מאמר שיטה

הבהרת הבסיס החומרי של נוסחת Yiqi Qingjie נגד נפרופתיה של IgA באמצעות UHPLC-Q-Orbitrap HRMS משולב עם פרמקולוגיה רשתית

326 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70541

⸱

19 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה של קוודרופול-אורביטראפ (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), בשילוב עם פרמקולוגיה רשת ועגינה מולקולרית, כדי לחזות ולאמת את הבסיס החומרי של נוסחת Yiqi Qingjie (YQQJ) לטיפול בנפרופתיה של IgA (IgAN).

תקציר

מחקר זה עושה שימוש ב-UHPLC-Q-Orbitrap HRMS לאפיון המרכיבים הניתנים להפקת מים ונספגי דם של YQQJ. פרמקולוגיה רשתית ועגינה מולקולרית מיושמות גם כדי לחזות ולאמת את הבסיס החומרי שמאחורי ההשפעות הטיפוליות של YQQJ נגד IgAN. דגימות התמצית המימית והסרום של YQQJ נותחו באמצעות UHPLC-Q-Orbitrap HRMS לאפיון המרכיבים הכימיים ולזיהוי תרכובות נספגות בדם. זיהוי התרכובות בוצע בהתבסס על מאגרי מידע מקושרים, ספרות פורסמת, והערכה מקיפה של זמן השימור, דיוק מסה של יוני מקדים, דפוסי פיצול של MS/MS והתפלגות איזוטופית. המטרות הפוטנציאליות של תרכובות אב-טיפוס שנספגו בדם נחזו באמצעות מאגרי מידע לחיזוי מטרות, בעוד שמטרות הקשורות ל-IgAN נאספו מפלטפורמות ביואינפורמטיקה משולבות. היעדים המרכזיים נבדקו באמצעות ניתוח רשת PPI. נבנתה רשת "תרכובות–מטרה–מסלול–מחלה' לזיהוי רכיבים מרכזיים, ובוצעה עגינה מולקולרית להערכת האינטראקציות בין תרכובות ליבה למטרות. בסך הכל זוהו 185 תרכובות בתמצית המים של YQQJ. מתוכן, 28 תרכובות נכנסו לזרם הדם בצורות אב-טיפוס שלהן. PPI זיהה 42 יעדים מרכזיים הקשורים להשפעות הטיפוליות של YQQJ ב-IgAN. ניתוחי העשרת KEGG ו-GO הראו מעורבות בהתרבות תאים, דלקת ואפופטוזיס, והעשרה במספר מסלולים מרכזיים כגון PI3K-Akt, MAPK ו-JAK-STAT. ניתוח עגינה מולקולרית חזה אינטראקציות קשירה חיוביות בין שישה יעדים קריטיים (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB ו-PIK3CA) לבין שלוש תרכובות עיקריות שנספגו בדם—חומצה דה-אצטילספרולוזידית, חומצה גניפוסידית ודיוסין—עם אנרגיות קישור נמוכות באופן עקבי, מה שמרמז על אינטראקציות פוטנציאליות. ניתוח משולב זה מגלה ש-YQQJ מפעיל השפעות טיפוליות נגד IgAN באמצעות רכיבים מרובים ומטרות מרובות. חומצה דה-אצטילספרולוסידית, חומצה גניפוסידית ודיוסין מוצעים כמרכיבים פעילים מרכזיים התורמים להשפעות אלו.

מבוא

נפרופתיה של IgA (IgAN) היא אחת מהגלומרולונפריטיס הראשונית השכיחות ביותר בעולם. ההופעות הקליניות שלו הן הטרוגניות מאוד, בדרך כלל כהמטוריה מיקרוסקופית או גסה, לעיתים מלווה בדרגות שונות של פרוטאנוריה, יתר לחץ דם ופגיעה בכליות. מחקרים קודמים הצביעו על כך שעד 40% מהמטופלים מתקדמים לאי ספיקת כליות בתוך 20 שנה מהאבחון1; עם זאת, עדויות עדכניות יותר מצביעות על פרוגנוזה גרועה בהרבה, כאשר רוב המטופלים מפתחים אי ספיקת כליות בתוך 10–15 שנים, ורק אחוז קטן מהם שומרים על תפקוד כליה לאורך החיים ללא התקדמות 2,3,4. למרות שטיפולים ממוקדים השיגו לאחרונה התקדמות קלינית בניהול IgAN, עלותם הגבוהה ותחילת היעילות האיטית יחסית שלהם נותרו אתגרים מרכזיים, והאיזון הקליני בין תועלת לסיכון עדיין נמצא במחלוקת 5,6.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) מדגימה יתרונות ייחודיים בטיפול במחלות מורכבות. הוא מאופיין ביעילות טיפולית יציבה, שכיחות יחסית נמוכה של תגובות לוואי, ואפקטים סינרגטיים מרובי מטרות7. בניגוד לסוכנים פרמקולוגיים חד-יעדיים, נוסחאות TCM בדרך כלל מכילות מספר רכיבים ביואקטיביים שיכולים לווסת בו זמנית מסלולים ביולוגיים מגוונים. אופן פעולה רב-מרכיבי ורב-מטרות זה מספק יתרון טיפולי פוטנציאלי בטיפול במחלות מורכבות כגון IgAN8. בתיאוריה של הרפואה הסינית הסינית (TCM), ל-IgAN אין שם מחלה ספציפי אך הוא מסווג בדרך כלל תחת "המטוריה", "בצקת", "כאבי גב", "רוח כליות" ו"מחלת צרה". רוב החוקרים רואים את הפתוגנזה המרכזית שלה כקשורה לחסר צ'י ריאות-טחול, מה שמוביל לאובדן שליטה על הצ'י ההגנתי, ובתורו לפלישת רוח, לחות, חום ורעלים, ולבסוף פוגע בכליות. למרות שהכליה היא האיבר העיקרי המעורב, הלב, הכבד, הטחול והריאות עלוליםגם הם להיות מושפעים. בהתבסס על הבנה זו, מחקרים רבים התמקדו בזיהוי תרופות צמחיות ונוסחאות עם תכונות מחזקות את Qi, מאחדות חיצוניות, ניקוי חום, ניקוי רעלים ופתרון לחות לטיפול קליני ב-IgAN10,11.

נוסחת ייצ'י צ'ינגג'יה (YQQJ) היא מרשם אמפירי יעיל המשמש במחלקת הנפרולוגיה בבית החולים שלנו לטיפול ב-IgAN. הנוסחה כוללת שבעה עשבים, ביניהם Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica Makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) ו-Plantago asiatica L. (צ'צ'יאנקאו). YQQJ מפעיל תפקידים טיפוליים של חיזוק הצ'י, חיזוק החיצוני, ניקוי חום, ניקוי רעלים, הפעלת זרימת הדם וקידום משתנת12. מחקרים קליניים הראו ש-YQQJ מפחית משמעותית את הפראונואוריה וההמטוריה אצל חולים עם IgAN, משפר את תפקוד הכליות ומקל על תסמינים הקשורים למערכת החיסון הרירית, תוך הצגת פרופיל בטיחות חיובי12,13.

