מאמר שיטה

פרוטוקול סטנדרטי להערכת רעילות קדמיום באורגנואידים במעי הגס האנושיים באמצעות בדיקת היתכנות מבוססת לוציפראז

DOI:

10.3791/70531

⸱

21 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 2College of Life Science, North China University of Science and Technology, 3Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול שואף לזהות אורגנואידים במעי הגס האנושי ולהעריך בדיקת ביולומינסציה ATP מבוססת לוסיפראז לזיהוי רעילות הנגרמת על ידי קדמיום. הוא מעריך את היתכנות ורגישות הבדיקה על ידי כימות שינויים תלויי מינון וזמן בחיוניות האורגנידים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קדמיום (Cd) מסווג כמסרטן קבוצה 1 ומהווה בעיה סביבתית עולמית חמורה. מחקר זה נועד להקים מודל אורגנואידי של המעי הגס האנושי ולהעריך את היתכנות ורגישות של בדיקת ביולומינסציה ATP מבוססת לוסיפראז לזיהוי תגובות רעילות של אורגנואידים במעי הגס (COs) לחשיפה ל-Cd. תאי גזע בודדו מרקמת המעי הגס האנושית וגודלו במטריצת ממברנת הבסיס תלת-ממדית ליצירת COs. אורגנואידים טופלו בסדרה מדורגת של ריכוזי Cd למשך חשיפה שונים. נוסף תגובת חיוניות זוהרת ביחס נפח שווה, מעורבב בעדינות על ידי נדנוד בטמפרטורת החדר לקידום ליזיס וחדירת תגובה, ולאחר מכן דוגר כדי לאפשר לתגובה ביולומינצנטית להתקדם. זוהר נרשם במצב זוהר על קורא מיקרופלט רב-מצב. התאמת עקומת מינון-תגובה שימשה לחישוב ריכוז המעכב החצי-מקסימלי ולהערכת שינויים בחיוניות או בחיוניות היחסית. תאי גזע ראשוניים בודדו בהצלחה מרקמת המעי הגס האנושית ושימשו ליצירת COs. חשיפה ל-Cd גרמה לירידה תלויה במינון ובזמן בפעילות מטבולית אורגנואידית; ניתוח מינון-תגובה הניב עקומות הישרדות וערכי IC50 עבור האורגנואידים. מחקר זה מספק הנחיות מתודולוגיות ותובנות מעשיות לשימוש ב-COs אנושיים במחקרי טוקסיקולוגיה סביבתית של מתכות כבדות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cd הוא מתכת כבדה טבעית המסווגת כמסרטן קבוצה 1 והפך לדאגה סביבתית עולמית1. חשיפה אנושית ל-Cd מתרחשת בעיקר דרך שאיפה וצריכת תזונה. למרות שחשיפה כרונית במינון נמוך קשורה למגוון תוצאות בריאותיות שליליות, הפחתה משמעותית של השימוש בו ושחרור הסביבה נותרת אתגר 2,3. תרביות דו-ממדיות מסורתיות גדלות על מצעים שטוחים וחסרות ארכיטקטורת רקמה, קוטביות תא ומיקרוסביבה של הגידול. כתוצאה מכך, יש להם יכולת מוגבלת לחזור על הטרוגניות ב-vivo ותגובות טוקסיקולוגיות אותנטיות לחשיפה לקדמיום4. מערכות כאלה אינן יכולות למודל כראוי אינטראקציות בין תאים, גדילה תלויה במטריצה, או התהליכים הביולוגיים שמאחורי התפתחות עמידות לתרופות5. מערכות אורגנואידיות תלת-ממדיות שמקורן ברקמות המטופל מציעות פלטפורמה פיזיולוגית רלוונטית יותר בהשוואה לקווי תאים דו-ממדיים קונבנציונליים6. אורגנואידים שומרים על התכונות הגנומיות, הארגון ההיסטולוגי והמצבים התפקודיים של הרקמה הראשונית. דבר זה מאפשר מידול מדויק יותר של צמיחת גידול, התפתחות ורגישות לרעילות קדמיום, ומספק יתרונות ברורים למידול מחלות ומחקר טוקסיקולוגיה7. ל-COs יש ארכיטקטורה תלת-ממדית מורכבת, הטרוגניות תאית ויכולות פנימיות להתחדשות עצמית וארגון עצמי 8,9. השתלת COs לעכברים המקבלים יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי הגזע במעי ולווסת את המיקרו-סביבה החיסונית של המארח, וליצור השפעות הגנה4. בשנת 2009, סאטו ועמיתיו הראו לראשונה שתא גזע מעי בוגר בודד מסוג Lgr5⁺ יכול להתארגן ולהתמיין באופן ספונטני וליצור מבני קריפט-וילוס הכוללים את כל שושלות תאי המעי10.

