה בבסיס.
   2. הניחו את הצלחת המטופלת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ לעיכול, עם זמן עיכול ראשוני של 10 דקות.
   3. אספו את תמיסת העיכול מכל באר בלוח 24 בארות לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל והוסיפו 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם.
   4. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 3 דקות כדי לאסוף את האורגנואיד ולהשליך את הסופרנטנט.
   5. הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם, ערבבו היטב על ידי פיפטינג, והעבירו את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
   6. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 3 דקות, ואז להשליך את הסופרנטנט.
   7. הוסיפו 100 מיקרוליטר מטריצת ממברנת הבסיס וערבבו היטב באמצעות פיפטינג.
   8. הפרדו את האורגנואידים והערכו את מספר התאים הבודדים תחת מיקרוסקופ לפני זריעה של כ-3,000–5,000 תאים בודדים בכל באר.
   9. לשמור על צפיפות זריעה יחסית עקבית בכל קבוצות הניסוי כדי להבטיח צמיחה אורגנית שניתנת לשחזור ותוצאות ניסויים.
   10. התאם את טווח הזריעה בהתבסס על הערכה מיקרוסקופית לאחר דיסוציאציה אורגנואידית ועל תנאים שדווחו בעבר הנפוצים במחקרי תרביות אורגנואידים.
   11. הוסיפו 6 מיקרוליטר מהתערובת למרכז כל באר בלוח עם 96 בארות. השתמש ב-30 בארות בסך הכל, עם שלושה שכפולים טכניים.
   12. הפוך את הפלטה ודגר אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂ למשך 15 דקות.
   13. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואידי לכל באר בלוח עם 96 בארות.
   14. התחל בטיפול בקדמיום בדיוק 7 ימים לאחר הזריעה.
       הערה: תקופת התרבית בת 7 הימים מאפשרת לתאים בודדים להתפתח במלואם ל-COs שלמים מבנית.
2. דילול ריכוזי CD
   1. המיס 3.67 מ"ג אבקת כלוריד קדמיום ב-2 מ"ל מים סטריליים וטהורים במיוחד להכנת תמיסת מלאי של 10 מ"מ עם נפח סופי של 2 מ"ל.
   2. סטריליזציה של 2 מ"ל של תמיסת קדמיום של 10 מ"מ על ידי העברתה דרך פילטר של 0.22 מיקרון.
   3. עליקו את תמיסת הקדמיום המעוטא לצינורות צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מאור.
   4. לבש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות מגן ומשקפי מגן, לאורך כל הניסוי.
   5. בצע את כל הפעולות הקשורות בתוך מכסה אדים כימי כדי למזער סיכוני חשיפה.
   6. סווג ומנהל את כל הפסולת המכילה CD, כולל מדיום תרבית עם תוספת קדמיום, קצות פיפטה, צינורות צנטריפוגות וכלי גידול, כפסולת כימית מסוכנת.
   7. להשליך את החומרים הללו במיכלי איסוף נוזלים או פסולת מוצקה ייעודיים למתכות כבדות.
   8. להשליך את כל הפסולת בהתאם להנחיות המוסדיות ולתקנות הסביבתיות המקומיות.
   9. לעולם אל תתייחסו לפסולת Cd כאשפה כללית במעבדה או תשפכו אותה לכיור.
   10. סמנו את המכסה של לוח עם 24 בארות כ-4, 3, 2, 1 ו-0.
       הערה: לטפל באורגנידים ב-Cd בריכוזים סופיים של 40 מיקרומון, 20 מיקרומון, 10 מיקרומון, 5 מיקרומום ו-0 מיקרומון. דילול תמיסת מלאי הקדמיום חושב באמצעות הנוסחה הסטנדרטית:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. להכנת 4 מ"ל מריכוז עבודה של 20 מיקרומון, מוסיפים 8 מיקרוליטר מהתמיסה של 10 מ"מ ל-3992 מיקרוליטר של מדיום תרבית מלא. ערבבו את התמיסה היטב כדי להבטיח פיזור אחיד.
   1. הוסיפו 1.4 מ"ל מדיום גידול לבאר המסומנת ומוסיפים 700 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר שנותרו.
   2. הסר 5.6 מיקרוליטר של מדיום תרבית מה-4 המסומן היטב והוסיף 5.6 מיקרוליטר של תמיסת קדמיום. ערבב היטב.
   3. העבר 700 מיקרוליטר מהתמיסה מהבאר המסומנת '4' לבאר המסומנת '3' ולערבב היטב.
   4. חזור על תהליך ההעברה והערבוב מכל באר לבאר הבאה עם מספר נמוך יותר (מ'3' ל'2', '2' ל'1', ו'1' עד '0'), תוך ערבוב יסודי בכל שלב.
      הערה: אל תבצע כל פעולה ב-0 המסומן היטב.
   5. הסר את לוח ה-96 בארות מהאינקובטור והשליך את מדיום הגידול הקיים.
   6. סמנו את מכסה לוח ה-96 בארות משמאל לימין כ-40 מיקרומ', 20 מיקרומ', 10 מיקרומ', 5 מיקרומום ו-0 מיקרומ'.
   7. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל קדמיום לכל באר מתויגת תאימה.
   8. הנח את הצלחת באינקובטור.

