Method Article

פענוח האפיטרנסקריפטום: תובנות בסיליקו על רשת רגולציה של m6A בסרטן השד

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג גישה לביצוע ניתוחים גנטיים, מולקולריים ופרוגנוסטיים בסיליקו של רגולטורי שינוי m6A על ידי שילוב פרופילי מוטציה, שינויים במספר עותקים, ביטוי גנים ותוצאות קליניות, באמצעות מאגרי נתונים זמינים לציבור מאטלס הגנום של הסרטן (TCGA), פרויקט ביטוי גנוטיפ-רקמה (GTEx) ופלטפורמות מיקרוארי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-מתילאדנוזין (m6A) הוא השינוי הפנימי השכיח ביותר ב-RNA בתעתיקים אאוקריוטיים ומשחק תפקיד קריטי במטבוליזם של ה-RNA, ביטוי גנים וההומאוסטזיס התאי. הדיסרגולציה של רגולטורים של m6A, כולל "כותבים", "מחקים" ו"קוראים", הוחשתה יותר ויותר בביולוגיה של סרטן; עם זאת, תפקידיהם המקיפים בסרטן השד עדיין לא ברורים. המטרה העיקרית של מאמר שיטה זה היא לספק למתחילים בביואינפורמטיקה מסגרת שלב אחר שלב לשימוש במאגרי נתונים זמינים לסרטן לביצוע ניתוחים מוטציוניים, הערכת שינויים בביטוי גנים ובחינת הקשרים שלהם להישרדות המטופלים. כמחקר מקרה, ווסתי m6A בסרטן השד נותחו באמצעות מערכי נתונים מאטלס הגנום של הסרטן (TCGA), פרויקט ביטוי הגנוטיפ-רקמה (GTEx) ופלטפורמות מיקרוארי. פרופילים טרנסקריפטומיים נותחו באופן שיטתי כדי להדגים זרימות עבודה להערכת הרלוונטיות הפרוגנוסטית של רכיבי רגולציה של m6A בסרטן השד. באמצעות מסגרת אנליטית זוה, זוהו דפוסים מובחנים של שינויים גנטיים והבעה שונה בין רגולטורים מרכזיים של m6A. מספר רגולטורים, כולל METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 ו-RBMX, היו קשורים להישרדות מטופלת טובה יותר, בעוד ש-YWHAG היה קשור להישרדות כוללת נמוכה. מחקר זה מספק סקירה מקיפה בגנומיקה מערכתית של גנים רגולטוריים של m6A בסרטן השד, תוך הדגמת תהליך ביואינפורמטיקה מבוסס רשת מעשי וניתן לשחזור. ממצאים אלו מקדמים את ההבנה של ויסות אפיטרנסקריפטומי בסרטן השד ומספקים בסיס לפיתוח אסטרטגיות אבחון וטיפול חדשות מבוססות m6A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים אפיטרנסקריפטומיים מהווים שכבה חשובה של ויסות גנים לאחר שעתוק ותורמים לתהליכים תאיים ומצבי מחלה מגוונים. מבין יותר מ-170 שינויים ב-RNA שזוהו עד כה, N6-מתילאדנוזין (m6A) הוא הנפוץ והמאופיין ביותר ב-mRNA אאוקריוטיים1. הותקן על ידי קומפלקסים "כותבים" כולל METTL3/METTL14, מוסר על ידי "מחקים" כולל FTO ו-ALKBH5, ומפורש על ידי חלבוני "קורא" כולל חברי משפחות YTH ו-IGF2BP, m6A מתאם חיבור, יציבות, הובלה ותרגום, ובכך משפיע על תהליכים ביולוגיים מרכזיים כולל התפתחות, התמיינות ותגובת לחץ 2,3.

שינויים ברכיבי הרגולציה של m6A דווחו במגוון רחב של ממאירים4. ברבים מסוגי הסרטן, פעילות חריגה של m6A מניעה פנוטיפים ממאירים; לדוגמה, ביטוי מוגבר של METTL3 מקדם התחלה והתקדמות סרטן הערמונית על ידי ויסות מסלול הקיפוד ומתילציה של MYC RNA 5,6. בתחילה נמצא כי FTO מעורב בהשפעה אונקוגנית בלוקמיה מיאלואידית חריפה, אך הוכח כי הוא מניע התקדמות גידול בסרטן הכבד, הריאות והמעי הגס 7,8,9,10. עם זאת, זוהו תפקידים תלויי הקשר של FTO ו-ALKBH5 הממחישים את האופי הכפול של ויסות מתווך m6A, שיכול לקדם הן את האיתות האונקוגני והן את האיתות המדכא של הגידולים 11,12,13,14. קוראי M6A, כולל YTHDF1/2/3, ריבונוקלאופרוטאינים גרעיניים הטרוגניים (hnRNPs) וחלבוני קישור mRNA דמויי אינסולין-2 (IGF2BP1-3), נמצאו גם הם קשורים לקרצינוגנזה 15,16,17.

בסרטן השד, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמווסתי m6A לעיתים קרובות אינם מווסתים ועשויים להיות קשורים לתת-סוגי גידול, תכונות הקשורות למערכת החיסון ותוצאות קליניות. מחקרים מכניים רבים ממקמים את METTL3 כגורם פרו-אונקוגני מוסדר לעיתים קרובות בסרטן השד. התקנה של m6A בתיווך METTL3 יכולה לייצב או לשפר תרגום של תמלולים המעודדים התפשטות, מעבר אפיתליאלי-מזנכימי (EMT), גרורות וכימו-עמידות20. הוכח גם כי METTL3 מקדם התקדמות סרטן השד על ידי מיקוד ב-Bcl-221. ALKBH5 היה מעורב בוויסות תוכניות גזע סרטן באמצעות NANOG ומולקולות נוספות הקשורות לגבעולים, אך השפעתו עשויה להשתנות בהתאם להקשר הגידול22.

ככל שרשימת הרגולטורים של m6A ממשיכה להתרחב בשנים האחרונות, יש צורך בעדכון על האופן שבו הרגולטורים החדשים שזוהו עלולים להיות לא מוסדרים בסרטן השד. טבלה 1 מספקת רשימה של רגולטורים של m6A הכוללים כותבים, קוראים ומחקים של שינויים ב-m6A. בנוסף, זוהו רגולטורים חדשניים של m6A, כולל LRPPRC ו-YWHAG, עם השלכות בהתקדמות הסרטן 23,24,25. לכן, נערך אפיון גנטי ומולקולרי מקיף של כל רגולטורי m6A הידועים בסרטן השד באמצעות כלים שניתן להשתמש בהם על ידי חוקרים עם רקע ביואינפורמטי מוגבל.

מטרת מאמר זה ב-Methods היא להציג פרוטוקול ביואינפורמטיקה מבוסס פלטפורמה שלב אחר שלב לניתוח רגולטורים של m6A בסרטן השד באמצעות משאבים זמינים לציבור בתחום גנומיקת הסרטן. באמצעות מערכי נתונים מ-The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), פרויקט Genotype Tissue Expression (GTEx)26, ופלטפורמות אנליטיות מבוססות רשת כמו cBioPortal ו-UCSC Xena, פרוטוקול זה מדגים זרימות עבודה ניתנות לשחזור להערכת פרופילים מוטציוניים, שינויים בביטוי גנים וקשר להישרדות המטופלים. גישה ויזואלית ונגישה זו נועדה להקל על אימוץ ניתוח נתונים אפיטרנסקריפטומיים על ידי חוקרים חדשים בתחום הביואינפורמטיקה של סרטן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: רשימת הגנים המקודדים מווסתי מתילציה של m6A, המסווגים ככותבים, קוראים ומחקים, מוצגת בטבלה 1. כל הגנים שצוינו נכללו בניתוחים הבאים של מוטציות, דפוסי ביטוי והישרדות כללית. כל התוכנות והכלים ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. זיהוי שינויים גנטיים ברגולטורים של m6A

  1. גש ל-cBioPortal לגנומיקת סרטן. עבור לאתר cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. מדף הבית, בחר בלשונית "שאילה" כדי להתחיל ניתוח חדש.
  2. בחר את מחקר הסרטן ואת הקבוצה המתאימה.
  3. בשורת החיפוש "Select Studies for Visualization and Analysis", יש להקליד "Breast Inversive Carcinoma" ולבחור "Breast Inversive Carcinoma (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. בתחתית, בחר "שאילתה לפי גן".
    קריטי: ודא שהקוהורט שנבחר (996 דגימות) כולל גם נתוני מוטציה וגם נתוני שינוי מספר עותקים (CNA).
  5. הגדר את השאילתת הגנטית. ב"Enter Genes", הזינו את סמלי הגנים HUGO לרשימה המלאה של רגולטורים m6A הנחקרים.
    הערה: ניתן להזין גנים כרשימה המופרדת ברווחים. תחת "בחירת פרופילים גנומיים", ודא ששני סוגי הנתונים הבאים נבדקים: מוטציות ושינויים במספר העתק.
  6. תחת "בחר קבוצת מטופל/מקרה", בחר את מערך המדגם ברירת המחדל המתאים לקבוצה עם כל מקרי הפרופיל.
  7. לחץ על כפתור הכחול "שלח שאילתה".
  8. שלפו ופרשו את נתוני השינוי הגנטי. עם ההגשה, התוצאה נטענת בלשונית "סיכום". ההדמיה המרכזית של "OncoPrint" מספקת סקירה מיידית של שינויים גנטיים בכל הגנים שנשאלו בקבוצה, שניתן להורדה.
  9. ליד ה-OncoPrint, מצא את תרשים "סיכום סוגי סרטן". זה מספק פירוט כמותי של שינויים בין תתי-סוגי סרטן השד.
  10. בצע ניתוח פאן-סרטן. חזור לדף הבית של cBioPortal ובחר "TCGA PanCancer Atlas Studies" תחת לשונית "שאילתה".
  11. בתיבת הקלט של הגן, הזן את אותה רשימה של גני ווסת m6A.
  12. לחצו על "שלח שאילתה" ובדף התוצאות עברו ללשונית "סיכום סוגי סרטן". זה מספק מבט על סרטן כוללני.

2. ניתוח טרנסקריפטומי השוואתי של רגולטורי m6A באמצעות UCSC Xena.

  1. גש לפלטפורמת UCSC Xena. עבור לאתר UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. מדף הבית, לחץ על כפתור "השקת Xena" כדי להיכנס לדפדפן הניתוח הראשי.
  3. בדפדפן Xena, לחץ על "DATA SETS".
  4. בין מערכי הנתונים, בחרו ב-"TCGA TARGET GTEx". זה מכיל נתוני RNA-Seq מעובדים אחידים מרקמות תקינות של פרויקטי TCGA ו-GTEx.
  5. בעמוד הבא, לחץ על "המחשה".
  6. הגדר את משתנה הפנוטיפ (קבוצת המדגם). ב"בחר את המשתנה הראשון שלך", בחר "קטגוריה ראשית" בסוג הנתונים הפנוטיפי.
  7. לחץ על "למשתנה השני". לאחר מכן, בסוג הנתונים הגנומי, סמן "ביטוי גן" במאגר הנתונים. הוסף את רשימת הגנים בתיבת "הוסף גן או מיקום". לחץ על "בוצע".
  8. דמיין דפוסי הבעה עם מפת חום.
  9. כדי להפריד בין דגימות השד (TCGA+GTEx) לבין דגימות TCGA TARGET GTEx, הקלידו "Breast" והשתמשו באפשרות המסנן לשמירת הדגימות.
  10. מפת החום נראית כעת וניתן להוריד אותה כקובץ PDF.
  11. יצר גרפים השוואתיים לגנים בודדים. כדי לכמת ולהמחיש את הבדלי הביטוי של גן מסוים, השתמשו ב"הצג כגרף". באמצעות אפשרות זו, ניתן לראות את הנתונים כגרף קופסה, גרף נקודות, וגרף כינור, השוואה בין התפלגות הביטויים בין שתי קבוצות הדגימה.
  12. השתמשו באפשרות "הורדה כ-PDF" כדי להוריד את התרשימים.
  13. מובהקות סטטיסטית (ערך p) ניתן לקבל על ידי לחיצה על "סטטיסטיקה".

3. הערכת חשיבות פרוגנוסטית של רגולטורים m6A באמצעות פלוטר קפלן-מאייר.

  1. גש לכלי המתכנן קפלן-מאייר. עבור לאתר Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. מדף הבית, בחרו בלשונית "סרטן השד" כדי להתחיל ניתוח ייעודי למאגרי נתוני סרטן השד.
  3. הגדר את שאילתת הגנים לגן יחיד.
  4. בחלק הקלט הראשי, אתר את תיבת "סמל גן".
  5. הכנס את הסמל הרשמי של גן הרגולטור m6A לניתוח (למשל, METTL3).
    קריטי: ממש מתחת לתיבת הקלט של הגן, אתר והפעל את תיבת הסימון של "רק JetSet את ערכת הגשוש הטובה ביותר". זה מבטיח שהגלאי המיקרו-מערך האמין והמדויק ביותר ייבחר אוטומטית עבור הגן שלך, ומייעל את איכות הנתונים ואת השחזוריות.
  6. הגדר את פרמטרי ניתוח ההישרדות. בסעיף "הישרדות", בחרו ב"הישרדות כוללת (OS)" כנקודת הסיום העיקרית לניתוח זה. הכלי ישתמש אוטומטית בנתונים מ-1880 מטופלות סרטן השד כאשר ייבחר הגדרה זו.
  7. ודא שהאפשרות "פיצול מטופלים לפי" מוגדרת ל"חציון". זה יחלק את המטופלים לשתי קבוצות שוות; ביטוי גבוה וביטוי נמוך, בהתבסס על ערך הביטוי החציוני של הגן שנשאלה בכל הדגימות.
  8. ניתן להשתמש ב"סף מעקב" לבחירת תקופת המעקב. למחקר זה נבחרו 180 חודשים.
  9. יצר ופרש את עלילת קפלן-מאייר.
  10. לחץ על כפתור "ציור עלילה של קפלן-מאייר".
  11. חלון חדש ייטען, ויציג את עקומת ההישרדות.
  12. פרש את האלמנטים המרכזיים בעלילה; ציר ה-X מצביע על זמן בחודשים, ציר ה-Y מראה את ההסתברות להישרדות הכוללת, ושני הקווים הצבעוניים מייצגים את עקומות ההישרדות של קבוצות החולים בעלות ביטוי גבוה (אדום) ונמוך (שחור). ערך ה-P בדירוג-לוגיתם מוצג ומציין את המובהקות הסטטיסטית של ההבדל בין שתי עקומות ההישרדות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוף מוטציוני של רגולטורי מתילציה של m6a בסרטן השד

במחקר קודם על ניתוח גנומי של מערכי נתונים של TCGA, דווחו מוטציות חוזרות בכמה גנים המקודדים רגולטורים של מתילציה של DNA31. במחקר הנוכחי, cBioPortal שימש לניתוח מערך הנתונים "קרצינומה פולשנית לשד (TCGA, PanCancer Atlas)" במטרה לבחון פרופילים מוטציוניים של גנים המקודדים את הכותבים, הקוראים והמחקים של מתילציה של m6A RNA. ניתוח זה חשף שינויים גנטיים מגוונים בקרב חולות סרטן השד, כאשר תדירויות השינוי משתנות באו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאמר של שיטה זו מספק תהליך עבודה מקיף, נגיש ומשולב לפרופיל מולטי-אומיקס שיטתי ולתרגום קליני של כל חתימת גן במחקר סרטן, כפי שמודגם כאן באמצעות ניתוח רגולטורים של מתילציה RNA של m6A בסרטן השד. על ידי שילוב פלטפורמות ביואינפורמטיקה ציבוריות מרכזיות אלו, גישה זו מאפשרת לחוקרים להתקדם ביעילות מגילוי גנומי להשערות קליניות רלוונטיות, מבלי לדרוש מומחיות חישובית מתקדמת.

החוזקה העיקרית של המתודולוגיה הזו היא הצינור המודולרי שמייצר השערות. הפרוטוקול מדריך את המשתמש דרך ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקים מהמאמר הזה עברו עדכון בעזרת כלי שפה מבוססי בינה מלאכותית לשיפור הבהירות והקריאות. כל התוכן המהותי, הפרשנות, הניתוחים והמסקנות הם של המחברים בלבד. אנו מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מענק מאוניברסיטת אלפייסל (IRG 25450) ל-RM מוכר לשמחתנו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalמרכז הסרטן ממוריאל סלואן-קטרינגhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier Plotterמעבדת Gyorffy/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)המכון הלאומי לסרטן (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena Browserאוניברסיטת קליפורניה סנטה קרוזhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles