חקר המנגנון של גרנולת גובן פינגצ'ואן בטיפול באסתמה ברונכיאלית

סיכום

פרוטוקול זה בוחן את מנגנון הפעולה של גרגירי גובן פינגצ'ואן באסתמה ברונכיאלית באמצעות פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית ואימות חי .

תקציר

מחקר זה בוחן את מנגנון הפעולה של גרגירי גובן פינגצ'ואן בטיפול באסתמה ברונכיאלית באמצעות פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית ואימות ניסוי. מרכיבים פעילים ומטרות מתאימות זוהו באמצעות מאגרי TCMSP, HERB ו-SymMap. מטרות הקשורות לאסתמה נאספו מ-GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank ו-PharmGKB. זוהו מטרות חופפות, ונבנו רשתות אינטראקציה בין רכיב-מטרה וחלבון-חלבון (PPI). אונטולוגיית גנים (GO) וניתוחי העשרת אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) בוצעו עם תיקון קצב גילוי שגוי (FDR). בוצעה עגינה מולקולרית להערכת זיקת הקשר, ואחריה אימות in vivo. זוהו בסך הכל 121 רכיבים פעילים ו-234 מטרות הקשורות לסמים, מה שהניב 155 מטרות חופפות. המטרות המרכזיות כללו TP53, AKT1, TNF ו-IL6. ניתוח KEGG הראה העשרה משמעותית של מסלול האיתות PI3K–Akt, שנבחר לאימות ניסיוני. עגינה מולקולרית חשפה זיקה חזקה בין רכיבי הליבה ל-AKT1. בעכברים אסתמטיים שנגרמו על ידי אובאלבומין, גרנול גובן פינגצ'ואן הפחיתו את רמות IL-4 ו-IL-10 בסרום, הגבירו את ביטוי FoxP3 ברקמת הריאה, והגביר את רמות ה-mRNA של PI3K ו-AKT. ממצאים אלו מצביעים על כך שגרנולה של גובן פינגצ'ואן מקלה על אסתמה ברונכיאלית על ידי ויסות מסלול האיתות PI3K–Akt, ויסות ציטוקינים דלקתיים ושיפור תפקוד תאי ה-T.

מבוא

אסתמה ברונכיאלית היא מחלת נשימה כרונית הטרוגנית המאופיינת בדלקת בדרכי הנשימה, תגובה יתר של דרכי הנשימה, הפרשה מופרזת של ריר ועיצוב מחדש של דרכי הנשימה¹. הפתוגנזה שלו כוללת אינטראקציות מורכבות בין הפעלת תאי החיסון, מתווכים דלקתיים ומסלולי איתות מרובים. קלינית, אסתמה מתבטאת בצפצופים חוזרים, קוצר נשימה, לחץ בחזה ושיעול. דלקת בדרכי הנשימה היא מנגנון מרכזי שמאחורי הופעת המחלה והתקדמותה, המאופיין בהפרשה מוגברת של ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון IL-6, IL-4, IL-17 ו-TNF-α., חדירת תאים דלקתיים כולל אאוזינופילים ונויטרופילים, ושינויים מבניים כמו התרבות שרירי חלק בדרכי האוויר, עיבוי ממברנת הבסיס והיפרפלזיה של בלוטות הריר^2˒3. תהליכים פתולוגיים אלה מובילים בסופו של דבר לחסימת דרכי הנשימה ולפגיעה בזרימת האוויר.

הפתופיזיולוגיה של אסתמה מוסדרת על ידי מספר מסלולי איתות אינטראקטיביים במקום על ידי מנגנון יחיד. מסלול האיתות PI3K–Akt ממלא תפקיד מרכזי בוויסות האיזון החיסוני, במיוחד בציר Treg/Th17, על ידי ויסות ביטוי FoxP3. מסלול זה גם מתקשר עם מסלולי איתות IL-17 ו-TNF להגברת תגובות דלקתיות ועיצוב דרכי הנשימה, ותורם להטרוגניות מחלה ולעמידות לטיפול ^3,4. נתונים אפידמיולוגיים מצביעים על עלייה מתמשכת עולמית בשכיחות אסתמה, עם למעלה מ-358 מיליון אנשים שנפגעו ברחבי העולם וכ-45.7 מיליון מטופלים מבוגרים בסין ^5,6. אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות מתבססות בעיקר על אגוניסטים β₂ בשאיפה וגלוקוקורטיקואידים; עם זאת, טיפולים אלו מכוונים למנגנונים פתולוגיים מוגבלים ועלולים להוביל לתופעות לוואי ועמידות לגלוקוקורטיקואידים אצל מטופלים מסוימים. דיסרגולציה של מסלולים כמו PI3K–Akt. נקשרה לירידה בתגובתיות טיפולית, מה שמדגיש את הצורך בגישות טיפוליות מרובות מטרות ^7,4.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) מסווגת אסתמה כ"תסמונת שיאו", הקשורה לליקויים בתפקוד הריאות, הטחול והכליות, בשילוב עם גורמים פתוגניים חיצוניים. נוסחאות הרפואה הסינית הסינית שימשו רבות בניהול אסתמה בשל תכונותיהן הרב-רכיביים ורב-מטרות. ^8,9. בניגוד לסוכנים פרמקולוגיים חד-מטרה בלבד, תרכובות TCM מפעילות השפעות טיפוליות על ידי תיאום ויסות מסלולים ביולוגיים מרובים, בהתאם לפתופיזיולוגיה המורכבת של אסתמה¹⁰. פרמקולוגיה רשתית מספקת גישה ברמת מערכת לניתוח אינטראקציות בין רכיבי תרופות, מטרות ומסלולי מחלה, ומאפשרת זיהוי תרכובות ביואקטיביות מרכזיות ומנגנונים מולקולריים¹¹. עגינה מולקולרית משלימים גישה זו על ידי הערכת הקשר בין מולקולות קטנות לחלבוני היעד.

גרגר גובן פינגצ'ואן הוא פורמולה רפואית סינית מסורתית המורכבת משמונה רכיבים צמחיים, בהם אפדרה סיניקה (עשב אפדרה), פרי Psoralea corylifolia, זרעי Prunus armeniaca (זרעי משמש), שורש Pseudostellaria heterophylla, פרי Perilla frutescens, עלה Eriobotrya japonica (עלה Loquat), פקעת Lilium brownii, ו-Epimedium brevicornum. נוסחה זו משמשת באופן מסורתי לחיזוק אנרגיה חיונית, לפתרון ליחה ולהקלה על צפצופים. מחקרים קליניים קודמים הראו את יעילותו הטיפולית באסתמה ברונכיאלית, עם שיעורי תגובה גבוהים יותר בהשוואה לטיפולים קונבנציונליים.

כדי להבהיר את מנגנון הפעולה הבסיסי, מיושמת גישה משולבת המשלבת פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית ואימות ניסויי in vivo . פרמקולוגיית רשת משמשת לזיהוי רכיבים פעילים ומטרות פוטנציאליות הקשורים לאסתמה ברונכיאלית. עגינה מולקולרית משמשת להערכת אינטראקציות בין תרכובות מרכזיות לחלבוני המטרה. לאחר מכן מתבצע אימות ניסיוני במודל בעלי חיים כדי להעריך את ההשפעות הרגולטוריות על מסלולי איתות קריטיים, במיוחד מסלול PI3K–Akt. גישה זו שואפת לספק תובנות מכניות לגבי ההשפעות הטיפוליות הרב-מטריות של גרגירי גובן פינגצ'ואן ולתמוך ביישומם בטיפול באסתמה ברונכיאלית.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת ליאונינג לרפואה סינית מסורתית (אישור מס' 21000042023058) ובוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות. כלי המחקר המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. מסדי נתונים ותוכנה

1. גישה למסדי הנתונים והתוכנות הבאות: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt ו-Cytoscape (גרסה 3.9.1).

2. רכישת מטרות רכיב

1. שלף רכיבים כימיים של עשב אפדרה, זרעי משמש, שורש פסאודוסטלריה, פרי פרילה, עלה לוקואט, מיני שושן ואפימדיום ממאגר הנתונים של TCMSP¹³. שלפו תרכובות של פסורליה ממאגרי הנתונים HERB ו-SymMap.
2. סקר תרכובות פעילות באמצעות זמינות ביולוגית דרך הפה (OB ≥ 30%) ודמויות תרופות (DL ≥ 0.18)^14,15.
3. חיזוי גנים מטרה באמצעות TCMSP. סטנדרטיזציה של כל המטרות באמצעות מסד הנתונים UniProt על ידי בחירת Homo sapiens. הסר מטרות כפולות ולא תקפות, כולל רשומות לא-אנושיות, חלבונים ללא הערות ומזהים מיושנים.

3. רכישת מטרות לאסתמה ברונכיאלית

1. חפש GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank ו-PharmGKB באמצעות מילת המפתח "אסתמה ברונכיאלית". הגדר את ציון הרלוונטיות של כרטיסי הגן ל->4. למזג את כל המטרות שנשלפו ולהסיר כפילויות.

4. זיהוי מטרות הצטלבות

1. ייבאו מטרות תרופות ויעדי מחלות לכלי ניתוח Venn מקוון. זהה מטרות חופפות ורשם את המספר הכולל לניתוח הבא.

5. בניית רשת רכיב-יעד

1. ייבא מטרות מפגש ל-Cytoscape 3.9.1. בנו את רשת הרכיב-יעד. התאימו את גודל הצומת והצבע לפי ערכי דרגות.

6. בניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)

1. העלה יעדי חיתוך למסד הנתונים של STRING. בחר הומו ספיינס וקבע את ציון האמון ל-≥0.900. ייצא את הרשת וייבא אותה ל-Cytoscape.
2. חשב פרמטרים טופולוגיים (מרכזיות דרגה, מרכזיות ביניים, ומרכזיות קרבה). זהה מטרות ליבה באמצעות סף חציוני ודרגה >20.

7. ניתוח העשרה GO ו-KEGG

1. העלה מטרות חופפות למסד הנתונים של DAVID או ניתוח באמצעות חבילת R clusterProfiler.
2. בצע ניתוח העשרת אונטולוגיה גנטית (GO) עבור תהליכים ביולוגיים, רכיבים תאי ותפקוד מולקולרי.
3. בצע ניתוח העשרת מסלולי KEGG. החלו תיקון שיעור גילוי שגוי (FDR) וקבעו את סף המובהקות ל-FDR < 0.05.
4. המחישו את המונחים המועשרים ביותר באמצעות תרשימי בר או גרפים בועות.

8. עגינה מולקולרית

1. הורד מבנים דו-ממדיים של תרכובות ליבה מ-PubChem. צור מבנים תלת-ממדיים באמצעות ChemOffice ושמור כקבצי mol2.
2. הורד מבני חלבון ממאגר הנתונים של RCSB PDB. הסר מולקולות מים וליגנדים באמצעות PyMOL.
3. בצע עגינה מולקולרית באמצעות AutoDock Vina. הגדר פרמטרים של קופסת רשת והריץ סימולציות עגינה.
4. רשמו אנרגיות קישור (kcal/mol) ושאריות מפתח האינטראקטיביות. המחישו תוצאות עגינה באמצעות מודלים מולקולריים, ויזואליזציה ופלטפורמות סימולציה.

9. אימות ניסויי

1. בעלי חיים
   1. להשיג 48 זכרים של חולדות ספרג–דולי (9 שבועות, 220–240 גרם). חיות בית בטמפרטורה של 20–25 מעלות צלזיוס עם 55%–60% לחות בתנאים סטנדרטיים.
2. תרופות ותגובות
   1. הכינו גרגירי גובן פינגצ'ואן המורכבים מעשב אפדרה, פסורליאה, זרעי משמש, שורש פסאודוסטלריה, פרי פרילה, עלה לוקואט, שושן ואפימדיום.
   2. הכינו דקסמתאזון, אובאלבמין (OVA), הידרוקסיד אלומיניום, ערכות ELISA, ערכות חילוץ RNA ונוגדנים כפי שמפורט בטבלת החומרים.
3. כלים
   1. הכינו ציוד מעבדה סטנדרטי, כולל קורא מיקרופלט, מערכת אלקטרופורזה, מיקרוטום פרפין ומערכת הדמיה.
4. קיבוץ וטיפול בבעלי חיים
   1. חלק את העכברים באקראי לשש קבוצות (n = 8): קבוצת ביקורת ריקה, קבוצת מודל, קבוצת דקסמטסון (0.3 מ"ג/ק"ג), קבוצת הרפואה הסינית במינון נמוך, קבוצת הרפואה הסינית במינון בינוני, וקבוצת הרפואה הסינית במינון גבוה.
   2. בימים 1, 7 ו-14, הזרקת 1 מ״ל תוך-פריטונאלית של 10% OVA + 10% אל(OH)₃ לעכברים בקבוצת המודל, קבוצת הרפואה הסינית במינון נמוך, קבוצת הרפואה הסינית במינון בינוני, קבוצת הרפואה הסינית במינון גבוה, וקבוצת הדקסמטסון לצורך רגישות.
   3. נתנו 1 מ"ל זריקה תוך-פריטוניאלית של 0.9% מלח פיזיולוגי לעכברים בקבוצת הביקורת הריקה בימים 1, 7 ו-14.
   4. מימים 15 עד 21, בצע גירוי שאיפה מבולטת פעם ביום למשך 20 דקות. מתן 5% שאיפת OVA נבוציאלית לעכברים בקבוצת המודל, קבוצת הרפואה הסינית במינון נמוך, קבוצת הרפואה הסינית במינון בינוני, קבוצת הרפואה הסינית במינון גבוה וקבוצת הדקסמטסון.
   5. נתנו 0.9% שאיפת מלח פיזיולוגית לחולדות בקבוצת הביקורת הריקה בין הימים 15 ל-21.
   6. מתן טיפולים באמצעות גוואג' אוראלי פעם ביום מימים 22 עד 36 בהתאם לקבוצת הטיפול שהוקצתה.
   7. עקוב אחרי משקל הגוף והמצב הכללי מדי יום לאורך כל הניסוי. ציר הזמן הניסויי מסוכם בטבלה 1.
5. היסטופתולוגיה
   1. לאסוף רקמת ריאה. תיקון, הטמעה וחתך דגמיות. בצע צביעת המטוקסילין–אאוזין.
   2. בצע צביעת מסון להערכת הצטברות קולגן.
6. ניתוח RT-PCR
   1. להוציא RNA מלא מרקמת ריאה.
   2. הומוגניזציה של רקמת ריאה קפואה בתנאי טמפרטורה נמוכה במיוחד. לאחר שקילת הדגימה, העבר אותה במהירות למכתש מקורר מראש המכיל חנקן נוזלי וטחן לאבקה.
   3. העבר את הדגימה האבקה לצינור צנטריפוגה. הוסף 1 מ"ל TransZol UP ו-0.2 מ"ל ריגבת חילוץ RNA לכל 50–100 מ"ג רקמה. נער את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   4. צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 1000 × גרם ו-2–8 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העבר את הפאזה המימית חסרת הצבע לצינור צנטריפוגה חדש.
   5. הוסף 1 מ"ל טרנזול UP ל-0.5 מ"ל איזופרופנול. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   6. צנטריפוגה את הדגימה ב-1000 × גרם למשך 10 דקות. הוסיפו 1 מ״ל של 75% אתנול וצנטריפוגה שוב למשך 5 דקות.
   7. השליכו את הסופרנטנט וייבשו את המשקעים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. המיס את המשקע ב-50–100 מיקרוליטר של תמיסת RNA, ואז דגר במשך 10 דקות.
   8. אחסן את הדגימה בטמפרטורה של −70 מעלות צלזיוס לשימור ארוך טווח.
   9. סינתז cDNA וביצוע PCR כמותי למדידת ביטוי PI3K ו-AKT.
7. אליסה
   1. הפשרה דגימות סרום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מדדו רמות IL-4 ו-IL-10. באמצעות ערכות ELISA לפי הוראות היצרן.
8. אימונוהיסטוכימיה
   1. רקמת ריאה קבועה עם 4% פאראפורמלדהיד, מוטמעת בפארפין, חתכה, הסרת שעווה והידרדרה.
   2. לבצע שליפת אנטיגן, חסימה ודגירה של נוגדנים. הצביעה לפי ערכת האימונוהיסטוכימיה FoxP3, תמיסת צביעת DAB וההבעה החיובית מופיעה כצביעה חומה-צהבהבת או חומה כהה.
   3. תבונן וצלם תחת מיקרוסקופ, והשתמש בתוכנת Image J לניתוח סטטיסטי כמותי של ביטוי FoxP3.
9. ניתוח סטטיסטי
   1. בדיקת נורמליות הנתונים באמצעות מבחן שפירו–וילק והומוגניות השונות באמצעות מבחן לוון.
   2. נתח נתונים באמצעות בדיקות ANOVA חד-כיווניות או בדיקות לא פרמטריות לפי הצורך. מבטאים נתונים כסטיית תקן ממוצעת ±.
   3. הגדר p < 0.05 כמובהק סטטיסטית. ★★P < 0.01 ו-P ★< 0.05 לעומת קבוצת הביקורת; ◆◆p < 0.01 ו-◆p < 0.05 לעומת קבוצת המודלים; ##p < 0.01 ו-#p < 0.05 לעומת קבוצת דקסמתאזון.

טבלה 1: ציר זמן ניסיוני. לוח זמנים של רגישות, אתגר וטיפול. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

תוצאות

סינון מרכיבים פעילים
סך הכל זוהו 121 רכיבים פעילים ממסד הנתונים של TCMSP לאחר סינון פעילות יעד. אלה כללו 23 רכיבים מעשב אפדרה , 7 מפסורליאה, 19 מזרעי משמש, 8 משורש פסאודוסטלריה , 16 מפרי פרילה, 18 מעלי לוקואט, 7 מליליום ו-23 מאפימדיום. (טבלה 2). זוהו שישה עשר רכיבים נפוצים, כולל לוטאולין, קוורצטין, β-סיטוסטרול, קמפפרול, סטיגמאסטרול ו-(+)-קטכין. בסך הכל הושגו 234 יעדים הקשורים לתרופות לאחר התקנון. בנוסף, זוה...

דיון

אסתמה ברונכיאלית היא מחלה נפוצה במחלקת הנשימה¹⁶. מדובר בהפרעת חסימה בדרכי הנשימה הנגרמת מאלרגנים ותגובתיות יתר בדרכי הנשימה¹⁷. יש לה שכיחות קלינית גבוהה, נוטה להישנות, וקשה לריפוי, מה שמשפיע משמעותית על בריאות המטופלים ואיכות חייהם. היוזמה הגלובלית לאסתמה לשנת 2025 (GINA) מדווחת כי טיפול גלוקוקורטיקואידי בשאיפה יעיל לאסתמה¹⁸; עם זאת, שימוש ארוך טווח עלול להוביל לעמידה לקויה. חלק מהמטופלים חווים הישנות לאחר הפחתת מינו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת qPCR	Novogene	NQ-001, 2×1mL	גילוי ביטוי mRNA יחסי של גנים ממוקדים
אלומיניום הידרוקסיד Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	מגביר תגובה חיסונית כדי לשפר את התגובה החיסונית לנוגדן
ערכת בדיקת ריכוז חלבון BCA	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 חתיכות לקופסה	כימות חלבון כולל לסטנדרטיזציה של העמסת דגימות
מערכת הדמיית כימולומינציה	Tanon	5200Multi	הדמיית רצועת WB, איסוף ואנליזה של תמונות ג'ל ובלוט
מדד חלבון צבוע מראש	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	עיון במשקל מולקולרי של חלבון לניסויי אלקטרופורזה
ערכת חילוץ RNA משופרת	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 חתיכות לקופסה	חילוץ וטיהור של RNA כולל מרקמות ותאים
קורא ניתוח ELISA מקושר לרנת	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	גילוי כמותי של ציטוקינים ותכולות חלבון בדגימות
נוגדן ראשוני FOXP3	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/חתיכה	קשירה ממוקדת לחלבון FOXP3 לצורך בדיקה חיסונית
ערכת הכנה מהירה של ג'ל	Shanghai Yamei	PG212, 30 ערכים	הכנה מהירה של ג'ל הפרדה וג'ל ערימה לאלקטרופורזה
ערכת צביעת masson	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 טבליות	צביעה ספציפית להבחנה בסיבי קולגן רקמות ותצפית פיברוזיס
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	אלרגן קלאסי להקמת מודלים של בעלי חיים אלרגיים
פתרון דילול נוגדן ראשוני	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	דילול נוגדן ראשוני, שמירה על פעילות והפחתת קשירה לא ספציפית
ערכת ELISA Rat IL-10	Andy Bio	E-30649, 96T	גילוי כמותי של גורם אנטי-דלקתי של Rat IL-10
ערכת ELISA Rat IL-4	Andy Bio	E-30623, 96T	גילוי כמותי של גורם דלקתי IL-4 של Rat Th2
ערכת שעתוק הופכי	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	שעתוק הופכי של RNA ל-cDNA לצורך ניתוח גנים עוקב
ערכת צביעת Oil Red O רווי	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 בקבוק	צביעה מיוחדת וגילוי של טיפות שומן בתאים
נוגדן משני נוגד ארנב Shangyang	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	התחברות לנוגדן ראשוני של ארנב לצורך תגובת צבע WB
מאגר TBST	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / בקבוק	מאגר לשטיפת ממברנה ודילול נוגדנים ב-Western blot
מערכת אלקטרופורזה להעברה	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	משמש לאלקטרופורזה של חלבון והעברת ממברנה של Western blot
מקרר טמפרטורה נמוכה במיוחד	Zhongke Meiling	MDF-382	שימור קריוגני בטמפרטורה נמוכה של ריאגנטים, דגימות חלבון ורקמות
מיכל אלקטרופורזה אנכי	BIO-RAD	JY-ZY5	הפרדה אלקטרופורטית אנכית של דגימות חלבון וחומצות גרעין