3. הוספת מגיב החיוניות הזוהר

1. הסר את מגיב החיוניות הזוהר מהמקפיא בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס ואפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר. הוסיפו את תגובת החיוניות הזוהר ביחס נפח של 1:1.
2. הוסף 2.5 מ"ל של תגובת חיוניות זוהרת למאגר תגובת חד-פעמית.
3. הוסיפו 2.5 מ"ל מדיום תרבית אורגנואיד במעי הגס וערבבו היטב באמצעות פיפטינג.
4. השתמש במערכת שאיבת פסולת כדי להסיר את מדיום התרבית האורגנואידי מכל באר בלוח 96 הבארות. הימנעו משאיפת מטריצת ממברנת הבסיס מהבארות.
5. העבר 200 מיקרוליטר מהתמיסה מהמאגר החד-פעמי לכל באר בלוח 96 בארות המכיל COs, וערבב היטב באמצעות פיפטינג נמרץ. הימנעו מהחדרת בועות אוויר במהלך פיפטינג.
6. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. דגרו בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.

4. מדידת תגובת חיוניות זוהרת

1. פתח את התוכנה התפעולית לקורא המיקרופלט הספציפי (איור משלים 1A).
2. לחצו על 'קרא עכשיו' (איור משלים 1B).
3. לחץ חדש (איור משלים 1B).
4. לחץ על קריאה (איור משלים 1C).
5. בחר זוהר (איור משלים 1D).
6. בחר סיבי זוהר (איור משלים 1D).
7. לחץ OK (איור משלים 1D).
8. בחר לוח מלא (איור משלים 1E).
9. לחץ על ניקוי הכל (איור משלים 1F).
10. בחרו את המיקומים המתאימים על לוח היעד של 96 בארות, לסך כולל של 15 בארות (איור משלים 1G).
11. לחץ OK (איור משלים 1G).
12. הכניסו את לוח ה-96 בארות לתוך המכשיר (איור משלים 1H).
13. בחר להשתמש במכסה (איור משלים 1I).
14. לחץ על OK כדי להתחיל את המדידה (איור משלים 1I).
15. לאחר סיום המדידה, לחץ על ייצוא לייצא את הנתונים לאקסל (איור משלים 1J).

5. עיבוד וניתוח נתונים

1. תוכנת ניתוח נתונים סטטיסטית פתוחה המסוגלת לרגרסיה לא ליניארית. (איור משלים 2A).
2. בחר טבלת נתונים XY (איור משלים 2A).
3. הגדר X למספרים (איור משלים 2A).
4. הגדר Y ל-Enter - שכפל ערכים בעמודות משנה זו לצד זו והזן 3 שכפולים (איור משלים 2A).
5. הכירו את הנתונים (איור משלים 2B).
6. ניתוחי לחיצה (איור משלים 2C).
7. Click XY ניתוחים (איור משלים 2D).
8. לחץ על רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) (איור משלים 2D).
9. לחץ אוקיי. (איור משלים 2D).
10. בחירת מינון–תגובה – עיכוב (איור משלים 2E).
11. בחר לוגריתם (מעכב) לעומת תגובה מנורמלת – שיפוע משתנה (איור משלים 2E).
12. לחץ על אישור כדי להריץ את הניתוח (איור משלים 2E).
13. לחץ על קובץ (איור משלים 2F).
14. לחץ על ייצוא (איור משלים 2F).
15. לחץ OK (איור משלים 2G).

תוצאות

הקמת קצינים אנושיים
הצלחנו לבודד בהצלחה מבני קריפטה של המעי הגס מדגימות רקמה, ומורפולוגיית הקריפטה הטיפוסית נצפתה בבירור תחת מיקרוסקופיה בהגדלה נמוכה וגבוהה. במהלך תרבית חוץ-גופית, הקברים המבודדים התרחבו בהדרגה והציגו תהליך מסודר של בגרות מורפולוגית (איור 1A,B). ביום השלישי וה-6 של התרבות, נוצרו אורגנואידים במגעי מעי הגס שלמים מבניים, המציגים בעיקר מבנים כדוריים או דמויי נחיטה מוקדמת (איור 1C,D

דיון

מחקר זה קובע פרוטוקול סטנדרטי לחשיפה לקדמיום ולבדיקות היתכנות ATP באמצעות COs להערכת השפעת הקדמיום על חיוניות אורגנואידים. פרוטוקול זה מייעל במיוחד את פירוק האורגנידים ואת שלבי הציפוי של 96 בארות כדי לשפר את השחזוריות הניסיונית ואת יציבות תוצאות בדיקות ATP הבאות. למרות שהפרוטוקול הניסויי הנוכחי מתמקד בעיקר בהקמת מודל אורגנואיד תלת-ממדי לסרטן המעי הגס להערכת רעילות Cd, מחקרים נרחבים הראו כי תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות ומודלים תלת-ממדיים אורגנואידים שונים משמעותית בתגובות התרופות, אינטר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	התוכנה התפעולית עבור קורא מיקרו-לוח מסוים.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	חומר רייגנט זורח בנפח יחס של 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	המטריצה של ממברנה בסיסית
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	פתרון פירוק אורגנואיד
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		התוכנה התפעולית עבור קורא מיקרו-לוח מסוים.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S