האפיתל המעי מהווה את קו ההגנה הראשון מפני רעילות ל-Cd לאחר בליעה. למעשה, זמינות ביולוגית דרך הפה של Cd בדרך כלל נמוכה מ-5%. רעילות מעיים הנגרמת על ידי Cd מאופיינת בהפרעה של מפגשים בין-תאיים, הגברת החדירות הפרתאית והשראת תגובות דלקתיות. יתרה מזאת, Cd מפריע לתפקוד מערכת החיסון של המעי ומשנה את הרכב וההומאוסטזיס של מיקרוביום המעי11. בהתאם למינון החשיפה ומשך החשיפה, Cd עלול לגרום לחוסר ויסות במחזור התאים, לקדם פנוטיפים אונקוגניים בהקשרים מסוימים בעוד שגורם לאפופטוזיס באחרים. Cd יכול בעקיפין לעורר ייצור ROS (מיני חמצן תגובתי), ולגרום ללחץ חמצוני ולחוסר איזון חמצון אדום. תפקוד הקולטנים, הקינאזות, הפוספטאזות, הפרוטאזות, מולקולות ההידבקות וגורמי השעתוק עשוי להיות מווסת באמצעות איתות רדוקס. Cd גם מפריע למפלי איתות, ומשנה את מצב ההפעלה של ERK1/2, JNK (קינאז סופי N-Jun) ו-p38 MAPK (קינאז חלבון מופעל על ידי מיטוגן p38) במספר סוגי תאים12. על ידי הפעלת ERK1/2 בתוך מפל MAPK, Cd יכול לקדם התרבות והישרדות תאים, לדכא מוות תאי מתוכנת, ולתרום להיפררבולציה חריגה. Cd יכול לווסת ישירות או בעקיפין את הביטוי והפעילות של חלבוני אפקטור מרכזיים. לדוגמה, הוא מוריד את המדכא p53 ומעלה את החלבונים האנטי-אפופטוטיים כמו Bcl-2 ו-Bcl-xL, ובסופו של דבר משבש את האפופטוזיס וההומאוסטזיס במחזור התאים.

במודלים של CO המשמשים להערכת השפעות הציטוטוקסיות של Cd, מדידת תכולת ATP משמשת באופן נרחב להערכת הקיימות האורגנית. ATP, המולקולה המרכזית של חילוף החומרים של האנרגיה, משקפת ישירות את המצב המטבולי הכללי והחיוניות של אורגנואידים. לאחר חשיפה לקדמיום ב-COs, Cd גורם בעיקר לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מחמיר לחץ חמצוני ומפריע להמאוסטזיס של אנרגיה אורגנואידית. אירועים אלו פוגעים יחד בייצור ATP ובסופו של דבר מפחיתים את החיוניות האורגנית. לכן, שינויים ברמות ה-ATP משמשים כקריאה תפקודית חזקה של ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי קדמיום. בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות כוללות בדיקות MTT/CCK-8 צבעוניות, צביעה חיה/מתה, וניתוחים מבוססי ציטומטריית זרימה. בהשוואה לשיטות אלו, בדיקות מבוססות ATP מציעות יתרונות ברורים במערכות אורגנואידיות תלת-ממדיות. עקב המורכבות המבנית וההטרוגניות המרחבית הבולטת של אורגנואידים, גישות צביעה ודימות מסורתיות מוגבלות לעיתים קרובות עקב חדירת רקמה לקויה ודיוק כמותי ירוד. לעומת זאת, בדיקות ATP מתבססות על תגובה ביולומינצנטית המתווכת בלוציפראז, המאפשרת כימות ישיר מבלי להפריע למבנה האורגני. מדידת ATP מציגה רגישות גבוהה וטווח דינמי רחב. זה מאפשר זיהוי תגובות ביולוגיות רציפות, החל מדיכוי מטבולי מוקדם ועד מוות אורגנואידי, ומקל על ניתוחי מינון-תגובה מדויקים בריכוזי קדמיום משתנים. רמות ה-ATP משקפות באופן מקיף את המצב התפקודי הכללי של האורגנידים, ועולות על גישות התלויות בהערכה מורפולוגית או בסמנים מולקולריים בודדים. כתוצאה מכך, בדיקה זו מתאימה במיוחד לסריקת רעילות בתפוקה גבוהה, ומציעה יציבות ושחזור משופרות.

העיקרון המרכזי שמאחורי השימוש בביולומינסציה של ATP להערכת הרגישות של COs לחשיפת Cd הוא שלוציפראז של גחליליות מזרז את החמצון של D-לוסיפרין בנוכחות ATP, Mg2⁺ ו-O₂ כדי לייצר אוקסילוציפרין ופולט פוטונים. עוצמת האור הנפלט פרופורציונלית לתכולת ה-ATP המדידה בדגימה בתוך טווח ליניארי מוגדר. לכן, זוהר משמש כתחליף כמותי עקיף לפעילות מטבולית תאית או לחיוניות. אורגנואידים מוטמעים במטריצה חוץ-תאית ובעלי מבנה תלת-ממדי רב-שכבתי. כדי להתאים לכך, מגיבים לבדיקת ATP כוללים הרכבים ופרוצדורות אופטימליות של בופר ליזיס. אופטימיזציות אלו משפרות את ההפרעה של תאים אורגנואידים פנימיים, מעודדות שחרור ATP ומייצבות את אות הביולומינסנטי15. חשוב לציין שביולומינסצנציה של ATP מדווחת על פעילות מטבולית ולא ספירת תאים מדויקת. לדוגמה, מעכבי מיטוכונדריה יכולים להפחית משמעותית את רמות ה-ATP התאים בפרקי זמן קצרים גם כאשר התאים נשארים חיים. לעומת זאת, חלק מהצורות המוקדמות של מוות תאי עשויות לשמר באופן זמני רמות ATP גבוהות יחסית.

למרות שהדגים רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה יותר בהערכות רעילות קדמיום (Cd), מודלים אורגאנואידים במעי הגס מציגים מספר מגבלות מעשיות. בהשוואה לקווי תאים דו-ממדיים מסורתיים (דו-ממדיים), גידול אורגנואידים גוזל זמן רב יותר ודורש עלות. יתרה מזאת, התלות שלהם במטריצות שמקורן בבעלי חיים מכניסה שונות בין אצווה, מה שמגביל את השימושיות שלהן בסקר רעילות בקנה מידה גדול ובתפוקה גבוהה. בעוד שמודלים אלו מתאימים מאוד להערכת ההשפעות הטוקסיקולוגיות הישירות של מתכות כבדות על אפיתל המעי, הם עדיין אינם יכולים להחליף לחלוטין מודלים ב-vivo להערכת רעילות מערכתית או תהליכים טוקסיקוקינטיים מורכבים.

במחקר זה, רקמת המעי הגס האנושית שימשה כחומר מקור לבידוד תאי גזע במעי הגס ולהקמת COs במבחנה. אורגנואידים נחשפו ל-Cd בריכוזים שונים ובזמני חשיפה שונים. לאחר מכן נמדדה הזוהר באמצעות קורא מיקרופלט רב-מצבי במצב זיהוי זוהר. ערכי הקיימות של תאים או IC50 חושבו והוצגו באמצעות תוכנה תפעולית לקורא מיקרופלט ספציפי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה של המכללה לבריאות מקצועית בסוז'ואו (אישור מס' SWYXLL202516) והתבצע בהתאם לסטנדרטים אתיים רפואיים. כל הנבדקים במחקר זה סיפקו הסכמה מדעת בכתב.

1. בידוד רקמת המעי הגס האנושית והקמת COs

  1. הובלה ושימור דגימות רקמה
    1. לפני הניסוי, יש להפשיר את מטריצת ממברנת הבסיס באיטיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאזן את המדיום הנדרש לטמפרטורת החדר.
    2. יש להניח מיד את רקמת המעי הגס האנושית שהושגה מההליכים הקליניים לתמיסת שימור רקמה מקוררת מראש (2–8 מעלות צלזיוס).
      הערה: ודאו שהרקמה נשארת שקועה לחלוטין במהלך ההובלה. העבר את הדגימות למעבדה.
  2. מתחת לארון בטיחות ביולוגית, הניחו את הרקמה בצלחת תרבית בגודל 6 ס"מ לבדיקה. הסר בזהירות רקמת שומן ושכבות שרירים נראות לעין באמצעות סכין מלמדים ומלקחיים, תוך שמירה על רכיבי האפיתל הנראות.
  3. העבר את הרקמה לצלחת בגודל 6 ס"מ המכילה 3 מ"ל של תמיסת פוספאט (PBS) בתוספת 300 מיקרוליטר אנטיביוטיקה. חתוך את הרקמה לחתיכות של 2 מ"מ × 5 מ"מ.
  4. העבר את שברי הרקמה לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
  5. הוסף 10 מ"ל של PBS מקורר מראש ו-200 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA (ריכוז סופי ~10 מ"מ) לצינור.
  6. הנח את הצינור על שייקר בטמפרטורת החדר וערבב אותו בעדינות ב-0.072 גרם למשך 15 דקות.
  7. השתמש במלקחיים כדי להעביר את הרקמה לצלחת התרבית ולבדוק אותה תחת מיקרוסקופ. המשך לשלב הבא ברגע שמבני הקריפטה נראים או מתחילים להתנתק.
    הערה: כאשר מבני הקריפטה נראים תחת תצפית מיקרוסקופית לאחר טיפול ב-EDTA, העיכול בדרך כלל הגיע לרמה מספקת לבידוד הקריפטה, והקריפטות מתחילות להתנתק מחלקי רקמת אפיתל רפויים. קריפטות שלמות שומרות בדרך כלל על מורפולוגיה בבלוטית או צינורית מוגדרת היטב עם לומן מרכזי ברור, בעוד שעיכול יתר מייצר מספר רב של תאים בודדים מפורקים ופסולת נקרוטית.
  8. סיימו את העיכול כאשר מספר קריפטות שלמות נראים וחלקי הרקמה נראים רפויים ושקופים, מה שמאפשר לפיפט עדין לשחרר בקלות קריפטות.
    הערה: דגירה ממושכת של EDTA משבשת את שלמות הקריפטה, מגבירה את הצטברות פסולת התאים ומפחיתה את חיוניות תאי הגזע במעי, ובכך מפחיתה את יעילות היווצרות האורגנידים בהמשך.
  9. הוסף 15 מ"ל של PBS עם תוספים אנטיביוטיים כדי לעצור את עיכול EDTA. ערבב בעדינות.
  10. צנטריפוגה את הדגימה ב-300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. הסר את הסופרנטנט.
  12. הוסיפו 1 מ"ל מדיום תא שלם והעבירו את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  13. צנטריפוגה את המתלים ב-300 × גרם למשך 3 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
  14. הוסף 500 מיקרוליטר ממטריצת ממברנת הבסיס לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וערבב היטב.
  15. למזער חשיפה לטמפרטורת החדר במהלך הערבוב ולשמור על מטריצת ממברנת הבסיס על קרח כדי למנוע התמצקות מוקדמת.
  16. הוסיפו 25 מיקרו-ליטר מהתערובת בזריזות לכל באר של צלחת 24 בארות ליצירת טיפה.
  17. הפוך את לוח ה-24 בארות ודגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 20 דקות.
  18. הוסיפו 600 מיקרול מדיום תרבית CO לכל באר.
  19. השגת מדיום תרבית אורגנואידים של המעי הגס ותגובות דיסוציאציה ממקורות מסחריים והשתמשו בהם בהתאם בקפדנות להוראות היצרן.
  20. להכנת תווך תרבית תאים מלא, יש להוסיף 500 מ"ל של מדיום בסיס DMEM עם 50 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) ו-5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין. ערבבו את התמיסה היטב באמצעות היפוך עדין.

2. בדיקת רגישות של COs החשופים ל-Cd

  1. ציפוי ועיבוד COs בלוחות 96 בארות
    1. השליכו את מדיום התרבית מכל באר והוסיפו 500 מיקרול של תמיסת פירוק אורגנואידית. הפיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לפזר את מטריצת הממברנה בבסיס.
    2. הניחו את הצלחת המטופלת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ לעיכול, עם זמן עיכול ראשוני של 10 דקות.
    3. אספו את תמיסת העיכול מכל באר בלוח 24 בארות לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל והוסיפו 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם.
    4. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 3 דקות כדי לאסוף את האורגנואיד ולהשליך את הסופרנטנט.
    5. הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם, ערבבו היטב על ידי פיפטינג, והעבירו את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    6. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 3 דקות, ואז להשליך את הסופרנטנט.
    7. הוסיפו 100 מיקרוליטר מטריצת ממברנת הבסיס וערבבו היטב באמצעות פיפטינג.
    8. הפרדו את האורגנואידים והערכו את מספר התאים הבודדים תחת מיקרוסקופ לפני זריעה של כ-3,000–5,000 תאים בודדים בכל באר.
    9. לשמור על צפיפות זריעה יחסית עקבית בכל קבוצות הניסוי כדי להבטיח צמיחה אורגנית שניתנת לשחזור ותוצאות ניסויים.
    10. התאם את טווח הזריעה בהתבסס על הערכה מיקרוסקופית לאחר דיסוציאציה אורגנואידית ועל תנאים שדווחו בעבר הנפוצים במחקרי תרביות אורגנואידים.
    11. הוסיפו 6 מיקרוליטר מהתערובת למרכז כל באר בלוח עם 96 בארות. השתמש ב-30 בארות בסך הכל, עם שלושה שכפולים טכניים.
    12. הפוך את הפלטה ודגר אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂ למשך 15 דקות.
    13. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואידי לכל באר בלוח עם 96 בארות.
    14. התחל בטיפול בקדמיום בדיוק 7 ימים לאחר הזריעה.
      הערה: תקופת התרבית בת 7 הימים מאפשרת לתאים בודדים להתפתח במלואם ל-COs שלמים מבנית.
  2. דילול ריכוזי CD
    1. המיס 3.67 מ"ג אבקת כלוריד קדמיום ב-2 מ"ל מים סטריליים וטהורים במיוחד להכנת תמיסת מלאי של 10 מ"מ עם נפח סופי של 2 מ"ל.
    2. סטריליזציה של 2 מ"ל של תמיסת קדמיום של 10 מ"מ על ידי העברתה דרך פילטר של 0.22 מיקרון.
    3. עליקו את תמיסת הקדמיום המעוטא לצינורות צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מאור.
    4. לבש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות מגן ומשקפי מגן, לאורך כל הניסוי.
    5. בצע את כל הפעולות הקשורות בתוך מכסה אדים כימי כדי למזער סיכוני חשיפה.
    6. סווג ומנהל את כל הפסולת המכילה CD, כולל מדיום תרבית עם תוספת קדמיום, קצות פיפטה, צינורות צנטריפוגות וכלי גידול, כפסולת כימית מסוכנת.
    7. להשליך את החומרים הללו במיכלי איסוף נוזלים או פסולת מוצקה ייעודיים למתכות כבדות.
    8. להשליך את כל הפסולת בהתאם להנחיות המוסדיות ולתקנות הסביבתיות המקומיות.
    9. לעולם אל תתייחסו לפסולת Cd כאשפה כללית במעבדה או תשפכו אותה לכיור.
    10. סמנו את המכסה של לוח עם 24 בארות כ-4, 3, 2, 1 ו-0.
      הערה: לטפל באורגנידים ב-Cd בריכוזים סופיים של 40 מיקרומון, 20 מיקרומון, 10 מיקרומון, 5 מיקרומום ו-0 מיקרומון. דילול תמיסת מלאי הקדמיום חושב באמצעות הנוסחה הסטנדרטית:
              C1 V1 = C2 V2
  3. להכנת 4 מ"ל מריכוז עבודה של 20 מיקרומון, מוסיפים 8 מיקרוליטר מהתמיסה של 10 מ"מ ל-3992 מיקרוליטר של מדיום תרבית מלא. ערבבו את התמיסה היטב כדי להבטיח פיזור אחיד.
    1. הוסיפו 1.4 מ"ל מדיום גידול לבאר המסומנת ומוסיפים 700 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר שנותרו.
    2. הסר 5.6 מיקרוליטר של מדיום תרבית מה-4 המסומן היטב והוסיף 5.6 מיקרוליטר של תמיסת קדמיום. ערבב היטב.
    3. העבר 700 מיקרוליטר מהתמיסה מהבאר המסומנת '4' לבאר המסומנת '3' ולערבב היטב.
    4. חזור על תהליך ההעברה והערבוב מכל באר לבאר הבאה עם מספר נמוך יותר (מ'3' ל'2', '2' ל'1', ו'1' עד '0'), תוך ערבוב יסודי בכל שלב.
      הערה: אל תבצע כל פעולה ב-0 המסומן היטב.
    5. הסר את לוח ה-96 בארות מהאינקובטור והשליך את מדיום הגידול הקיים.
    6. סמנו את מכסה לוח ה-96 בארות משמאל לימין כ-40 מיקרומ', 20 מיקרומ', 10 מיקרומ', 5 מיקרומום ו-0 מיקרומ'.
    7. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל קדמיום לכל באר מתויגת תאימה.
    8. הנח את הצלחת באינקובטור.

3. הוספת מגיב החיוניות הזוהר

  1. הסר את מגיב החיוניות הזוהר מהמקפיא בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס ואפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר. הוסיפו את תגובת החיוניות הזוהר ביחס נפח של 1:1.
  2. הוסף 2.5 מ"ל של תגובת חיוניות זוהרת למאגר תגובת חד-פעמית.
  3. הוסיפו 2.5 מ"ל מדיום תרבית אורגנואיד במעי הגס וערבבו היטב באמצעות פיפטינג.
  4. השתמש במערכת שאיבת פסולת כדי להסיר את מדיום התרבית האורגנואידי מכל באר בלוח 96 הבארות. הימנעו משאיפת מטריצת ממברנת הבסיס מהבארות.
  5. העבר 200 מיקרוליטר מהתמיסה מהמאגר החד-פעמי לכל באר בלוח 96 בארות המכיל COs, וערבב היטב באמצעות פיפטינג נמרץ. הימנעו מהחדרת בועות אוויר במהלך פיפטינג.
  6. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. דגרו בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.

4. מדידת תגובת חיוניות זוהרת

  1. פתח את התוכנה התפעולית לקורא המיקרופלט הספציפי (איור משלים 1A).
  2. לחצו על 'קרא עכשיו' (איור משלים 1B).
  3. לחץ חדש (איור משלים 1B).
  4. לחץ על קריאה (איור משלים 1C).
  5. בחר זוהר (איור משלים 1D).
  6. בחר סיבי זוהר (איור משלים 1D).
  7. לחץ OK (איור משלים 1D).
  8. בחר לוח מלא (איור משלים 1E).
  9. לחץ על ניקוי הכל (איור משלים 1F).
  10. בחרו את המיקומים המתאימים על לוח היעד של 96 בארות, לסך כולל של 15 בארות (איור משלים 1G).
  11. לחץ OK (איור משלים 1G).
  12. הכניסו את לוח ה-96 בארות לתוך המכשיר (איור משלים 1H).
  13. בחר להשתמש במכסה (איור משלים 1I).
  14. לחץ על OK כדי להתחיל את המדידה (איור משלים 1I).
  15. לאחר סיום המדידה, לחץ על ייצוא לייצא את הנתונים לאקסל (איור משלים 1J).

5. עיבוד וניתוח נתונים

  1. תוכנת ניתוח נתונים סטטיסטית פתוחה המסוגלת לרגרסיה לא ליניארית. (איור משלים 2A).
  2. בחר טבלת נתונים XY (איור משלים 2A).
  3. הגדר X למספרים (איור משלים 2A).
  4. הגדר Y ל-Enter - שכפל ערכים בעמודות משנה זו לצד זו והזן 3 שכפולים (איור משלים 2A).
  5. הכירו את הנתונים (איור משלים 2B).
  6. ניתוחי לחיצה (איור משלים 2C).
  7. Click XY ניתוחים (איור משלים 2D).
  8. לחץ על רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) (איור משלים 2D).
  9. לחץ אוקיי. (איור משלים 2D).
  10. בחירת מינון–תגובה – עיכוב (איור משלים 2E).
  11. בחר לוגריתם (מעכב) לעומת תגובה מנורמלת – שיפוע משתנה (איור משלים 2E).
  12. לחץ על אישור כדי להריץ את הניתוח (איור משלים 2E).
  13. לחץ על קובץ (איור משלים 2F).
  14. לחץ על ייצוא (איור משלים 2F).
  15. לחץ OK (איור משלים 2G).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמת קצינים אנושיים
הצלחנו לבודד בהצלחה מבני קריפטה של המעי הגס מדגימות רקמה, ומורפולוגיית הקריפטה הטיפוסית נצפתה בבירור תחת מיקרוסקופיה בהגדלה נמוכה וגבוהה. במהלך תרבית חוץ-גופית, הקברים המבודדים התרחבו בהדרגה והציגו תהליך מסודר של בגרות מורפולוגית (איור 1A,B). ביום השלישי וה-6 של התרבות, נוצרו אורגנואידים במגעי מעי הגס שלמים מבניים, המציגים בעיקר מבנים כדוריים או דמויי נחיטה מוקדמת (איור 1C,D).

רגישות של COs לחשיפה ל-Cd
COs נזרעו ללוחות של 96 בארות וגודלו במשך 5 ימים נוספים, ולאחר מכן טופלו בקדמיום בריכוזים של 0, 5, 10, 20 ו-40 מיקרומון. לאחר 72 שעות חשיפה, בוצעה בדיקת לומינסנציה מבוססת ATP למדידת יחידות זוהר יחסית (RLU), והנתונים נותחו והוצגו. התוצאות הראו ירידה משמעותית תלויה במינון בחיוניות האורגנידים עם עלייה בריכוזי קדמיום (איור 2A). COs שנחשפו ל-10 מיקרומטר, 20 מיקרומולר ו-40 מיקרומולר קדמיום הציגו ירידה משמעותית בערכי RLU (איור 2B). לא ראינו רעילות משמעותית באורגנואידים של המעי הגס שנחשפו ל-5 מיקרומולר Cd. בהתאם לנתוני הקיימות, ניתוח מורפולוגי חשף שינויים מבניים בולטים באורגנידים המעי הגס שטופלו בקדמיום, כולל הפחתת גודל האורגנואידים, הפרעה חמורה לארכיטקטורת האפיתל ופיצול מבני מתקדם (איור 2C). ממצאים אלו מצביעים על כך שאורגנואידים במעי הגס רגישים מאוד לציטוטוקסיות הנגרמת על ידי קדמיום.

figure-results-1
איור 1: בידוד קריפטות המעי הגס האנושיות והקמת תרביות אורגנואידים במעי הגס. (א) תמונה מייצגת של קריפטות המעי הגס המבודדות של בני אדם. (10×). (ב) תצוגה בהגדלה גבוהה של קריפטה בודדת (20×). (ג) תמונה מייצגת של COs לאחר 3 ימים בתרבית (4×). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: שינויים ציטוטוקסיים ומורפולוגיים שנגרמו על ידי Cd ב-COs. (א) עקומת מינון-תגובה יחסית של COs החשופים לריכוזים משתנים של Cd. ציר ה-x מייצג ריכוזי Cd, וציר ה-y מציין את הקיימות היחסית של אורגנואידים. (B) ערכי RLU יחסיים של COs לאחר טיפול בריכוזים משתנים של Cd. ציר ה-X מייצג את ריכוזי ה-Cd, וציר ה-Y מציין את ערכי ה-RLU היחסיים. ANOVA חד-כיווני *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. (C) תמונות שדה בהיר מייצגות של COs לא מטופלים (0 מיקרומ') ו-COs מטופלים ב-Cd ב-5 מיקרומטר, 10 מיקרומ', 20 מיקרומ', 40 מיקרומ'. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: תהליך עבודה מפורט בן 16 שלבים לזיהוי RLU תוך שימוש בתוכנה התפעולית לקורא מיקרופלט ספציפי. (א) אייקון תוכנה. (B) ממשק השקת תוכנה. (C) תפריט הגדרות. (ד) ממשק בחירת בדיקה. (ה) תפריט תצורת פריסת הצלחות. (ו) פריסת הלוחות ברירת המחדל. (ז) להגדיר את מיקומי הבאר לפי פריסת הלוחות הניסיוניים. (ח) טוענת המיקרופלטה. (I) המכשיר מפעיל מדידת RLU. (J) ייצוא נתונים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: לאחר ייצוא הנתונים, מתבצעים עיבוד נתונים וניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנות ניתוח נתונים סטטיסטיות. (א) מסך הבית. (ב) טבלת הזנת נתונים. (ג) דיאלוג ניתוח. (ד) תפריט פרמטרי ניתוח. (E) תפריט קונפיגורציה לרגרסיה לא ליניארית. (F) תפריט אפשרויות קבצים. (ז) דיאלוג ייצוא נתונים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה קובע פרוטוקול סטנדרטי לחשיפה לקדמיום ולבדיקות היתכנות ATP באמצעות COs להערכת השפעת הקדמיום על חיוניות אורגנואידים. פרוטוקול זה מייעל במיוחד את פירוק האורגנידים ואת שלבי הציפוי של 96 בארות כדי לשפר את השחזוריות הניסיונית ואת יציבות תוצאות בדיקות ATP הבאות. למרות שהפרוטוקול הניסויי הנוכחי מתמקד בעיקר בהקמת מודל אורגנואיד תלת-ממדי לסרטן המעי הגס להערכת רעילות Cd, מחקרים נרחבים הראו כי תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות ומודלים תלת-ממדיים אורגנואידים שונים משמעותית בתגובות התרופות, אינטראקציות תא-תא, ארכיטקטורת רקמה ופרופילים טוקסיקולוגיים. בהשוואה לשכבות דו-ממדיות, אורגנואידים משחזרים בנאמנות רבה יותר את הארכיטקטורה המרחבית, ההטרוגניות התאית וסביבת המיקרו-דמוית חיים של גידולים, ומציעים רלוונטיות פיזיולוגית עליונה. עקב היעדר אינטראקציות מורכבות בין תא-תא ומטריקס תא-חוץ-תא (ECM), תגובת תרביות דו-ממדיות לחשיפה למתכות כבדות עלולה לא ללכוד במדויק תהליכים טוקסולוגיים אמיתיים ב-vivo16. לעומת זאת, מודל CO שהוקם במחקר זה מדמה ביעילות את דינמיקת הגדילה התלת-ממדית של רקמות הגידול, ומספק פלטפורמה פיזיולוגית רלוונטית להערכת רעילות הנגרמת על ידי Cd.

במהלך מעבר אורגנואידים, זמן הדיסוציאציה נשמר בקפדנות, כ-10 דקות. אופטימיזציה זו מונעת דיסוציאציה לא שלמה, שמובילה לאגרגטים גדולים מדי של תאים, ובמקביל מונעת פירוק יתר, שמוביל למספר מופרז של תאים בודדים. על ידי שליטה מדויקת בהיקף הדיסוציאציה, השגנו מבנים אורגנואידיים אחידים יחסית, מה ששיפר את העקביות של טיפולים פרמקולוגיים מאוחרים ומבחני כדאיות ATP.

השתמשנו במערכת גידול בתפוקה גבוהה של 96 בארות ותקננו את נפח ציפוי מטריצת ממברנת הבסיס ל-6 מיקרוליטר לבאר. תקינה זו ממזערת שונות בין בארות על ידי הבטחת צפיפות אורגנית ומאפייני גדילה אחידים בכל הבארות, ובסופו של דבר משפרת את השחזוריות הניסויית והשוואת הנתונים. על ידי שילוב בדיקות זוהר ATP עם ניתוחי עקומת מינון-תגובה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים סטטיסטיים, השגנו הערכה כמותית איתנה של שינויים בחיוניות האורגנידים לאחר חשיפה ל-Cd. ביחד, מחקר זה קובע פרוטוקול ניסויי רב-שכפול ליישום מודלים אורגנואידיים בטוקסיקולוגיה סביבתית ובחשיפה למתכות כבדות.

במהלך תרבית ה-COs, ערבוב יסודי של כדור הקריפטה עם מטריצת ממברנת הבסיס הוא שלב קריטי להבטחת היווצרות נכונה של COs וצמיחה יציבה. היחס של מטריצת ממברנת הבסיס צריך להישמר מעל 70% (נפח מטריצת ממברנת הבסיס > 70%). נפחי מטריצת ממברנת הבסיס המומלצים הם 6 מיקרוליטר לבאר עבור לוחות עם 96 בארות, 20 מיקרוליטר לבאר ללוחות 48 בארות, ו-25 מיקרוליטר לבאר ללוחות עם 24 בארות. לאחר פולימריזציה של מטריצה, מוסיפים את הנפחים הבאים לבארות: 100 מיקרוליטר לבאר עבור לוחות עם 96 בארות, 300 מיקרוליטר לבאר עבור לוחות 48 בארות, ו-500 מיקרוליטר לבאר ללוחות עם 24 בארות. יש להיזהר להימנע מפיפטינג ישיר של המדיום על כיפות מטריצת ממברנת המרתף, שכן הדבר עלול להפריע לארכיטקטורה התלת-ממדית. כדי לשמור על יציבות פנוטיפית וגנטית, מחקר זה הגביל את השימוש באורגנואידים במעי הגס למקסימום 4 מעברים.

כאשר קריפטות או COs מגיעים לקוטר של כ-600 מיקרון או מציגים כהה ועצירת גדילה, יש לבצע מעבר במהירות כדי לאפשר ניתוחי רגישות נוספים. במהלך דיסוציאציה אנזימטית של COs, יש לעקוב אחרי העיכול תחת מיקרוסקופ. אם ה-COs אינם מפורקים מספיק לאשכולות תאים קטנים או תאים בודדים, זמן העיכול עשוי להתארך בהדרגה בהתאם לגודל האורגנואיד ולמצב הדיסוציאציה. יש להימנע מעיכול ממושך בשלב אחד כדי למזער את הסיכון לעיכול יתר ואובדן חיוניות התאים.

חשב את הכדאיות היחסית לכל באר באמצעות המשוואה הבאה, והשתמש באחוז הממוצע מבארות משוכפלות כערך התגובה לכל ריכוז

 figure-discussion-1

מבחן הביולומינציה של ATP מבוסס על חמצון D-לוסיפרז עם זרז של גחלילית, מה שמוביל לפליטת פוטונים. בשל רגישותו הגבוהה, התאימות לפורמטים מבוססי פלטות עם הספק גבוה, וזמינות ערכות מסחריות סטנדרטיות, שיטה זו יושמה באופן נרחב לסקר רעילות ראשוני בדגמי אורגנואיד17.

יש לקחת בחשבון מספר גורמים מבלבלים. כימיקלים מסוימים עשויים לעכב ישירות את תגובת הלוציפראז האנזימטית באמצעות הפרעות כימיות או דיכוי אנזימטי, מה שמוביל לכיבוי אותות. זוהר רקע מהמטריצה החוץ-תאית התלת-ממדית, הטרוגניות בגודל ובצפיפות האורגנית, וליזה לא שלמה יכולים לגרום לשונות משמעותית בין בארות ובין אצוות. זוהר מבוסס ATP לבדו אינו יכול להבחין במדויק במודאליות של מוות תאים או להבהיר מנגנונים טוקסיקולוגיים בסיסיים18.

כדי לשפר את האמינות המתודולוגית, מומלץ להשתמש באמצעי בקרת איכות שיטתיים. שימוש במאגרי ליזה שהומלצו על ידי היצרן או מאומתים בעבר, וזמן ליזיס מוארך, דיסוציאציה מכנית או מחזורי הקפאה-הפסה בעת הצורך לשיפור יעילות הליזה של התאים במטריצה. שנית, לבצע ניסויי התאוששות של ATP (ספייק-אין) במהלך אופטימיזציית הבדיקה כדי להעריך עיכוב ישיר פוטנציאלי של תגובת הזוהר על ידי תרכובות הבדיקה או סביבת הליזה. שלישית, לאשר את טווח הגילוי הלינארי באמצעות עקומת ATP סטנדרטית ולשלוט בקפדנות בתזמון בין הוספת מגבים, דגירה וקריאת לוחות כדי למזער שונות טכנית. לבסוף, כללו בקרות ריקות, כלי רכב ושליליות בכל בדיקה וכללו שכפולים טכניים מספקים להערכת ותיקון אפקטים קצוות ושונות הקשורה לאצווה. לאחרונה פותחו מספר בדיקות כדאיות מותאמות לאורגנואידים עם שיפור כימיה של ליזיס ויציבות אות משופרת, ונוסחאות אלו הראו בדרך כלל ביצועים מעולים בבדיקות רעילות תלת-ממדיות19. לסיכום, מחקר זה השתמש ב-COs אנושיים כמודל במבחנה של טוקסיקולוגיה סביבתית של מתכות כבדות וקבע בדיקה מבוססת ביולומינסציה ATP רגישה בתפוקה גבוהה להערכת רגישות אורגנואידים לחשיפה ל-Cd. עבודה זו מספקת ייחוס ניסויי מעשי והנחיה מתודולוגית להערכת רעילות במערכות מחקר מבוססות אורגנואידים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים תרמו מספיק לעבודה והסכימו להיות אחראים לכל היבטיה. צוות המחקר החדשני למדע וטכנולוגיה של מוסד ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (2021), תוכנית מרכז המחקר הטכנולוגי להנדסה במכללה המקצועית של ג'יאנגסו (2023), מרכז המחקר ההנדסי של מחוז ג'יאנגסו לפיתוח ותרגום טכנולוגיות מפתח למניעה ושליטה במחלות כרוניות (2024), פרויקט מרכז המחקר ההנדסי של מחוז ג'יאנגסו לטיפול מולקולרי ואבחון נלווה באונקולוגיה (SGK2202506), תוכנית פרויקטי טכנולוגיית פרנסת תושבי סוז'ואו (מענק מס' SYWD2024099), קרן המרכזית למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו בסין (מענק מס' 24KJA310008), תוכניות המכללה לבריאות מקצועית בסוז'ואו (מענק מס' szwzy202406, מענק מס' szwzy202304, מענק מס' szwzy202320 ומענק מס' szwzy202308). פרויקט צ'ינג-לאן של מחוז ג'יאנגסו בסין (2025). פרויקט החדשנות במדע וטכנולוגיה במחקר בסיסי יישומי (רפואה ובריאות) בסוז'ואו / פרויקט הנוער למחקר בסיסי יישומי (רפואה ובריאות) בסוז'ואו (SYW2024185)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILCFT011150
1mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesCLUXCELL321050
96-well platesCorning Incorporated220400
BioTek Cytation 5BioTek Co., LTD16280004התוכנה התפעולית עבור קורא מיקרו-לוח מסוים.
Cadmium chloride,10gSigma202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability AssayVazymeDD1102-01/02/03חומר רייגנט זורח בנפח יחס של 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)Mogenel BiotechnologyMA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Mediumthermo fisher6125552
ForcepsBeyotimeFS019
Ice boxBeyotimeFBX078
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40
MatrigelMogenel Biotechnology82755המטריצה של ממברנה בסיסית
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01Lפתרון פירוק אורגנואיד
Penicillin-StreptomycinBeyotimeC0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032
PipettesRUININGPipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0GraphPad Softwareהתוכנה התפעולית עבור קורא מיקרו-לוח מסוים.
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06S

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cancer Researchcadmiumcolorectal organoidsorganoids

מאמרים קשורים