Method Article

פענוח האפיטרנסקריפטום: תובנות בסיליקו על רשת רגולציה של m6A בסרטן השד

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג גישה לביצוע ניתוחים גנטיים, מולקולריים ופרוגנוסטיים בסיליקו של רגולטורי שינוי m6A על ידי שילוב פרופילי מוטציה, שינויים במספר עותקים, ביטוי גנים ותוצאות קליניות, באמצעות מאגרי נתונים זמינים לציבור מאטלס הגנום של הסרטן (TCGA), פרויקט ביטוי גנוטיפ-רקמה (GTEx) ופלטפורמות מיקרוארי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-מתילאדנוזין (m6A) הוא השינוי הפנימי השכיח ביותר ב-RNA בתעתיקים אאוקריוטיים ומשחק תפקיד קריטי במטבוליזם של ה-RNA, ביטוי גנים וההומאוסטזיס התאי. הדיסרגולציה של רגולטורים של m6A, כולל "כותבים", "מחקים" ו"קוראים", הוחשתה יותר ויותר בביולוגיה של סרטן; עם זאת, תפקידיהם המקיפים בסרטן השד עדיין לא ברורים. המטרה העיקרית של מאמר שיטה זה היא לספק למתחילים בביואינפורמטיקה מסגרת שלב אחר שלב לשימוש במאגרי נתונים זמינים לסרטן לביצוע ניתוחים מוטציוניים, הערכת שינויים בביטוי גנים ובחינת הקשרים שלהם להישרדות המטופלים. כמחקר מקרה, ווסתי m6A בסרטן השד נותחו באמצעות מערכי נתונים מאטלס הגנום של הסרטן (TCGA), פרויקט ביטוי הגנוטיפ-רקמה (GTEx) ופלטפורמות מיקרוארי. פרופילים טרנסקריפטומיים נותחו באופן שיטתי כדי להדגים זרימות עבודה להערכת הרלוונטיות הפרוגנוסטית של רכיבי רגולציה של m6A בסרטן השד. באמצעות מסגרת אנליטית זוה, זוהו דפוסים מובחנים של שינויים גנטיים והבעה שונה בין רגולטורים מרכזיים של m6A. מספר רגולטורים, כולל METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ו-RBMX, היו קשורים להישרדות מטופלת טובה יותר, בעוד ש-YWHAG היה קשור להישרדות כוללת נמוכה. מחקר זה מספק סקירה מקיפה בגנומיקה מערכתית של גנים רגולטוריים של m6A בסרטן השד, תוך הדגמת תהליך ביואינפורמטיקה מבוסס רשת מעשי וניתן לשחזור. ממצאים אלו מקדמים את ההבנה של ויסות אפיטרנסקריפטומי בסרטן השד ומספקים בסיס לפיתוח אסטרטגיות אבחון וטיפול חדשות מבוססות m6A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים אפיטרנסקריפטומיים מהווים שכבה חשובה של ויסות גנים לאחר שעתוק ותורמים לתהליכים תאיים ומצבי מחלה מגוונים. מבין יותר מ-170 שינויים ב-RNA שזוהו עד כה, N6-מתילאדנוזין (m6A) הוא הנפוץ והמאופיין ביותר ב-mRNA אאוקריוטיים1. הותקן על ידי קומפלקסים "כותבים" כולל METTL3/METTL14, מוסר על ידי "מחקים" כולל FTO ו-ALKBH5, ומפורש על ידי חלבוני "קורא" כולל חברי משפחות YTH ו-IGF2BP, m6A מתאם חיבור, יציבות, הובלה ותרגום, ובכך משפיע על תהליכים ביולוגיים מרכזיים כולל התפתחות, התמיינות ותגובת לחץ 2,3.