למרות שנוסחה זו הראתה יעילות קלינית חיובית, הבסיס הפעיל תרופתית של החומר עדיין קשה להבהרה, שכן נוסחאות הרפואה הסינית מכילות רכיבים כימיים רבים. פרופילינג כימי המבוסס אך ורק על ניתוח כרומטוגרפי או ספקטרומטרי מסה יכול לחשוף את ההרכב הכימי הכולל של נוסחה; עם זאת, היא אינה יכולה לקבוע אילו תרכובות נספגות במחזור הדם המערכתי ותורמות ישירות להשפעות הטיפוליות14. בנוסף, מחקרי פרמקולוגיה רשתית קונבנציונליים מסתמכים בעיקר על תחזיות מבוססות מסדי נתונים ובדרך כלל מסננים תרכובות מועמדות באמצעות פרמטרים כמו זמינות ביולוגית דרך הפה ודמיון תרופתי. גישה זו עשויה להתעלם מתרכובות שמפעילות באמת פעילות פרמקולוגית ב-vivo15.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, מחקרים עדכניים מאמצים יותר ויותר אסטרטגיות אנליטיות אינטגרטיביות המשלבות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד יחד עם פרמקוכימיה היברידית של ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה של Orbitrap (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) בפרמקוכימיה של סרומים ופרמקולוגיה מערכתית במחקר הרפואה הסינית16,17. פרמקוכימיה של הסרום מזהה תרכובות שנכנסות למחזור הדם המערכתי לאחר ההעברה, ובכך מספקת ראיות רלוונטיות לפרמקוקינטית לסינון רכיבים ביואקטיביים פוטנציאליים18. במקביל, UHPLC-Q-Orbitrap HRMS מאפשר זיהוי מדויק מאוד ואפיון מבני של רכיבים כימיים במטריצות צמחיות מורכבות19.

בהשוואה לגישות המתבססות אך ורק על פרופיל כימי או חיזוי מטרות תיאורטי, זרימת העבודה האינטגרטיבית שהוחלתה במחקר זה—הכוללת זיהוי רכיבים מבוסס UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, סקר פרמקוכימיה של סרום, ניתוח פרמקולוגיה רשתית ואימות עגינה מולקולרית—מציעה מספר יתרונות מתודולוגיים. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS מאפשר זיהוי מקיף ומדויק של רכיבים כימיים מורכבים. פרמקוכימיה בסרום מגבילה תרכובות מועמדות לאלו שבפועל נספגות במחזור הדם המערכתי, ובכך משפרת את הסבירות הביולוגית של ניתוחי רשת עתידיים. ניתוח פרמקולוגיה רשתית המבוסס על תרכובות נספגות מאושרות ניסיונית מאפשר חקירה ברמת המערכת של מנגנונים מרובי מטרות ומשקף טוב יותר את המאפיינים הפרמקולוגיים ההוליסטיים של נוסחאות ה-TCM (TCM). עגינה מולקולרית מספקת בנוסף אימות חישובי ראשוני של אינטראקציות חזויות בין תרכובת למטרה ותומכת בתעדוף רציונלי של מולקולות מועמדות לאימות ניסויי עתידי. ביחד, תהליך העבודה האינטגרטיבי הזה מספק אסטרטגיה אמינה, יעילה ורלוונטית פיזיולוגית להבהרת הבסיס והמנגנונים החומריים של נוסחאות צמחיות מורכבות כמו YQQJ.

תהליך עבודה זה מתאים במיוחד לחקירת הבסיס והמנגנונים של חומרים פעילים פרמקולוגית של נוסחאות צמחיות מורכבות, כאשר ניתן לקבל נתוני ספיגה ב-vivo ממחקרים פרמקוקינטיים של בעלי חיים או בני אדם. הוא רלוונטי במיוחד לנוסחאות עם יעילות קלינית מבוססת אך רכיבים פעילים לא ברורים. עם זאת, יש להכיר בכמה מגבלות. ראשית, דיוק חיזוי היעד תלוי באיכות ובשלמות של מסדי נתונים ציבוריים. שנית, זרימת העבודה מתמקדת בתרכובות אב-טיפוס שזוהו במחזור ואינה מתחשבת במטבוליטים ביואקטיביים שנוצרים ב-vivo. שלישית, תחזיות שמקורן בניתוחי פרמקולוגיה רשתית דורשות אימות ניסויי נוסף. למרות מגבלות אלו, זרימת העבודה מספקת גישה יעילה ואמינה ליצירת השערות ולקביעת יעדים במחקרים מכניים של נוסחאות TCM (TCM).

לכן, מחקר זה משתמש ב-UHPLC-Q-Orbitrap HRMS כדי לאפיין באופן שיטתי הן את רכיבי התמצית המימית והן את התרכובות המסתובבות של YQQJ, ובכך להקים מאגר נתונים מקיף יחסית של רכיבים פעילים פוטנציאליים. בהתבסס על מערך נתונים זה, ניתוח פרמקולוגיה רשתית, בשילוב עם אימות עגינה מולקולרית, חוזה את הרכיבים הפעילים הפרמקולוגית הפוטנציאליים של YQQJ לטיפול ב-IgAN ומספק בסיס לחקירות מכניות עתידיות.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים שעסקו בבעלי חיים עמדו בהנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה שהוציאה ועדת רווחת בעלי החיים של סין. כל ההליכים במחקר זה אושרו על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) של מרכז הניסויים בבעלי חיים בבית החולים גואנג'אנמן.

1. ניהול בעלי חיים ותרופות

  1. השתמש בזכרים בני 6 שבועות Sprague–Dawley (SD) במשקל 200–230 גרם.
  2. כל בעלי החיים לאחסן במרכז הניסויים לבעלי חיים.
    הערה: שמרו על טמפרטורת המעטפת של 20–26 מעלות צלזיוס ועל לחות יחסית של 40–70%. השתמש במחזור אור/חושך של 12 שעות ו-12 שעות כדי לדמות קצב צירקדי טבעי.
  3. הסתגלו לבעלי חיים למשך 7 ימים בתנאים סטנדרטיים עם גישה חופשית למזון ומים לפני הניסוי. חלק את העכברים באקראי לשתי קבוצות (n = 6 לכל קבוצה): קבוצת ביקורת וקבוצה שטופלה בסמים.
  4. התייחס למינון המקביל המומר לפי שטח פנים הגוף בין בני אדם לבעלי חיים20. העניקו תמצית מרוכזת YQQJ באמצעות גאווג' אורלי ב-24.68 מ"ל/(ק"ג·יום) לקבוצת הטיפול בתרופות. יש להזריק כמות שווה של מים מזוקקים לקבוצת הביקורת בו-זמנית כדי להבטיח טיפול סינכרוני.
  5. המשך את המינון ליום אחד. חלק את המנה היומית הכוללת לשלוש מנות שוות (למשל, ב-08:00, 13:00 ו-18:00) כדי להבטיח מינון מלא בתוך יום אחד.
    הערה: חיות מהרות במשך 12 שעות לפני הגוואז' הסופי, עם גישה חופשית למים.
  6. אספו דגימות דם לאחר שעתיים ו-8 שעות לאחר המתן הסופי. הרדימו את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפיקית של 1% נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג). אספו דם מהאאורטה הבטנית.
  7. השאירו את דגימות הדם זקופות בטמפרטורת החדר למשך שעה, ואז צנטריפוגה ב-450 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בדוק שהסופרנטנט (סרום) נקי וללא המוליזה. העבר את סרום הסופרנטנט ואחסן בטמפרטורה של –80°C לניתוח נוסף.

2. הכנת פתרונות

  1. הכנת פתרונות בדיקה
    1. אסוף את כל העשבים הגולמיים של YQQJ לפי הנוסחה. הוסיפו 4 נפחים של מים מטוהרים לסיר הרוק והשרו במשך 20 דקות.
      הערה: מים מטוהרים נוספו לעשבים ביחס של 4:1 (v/w).
    2. מביאים את התערובת לרתיחה, ואז ממשיכים לתבוש במשך 30 דקות על אש נמוכה. סנן דרך הגזה ואספו את הסינון. חזור על הרוק של השאריות עם 4 נפחי מים לעוד 30 דקות ומסנן שוב.
    3. שלבו את שני הסינון. ריכזו את התמיסה המשולבת באמצעות אידוי סיבובי שמוגדר בטמפרטורת אמבט מים של 60°C עד להגיע לריכוז של 3 גרם/מ"ל (w/v, שווה ערך לחומרים רפואיים גולמיים).
    4. ודאו שהתמצית המרוכזת היא נוזל כהה וצמיגי ללא משקעים נראים לעין. אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  2. הכנת פתרונות ייחוס
    1. שקלו במדויק את תרכובות הייחוס הבאות: חומצה דה-אצטילספרולוזידית, חומצה גניפוסידית, חומצה לוגאנית, מורוניסיד, חומצה כלורוגנית, סוורוסיד, חומצה פלנטגוגואנידינית, ריין-8-O-β-D-גלוקופירנוזיד, גניסטין, אפיגנין-7-גלוקוזיד, דיוסמטין-7-O-β-D-גלוקיפירנוזיד, קליקוזין, פרוטודיוסין, גניסטיין, דיוסמטין, פסאודופרוטודיוסין, פורמונונטין, 3-הידרוקסיבי-9,10-דימתוקסיפטרפן, אלואימודין, ריין, דיוסין.
    2. המיס כל תרכובת במתנול, מערבב את התערובת במשך דקה, ואז סוניקט בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי להבטיח המסה מלאה.
    3. דיללו כל תמיסה במתנול כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל לכל תקן.

3. הכנת דוגמאות

  1. הכנת דגימות תמצית YQQJ
    1. פיפט 100 מיקרוליטר של תמצית מימית YQQJ לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. הוסיפו 300 מיקרוליטר מתנול ומערבולת למשך דקה. צנטריפוגה ב-1800 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ודא שהסופרנטנט שנוצר נקי וללא חלקיקים תלויים.
    2. קח 100 מיקרוליטר מהסופרנטנט וערבב עם 100 מיקרוליטר מים אולטרה-טהורים כדי להגיע לדילול של 1:1. וורטקס בעדינות והעבר לבקבוקון אוטוסמפלר לניתוח.
  2. הכנת דגימות סרום המכילות תרופות
    1. פיפט 100 מיקרוליטר סרום לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 300 מיקרוליטר מתנול, ומערבולת למשך 10 דקות כדי להבטיח שקיעת חלבון. צנטריפוגה ב-1800 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. לאסוף 270 מיקרוליטר של הסופרנטנט ולהעביר לצינור נקי. אידוי את הסופרנטנט לייבוש באמצעות מרוכז צנטריפוגלי ואקום שמוגדר על 120 × גרם, 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עד להיווצרות שארית מוצקה נראית לעין.
    3. לשחזר את השאריות עם 90 מיקרוליטר של תמיסה מימית של 50% מתנול. מערבולת למשך דקה אחת כדי להמיס לחלוטין את השארית, ואז שוב בצנטריפוגה ב-1800 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. אסוף 80 מיקרו-ליטר מהסופרנטנט השקוף הסופי והעבר אותו לבקבוקון אוטוסמפלר לניתוח.

4. תנאים אנליטיים

  1. תנאים כרומטוגרפיים
    1. בצע הפרדה כרומטוגרפית באמצעות מערכת UHPLC המצוידת בעמודה כרומטוגרפית.
    2. השתמש בפאזה ניידת בינארית (שלב A: מים עם 0.1% חומצה פורמית; שלב ב': אצטוניטריל). הפעילו תוכנית שחרור גרדיאנט כפי שמוצג בטבלה 1, בקצב זרימה של 0.3 mL/min. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-40 מעלות צלזיוס ואת נפח ההזרקה ל-6.0 מיקרוליטר.
      הערה: מפרטי העמודה הם 2.1 מ"מ × 100 מ"מ, מימד חלקיקים של 1.8 מיקרון.
  2. מצבי טרשת נפוצה
    1. ניתוח דגימות באמצעות ספקטרומטר מסה מרובע-אורביטראפ המצויד בגלאי ריסוס אלקטרוספריי מחומם (HESI).
    2. הגדר פרמטרים כך: מתח יינון: 3.7 kV (מצב חיובי) / 3.5 kV (מצב שלילי); טמפרטורת נימים: 320 מעלות צלזיוס; לחץ גז מעטפת: 30 psi; לחץ גז עזר: 10 psi; טמפרטורת המיסה: 300°C; גז מעטפת וגז עזר: חנקן; גז התנגשות: חנקן, 1.5 mTorr.
    3. אסוף נתונים במצב סריקה מלאה/dd-MS2 . הגדר פרמטרי סריקה מלאים כך: רזולוציה 70000, יעד בקרת רווח אוטומטי 1×106, זמן בידוד מקסימלי 50 מילישניות, וטווח סריקת m/z 100 – 1500.
    4. אסוף נתוני dd-MS2 עם פרמטרים של רזולוציה 17500, יעד בקרת רווח אוטומטי 1×105, זמן בידוד מקסימלי 50 מילישניות, בחירת n (n≤10) יונים הוריים החזקים ביותר לפיצול יחד עם מנגנון הדרה דינמי, חלון בידוד של m/z 2, אנרגיית התנגשות 10 V, 30V, 60 V, וסף עוצמה 1×105.

5. עיבוד נתוני MS

  1. עבדו את נתוני ה-MS שנרכשו באמצעות תוכנת עיבוד נתונים ייעודית. עבור למודול Import Data והעלה את קבצי הנתונים הגולמיים.
  2. הפעילו את מודול בחירת השיא ובצעו דה-קונבולוציה של שיא כדי לקבץ יוני אדוקט וליצור תכונות מורכבות.
  3. חפש מאגרי מידע של תרכובות ייחוס, מאגרי תחזיות יעדים וספרות שפורסמה רלוונטית לזיהוי מועמדים.
  4. זיהוי תרכובות באמצעות שתי אסטרטגיות זיהוי משלימות המבוססות על נתוני טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה.
    1. זיהוי מבוסס על התאמת תקן ייחוס. אשר תרכובות בהשוואה לסטנדרטים אותנטיים. קבל תעודות זהות רק כאשר כל הקריטריונים הבאים מתקיימים:
      1. דיוק המסה: שגיאת המסה של יוני הפרקורטור ושל יוני הקטעים חייבת להיות בטווח של ±5 ppm.
      2. דמיון ספקטרלי: ציון הדמיון הקוסינוסי בין ספקטרום ה-MS/MS הניסיוני לבין ספקטרום MS/MS של תקן הייחוס חייב להיות ≥ 0.85.
      3. התפלגות איזוטופית: ציון התאמת דפוסי האיזוטופים חייב להיות ≥ 90%.
      4. התנהגות כרומטוגרפית: סטיית זמן השימור בין התרכובת שזוהה לתקן הייחוס חייבת להיות < 0.2 דקות.
        הערה: תרכובות העומדות בכל הקריטריונים לעיל מסומנות כ-MSI רמה 1, המייצגת זיהוי מבני מאושר.
    2. זיהוי מבוסס נתוני MS ברזולוציה גבוהה ובחיזוי ספקטרלי סילקו. עבור תרכובות ללא תקני ייחוס זמינים, יש לבצע זיהוי משוער המבוסס על מדידות מסה מדויקות וחיזוי ספקטרלי חישובי. קבל הערות רק כאשר הקריטריונים הבאים מתקיימים:
      1. דיוק המסה: שגיאת המסה של יוני הפרקורסור חייבת להיות בטווח של ±5 ppm, ושגיאת המסה של יוני השברים חייבת להיות בטווח של ±10 ppm.
      2. דמיון ספקטרלי: השוו את ספקטרום ה-MS/MS הניסיוני עם הספקטרום התיאורטי של MS/MS שנוצר ממבנה SMILES המורכב באמצעות אלגוריתם Progenesis QI. קבל התאמות עם ציון דמיון קוסינוס ≥ 0.60.
      3. התפלגות איזוטופית: ציון התאמת דפוסי האיזוטופים חייב להיות ≥ 90%.
      4. חיזוי התנהגות כרומטוגרפית: הסטייה בין זמן השימור הניסויי לזמן השמירה החזוי בלמידת מכונה חייבת להיות < 1.0 דקות.
        הערה: מודל חיזוי זמן השימור אומן באמצעות נתונים כרומטוגרפיים ניסיוניים מיותר מ-2000 תרכובות ייחוס שנותחו תחת אותם תנאים כרומטוגרפיים. תרכובות העומדות בקריטריונים אלו מסומנות כ-MSI רמה 2, המייצגת תרכובות מזוהות לכאורה עם ביטחון מבני גבוה.

6. פרמקולוגיה רשתית

  1. זיהוי רכיבים נספגי דם ומטרות הקשורות ל-IgAN
    1. ייבא את המרכיבים הפרוטוטיפיים שנספגו בדם של YQQJ למאגרי תחזית המטרה. בחר את "הומו ספיינס" כמין היעד וקבל את היעדים הפוטנציאליים שלו. רשמו אותם כקבוצת היעד של תרכובות נספגות בדם ב-YQQJ.
    2. השתמש במילת המפתח "IgA Nephropathy" כדי לאסוף מטרות מחלות הקשורות ל-IgAN מפלטפורמות ביואינפורמטיקה משולבות. לאחד תוצאות ממקורות מרובים כדי למזער הטיות.
      הערה: השתמש במסד נתונים של חלבונים כדי להמיר את כל המטרות שנאספו לפורמט סמל הגנים לצורך עקביות.
  2. בניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) וזיהוי מטרות ליבה
    1. מאחד את מערך היעד של תרכובות נספגות בדם של YQQJ עם מערך היעד של מחלת IgAN והוציא את החיתוך ביניהן.
    2. העלה את היעדים החוצים לפלטפורמת PPI21. הגדר את ההגדרות: הגדר את האורגניזם כ-Homo sapiens, ציון האמון כ-0.90, והשליך את כל הצמתים המנותקים.
    3. ייבא את נתוני ה-PPI לתוכנת הוויזואליזציה22. השיק את תוסף הניתוח הטופולוגי. חשב מרכזיות דרגה (DC)23, מרכזיות הביניים (BC)24, ומרכזיות קרבה (CC)25.
    4. סינון המטרות הטיפוליות המרכזיות של YQQJ מול IgAN על ידי סינון צמתים עם ערכי פרמטרים טופולוגיים (DC, BC ו-CC) העולים על החציון.
  3. בנייה וניתוח של רשת משולבת "YQQJ – רכיבי דם נספגים – מטרות – מסלולים – מחלה"
    1. הכינו את קובץ המאפיינים של הצומת: צרו גיליון אלקטרוני המכיל שתי עמודות. סמנו את העמודה הראשונה כשם צומת ואת סוג הצומת השני. הקצה אחת מחמש הקטגוריות (נוסחה, רכיב נספג דם, מטרה חיתוך, מסלול או מחלה) לכל צומת.
    2. הכנת קובץ אינטראקציה (קצה): צור גיליון אלקטרוני שמגדיר את הקשרים בין הצמתים (למשל, רכיב ספוג דם ליעד החיתוך). ודא שכל שמות הצמתים תואמים לאלו שבקובץ התכונות של הצומת כדי למנוע שגיאות מיפוי.
    3. ייבוא ובניית הרשת: השיק את תוכנת הוויזואליזציה של הרשת. עבור לקובץ > ייבוא > רשת כדי לטעון את קובץ הקצה. בחלון התצוגה המקדימה, מפה את העמודות כ-Source Node ו-Target Node ולחץ על OK כדי ליצור את הגרף הראשוני.
    4. מיפוי מאפייני צומת וקבעו סגנונות ויזואליים: ייבא את קובץ התכונות של הצומת דרך קובץ > ייבא > טבלה. פתח את לוח הסגנון ומפה את עמודת סוג הצומת לתכונות ויזואליות ספציפיות, כולל צורת הצומת, צבע מילוי וגודל.
    5. ביצוע ניתוח טופולוגי: ניווט לכלים > ניתוח רשת לביצוע חישובים טופולוגיים. סינון וזיהוי תרכובות פעילות מרכזיות ומטרות טיפוליות מרכזיות בהתבסס על ערכי דרגה.
      הערה: השתמש באותם פרמטרים טופולוגיים כפי שמתואר בשלב 6.2 כדי להבטיח עקביות בזיהוי צומת הליבה.
    6. ייצוא תמונת הרשת: סיים את פריסת הרשת. עבור לקובץ > לייצא > רשת לתמונה כדי לשמור את הוויזואליזציה האופטימלית.
  4. העשרת GO וניתוחי מסלולי KEGG
    1. הגשת רשימת הגנים: פתח את פלטפורמת ההערות הפונקציונלית מבוססת האינטרנט. עבור לאזור שלב 1: הגשת רשימת גנים והעלה את רשימת הגנים המרכזיתשסיננה קודם לכן 26.
    2. בחר מינים: בתפריטים הנרחבים עבור שלב 2: קלט כמין ושלב 3: ניתוח כמין, בחר H. sapiens. (אדם) כדי להבטיח שהניתוח מתבצע בהקשר הביולוגי הנכון.
    3. הגדר ניתוח מותאם אישית: בחר במצב ניתוח מותאם אישית. בקטגוריית ההעשרה , בדקו את מאגרי המידע הבאים: אונטולוגיית גנים (GO) פונקציה מולקולרית (MF), תהליך ביולוגי של GO (BP), רכיב תאי GO (CC), ומסלול אנציקלופדיית גנים וגנומים של קיוטו.
    4. קבע ספי מובהקות: הגדר את סף ערך ה-P ל-< 0.01, את העשרת המינימום ל-≥ 1.5, ואת החפיפה המינימלית ל-≥ 3. שמור על כל שאר הפרמטרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם.
    5. בצע את הניתוח: לחץ על כפתור ניתוח העשרה כדי להגיש את המשימה והמתין להשלמת החישוב.
    6. שליפת וייצא תוצאות: גש לעמוד דוח הניתוח שנוצר. לחצו על כפתור ההורדה כדי לייצא את נתוני ההעשרה המפורטים בפורמט גיליון אלקטרוני, יחד עם תרשימי עמודות ומפות חום מתאימים.

7. אימות עגינה מולקולרית

  1. הורד את מבני החלבון התלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה (< 2.50 Å) של מטרות הליבה ומבנים כימיים דו-ממדיים של רכיבי הליבה הנספגים בדם ממאגרי הנתונים של ביולוגיה מבנית27.
  2. השיק את תוכנת העגינה המולקולרית וייבא את המבנים שהורד.
  3. בצע את שלבי העיבוד המוקדם הבאים ברצף: לנווט לעריכה > להסיר מים כדי להסיר מולקולות מים; בחר עריכה > הסרת הטרואטומים כדי להשליך שאריות לא סטנדרטיות.
  4. לך לעריכת מימן > > להוסיף > קוטבי רק כדי להוסיף אטומי מימן קוטביים. שמור את המבנים המעובדים בפורמט PDBQT דרך קובץ > שמור > כתוב PDBQT.
  5. הגדר את אתר העגינה באמצעות כלי Grid > Grid Box . מידות קופסת הרשת הותאמו באופן אדפטיבי (20–100 Å) כדי להבטיח כיסוי מלא של אזורי הקישור החזויים.
  6. אתחול פרמטרי העגינה: בחר את הקולטן דרך Docking > Macromolecule > הגדר Rigid Filename ופתח את הליגנד דרך Docking > Ligand > Open. פרמטרי העגינה נקבעו כך: מיצוי = 32, טווח אנרגיה = 3 קקלורי/מול, ועד 10 מצבי קישור נשמרו. עבור חלבונים עם ליגנדים קו-קריסטליזציה, תיבת רשת העגינה הייתה מרוכזת במרכז הליגנד עם הרחבה של 8.0 Å, בעוד שבחלבונים ללא ליגנדים קו-קריסטליזציה, חזו כיסי קישור באמצעות DoGSiteScorer עם כיסוי של כ-90%.
  7. בחר באלגוריתם הגנטי של למרק (LGA) כאסטרטגיית החיפוש. בצע את הסימולציה באמצעות עגינה > הרצת AutoDock.
  8. הערך את הזיקה של הקישור בהתבסס על אנרגיית הקישור המחושבת (ציון העגינה)28.
    הערה: אנרגיית קישור נמוכה יותר מצביעה על פעילות ביולוגית חזויה חזקה יותר ויציבות מבנית גבוהה יותר של קומפלקס החלבון-ליגנד. סף של ≤ -5.0 קקלורי/מול משמש בדרך כלל לזיהוי יציבות קישור חיובית.

תוצאות

ניתוח רכיבים בתמצית המימית של YQQJ
ניתוח הרכיבים של תמצית המימית YQQJ בוצע בתנאים שנקבעו בפרוטוקול 4. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS שימש הן במצב סריקה מלאה חיובי והן שלילי לפרופיל התמצית המימית של YQQJ, וכרומטוגרמת יוני שיא הבסיס (BPI) שהושגה מוצג באיור 1. על בסיס זה, מאגר רכיבי כימיה שהוקם בעצמו בשילוב עם אפיון ספקטרלי של MS/MS אפשר זיהוי מוצלח של 185 תרכובות מהתמצית המימית, כאשר המידע המפורט מסוכם בטבלה משלימה 1. התאמת ספקטרום ופריסת MS/MS מייצגים המשמשים לזיהוי תרכובות מוצגים באיור משלים 1. ניתוח סטטיסטי של קטגוריות התרכובות גילה כי פלבונואידים וטרפנואידים היו המרכיבים הדומיננטיים ב-YQQJ, המהווים 94 תרכובות, השיעור השכיח ביותר.

רכיבים נספגים בדם של YQQJ
כדי להבהיר את החומרים הביואקטיביים הישירים ב-vivo, דגימות סרום שנאספו לאחר מתן YQQJ נותחו. כרומטוגרמת BPI של סרום ריק (איור 2) נכללה להשוואה להבחנה בין תרכובות שמקורן בתרופות לרכיבי סרום אנדוגניים. בהתבסס על BPI של הסרום המכיל תרופה (איור 3), זוהו בסך הכל 28 רכיבי אב-טיפוס שנספגו בזרם הדם, בעיקר פלבונואידים, טרפנואידים וסטרואידים. כרומטוגרמות יונים (EICs) שהופקו מתרכובות מייצגות בתמצית YQQJ, סרום ריק וסרום המכיל תרופות אישרו עוד יותר את נוכחות רכיבים שמקורם בתרופות במחזור הדם (איור משלים 2). מתוכם, 10 תרכובות שמקורן ב-Spatholobus suberectus Dunn, 7 מ-Dioscorea nipponica Makino, 7 מ-Astragalus membranaceus, 6 מ-Hedyotis diffusa Willd., 6 מ-Lonicera japonica Thunb., 4 מ-Plantago asiatica L., ו-4 מ-Rheum palmatum.L., כפי שמסוכם בטבלה משלימה 1.

חיזוי מטרות של רכיבים נספגים בדם של YQQJ הקשורים ל-IgAN
בסך הכל 28 רכיבי אב-טיפוס שזוהו הנכנסו לזרם הדם הוזנו למאגרי תחזית מטרות, מה שהניב 459 יעדים פוטנציאליים. בינתיים, 2779 יעדים הקשורים ל-IgAN נאספו מפלטפורמות ביואינפורמטיקה משולבות. ניתוח הצמתים זיהה 247 מטרות חופפות בין YQQJ ל-IgAN (איור 4).

בנייה וניתוח רשת PPI
247 המטרות המצטלבות הועלו לפלטפורמת ה-PPI, ותוכנת ההדמיה שימשה לסינון מטרות ליבה על פי שלושה פרמטרים טופולוגיים: DC, BC ו-CC. בסך הכול זוהו לבסוף 42 מטרות כנקודות ליבה. זרימת העבודה המשמשת לסינון היעדים המרכזיים הללו מסוכמת באיור משלים 3. ברשת PPI, גודל הצמתים וצבעו השתנו בהתאם לערכי הפרמטרים (איור 5), כאשר TP53, SRC, AKT1, ESR1 ו-STAT3 דורגו בין חמשת היעדים המרכזיים המובילים.

רשת "פורמולה – רכיבים ספוגים בדם – מטרות ליבה – מסלולים – מחלה" של YQQJ
כדי לחשוף באופן שיטתי את המנגנונים הרב-רכיבים והרב-מטריים של YQQJ נגד IgAN, נבנתה רשת אינטראקציה "נוסחה–רכיבים נספגים–מטרות ליבה–מסלולים–מחלה" באמצעות תוכנת ויזואליזציה. הרשת כללה 96 צמתים ו-459 קשתות, כאשר כל קשת ייצגה קשר או אינטראקציה בין שני צמתים (איור 6).

ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG
ניתוח העשרת GO של 42 יעדי הליבה חשף 1162 מונחי BP, 52 מונחי CC ו-92 מונחי MF. איור 7 מציג את עשרת מונחי GO המועשרים ביותר בקטגוריות BP, CC ו-MF. ניתוח העשרת KEGG זיהה עוד 182 מסלולים הקשורים למטרות הליבה הללו. איור 8 ממחיש את 20 המסלולים המועשרים משמעותית המובילים הקשורים קשר הדוק לפתוגנזה של IgAN. בגרפים אלו, צבעים אדומים עמוקים מצביעים על מובהקות סטטיסטית חזקה יותר, בעוד שגודל בועות גדול יותר או אורכי מוטות ארוכים מייצגים מספר גדול יותר של מטרות מועשרות בכל מסלול.

הערכת עגינה מולקולרית
במחקר זה, בהתבסס על ניתוח קודם של מטרות מרכזיות ונתיבים קשורים ל-YQQJ בטיפול ב-IgAN 29,30,31,32, נבחרו שישה יעדים מרכזיים, כולל CASP3 (מזהה PDB: 6X8I), IGF1R (מזהה PDB: 1JQH), ג'ון (מזהה PDB: 8RPP), STAT3 (מזהה PDB: 6NJS), PRKCB (מזהה PDB: 8SE3) ו-PIK3CA (PDB ID: 5FI4), כחלבוני קולטנים לעגינה מולקולרית. בהתאם לפתוגנזה הליבה של IgAN, המוגדרת כ"רוח פתוגנית, לח-חום ורעלים הפולשים לכליה", נבחרו רכיבים פעילים מייצגים בעלי תכונות ניקוי חום, הסרת לחות וניקוי רעלים כליות, כלומר חומצה דה-אצטילספרולוזידית וחומצה ג'ניפוסידית מ-Hedyotis diffusa Willd., ודיוסין מ-Dioscorea nipponica. מקינו. תוצאות העגינה מוצגות באיור 9. מבין כל השילובים של ליגנד-קולטן, דיוסין הראה אנרגיות קישור נמוכות בהרבה עם כל היעדים הנבחרים, מה שמרמז על זיקה גבוהה יותר לחזויה. למעט האינטראקציות בין JUN לחומצה Deacetylasperulosidic / Geniposidic Acid, זוגות העגינה האחרים גם הם הראו פעילויות קישור חיוביות. קונפורמציות עגינה תלת-ממדיות מייצגות מוצגות באיור 10.

figure-results-1
איור 1: כרומטוגרמות יוני פסגת בסיס של תמצית מימית YQQJ. (A) כרומטוגרמה BPI במצב יוני חיובי. (B) כרומטוגרמה BPI במצב יוני שלילי. הכרומטוגרמות מציגות את הפרופיל הכימי הכולל של תמצית המים YQQJ תחת תנאי UHPLC-Q-Orbitrap HRMS שנקבעו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: כרומטוגרמות יוני Base Peak של סרום ריק. (A) כרומטוגרמה BPI במצב יוני חיובי. (B) כרומטוגרמה BPI במצב יוני שלילי. הכרומטוגרמות מייצגות את פרופיל הרקע האנדוגני של הסרום המשמש כאמצעי בקרה להשוואה לסרום המכיל תרופות להבחנה בין רכיבים שמקורם בתרופות לבין רכיבים אנדוגניים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: כרומטוגרמות יוני שיא בסיסי של סרום המכיל YQQJ. (A) כרומטוגרמה BPI במצב יוני חיובי. (B) כרומטוגרמה BPI במצב יוני שלילי. הכרומטוגרמות מייצגות את הפרופיל של רכיבים נספגי דם שזוהו בסרום לאחר מתן YQQJ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: דיאגרמת ון של מטרות חופפות בין YQQJ ל-IgAN. הדיאגרמה מציגה את מספר היעדים החזויים של YQQJ, מטרות הקשורות ל-IgAN, והצטלבות ביניהן, ומדגיש את המטרות המשותפות האפשריות להיות מעורבות בהשפעות טיפוליות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: רשת אינטראקציה חלבון-חלבון (PPI) של מטרות ליבה. צמתים מייצגים מטרות חלבון, וקצוות מייצגים אינטראקציות בין מטרות. גודל הצומת ועוצמת הצבע מתאימים לערכי דרגות, כאשר צמתים גדולים וכהים יותר מצביעים על קישוריות גבוהה יותר בתוך הרשת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: רשת משולבת של רכיבי YQQJ, מטרות, מסלולים ומחלות. הרשת ממחישה את הקשרים בין הנוסחה, רכיבים נספגי דם, מטרות ליבה, מסלולים ו-IgAN. משולש מייצג מחלה; מעגל מייצג שבילים; צומת בצורת V מייצג את נוסחת YQQJ; יהלום מייצג עשבים; משושה מייצג רכיבים; אוקטגון מייצג רכיבים אב-טיפוס שנספגו בדם; מלבן מייצג מטרות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 7: ניתוח העשרת GO של יעדי הליבה. תרשים הבר מציג את עשרת מונחי אונטולוגיית הגנים המועשרים ביותר בקטגוריות BP, CC ו-MF. ציר ה-x מייצג את מונחי GO, וציר ה-y מציג −log10(ערך p), מה שמציין את משמעות ההעשרה. קיצורים: BP = תהליך ביולוגי; CC = רכיב תאי; MF = פונקציה מולקולרית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-8
איור 8: ניתוח העשרת מסלולי KEGG של מטרות ליבה. תרשים הבועות מציג את 20 מסלולי KEGG המועשרים ביותר. גודל הנקודה מציין את מספר הגנים המועשרים, וגרדיאנט הצבע מציין −log10 (ערך p), כאשר צבעים אדומים יותר מצביעים על מובהקות סטטיסטית גבוהה יותר. ציר ה-x מציג את יחס הגנים, וציר ה-y מפרט את מונחי המסלול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-9
איור 9: מפת חום אנרגיית קישור מולקולרית של עגינה. מפת החום מציגה אנרגיות קישור (קקאל/מול) בין מטרות הליבה לבין תרכובות מפתח שנספגות בדם. ערכי אנרגיית קישור נמוכים יותר מעידים על חיבה חזקה יותר לחזויה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-10
איור 10: קונפורמציות עגינה מולקולרית מייצגות. (א) קונפורמציית קישור של חומצה דאצטילספרולוזידית עם CASP3. (ב) קונפורמציה קשירה של דיוסין עם STAT3. (ג) קונפורמציית קישור של חומצה גניפוסידית עם PIK3CA. התמונות מראות את האינטראקציות החזויות בין ליגנדים לחלבון ואת כיווני הקישור הצפויים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: זיהוי מבני של תרכובות מייצגות באמצעות MS/MS ברזולוציה גבוהה. (א) השוואה ספקטרלית ראש לזנב של חומצה דה-אצטילספרולוזידית בין ספקטרום ניסויי (עליון, אדום) לספקטרום מסד הנתונים הייחוס (תחתון, כחול). (B) ספקטרום פירוק MS/MS ברזולוציה גבוהה של חומצה דה-אצטילספרולוזידית. (ג) השוואה ספקטרלית ראש לזנב של חומצה גניפוסידית עם מסד הנתונים המקושר. (ד) ספקטרום ניסיוני של פרגמנטציה של חומצה גניפוסידית ב-MS/MS. (ה) השוואה ספקטרלית ראש לזנב של דיוסין עם מאגר ההתייחסות. (ו) ספקטרום הפרגמנטציה של MS/MS ברזולוציה גבוהה של דיוסין. פאנלים אלו ממחישים את ההתאמה הספקטרלית המשמשת לזיהוי תרכובות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: כרומטוגרמות יונים מופקות (EICs) של תרכובות מייצגות בין דגימות. (א) EIC של חומצה דיאצטילספרולוזידית. (B) EIC של חומצה גניפוסידית. (C) קצין ראשי של דיושין. לכל פאנל, העקבות העליונות מייצגות את תמצית המים של YQQJ (ZY), העקבות האמצעיות מייצגות סרום בקרה ריק (KBX), והעקבה התחתונה מייצגת דגימות סרום המכילות רכיבים נספגי דם לאחר מתן YQQJ (GYX). ההשוואה מדגישה נוכחות של תרכובות שמקורן בתרופות בסרום. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: זרימת עבודה לסינון יעדי הליבה. תרשים הזרימה ממחיש את תהליך זיהוי המטרות בשלב שלבי, כולל חיזוי מטרות מורכבות, איסוף מטרות הקשור ל-IgAN, ניתוח חיתוכים, בניית רשת PPI וסינון מטרות ליבה על בסיס פרמטרים טופולוגיים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

זמן (דקה)שלב נייד
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

טבלה 1: תוכנית שחרור גרדיאנטים של UHPLC. הטבלה מציגה את הרכב הפאזה הניידת ותנאי הגרדיאנט המשמשים להפרדה כרומטוגרפית, כולל נקודות זמן ופרופורציות מקבילות של ממסים מימיים (שלב A) ואורגני (שלב B).

טבלה משלימה 1: זוהו רכיבים כימיים של תמצית מימית YQQJ. הטבלה מפרטת תרכובות שזוהו על ידי UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, כולל רכיבים נספגי דם אב-טיפוס (A1–A28), יחד עם סיווגם ומקורן הצמח. קיצורים: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = דיוסקורה ניפוניקה מקינו; DH = ריאום פאלמטום L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = פלנטגו אסיאטיקה L.; JYH = לוניקרה יפוניקה. ת'אנב. מחלקות מורכבות כוללות את A = אלקלואידים; אלד = אלדהידים; F = פלבנואידים; N = נוקלאוזידים; O = אחרים; OA = חומצות אורגניות; P = פנולים; PA = חומצות פנוליות; Phe = פנילפרופנואידים; Q = קינונים; S = סוכריות; Ste = סטרואידים; T = טרפנואידים; טאן = טאנינים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

במחקר הנוכחי, שימשה אסטרטגיה משולבת המשלבת "זיהוי UHPLC-Q-Orbitrap HRMS – ניתוח פרמקוכימיה של סרום – חיזוי פרמקולוגיה רשת – אימות עגינה מולקולרית" כדי להבהיר באופן שיטתי את הבסיס והמנגנונים הפוטנציאליים של YQQJ בטיפול ב-IgAN. בניגוד למחקרים קודמים שהסתמכו בעיקר על טרשת נפוצה לניתוח רכיבים כימיים של נוסחאות צמחיות ואז חיזו מנגנונים באמצעות פרמקולוגיה רשת בלבד16, פרמקוכימיה בסרום פועלת לפי תהליך של "רכיבים צמחיים מורכבים – רכיבים נספגים בדם – חומרים פעילים ישירים בגוף – בסיס חומר פרמקודינמי". על ידי זיהוי הרכיבים הנכנסים למחזור המערכתי לאחר ההעברה, גישה זו נחשבת לאסטרטגיה יעילה לזיהוי הבסיס הפרמקודינמי של החומרים הפרמקודינמיים של נוסחאות הרפואה הסינית הסינית.

במחקר זה, ניתוח UHPLC-Q-Orbitrap HRMS זיהה בתחילה 185 רכיבים ב-YQQJ, מתוכם 28 אושרו כתרכובות אב-טיפוס נספגות דם, ובכך סיפק בסיס כימי אמין למחקרים מכניים עתידיים. דיוק זיהוי זה היה תלוי בהתאמה מקיפה של זמן השמירה, מסה מדויקת ומידע על פיצול MS/MS14. בהתבסס על אסטרטגיית הפרמקוכימיה של הסרום, תרכובות אב-טיפוס אלו שנספגו בדם שימשו כנקודת התחלה לבניית רשת, מה שהגביר את הרלוונטיות בין רכיבים צמחיים ליעילות בפועל ב-in vivo33. על ידי שילוב מטרות מצטלבות בין תרכובות למחלות עם סקר מבוסס PPI של נקודות ליבה, ולאחר מכן ניתוחי העשרת GO ו-KEGG, זוהו מסלולי איתות מרכזיים הקשורים ל-IgAN15. תוצאות העגינה המולקולרית הצביעו על כך שהרכיבים העיקריים שנספגו בדם נגזרים מ-Hedyotis diffusa Willd. ו-Dioscorea nipponica Makino.עשוי לקיים אינטראקציה עם מטרות ליבה בהתבסס על זיקות קשירה צפויות ולא על פי פעילות פונקציונלית מאושרת בניסוי. ממצאים אלו תומכים בהשערה כי חומצה דה-אצטילספרולוזידית, חומצה גניפוסידית ודיוסין עשויים לשמש כמרכיבים פרמקודינמיים פוטנציאליים של YQQJ, בכפוף לאימות ניסיוני נוסף.

מבחינה טכנית, טיפול מקדים בדגימה היה קריטי. עקב מורכבות הסרום ונוכחות חלבונים אנדוגניים (כגון הורמונים ואנזימים), התערבות בזיהוי רכיבים נספגי דם היא בלתי נמנעת. במחקר זה, הושמעו משקעים במתנול כדי להעשיר אנליטים ולהפחתת הפרעות רקע, מה שמבטיח הן רגישות והן את דיוק ניתוח הטרשת הנפוצה. לגבי זמני דגימת דם, רכיבים שונים בנוסחאות צמחיות עשויים להציג דפוסי ספיגה ושינוי ב-in vivo באופן מובחן, מה שיכול להשפיע על גילויהם בסרום. לכן, בהתבסס על ניסויים ראשוניים, נאספו דגימות סרום לאחר 2 שעות ו-8 שעות לאחר המתן הסופי כדי למקסם את כיסוי המרכיבים הזורמים.

נמצאו מספר שלבים פרוצדורליים קריטיים במיוחד ליישום מוצלח של תהליך עבודה זה. זיהוי מדויק של תרכובות נשען במידה רבה על הערכה משולבת של זמן השימור, דיוק מסה ברזולוציה גבוהה ויוני מקטעי MS/MS אבחנתיים. בנוסף, נקודות זמן נכונות לדגימת סרום חיוניות ללכידת רכיבים נספגים בדם שעשויים להופיע במחזור הדם בשלבים שונים לאחר הטיפול. לכן, אופטימיזציה זהירה של תנאי הטיפול המוקדם בדגימה והפרדה כרומטוגרפית היא הכרחית כדי להבטיח זיהוי אמין של תרכובות אב-טיפוס במטריצות ביולוגיות מורכבות.

אתגרים אנליטיים פוטנציאליים עלולים להתעורר במהלך הכנת הדגימה וניתוח טרשת נפוצה. לדוגמה, שקיעת חלבון לא שלמה עלולה לגרום להשפעות מטריציוניות שמדכאות את יעילות היינון, בעוד שרעש רקע מופרז עלול להפחית את רגישות הגילוי. ניתן להקל על בעיות אלו על ידי אופטימיזציה של יחסי הממס במהלך משקעי חלבונים, שיפור תנאי הפרדה כרומטוגרפית והתאמת פרמטרי רכישת טרשת נפוצה. במהלך עיבוד הנתונים, עשויות להתרחש הערות תרכובות חיוביות שגויות כאשר מסתמכים אך ורק על התאמת מסד נתונים; לכן, מומלץ לאמת ידנית של דפוסי פיצול MS/MS והתנהגות שימור כדי לשפר את אמינות הזיהוי.

בעבודה זו שולבו מספר שיקולים מתודולוגיים. ראשית, במקום ליישם קריטריונים קונבנציונליים כמו זמינות ביולוגית דרך הפה ודמיון לתרופות, נעשה שימוש רק ברכיבים שנספגו בדם שאומתו בניסוי לחיזוי המטרה. גישה זו מנעה אפשרות של השמטת תרכובות פעילות עקב ספי סינון מוגדרים מראש והסירה רכיבים לא רלוונטיים שאינם ביו-זמינים ב-vivo, ובכך חיזקה את הרלוונטיות הפיזיולוגית של חיזוי רשת16. שנית, בחירת הליגנדים הפעילים לעגינה התמקדה במיוחד ברכיבים עיקריים שמקורם בעשבים עם פונקציות של "פיזור לחות הרוח וניקוי רעלן חום" (Hedyotis diffusa Willd. ו-Dioscorea nipponica Makino), ויצרה גשר מכני בין מושג הפתולוגיה של ה-TCM של "רעלן-לח-חום הפולש לכליה" לבין התכונות הפתולוגיות המודרניות של IgAN. זה מספק ראיות ראשוניות התומכות בתיאוריית ה-TCM של קורלציה בין נוסחה-דפוס. שלישית, בהתחשב בהבדלים פוטנציאליים בגודל ובאיכות הנתונים בין מסדי נתונים, שולבו מספר פלטפורמות להרחבת כיסוי היעד ולהפחתת הטיה שהוכנסה על ידי כל מסד נתונים יחיד35.

בהשוואה לאסטרטגיות קונבנציונליות המיישמות ישירות פרמקולוגיה רשתית על כל המרכיבים הכימיים שזוהו, תהליך העבודה הנוכחי מדגיש עדיפות מונחית ראיות של תרכובות בהתבסס על רכיבים נספגי דם שזוהו בניסוייה. תהליך סינון מדורג זה מפחית את מספר התרכובות המועמדות הנכנסות לניתוח חישובי ומשפר את יכולת הפרשנות של רשתות אינטראקציה בין תרכובת למטרה. יתרה מזאת, בניגוד למחקרים ממוקדי מטבולומיקה, המתעדים בעיקר הפרעות מטבוליות אנדוגניות, האסטרטגיה הנוכחית מתמקדת בתרכובות אב-טיפוס חיצוניות שמקורן בתרופות צמחיות, ובכך מאפשרת ייחוס ישיר יותר של פעילות פרמקולוגית לרכיבים צמחיים ספציפיים.

מבחינה מתודולוגית מעשית, תהליך עבודה זה מספק מספר יתרונות לחקר נוסחאות צמחיות מורכבות. השילוב של HRMS עם פרמקוכימיה בסרום מאפשר זיהוי אמין של רכיבים ביו-זמינים, בעוד שהשילוב הבא של פרמקולוגיה רשתית ועגינה מולקולרית יוצר מסגרת אנליטית היררכית המקשרת בין ראיות כימיות לחיזוי מכניסטי. בנוסף, הגבלת בניית הרשת לתרכובות מאומתות ניסיונית מפחיתה את מורכבות הרשת ומקלה על זיהוי ברור יותר של אינטראקציות בין תרכובת ליבה למטרה.

למחקר הזה יש גם מגבלות. ראשית, פרמקולוגיה רשתית ועגינה מולקולרית הן גישות חישוביות חזויות. זיקה חזקה של קישור אינה בהכרח מתורגמת לויסולציה ביולוגית ב-vivo, שכן עגינה מולקולרית אינה מתחשבת בדינמיקת חלבונים, הקשר תאי או איתות במורד הזרם. יתרה מזאת, פרוטוקול העגינה הנוכחי לא כלל אימות עגינה מחדש באמצעות ליגנדים קו-קריסטליזציה או השוואת ביצועים מול מעכבים ידועים, מה שעשוי להגביל את הערכת דיוק העגינה. מחקרים עתידיים שיכללו אימות מבוסס RMSD, סימולציות דינמיקה מולקולרית ומבחנים ניסיוניים יחזקו עוד יותר את אמינות התחזיות הללו. נכון לעכשיו, הקבוצה שלנו השלימה אימות מכני שמראה כי דיוסין פועל דרך מסלול JAK2/STAT3, מה שמחזק במידה מסוימת את אמינות התחזית ומספק תמיכה ניסיונית חלקית למטרות המרכזיות שזוהו במחקר זה, אם כי אינטראקציות רכיב-מטרה אחרות עדיין דורשות אישור36. שנית, ההשפעות של התאמה פרופורציונלית ויחסי מינון בין צמחים לא שולבו בניתוח הנוכחי. עבודות עתידיות עשויות להציג מודלים של רשת משוקללים במינון-אפקט כדי לשקף טוב יותר את שיטות המרשמים הקליניות37.

לסיכום, זרימת העבודה הנוכחית — זיהוי רכיבים נספגי דם מבוסס טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, ניתוח ממוקד מטרות ומסלול מבוסס פרמקולוגיה רשתית, ואימות עגינה מולקולרית — מאפשר צמצום יעיל של בסיס החומר הפעיל ומטרות הפעולה מתוך נוסחה צמחית מורכבת. דבר זה מספק כיוון ניסויי ברור לאימות ביולוגי מעקב ומאיץ חקירות מכניות של נוסחאות הרפואה הסינית הסינית (TCM). בעתיד, שילוב מטבולומיקה מרחבית, מודלים אורגנואידיים וטכנולוגיות מולטי-אומיקס עשוי לאפשר אימות והרחבה דינמית ותלת-ממדית של הממצאים הנוכחיים במערכות המשקפות ביתר דיוק מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים, ובכך לספק ראיות מוצקות יותר להבהרת הבסיס המדעי של נוסחאות הרפואה הסינית הסינית.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 81973675), פרויקט קידום בית החולים הרפואי הסיני ברמה גבוהה (מענק מס' HLCMHPP2023039), וקרן המדע הטבעי של בייג'ינג (מענק מס' 7252259).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אוטודוק 4.2.6מכון מחקר התסריטים-
עמודה כרומטוגרפיתווטרס קורפ.ACQUITY UPLC HSS T3
צנטריפוגה מקוררת מהירהטכנולוגיית המעבדה של הטיץ'Mikro 220R
פלטפורמות ביואינפורמטיקה משולבותויצמן  Institute  of  מדע-מאגר GeneCards (https://www.genecards.org/)
פלטפורמות ביואינפורמטיקה משולבותה  Johns  הופקינס  אוניברסיטה  בית ספר  of  רפואה-מסד הנתונים OMIM (https://omim.org/).
LC-MS/4 L אצטוניטרילתרמו פישר סיינטיפיקA955-4
LC-MS/4 ליטר מתנולתרמו פישר סיינטיפיקA456-4
LC-MS/4 ליטר מיםתרמו פישר סיינטיפיקW6-4
LC-MS/50 מ"ל חומצה פורמיתתרמו פישר סיינטיפיקA117-50
תוכנת עיבוד נתוני ספקטרומטריית מסהווטרס קורפ.-תוכנת Progenesis QI 3.0
תוכנת עגינה מולקולריתמעבדת אולסוןאוטודוק 4.2.6
פלטפורמת PPIחברת מסד הנתונים STRING-הפלטפורמה המקוונת STRING (https://string-db.org)
מאגר חלבוניםהמכון האירופי לביואינפורמטיקה; המכון השווייצרי לביואינפורמטיקה; משאב מידע על חלבונים-פלטפורמת UniProt (https://www.uniprot.org/)
ספקטרומטר מסה של אורביטראפ מרובעתרמו פישר סיינטיפיקIQLAAEGAAPFALGMAZR
מאגרי מידע של תרכובות ייחוסTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
אידוי סיבובישנגחאי טיטאן סיינטיפיק בע"מTR-3L
מאגרי מידע לביולוגיה מבנית.מעבדת ברוקהייבן הלאומית-מסד הנתונים של RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)
מאגרי מידע לביולוגיה מבנית.המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי-מאגר PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
מסדי נתונים לחיזוי מטרותSIB המכון השווייצרי לביואינפורמטיקה-מאגר הנתונים SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch)
מסדי נתונים לחיזוי מטרותשנגחאי  Institute  of  Materia  מדיקה-מסד הנתונים של TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
תוסף ניתוח טופולוגי--תוסף Centiscape 2.2; מנתח רשת
מערכת UHPLCואנקוויש פלקס-
כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים במיוחדתרמו פישר סיינטיפיקVanquish Flex UHPLC
מחלץ אולטרסוניקונשאן אולטרסוניק אינסטרומנטס בע"מKQ3200D
מרכז צנטריפוגלי בוואקוםNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
תוכנת ויזואליזציה--סייטוסקייף 3.10.4
פלטפורמת הערות פונקציונליות מבוססת רשת.Broad  המכון-הפלטפורמה המקוונת Metascape (https://metascape.org)

מקורות

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

KEGG
הבהרת הבסיס החומרי של נוסחת Yiqi Qingjie נגד נפרופתיה של IgA באמצעות UHPLC-Q-Orbitrap HRMS משולב עם פרמקולוגיה רשתית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.