שינויים ברכיבי הרגולציה של m6A דווחו במגוון רחב של ממאירים4. ברבים מסוגי הסרטן, פעילות חריגה של m6A מניעה פנוטיפים ממאירים; לדוגמה, ביטוי מוגבר של METTL3 מקדם התחלה והתקדמות סרטן הערמונית על ידי ויסות מסלול הקיפוד ומתילציה של MYC RNA 5,6. בתחילה נמצא כי FTO מעורב בהשפעה אונקוגנית בלוקמיה מיאלואידית חריפה, אך הוכח כי הוא מניע התקדמות גידול בסרטן הכבד, הריאות והמעי הגס 7,8,9,10. עם זאת, זוהו תפקידים תלויי הקשר של FTO ו-ALKBH5 הממחישים את האופי הכפול של ויסות מתווך m6A, שיכול לקדם הן את האיתות האונקוגני והן את האיתות המדכא של הגידולים 11,12,13,14. קוראי M6A, כולל YTHDF1/2/3, ריבונוקלאופרוטאינים גרעיניים הטרוגניים (hnRNPs) וחלבוני קישור mRNA דמויי אינסולין-2 (IGF2BP1-3), נמצאו גם הם קשורים לקרצינוגנזה 15,16,17.

בסרטן השד, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמווסתי m6A לעיתים קרובות אינם מווסתים ועשויים להיות קשורים לתת-סוגי גידול, תכונות הקשורות למערכת החיסון ותוצאות קליניות. מחקרים מכניים רבים ממקמים את METTL3 כגורם פרו-אונקוגני מוסדר לעיתים קרובות בסרטן השד. התקנה של m6A בתיווך METTL3 יכולה לייצב או לשפר תרגום של תמלולים המעודדים התפשטות, מעבר אפיתליאלי-מזנכימי (EMT), גרורות וכימו-עמידות20. הוכח גם כי METTL3 מקדם התקדמות סרטן השד על ידי מיקוד ב-Bcl-221. ALKBH5 היה מעורב בוויסות תוכניות גזע סרטן באמצעות NANOG ומולקולות נוספות הקשורות לגבעולים, אך השפעתו עשויה להשתנות בהתאם להקשר הגידול22.

ככל שרשימת הרגולטורים של m6A ממשיכה להתרחב בשנים האחרונות, יש צורך בעדכון על האופן שבו הרגולטורים החדשים שזוהו עלולים להיות לא מוסדרים בסרטן השד. טבלה 1 מספקת רשימה של רגולטורים של m6A הכוללים כותבים, קוראים ומחקים של שינויים ב-m6A. בנוסף, זוהו רגולטורים חדשניים של m6A, כולל LRPPRC ו-YWHAG, עם השלכות בהתקדמות הסרטן 23,24,25. לכן, נערך אפיון גנטי ומולקולרי מקיף של כל רגולטורי m6A הידועים בסרטן השד באמצעות כלים שניתן להשתמש בהם על ידי חוקרים עם רקע ביואינפורמטי מוגבל.

מטרת מאמר זה ב-Methods היא להציג פרוטוקול ביואינפורמטיקה מבוסס פלטפורמה שלב אחר שלב לניתוח רגולטורים של m6A בסרטן השד באמצעות משאבים זמינים לציבור בתחום גנומיקת הסרטן. באמצעות מערכי נתונים מ-The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), פרויקט Genotype Tissue Expression (GTEx)26, ופלטפורמות אנליטיות מבוססות רשת כמו cBioPortal ו-UCSC Xena, פרוטוקול זה מדגים זרימות עבודה ניתנות לשחזור להערכת פרופילים מוטציוניים, שינויים בביטוי גנים וקשר להישרדות המטופלים. גישה ויזואלית ונגישה זו נועדה להקל על אימוץ ניתוח נתונים אפיטרנסקריפטומיים על ידי חוקרים חדשים בתחום הביואינפורמטיקה של סרטן.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: רשימת הגנים המקודדים מווסתי מתילציה של m6A, המסווגים ככותבים, קוראים ומחקים, מוצגת בטבלה 1. כל הגנים שצוינו נכללו בניתוחים הבאים של מוטציות, דפוסי ביטוי והישרדות כללית. כל התוכנות והכלים ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. זיהוי שינויים גנטיים ברגולטורים של m6A

  1. גש ל-cBioPortal לגנומיקת סרטן. עבור לאתר cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. מדף הבית, בחר בלשונית "שאילה" כדי להתחיל ניתוח חדש.
  2. בחר את מחקר הסרטן ואת הקבוצה המתאימה.
  3. בשורת החיפוש "Select Studies for Visualization and Analysis", יש להקליד "Breast Inversive Carcinoma" ולבחור "Breast Inversive Carcinoma (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. בתחתית, בחר "שאילתה לפי גן".
    קריטי: ודא שהקוהורט שנבחר (996 דגימות) כולל גם נתוני מוטציה וגם נתוני שינוי מספר עותקים (CNA).
  5. הגדר את השאילתת הגנטית. ב"Enter Genes", הזינו את סמלי הגנים HUGO לרשימה המלאה של רגולטורים m6A הנחקרים.
    הערה: ניתן להזין גנים כרשימה המופרדת ברווחים. תחת "בחירת פרופילים גנומיים", ודא ששני סוגי הנתונים הבאים נבדקים: מוטציות ושינויים במספר העתק.
  6. תחת "בחר קבוצת מטופל/מקרה", בחר את מערך המדגם ברירת המחדל המתאים לקבוצה עם כל מקרי הפרופיל.
  7. לחץ על כפתור הכחול "שלח שאילתה".
  8. שלפו ופרשו את נתוני השינוי הגנטי. עם ההגשה, התוצאה נטענת בלשונית "סיכום". ההדמיה המרכזית של "OncoPrint" מספקת סקירה מיידית של שינויים גנטיים בכל הגנים שנשאלו בקבוצה, שניתן להורדה.
  9. ליד ה-OncoPrint, מצא את תרשים "סיכום סוגי סרטן". זה מספק פירוט כמותי של שינויים בין תתי-סוגי סרטן השד.
  10. בצע ניתוח פאן-סרטן. חזור לדף הבית של cBioPortal ובחר "TCGA PanCancer Atlas Studies" תחת לשונית "שאילתה".
  11. בתיבת הקלט של הגן, הזן את אותה רשימה של גני ווסת m6A.
  12. לחצו על "שלח שאילתה" ובדף התוצאות עברו ללשונית "סיכום סוגי סרטן". זה מספק מבט על סרטן כוללני.

2. ניתוח טרנסקריפטומי השוואתי של רגולטורי m6A באמצעות UCSC Xena.

  1. גש לפלטפורמת UCSC Xena. עבור לאתר UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. מדף הבית, לחץ על כפתור "השקת Xena" כדי להיכנס לדפדפן הניתוח הראשי.
  3. בדפדפן Xena, לחץ על "DATA SETS".
  4. בין מערכי הנתונים, בחרו ב-"TCGA TARGET GTEx". זה מכיל נתוני RNA-Seq מעובדים אחידים מרקמות תקינות של פרויקטי TCGA ו-GTEx.
  5. בעמוד הבא, לחץ על "המחשה".
  6. הגדר את משתנה הפנוטיפ (קבוצת המדגם). ב"בחר את המשתנה הראשון שלך", בחר "קטגוריה ראשית" בסוג הנתונים הפנוטיפי.
  7. לחץ על "למשתנה השני". לאחר מכן, בסוג הנתונים הגנומי, סמן "ביטוי גן" במאגר הנתונים. הוסף את רשימת הגנים בתיבת "הוסף גן או מיקום". לחץ על "בוצע".
  8. דמיין דפוסי הבעה עם מפת חום.
  9. כדי להפריד בין דגימות השד (TCGA+GTEx) לבין דגימות TCGA TARGET GTEx, הקלידו "Breast" והשתמשו באפשרות המסנן לשמירת הדגימות.
  10. מפת החום נראית כעת וניתן להוריד אותה כקובץ PDF.
  11. יצר גרפים השוואתיים לגנים בודדים. כדי לכמת ולהמחיש את הבדלי הביטוי של גן מסוים, השתמשו ב"הצג כגרף". באמצעות אפשרות זו, ניתן לראות את הנתונים כגרף קופסה, גרף נקודות, וגרף כינור, השוואה בין התפלגות הביטויים בין שתי קבוצות הדגימה.
  12. השתמשו באפשרות "הורדה כ-PDF" כדי להוריד את התרשימים.
  13. מובהקות סטטיסטית (ערך p) ניתן לקבל על ידי לחיצה על "סטטיסטיקה".

3. הערכת חשיבות פרוגנוסטית של רגולטורים m6A באמצעות פלוטר קפלן-מאייר.

  1. גש לכלי המתכנן קפלן-מאייר. עבור לאתר Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. מדף הבית, בחרו בלשונית "סרטן השד" כדי להתחיל ניתוח ייעודי למאגרי נתוני סרטן השד.
  3. הגדר את שאילתת הגנים לגן יחיד.
  4. בחלק הקלט הראשי, אתר את תיבת "סמל גן".
  5. הכנס את הסמל הרשמי של גן הרגולטור m6A לניתוח (למשל, METTL3).
    קריטי: ממש מתחת לתיבת הקלט של הגן, אתר והפעל את תיבת הסימון של "רק JetSet את ערכת הגשוש הטובה ביותר". זה מבטיח שהגלאי המיקרו-מערך האמין והמדויק ביותר ייבחר אוטומטית עבור הגן שלך, ומייעל את איכות הנתונים ואת השחזוריות.
  6. הגדר את פרמטרי ניתוח ההישרדות. בסעיף "הישרדות", בחרו ב"הישרדות כוללת (OS)" כנקודת הסיום העיקרית לניתוח זה. הכלי ישתמש אוטומטית בנתונים מ-1880 מטופלות סרטן השד כאשר ייבחר הגדרה זו.
  7. ודא שהאפשרות "פיצול מטופלים לפי" מוגדרת ל"חציון". זה יחלק את המטופלים לשתי קבוצות שוות; ביטוי גבוה וביטוי נמוך, בהתבסס על ערך הביטוי החציוני של הגן שנשאלה בכל הדגימות.
  8. ניתן להשתמש ב"סף מעקב" לבחירת תקופת המעקב. למחקר זה נבחרו 180 חודשים.
  9. יצר ופרש את עלילת קפלן-מאייר.
  10. לחץ על כפתור "ציור עלילה של קפלן-מאייר".
  11. חלון חדש ייטען, ויציג את עקומת ההישרדות.
  12. פרש את האלמנטים המרכזיים בעלילה; ציר ה-X מצביע על זמן בחודשים, ציר ה-Y מראה את ההסתברות להישרדות הכוללת, ושני הקווים הצבעוניים מייצגים את עקומות ההישרדות של קבוצות החולים בעלות ביטוי גבוה (אדום) ונמוך (שחור). ערך ה-P בדירוג-לוגיתם מוצג ומציין את המובהקות הסטטיסטית של ההבדל בין שתי עקומות ההישרדות.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוף מוטציוני של רגולטורי מתילציה של m6a בסרטן השד

במחקר קודם על ניתוח גנומי של מערכי נתונים של TCGA, דווחו מוטציות חוזרות בכמה גנים המקודדים רגולטורים של מתילציה של DNA31. במחקר הנוכחי, cBioPortal שימש לניתוח מערך הנתונים "קרצינומה פולשנית לשד (TCGA, PanCancer Atlas)" במטרה לבחון פרופילים מוטציוניים של גנים המקודדים את הכותבים, הקוראים והמחקים של מתילציה של m6A RNA. ניתוח זה חשף שינויים גנטיים מגוונים בקרב חולות סרטן השד, כאשר תדירויות השינוי משתנות באופן משמעותי בין גנים – מ-0.4% ב-CNBP ו-RBM15B ועד 12% ב-VIRMA (איור 1A). הגברת גנים הייתה השינוי הנפוץ ביותר, בעוד אירועים נוספים כללו מחיקות עמוקות, החלפות בסיסים ושינויים מקבילים מרובים. ראוי לציין כי זוהו שינויים בגנים המווסתים פונקציות הקשורות ל-m6A ב-476 מטופלות (48% מהקבוצה) (איור 1B), מה שמדגיש את חשיבות דינמיקת שינוי m6A בסרטן השד. למרות שתדירות סוגי השינוי השונים השתנתה, מוטציות כאלה נצפתו בכל תת-הסוגים המולקולריים של סרטן השד (איור 1C). לצורך אימות, PIK3CA, TP53, CDH1 ו-GATA3 נכללו כגנים לבקרת ייחוס (איור 1A). באופן בולט, שינויים במנגנון הרגולציה של m6A לא הוגבלו לסרטן השד בלבד. ניתוח של 10,967 דגימות מ-10,953 מטופלים מ-32 מחקרים באטלס הפאן-סרטן של TCGA חשף דפוסי מוטציה משומרים במגוון רחב של סוגי סרטן. לאחרונה הוכח כי מסלול ה-m6A משתנה לעיתים קרובות בסרטן הערמונית (PCa) ובאופן כללי ממלא תפקיד תומך אונקוגני32. ממצאים אלו מצביעים על כך שמוטציות המשפיעות על גנים המקודדים את הכותבים, הקוראים והמחקים של שינוי RNA ב-m6A הן תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן (איור 2).

פרופילי ביטוי גנים חריגים בסרטן השד

עדויות מתחדשות מדגישות הפרעות טרנסקריפטומיות כגורמים מרכזיים להיווצרות גידולים, כאשר ביטוי גנים חריג מציע פוטנציאל כסמנים ביולוגיים בסרטן השד. כדי לחקור זאת, רמות התמלול של גנים המווסתים שינוי m6A נותחו באמצעות נתונים מה-TCGA ופרויקט ביטוי רקמת הגנוטיפ (GTEx) המייצגים רקמת שד תקינה. כפי שמודגם באיור 3A, גנים שונים הקשורים ל-m6A הראו חוסר ויסות משמעותי בדגימות סרטן השד. גם עלייה וגם ירידה בוויסות נצפו ברקמות גידול בהשוואה לביקורת תקינה. METTL3 ו-WTAP, שניהם מרכיבים של קומפלקס הכתיבה, עברו ויסות נמוך בין גנים אחרים, בעוד שמספר גנים נוספים, כולל VIRMA, YTHDF1 ו-YTHDF3, עברו ויסות מוגבר. איור 3B מפרט עוד את פרופילי הביטוי השונים של גנים בודדים בין קבוצות TCGA ו-GTEx. ביחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שגנים המקודדים כותבי מתילציה, קוראים ומחקים של m6A עוברים די ויסות שעתוק נרחב בסרטן השד, מה שמדגיש את הרלוונטיות הפוטנציאלית שלהם בהתקדמות המחלה.

גנים של מכונות m6A ותפקידם בפרוגנוזה של המטופל

בעקבות התצפית ששינויים גנטיים ושינויים בביטוי גנים נפוצים מאוד בקרב חולי סרטן, נחקרה הרלוונטיות הפרוגנוסטית של שינויים אלו בביטוי בסרטן השד. באמצעות כלי הפלטר Kaplan-Meier (KM)30, שמשלב מערכי נתונים של מיקרוארי, הוערכה ההישרדות הכוללת (OS) בקרב 1880 חולות סרטן השד לפי ביטוי גני רגולטור m6A. ניתוח זה חשף כי ביטוי מוגבר של METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ו-RBMX היה קשור באופן משמעותי לשיפור בהישרדות הכוללת. לעומת זאת, ביטוי יתר של YWHAG היה מתאם לתוצאות הישרדות ירודות (איור 4). כביקורת, נכללו CCND2 ו-TOP2A, סמנים ידועים של פרוגנוזה טובה וגרועה, בהתאמה. גנים אחרים המקודדים רגולטורים של m6A לא הראו קורלציות מובהקות סטטיסטית עם הישרדות המטופלים (איור משלים). ממצאים אלו מדגישים תת-קבוצה של גנים רגולטורי מתילציה של m6A עם פוטנציאל שימושי בתחזית סרטן השד.

figure-results-1
איור 1: שינויים גנטיים בכותבים, קוראים וגנים של מחקים m6A בסרטן השד. (א) מוצגת התפלגות השינויים בין 996 חולות סרטן השד, כאשר כל קו אפור מייצג מקרה בודד. הפסים המקודדים בצבעים מציינים סוגי שינוי שונים, כולל מוטציות של missense, מחיקות עמוקות, הגברות, מוטציות בתוך המסגרת ומוטציות קיצור. גנים מאופיינים היטב, PIK3CA, TP53, CDH1 ו-GATA3, נכללים כביקורת חיובית בשל תדירות המוטציות המובחנות שלהם. (B) תדירות השינוי הכוללת של גנים רגולטוריים של m6A בקרב קבוצת המטופלים. (ג) דפוסי שינוי גנטי בגנים של רגולטור m6A על ידי תת-סוגים של סרטן השד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו. 

figure-results-2
איור 2: תדירות שינויים גנטיים בגנים המקודדים כותבים, קוראים ומחקים של m6A בסוגי סרטן מגוונים. הניתוח מבוסס על נתונים מאטלס הסרטן הפאן-סרטני של TCGA, הכולל 10,967 דגימות מ-10,953 מטופלים ב-32 מחקרי סרטן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו. 

figure-results-3
איור 3: אנומליות ביטוי בגנים המקודדים כותבי m6A, קוראים ומחקים. (א) ביטוי יתר (פסים אדומים) ותת-ביטוי (פסי כחול) של כל הגנים מוצגים. נתונים מ-GTEx ו-TCGA שימשו להשוואת דגימות סרטן שד תקינות לעומת דגימות סרטן השד. (B) תרשים זה מציג השוואה בין ביטוי גנים בודד בקרב חולות סרטן שד תקינים לעומת סרטן השד. זינה משתמשת במבחן t של וולש כדי לקבוע את ערכי ה-p לכל גן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: פרופילי ביטוי של כותבים, קוראים ומחקים של m6A והקשר שלהם לתחזית בסרטן השד. עקומות ההישרדות של קפלן-מאייר מציגות את ההישרדות הכוללת של המטופלים, כאשר ציר ה-X מציין זמן (חודשים), וציר ה-Y מציג את הסתברות ההישרדות הכוללת. הקווים האדומים מייצגים את קבוצת הביטוי הגבוה, בעוד הקווים השחורים מייצגים את קבוצת הביטוי הנמוך. החולים חולקו בשכבות על פי רמות הביטוי החציוניות של הגן. ערכי p נקבעו באמצעות מבחן Log-Rank. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים: חברי רגולטורים של m6A אינם מראים קורלציה משמעותית עם הישרדות המטופלת הכוללת, כפי שמודגם בעקומות ההישרדות של קפלן-מאייר. הקווים האדומים מייצגים את קבוצת הביטוי הגבוה, בעוד הקווים השחורים מייצגים את קבוצת הביטוי הנמוך. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

סוגסמל הגן
סופריםMETTL3
METTL14
ZC3H13
WTAP
RBM15
RBM15B
METTL16
CBLL1
KIAA1429/VIRMA
קוראיםYTHDF1
YTHDF2
YTHDF3
YTHDC1
YTHDC2
HNRNPA2B1
HNRNPC
HNRNPG/RBMX
IGF2BP1
IGF2BP2
IGF2BP3
CNBP
ELAVL1
SND1
PRRC2A
PRRC2B
PRRC2C
EIF3A
FMR1
FXR1
FXR2
LRPPRC
MSI2
מחקיםALKBH5
FTO

טבלה 1: גנים מקודדים כותבים, קוראים ומחקים של m6A. טבלה 1 מספקת סקירה של משפחות הגנים העיקריות האחראיות להתקנה, זיהוי והסרה של שינוי m6A ב-RNA אאוקריוטי.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאמר של שיטה זו מספק תהליך עבודה מקיף, נגיש ומשולב לפרופיל מולטי-אומיקס שיטתי ולתרגום קליני של כל חתימת גן במחקר סרטן, כפי שמודגם כאן באמצעות ניתוח רגולטורים של מתילציה RNA של m6A בסרטן השד. על ידי שילוב פלטפורמות ביואינפורמטיקה ציבוריות מרכזיות אלו, גישה זו מאפשרת לחוקרים להתקדם ביעילות מגילוי גנומי להשערות קליניות רלוונטיות, מבלי לדרוש מומחיות חישובית מתקדמת.

החוזקה העיקרית של המתודולוגיה הזו היא הצינור המודולרי שמייצר השערות. הפרוטוקול מדריך את המשתמש דרך רצף לוגי; ראשית, זיהוי אילו גנים עברו שינוי גנטי (באמצעות cBioPortal), לאחר מכן הערכת חוסר ויסות ביטוי בסביבה מתוקנת אצווה (באמצעות UCSC Xena), ולבסוף הערכת ההשפעה הקלינית של חוסר הוויסות הזה על הישרדות המטופלים (באמצעות פלאטר קפלן-מאייר). ניתוח זה, מ-DNA ועד RNA ועד לתוצאה קלינית, מעניק למעשה עדיפות לגנים מועמדים למחקר נוסף. לדוגמה, יישום תהליך עבודה זה על רגולטורים של m6A זיהה ביעילות גנים כמו YWHAG (שינוי תכוף, פרוגנוסטי להישרדות לקויה) כיעדים בעלי עדיפות גבוהה לאימות תפקודי.

עיצוב הפרוטוקול לניתוח פאן-סרטן משפר עוד יותר את השימושיות שלו, ומאפשר לחוקרים לקבוע במהירות אם חתימה מולקולרית ספציפית לסרטן אחד או שהיא תכונה משותפת של גידול, כפי שנצפה בשינויים נרחבים במכונות m6A במחקר זה. ניתוח פאן-סרטן גילה שמוטציות המשפיעות על כותבים, קוראים ומחקים של m6A לא היו מוגבלות לסרטן השד אלא משותפות בין מספר מאירויות. דבר זה תואם את הראיות המצטברות לכך שווסות חריג של m6A הוא תכונה ייחודית של אונקוגנזה בסוגי גידולים מגוונים, שכן הוא משפיע על סימני ההיכר השונים של סרטן ותהליכים פיזיולוגיים, כולל חיבורי RNA, יציבות, תרגום ופעילות RNA לא מקודדת33.

גישה מתודולוגית זו גמישה מאוד. בעוד שמודגם עם רגולטורים של m6A, ניתן ליישם מיד את אותו תהליך לאפיון גנים של נקודות ביקורת חיסוניות, אנזימים מטבוליים או חתימות גנים חדשות מניסויי RNA-seq בכל סוג סרטן הזמין במאגרים אלו. פורמט שלב אחר שלב זה מוריד את המחסום עבור מדעני מעבדה רטובה לבצע ניתוחים מתקדמים בסיליקו , ומאיץ את המעבר מנתונים גנומיים לתובנות ביולוגיות.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק מסגרת איתנה להקשר של גנים הקשורים לסרטן. בנוסף להגדרת הנוף המוטציוני, הממצאים חשפו שינויים דו-כיווניים בביטוי בוויגולטורים של m6A. ממצא זה מדגיש את המורכבות של האפיטרנסקריפטום ומחזק את הפרדיגמה הקיימת של תפקוד תלוי הקשר, כפי שמודגם בתפקידים הכפולים המדווחים עבור חלבוני METTL3 ו-YTHDF בסרטנים שונים34,35. ציר m6A הוכח גם כממלא תפקיד בוויסות התפשטות, גרורות והתחמקות חיסונית בסרטן שד משולש שלילי36,37. מעניין לציין כי ניתוח ההישרדות זיהה תת-קבוצה של רגולטורים מסוג m6A בעלי משמעות פרוגנוסטית. ביטוי מוגבר של METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ו-RBMX היה קשור לתוצאות חיוביות, בעוד שביטוי YWHAG היה במתאם להישרדות כוללת נמוכה. ממצאים אלו תומכים בפוטנציאל השימושי הקליני של רגולטורי m6A כסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים. CBLL1 זוהה גם כאחד הגורמים עם תחזית חיובית במחקר קודם38. עם זאת, הניתוח הנוכחי שכלל חברים מעודכנים של רגולטורים של m6A זיהה חברים נוספים, כמו RBMX ו-YWHAG, עם הישרדות כוללת טובה יותר וגרועה יותר, בהתאמה. התצפית כי רגולטורים שונים יכולים לחזות פרוגנוזה שלילית או חיובית מדגישה את הפונקציות הכפולות והספציפיות להקשר של שינויים ב-m6A בביולוגיה של סרטן. למרות ש-YTHDF1 ו-YTHDF3 מוגברים משמעותית בגידולים, חוסר המתאם שלהם עם ההישרדות הכוללת עשוי לשקף יתירות תפקודית בקרב הקוראים, תפקידים תלויים בהקשר בין תתי-סוגי סרטן, או הצורך להתחשב ביחס שלהם או ברשת הרגולציה נטו m6A במקום ברמות הביטוי האישיות. בנוסף, למרות ש-VIRMA הציגה את תדירות השינוי הגבוהה ביותר (12%, בעיקר הגברה), הביטוי שלה לא היה בקשר משמעותי להישרדות כוללת בסרטן השד. הסבר אפשרי אחד הוא שביטוי hIgh VIRMA מצביע רק על פוטנציאל מוגבר להצטברות m6A, ולא אם קיימים קוראי המשך או mRNA המטרה הנדרשים כדי לתרגם זאת להתנהגות גידול אגרסיבית. ראוי לציין שבעוד ש-YTHDF1 ו-YTHDF3 היו מוגזמים בקבוצה, YTHDC1 ו-YTHDC2 היו מופחתת משמעותית. דפוס הביטוי הלא תואם הזה מצביע על כך שהשילוב התפקודי של כותבים וקוראים ספציפיים הנדרש לתפוקה אונקוגנית עשוי שלא להיות יעיל בסרטן השד. לכן, למרות הביטוי הגבוה שלה, ייתכן ש-VIRMA לא ישמש כמנוע דומיננטי בהקשר זה (תרשים משלימה).

המחברים מכירים במגבלה עיקרית של זה בצינור סילקו . הניתוחים הם במהותם קורלנטיים; הם מזהים אסוציאציות חזקות אך אינם קובעים סיבתיות מכנית. ניתן לקבוע סיבתיות זו באמצעות גנומיקה פונקציונלית או באמצעות מעכבי מולקולות קטנות המיוקדים רכיבים במסלול m6A39. ראוי לציין כי מעכב הפפטידים הראשון שמכוון ל-METTL3, RSM3, פותח לאחרונה והוכיח פוטנציאל אנטי-סרטני במודלים של סרטן הערמונית ב-vivo40. לכן, תהליך עבודה מתודולוגי זה מהווה כלי חשוב לזיהוי מטרות מועמדות ולדירוגי אוכלוסיות מטופלים הסבירות ביותר להרוויח מהתערבויות טיפוליות אלו.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקים מהמאמר הזה עברו עדכון בעזרת כלי שפה מבוססי בינה מלאכותית לשיפור הבהירות והקריאות. כל התוכן המהותי, הפרשנות, הניתוחים והמסקנות הם של המחברים בלבד. אנו מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מענק מאוניברסיטת אלפייסל (IRG 25450) ל-RM מוכר לשמחתנו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalמרכז הסרטן ממוריאל סלואן-קטרינגhttps://www.cbioportal.org
ביטוי גנוטיפ-רקמה (GTEx)קונסורציום GTExhttps://gtexportal.org
קפלן-מאייר מתכנןמעבדת גיורפי/A5 גנטיקה בע"מhttps://kmplot.com
אטלס הגנום לסרטן (TCGA)המכון הלאומי לסרטן (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
דפדפן UCSC Xenaאוניברסיטת קליפורניה סנטה קרוזhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles