מאמר שיטה

ייצור ויישום כירורגי של הידרוג'לים ג'לטין–ריבופלבין מועשרים עם קישור פוטופולינקרי לתיקון פצעי קרנית בארנבים

DOI:

10.3791/70579

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול שניתן לשחזור להכנה, העשרה ויישום של הידרוג'ל במיקום באור כחול– קישור צולב של ג'לטין–ריבופלבין לתיקון פצעי סטרומל בקרנית בארנבים, כולל שלבים פרוצדורליים לטיפול כירורגי, טרסורפאה חלקית וטיפול לאחר הניתוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב לייצור, השלמה ויישום כירורגי של הידרוג'ל ג'לטין הניתן לקישור באור כחול במקום לתיקון פצעי סטרומל בקרנית בארנבים. החומר המקדים של הידרוג'ל מורכב מג'לטין ב-5% (w/v) וריבופלבין פוספט ב-0.01% (w/v), המוכן בתנאים סטריליים ומוגנים מאור, מסונן סטרילי ומחומם לפני השימוש להשגת צמיגות מזרקת. מפורט שילוב אופציונלי של תמצית ממברנת מי שפיר אנושית או סרום אוטולוגי של ארנב. ג'לציה לפי דרישה מופעלת על פני השטח העין באמצעות אור כחול ב-λ = 420–480 ננומטר לסך כולל של 2 דקות. שיטת ה-in vio כוללת קראטקטומיה סטרומלית קדמית שניתן לשחזור (קוטר טרפין 6.5 מ"מ; עומק כ-187 מיקרון), ואחריה מילוי הידרוג'ל, הפעלה אורית וטרסורהאפיה צדדית חלקית לייצוב הטיפול, העדפת ריפוי פצעים וסטנדרטיזציה של טיפול לאחר הניתוח. תוצאות מייצגות במבחנה מעידות על התנהגות ויסקואלסטית דמוית ג'ל עם דילול גזירה והתאוששות מהירה, והעברת אופטים גבוהה (> 90%) מעבר ל-500 ננומטר, המצביעים על התאמה לשימוש בקרנית. בחי גוף, טיפולים מבוססי הידרוג'ל תומכים בסגירת אפיתל מתקדמת, סבילות עינית טובה (ציוני דרייז נמוכים בימים 3 ו-7), ואובדן הידרוג'ל גלוי תלוי זמן התואם לביודגרדציה והחלפת רקמות. מודגשים שלבים קריטיים ונקודות עצירה להבטחת שחזוריות, כולל בקרת טמפרטורה במהלך המסה וסינון, הגנה מפני אור ומיקום מנורות במהלך קישור צולב. הפרוטוקול מאפשר ייצוב הידרוג'ל ללא תפרים, ממוקם במדויק ומופעל באור, התואם להוספת תוספים ביואקטיביים מרובים. הוא מספק פלטפורמה מעשית להערכה פרה-קלינית של ביומטריאלים עיניים מהדור הבא ומקל על תרגום טיפולי הידרוג'ל פוטו-צולביים לתיקון פצעי קרנית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנית היא מבנה שקוף ואוסקולרי האחראי לכשני שלישים מכוח השבירה של העין, מה שהופך את שלמותה המבנית והתפקודית לחיונית לראייה1. עקב חשיפתה הישירה לסביבה החיצונית, הקרנית רגישה מאוד לטראומה, זיהום, פגיעה כימית וסיבוכים לאחר ניתוח 2,3. כישלון בשיקום מהיר ויעיל של שלמות אפיתל עלול להוביל למומים אפיתליים מתמשכים (PEDs) ולכיבים כרוניים בקרנית, ובסופו של דבר להיתך סטרומלי, נקבים, צלקותואובדן ראייה בלתי הפיך. טיפולים קונבנציונליים — כולל חומרי סיכה, מניעת אנטיביוטיקה וטיפות עיניים אוטולוגיות לסרום — לעיתים קרובות מספקים תועלת חלקית בלבד ואינם מקדמים כראוי תיקון סטרומלי במומים בינוניים עד חמורים 6,7,8.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, טיפולים מבוססי ביומטריה הפכו לחלופות מבטיחות בזכות יכולתם להגן על הפצע, לתמוך בתיקון אפיתל ולשקם רקמת סטרומל 9,10,11,12,13,14. הידרוג'לים אטרקטיביים במיוחד בזכות התאימות הביולוגית שלהם, שקיפות אופטית, התנהגות מכנית ניתנת לכוונון ויכולת לשלב חומרים טיפוליים. הידרוגלים טבעיים וסינתטיים, כולל ג'לטין 15,16,17, קולגן 18,19, צ'יטוזן20,21, פוליאתילן גליקול (PEG)22,23 וחומצה היאלורונית 18,24, הוכיחו פוטנציאל בקידום ריפוי פצעי הקרנית. מבין אלה, הידרוג'לים מבוססי ג'לטין הם בעלי ערך מיוחד בשל הרכבם שמקורם בקולגן ובמוטיבים המובנים של ההידבקות התאים.

הידרוג'לים הניתנים לקישורי פוטו-צולב מציעים יתרון נוסף בכך שהם מאפשרים התגבשות לפי דרישה ישירות על פני השטח העין, מה שמאפשר מיקום מדויק ויציבות מכנית משופרת ללא תפרים. קישור צולב מתווך ריבופלבין, שפותח במקור לטיפול בקרטוקונוס, הותאם לאחרונה לפוטופולימריזציה של הידרוג'ל בזכות תאימות ביולוגית מצוינת, בטיחות עינית ויכולת לייצר מיני חמצן תגובתיים המעודדים קישוריות צולבות תחת אור נראה או אור אולטרה סגול25,26. אור כחול (≈445 ננומטר) מועיל במיוחד ליישומים בקרנית, ומאפשר קישור מוצלב יעיל תוך הימנעות מסיכונים הקשורים ל-UV 27,28,29.

מאמר זה מציג את הייצור, העשרה והיישום הכירורגי של הידרוג'ל הניתן לקישור פוטו-צולב המורכב מ-5% (עם ג'לטין) ו-0.01% (עם ז) ריבופלבין פוספט (RFP). קיים פרוטוקול מפורט להכנת הידרוג'ל במבחנה, כולל שילוב אופציונלי של תמצית ממברנת מי השפיר האנושית (HAMe) או סרום אוטולוגי (AS), וכן יישום ב-vivo במודל קראטקטומיה סטרומלית של ארנב. HAMe ידוע בכך שהוא מפעיל השפעות אנטי-דלקתיות, אנטי-פיברוטיות ופרו-רגנרטיביות על פני העיניים 30,31,32,33,34,35, בעוד שהסרום האוטולוגי מספק ריכוזים דמויי דמעה של ויטמין A, EGF, פיברונקטין וגורמי גדילה נוספים החיוניים להתחדשות אפיתל 36,37,38. יחד, אלמנטים אלו תומכים בריפיתליזציה, מפחיתים דלקת ואולי גם מונעים התדרדרות סטרומלית39,40.

בעוד שהגישה המתוארת מספקת פוטופולימריזציה מבוקרת ופעילות ביולוגית מותאמת אישית, היישום שלה מוגבל כיום לליקויים שטחיים ובאמצע הסטרומל, ודורשת חשיפה לקו ראייה לאור כחול, מה שעלול להגביל את השימוש ברקמות אטומות או חדורות עמוק. על ידי שילוב הכנת הידרוג'ל והעשרה, טיפול עיני וטיפול לאחר הניתוח, כולל טרסורהפי צדדי חלקי, מאמר זה מציע גישה שחזורית התומכת בתיקון קרנית, מקלה על תרגום טכנולוגיות הידרוג'ל המופעלות באור לפרקטיקה קלינית, ותורמת לפיתוח פלטפורמות סטנדרטיות למחקר רגנרטיבי קרנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שליות אנושיות הושגו מתורמים בהסכמה מדעת, בהתאם להצהרת הלסינקי ובאישור ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי של קרוסס (מספר אישור CEIC E15/03). כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בעלי חיים של אוניברסיטת חבל הבסקים (UPV/EHU) (מספר אישור CEEA M20/2023/038) ועמדו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. כל ההליכים בוצעו במתקן בעלי החיים UPV/EHU (SGIker), תוך שמירה על טכניקה סטרילית לאורך כל התקופה (ארון בטיחות ביולוגית מסוג II בעת טיפול בביולוגי).

1. סינתזת הידרוג'ל

  1. תמיסות קדם-קודמות של ג'לטין–ריבופלבין (5% ו-10% w/v)
    הערה: עבדו באור עמום או השתמשו בבקבוקים או בקבוקים ענברים עטופים בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מחשיפה לאור. בצעו את כל השלבים בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינרי כאשר ההידרוג'ל מיועד לשימוש ביולוגי.
    1. שקלו את הכמויות הנדרשות של ג'לטין וריבופלבין פוספט (RFP): עבור 10 מ"ל של 5% (ללא v) + 0.01% (ללא RFP), שקלו 500 מ"ג ג'לטין ו-1 מ"ג RFP. ל-30 מ"ל מלאי RFP של 10% (ללא v) + 0.02% (עם RFP), שקלו 3 גרם ג'לטין ו-6 מ"ג RFP.
    2. הוסיפו את הג'לטין ו-RFP לנפח המתאים של מים דה-יוניים (≈90% מהנפח הסופי). ערבבו בעדינות עד שהאבקה מתפזרת לחלוטין.
    3. כוון את ה-pH ל-7.0 באמצעות 1 M NaOH, תוך הוספת הבסיס בכיוון הירידה תוך כדי ניטור ה-pH. רשם את נפח ה-NaOH שהשתמשו בו ואת הנפח הסופי המכוון. לאחר התאמת ה-pH, הביא את התמיסות לנפח הסופי עם מים דה-יוניים.
    4. המיס והומוגניזציה של התמיסה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס תחת ערבוב מגנטי במהירות 200 סל"ד למשך 30 דקות.
      הערה: יש לטפל בתמיסות חמות (>70–80 מעלות צלזיוס) באמצעות כפפות עמידות לחום.
    5. אפשר לתמיסות להתקרר ל-30–40 מעלות צלזיוס ולסנן אותן דרך מסנני ממברנה הידרופיליים של 0.22 מיקרון פוליאתרסולפון (PES) לבקבוקי ענבר סטריליים.
      הערה: חמים תמיסות צמיגות בעדינות (≈ 40–50 מעלות צלזיוס) לפני הסינון במידת הצורך; הימנעו מהתחממות יתר.
    6. יש לסמן את הבקבוקים עם ההרכב, התאריך וראשי התיבות של המפעיל. אחסן את תמיסות ההידרוג'ל המסוננות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, כדי להבטיח שתקופת האחסון לא תעלה על שבועיים ממועד ההכנה.
  2. ג'לטין הידרוג'לים נוספים (נפח סופי: 10 מ"ל)
    1. הכינו תמצית סרום אוטולוגי (AS) או תמצית ממברנת מי שפיר אנושית (HAMe) בהתאם להליכים המתוארים בסעיפים 4 ו-5. שמרו על התמציות סטריליות ומקוררות עד השימוש.
    2. לכל 10 מ"ל של הידרוג'ל מועשר, יש לערבב 5 מ"ל מג'לטין של 10% (עם וייט) + 0.02% (ללא וייט) RFP, ו-5 מ"ל מהתמצית הביולוגית המתאימה (AS או HAMe).
      הערה: חמים תמיסות צמיגות בעדינות (≈ 40–50 מעלות צלזיוס) לפני הסינון במידת הצורך; הימנעו מהתחממות יתר.
    3. סיננו את התמיסה החמה דרך מסנן ממברנה הידרופילית PES בנפח 0.22 מיקרומטר לבקבוקי ענבר סטריליים.
    4. יש לסמן ולאחסן את ההידרוגלים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. ודא שתקופת האחסון לא עולה על שבועיים ממועד ההכנה.
      הערה: יש להשליך את כל הפסולת בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדית.

2. יישום הידרוג'ל במבחנה

  1. הכינו את נוסחאות ההידרוג'ל כפי שמתואר בסעיף 1 ושמרו עליהן בטמפרטורה של 32°C לפני היישום כדי לשמור על צמיגות מספקת.
  2. באמצעות טכניקת סטרילית, הפיפטה את נפח ההידרוג'ל הנדרש אל באר המטרה, התבנית, הצלחת או המצע (איור 1A).
  3. מקם את מנורת הקיבוש Led-C 2 ס"מ מעל פני ההידרוג'ל. התחל קישור צולב במקום על ידי חשיפת ההידרוג'ל לאור כחול (λ = 420–480 ננומטר) ותפוקת אור של 850-1000 mW/cm2 למשך סך כולל של 2 דקות. העבר את ההארה כשישה פולסים של 20 שניות, תוך הוספת הפסקות של 5–10 שניות בין הפולסים כדי למנוע חימום מקומי (איור 1B).
  4. אשר ג'לציה מלאה חזותית ועל ידי נגיעה עדינה במשטח עם מכשיר סטרילי כדי להבטיח היווצרות הידרוג'ל מוצק וניתן למניפולציה (איור 1C,D).
  5. יש להשתמש מיד בהידרוג'ל המקושר או לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתנאים סטריליים המתאימים ליישום במורד הזרם.
    הערה: שמרו על טכניקה אספטית לאורך כל ההליך. הימנעו מחשיפה ישירה של עור או עיניים לקרינה באור כחול.

3. רכישת ממברנת מי השפיר האנושית (HAM)

הערה: השתמשו בשליה רק של תורמים סרושליליים שנתנו הסכמה מדעת ועומדים בדרישות מוסדיות ואתיות.

  1. זכאות והסכמה לתורם
    1. אשר שכל תורם עבר סקר ונמצא שלילי ל-HIV סוגים 1 ו-2, הפטיטיס B ו-C, וסיפיליס.
    2. קבל הסכמה בכתב מדעת מכל תורם לפני הניתוח.
    3. יש לקבל שליה אנושית מיד לאחר לידות קיסריות אלקטיביות של תורמים בריאים.
  2. איסוף ועיבוד ראשוני
    1. אספו כל שליה במיכל סטרילי מנירוסטה מיד לאחר הלידה.
    2. בחדר הניתוח, שטפו את השליה היטב בתמיסת מלח סטרילית להסרת קרישי דם. זהו את האמניון—הממברנה השקופה ביותר המציפה את חלל מי השפיר—והפרדו בזהירות מהכוריון על ידי קילוף עדין לכיוון קצה השליה באמצעות מלקחיים סטריליים.
      הערה: יש לטפל בממברנות בזהירות כדי למנוע קריעה.
    3. לאחר הפרדה מלאה, יש לחבר חלקי מסנן ניטרוצלולוזה סטריליים למשטח הסטרומלי של HAM כדי להקל על המניפולציה ולתקן את החלוקה שלו. חלק את ה-HAM לשלושה אזורים מוגדרים (איור 2A,B): אמניון דיסטלי: חתך ברוחב 10 ס"מ, אמניון מדיאלי: חתך ברוחב 10 ס"מ, אמניון פרוקסימל: חתך שמגיע עד קצה השליה.
  3. תחבורה
    1. הניחו כל קטע HAM בבקבוק סטרילי, וטבלו אותו ב-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 1.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 50 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ניאומיצין.
    2. סמן בבירור כל בקבוק את קוד התורם, התאריך ואזור המקור (דיסטלי, מדיאלי או פרוקסימלי).
    3. העבר את הדגימות מיד למעבדה בתנאים נקיים ואספטיים בקירור (4 מעלות צלזיוס).
      הערה: הובילו את הממברנות באריזה אטומה ומשולשת התואמת את UN 3373 (חומר ביולוגי, קטגוריה B), בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות המפקחות על רקמת האדם.
  4. עיבוד מעבדה
    הערה: יש לבצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגי מסוג Class II בתנאים סטריליים.
    1. חתוך כל קטע HAM דיסטלי, מדיאלי וקרוב לריבועים בגודל 4.0–4.5 × 4.0–4.5 ס"מ באמצעות מספריים סטריליים.
    2. טבלו את השברים ב-DMEM עם תוספת אנטיביוטיקה שהוזכרה ומרחו בעדינות עם קליפסים סטריליים להסרת שאריות דם. שטפו ב-DMEM המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין למשך 2 על 5 דקות.
    3. לשטוף ב-DMEM בלי אנטיביוטיקה למשך 2 על 5 דקות.
    4. שטפו את השברים הנבחרים הללו בתמיסת מלח סטרילית עם בופר פוספט (PBS).
    5. העבר כל קטע לצינור סטרילי בנפח 5 מ"ל ללא מדיום תרבית. הקפיא את הדגימות ישירות בטמפרטורה של –80°C עד לשימוש נוסף.

4. הכנת תמצית ממברנת מי השפיר האנושית (HAMe)

הערה: יש לבצע את כל השלבים בתנאים אספטיים וקרים כדי למזער את התדרדרות הזיהום והחלבון.

  1. שלפו את הצינורות המכילים קטעי ממברנת מי השפיר (HAM) המאוחסנים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. טבלו את הצינורות בחנקן נוזלי למשך 5 דקות כדי להקשות את הרקמה.
  2. העבר כל חתיכה קפואה למכתש מקורר מראש (−80 מעלות צלזיוס) ומעך אותו היטב באמצעות עלי עד שמתקבלת אבקה רכה והומוגנית.
  3. שקלו את הדגימה האבקה מיד על פלטת איזון כדי למזער הפשרה. העבירו את האבקה השקולה לצינור של 5 מ"ל והחזירו אותה ל-3 מ"ל PBS בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז של 5 מיקרוליטר/מ"ג.
    הערה: השאירו את כל הצינורות על קרח במהלך העיבוד כדי לשמור על שלמות החלבון.
  4. סוניקציה של כל דגימה למשך 20 דקות בעוצמה של 90% באמצעות הסוניקטור וגלאי בקוטר 1.5 מ"מ, תוך יישום 15 שניות הפעלה / 15 שניות כיבוי מחזורים כדי למנוע התחממות יתר.
  5. צנטריפוגה את הליזטים ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אספו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
  6. סיננו את הסופרנטנט דרך מסנן ממברנה הידרופילית PES בנפח 0.22 מיקרומטר בתנאים סטריליים. מסננים את ה-HAMe המסונן למיקרוצינורות של 0.2 מ"ל. אחסן את האליקוטים בטמפרטורה של −80°C עד לשימוש נוסף.
    הערה: ודא שתקופת האחסון אינה עולה על 6 חודשים ממועד ההכנה.

5. חילוץ סרום אוטולוגי שמקורו בדם מארנבים

הערה: יש לבצע את כל ההליכים לבדיקות in vivo בארנבים לבנים בניו זילנד (≈2 ק"ג) באישור ועדת האתיקה למחקר בעלי חיים של המוסד המתאים ובהתאם להנחיות המוסדיות.

  1. הרדימו את הארנב מקומית בלידוקאין (מקומי או תת-עורי) באתר הווריד.
  2. אסוף דם מהעורק המרכזי באוזן לצינורות איסוף דם בנפח 4.5 מ"ל המכילים מפריד ג'ל פולימרי (איור 3A,B). אפשר לדם להיקרש במשך שעתיים ב-RT ללא ערבוב (איור 3C).
  3. צנטריפוגה את הדגימות בעוצמה של 1,000 × גרם למשך 15 דקות ב-RT. אסוף את הסופרנטנט (סרום), שמרכיב את סרום האוטולוגי של הארנב (AS) (איור 3D).
  4. לסנן את הסרום דרך מסנן ממברנה הידרופילית PES של 0.22 מיקרון. לסנן את הסרום לצינורות סטריליים של 0.2 מ"ל ואחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: ודא שתקופת האחסון אינה עולה על 6 חודשים ממועד ההכנה.

6. הליך כירורגי בחיים

הערה: לבצע את כל ההליכים הניסיוניים בהתאם לוועדת האתיקה למחקר בעלי חיים של המוסד המתאים ולעמוד בעקרונות הצהרת הלסינקי ובהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

  1. הכנה טרום-ניתוחית
    הערה: השתמשו בארנבים לבנים ניו זילנדיים (≈2 ק"ג) כדגם החיה.
    1. לפני הניתוח, יש להניח הרדמה כללית באמצעות הזרקה תוך-שרירית לירך של בעלי החיים, תוך שימוש ב: קטמין ב-1 מ"ל/ק"ג (50 מ"ג/מ"ל) וקזילזין ב-0.3 מ"ל/ק"ג (20 מ"ג/מ"ל). אישור היעדר רפלקס הקרנית וכף הרגל לפני הפעלה.
    2. הניחו את החיה במצב דקוביטוס לטרלי על פלטפורמת ניתוח סטרילית וחטו את האזור הפריקולרי בתמיסת פובידון-יוד. הניחו ספקולום עפעף על העין הניתוחית כדי לשמור על חשיפה רציפה של פני העיניים במהלך ההליך.
  2. קרטקטומיה סטרומלית קדמית
    1. מרכז טרפין ואקום בקוטר 6.5 מ"מ על קרנית הארנב (איור 4A). הפעיל יניקה לייצוב המכשיר וסובב את הטרפין בשלושה רבעים, כדי להגיע לעומק סטרומלי משוער של 187 מיקרון.
    2. בצע קראטקטומיה סטרומלית קדמית באזור הטרפינד באמצעות להב סהר, הסרת שכבות האפיתל והסטרומל הקדמי עד לקבלת משטח פצע חלק (איור 4B).
  3. יישום הידרוג'ל בחיים
    1. מלאו את הפגם בקרנית ב-50 מיקרוליטר של נוסחת הידרוג'ל המתאימה, מחוממים מראש ל-32 מעלות צלזיוס כדי להבטיח צמיגות אופטימלית (איור 4C).
    2. התחל קישור צולב במקום על ידי הארת פני הקרנית באור כחול (λ= 420–480 ננומטר) למשך 2 דקות. ספק שישה פולסים של 20 שניות עם הפסקות של 5–10 שניות בין הפולסים כדי להגביל חימום מקומי (איור 4D).
  4. טרסורהפה חלקית לטרלית
    1. זהה שליש מהשוליים העליונים והתחתונים של העפעפיים באף כדי לאפשר חשיפה מדיאלית לצורך תצפית וטיפול.
    2. הניחו את התפר הראשון (השתמשו ב-1–2 תפרים בהתאם לאורך העפעף והיציבות הנדרשת) (איור 4E).
      1. אחזו בשוליים העליונים הצדדיים של העפעף עם מלקחיים. העבירי את המחט דרך הקו האפור/שוליים של העפעף מצד העור לצד הלחמית, תוך נשיכה בעובי מלא אך הימנעות מחדירה עמוקה ללוח הטארסל אם אפשר.
      2. העבר את המחט דרך הנקודה המתאימה בשוליים התחתונים של העפעף, מהצד הלחמיתית לצד העור כדי ליצור מיקום של שולי העפעף.
      3. קשרו את התפר עם קשר מנתח מאובטח ושני קשרים מרובעים, והשאירו את הקשר על פני העור ממוקם מעט בצד החיצוני של שולי העפעף במקום ישירות מעליו.
      4. יש להניח תפר שני בערך 3–4 מ"מ מדיאלי לראשון אם נדרשת יציבות נוספת, תוך שימוש בתפר U בעובי מלא או תפר פשוט מופרע.
      5. גזום זנבות התפרים עד 3–4 מ"מ כדי להפחית גירוי, ולהשאיר מספיק אורך להסרה מאוחרת.
      6. ודאו שנקודת העפעף מגנה על הקרנית המטופלת תוך מתן גישה ללחמית/קרנית המדיאלית והטמפורלית לבדיקה ולטיפול בטיפות. ודאו שהטרסורהפי אינה מתוחה מדי ושהעפעפיים של החיה אינם איסכמיים (איור 4F).
  5. ניטור וטיפול לאחר הניתוח
    1. ניתן בופרנורפין במינון 0.05 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תת-עורית לפני הקרטקטומיה וכל 12 שעות במשך 72 שעות כדי לספק הקלה לכאבים.
    2. הטמיעו טיפות עיניים של 3 מ"ג/מ"ל טוברמיצין פעמיים ביום עד לסגירת הפצע לחלוטין כדי למנוע זיהום.
    3. מרחו טיפה אחת של דמעות מלאכותיות של חומצה היאלורונית (HA) של 0.2% על כל העיניים, כולל הבקרה, ארבע פעמים ביום לשמירה על הידרציה בקרנית.
    4. בדקו את הטארסורהפי לפחות פעמיים ביום לאיתור סימנים להתרופפות התפרים, זיהום, נמק רקמות מקומי או מתיחות מיותרת. שמרו על החיה תחת השגחה להתנהגות תקינה, תזונה וסימני אי נוחות עיניים.
    5. לאחר 72 שעות לאחר ההליך, חתכו את קשר התפר ומשכו בעדינות כל תפר עם מלקחיים, תוך שמירה על הימנעות מגרירת מזהמים על פני הלחמית.
    6. בדקו את שולי העפעף להחלמה תקינה ואת פני הקרנית לשלמות האפיתל. המשיכו בטיפול העין לפי הצורך עד לצפייה בסגירה אפיתלית מלאה.
    7. לעקוב ולתעד סימנים קליניים וריפוי עיניים מהיום השלישי ועד היום השביעי, תוך הערכת סגירה, אטימות וניאווסקולריזציה באמצעות מיקרוסקופיית מנורת חריץ וצביעת פלואורסציין.
      הערה: אם מופיע סימן לאיסכמיה, שחרור פצע או גירוי חמור, הסר את התפרים מיד וטפלו בהתאם.
  6. הערכת גירוי עיני חריפה של דרייז
    1. הרסן את הארנב בעדינות באמצעות מגבת/שמיכה. בדקו קודם את הקשתית והלחמית תחת אור לבן.
    2. ציון אדמומיות בלחמית, כימוזה (בצקת) וההפרשה לפי סולם דרייז (ראו טבלה 1 וטבלה 2).
    3. רשמו את כל ששת פרמטרי דרייז בגיליון הנתונים. חישבו את מדד הגירוי העין (OII) כסכום ציוני הרכיבים; OII נע בין 0 ל-110, כאשר ערכים גבוהים יותר מצביעים על גירוי חזק יותר.
    4. סווג כל עין לפי קטגוריות Kay–Calandra בהתבסס על OII; רשם את הקטגוריה במאגר הנתונים.
  7. תיעוד צילום של ריפוי פצעים
    1. החדיר תמיסת פלואורסצאין (5 מיקרוליטר) לשק הלחמית התחתון.
    2. האירו את העין באור כחול והערכו את עכירות הקרנית (צפיפות ושטח) ואת היקף צביעת הפלואורסציין.
    3. כוון את המצלמה עם איזון לבן ידני, כבוי הזום האופטי, ומיקום כ-3 ס"מ מהעין כדי לצלם את כל התמונות באמצעות פרמטרים זהים לאורך המפגשים. לצלם תמונות לאחר החדרת פלואורסצאין עם ובלי תאורה כחולה כדי להדגיש ליקויים אפיתליים. לצלם תמונות ביום 0 (לפני הטארסוראפיה) ומדי יום מהיום השלישי (לאחר הסרת הטארסוראפיה) ועד סגירה אפיתלית מלאה.
    4. נתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ וכמת את שטח האזורים המוכתמים בפלואורסצאין.
      הערה: תיעוד צילום בימים 1 ו-2 בדרך כלל אינו אפשרי בשל הטארסורהפה החלקית. יש לציין שתמונות מהימים 1 ו-2 חסרות במאגר הנתונים ודווח על אירועים שליליים (למשל, שפשוף קרנית מקרי).
  8. המתת חסד ואיסוף רקמות
    1. ביום ה-21 (לאחר תקופת ההערכה של שתי העיניים), הרדימו בעלי חיים עמוקות באמצעות קטמין (2 מ"ל/ק"ג) וקסילזין (0.6 מ"ל/ק"ג) במתן תוך-שריר.
    2. הורד על ידי הזרקה תוך-ורידית של 10 מ"ל אשלגן כלוריד רווי (KCl) לתוך וריד האוזן השוליים.
    3. אשר מוות בעקבות הופעת נוקשות גופות והיעדר רפלקסים חיוניים לפני שממשיכים לאיסוף רקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזה ואפיון הידרוג'ל
ההידרוג'ל סונתז והוערך במבחנה כדי לקבוע את תכונותיו הראולוגיות והאופטיות לפני ואחרי פוטו-קרוסקינקינג. ריאולוגיה גזירה שימשה לאפיון ויסקואלסטיות, הכניעה והתנהגות זרימה. סריקות תדר הראו ש-G′ נשאר גבוה מ-G" בכל התדרים שנבדקו, מה שמעיד על התנהגות דמוית מוצק (איור 5A). סריקות משרעת ב-10 רדיו·שניות⁻1 חשפו אזור ויסקואלסטי ליניארי רחב (~100% מאמץ) עם מודול אחסון (G′) שעולה בעקביות על מודול האובדן (G"), מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מספק תהליך עבודה שניתן לשחזור עליו להכנה, טעינה ויישום של הידרוג'ל ג'לטין–ריבופלבין הניתן לקישור פוטו-צולב לריפוי פצעי קרנית. מספר שלבים במבחנה הם קריטיים להשגת איכות ג'ל עקבית ויש דגש משום שהם המקורות הנפוצים ביותר לשונות הזו. ראשית, שמירה על תמיסת הקדם-מדים בטמפרטורה של 80°C במהלך ערבוב מבטיחה המסה מלאה של ג'לטין וריבופלבין פוספט, ומונעת הצטברות חלקיקים שמפגיעה בבהירות האופטית ובאחידות הקישורים. לפני סינון סטרילי, יש לחמם מחדש את הנוסחה ל-40 °C כדי להבטיח נזיל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך במענקים ממחלקת הבריאות של ממשלת הבסקים (2023111027 ו-IT524-22). C.R.-V. נתמך על ידי מלגה מאוניברסיטת חבל הבסקים UPV/EHU. התמיכה הטכנית בטיפול בבעלי חיים ושירות המיקרוסקופיה האנליטית והברזולוציה הגבוהה שמספקת SGIker (UPV/EHU) מוערכת בהכרת תודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Amphotericin BGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018Final concentration: 1.25 μg/mL
Autologous serum, rabbit (AS)Prepared in-house-Prepared from whole blood; filtered through 0.22 μm PES
Blue LED curing lampWoodpecker Medical Instrument CoLED.C modelWavelength: λ=420–480 nm; Distance: 1–2 cm; Light output: 850-1000 mW/cm2
Buprenorphine (Buprecare)Ecuphar578950Dose: 0.05 mg/kg, subcutaneous injection every 12 h for 72 h
CameraPanasonicLUMIX TZ35Camera equipped with Leica optics
Cimarec Digital Stirring HotplateThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V, Max temperature: 540 °C
Crescent microsurgical bladeBVI Medical373807-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
Eppendorf tubes (0.2 mL)Merck KGaA30124707Kept cold for HAMe prep; aliquoting
Eppendorf tubes (5 mL)Merck KGaA30119606Kept cold for HAMe prep; aliquoting
Fluorescein solution NovartisColorcusi Fluotest2% Fluorescein solution, 5 µl eye drops
Gibco NeomycinMerck KGaAN1142Final concentration: 50 μg/mL
Gelatin powderSigma AldrichG1890Dissolved at 80 °C; pH adjusted to 7.0
Hyaluronic acid artificial tears (0.2%)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
ImageJ image processing softwareNational Institute of Mental Health-Developed by Wayne Rasband at the Research Services Branch
Ketamine (Ketolar)Pfizer631028.1
LidocaineVet OneNDC 13985-222-04Topical or subcutaneous injection
Penicillin–StreptomycinGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Final concentration: 50 μg/mL
PES syringe filters, 0.22 μm0.22μm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
Protease inhibitor cocktailSigma AldrichP8340Added at 5 μL per mg tissue
Povidone-iodine solutionMeda pharma7167204Preoperative disinfection
Riboflavin phosphate (RFP)Sigma AldrichR0630000Concentrations: 0.01% w/v (final); 0.02% w/v (stock)
SonicatorBandelein electronicSonoplus GM mini20-
Sonicator probeBandelein electronicMS 1.51.5 mm dimater probe, 63 mm length.
Tarsorrhaphy sutures (non-absorbable)Alcon 80653080011–2 sutures as needed
Tobramycin ophthalmic solution (3 mg/mL)NovartisTobrexDosing: twice daily until closure
Hessburg-Barron trephine, 6.5 mm diameterJedmed21-8265-
Vacutainer blood collection tubes with polymer gel separatorBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
Xylazine solutionLaboratorios Calier SAXylagesicDose: 5 mg/kg intramuscular injection

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meek, K., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Prog Retin Eye Res. 49, 1-16 (2015).
  2. Akowuah, P. K., Cruz, A. D. L., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An epithelial abrasion model for studying corneal wound healing. J Vis Exp. (178), e63112(2021).
  3. Mobaraki, M., et al. Corneal repair and regeneration: current concepts and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 7, 135(2019).
  4. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: a review article. Med Hypotheses Discov Innov Ophthalmol. 8 (3), 163-176 (2019).
  5. Wilson, S. E., Goshe, J. M. Prevention and treatment of persistent epithelial defects after common refractive surgery procedures. J Refract Surg. 40 (2), 117-124 (2024).
  6. Wirostko, B., Rafii, M. J., Sullivan, D. A., Morelli, J., Ding, J. Novel therapy to treat corneal epithelial defects: a hypothesis with growth hormone. Ocul Surf. 13 (3), 204-212 (2015).
  7. Zernii, E. Y., Baksheeva, V. E., Yani, E. V., Philippov, P. P., Senin, I. I. Therapeutic proteins for treatment of corneal epithelial defects. Curr Med Chem. 26 (3), 517-545 (2019).
  8. Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wu, J., Singh, V., Wilson, S. E. The corneal fibrosis response to epithelial-stromal injury. Exp Eye Res. 142, 110-118 (2016).
  9. Anitua, E., et al. Progress in the use of plasma rich in growth factors in ophthalmology: from ocular surface to ocular fundus. Expert Opin Biol Ther. 22 (1), 31-45 (2021).
  10. Meng, S., et al. A versatile hydrogel with antibacterial and sequential drug-releasing capability for the programmable healing of infectious keratitis. ACS Nano. 17 (23), 24055-24069 (2023).
  11. Rafat, M., et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol. 41 (1), 70-81 (2023).
  12. Di Girolamo, N. Biologicals and biomaterials for corneal regeneration and vision restoration in limbal stem cell deficiency. Adv Mater. 36 (42), 2401763(2024).
  13. Huang, J., et al. Biologically inspired bioactive hydrogels for scarless corneal repair. Sci Adv. 10 (51), eadt1643(2024).
  14. Brunel, L. G., et al. In situ universal orthogonal network (UNION) bioink deposition for direct delivery of corneal stromal stem cells to corneal wounds. Bioact Mater. 48, 414-430 (2025).
  15. Sani, E. S., et al. Sutureless repair of corneal injuries using naturally derived bioadhesive hydrogels. Sci Adv. 5 (3), eaav1281(2019).
  16. Sharifi, S., et al. Tuning gelatin-based hydrogel towards bioadhesive ocular tissue engineering applications. Bioact Mater. 6 (11), 3947-3961 (2021).
  17. Li, M., et al. A “T.E.S.T.” hydrogel bioadhesive assisted by corneal cross-linking for in situ sutureless corneal repair. Bioact Mater. 25, 333-346 (2023).
  18. Chen, F., Le, P., Fernandes-Cunha, G. M., Heilshorn, S. C., Myung, D. Bioorthogonally crosslinked hyaluronate collagen hydrogel for suture-free corneal defect repair. Biomaterials. 255, 120176(2020).
  19. McTiernan, C. D., et al. LiQD cornea: pro-regeneration collagen mimetics as patches and alternatives to corneal transplantation. Sci Adv. 6 (25), eaba2187(2020).
  20. Feng, L., et al. Thermo-gelling dendronized chitosans as biomimetic scaffolds for corneal tissue engineering. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (41), 49369-49379 (2021).
  21. Tang, Q., et al. Exosomes-loaded thermosensitive hydrogels for corneal epithelium and stroma regeneration. Biomaterials. 280, 121320(2022).
  22. Lee, Y. P., et al. Facile fabrication of superporous and biocompatible hydrogel scaffolds for artificial corneal periphery. Colloids Surf B Biointerfaces. 175, 26-35 (2019).
  23. He, B., et al. 3D printed biomimetic epithelium/stroma bilayer hydrogel implant for corneal regeneration. Bioact Mater. 17, 234-247 (2022).
  24. Fernandes-Cunha, G. M., et al. Supramolecular host-guest hyaluronic acid hydrogels enhance corneal wound healing through dynamic spatiotemporal effects. Ocul Surf. 23, 148-161 (2023).
  25. Wang, Q., et al. Photocurable and temperature-sensitive bioadhesive hydrogels for sutureless sealing of full-thickness corneal wounds. Small Methods. 8 (3), 2300996(2024).
  26. Brar, S., Ganesh, S., Reddy, S. S., Nagesh, B. N., Shahanand, D. A prospective, comparative, clinical study to evaluate the safety and efficacy of two different 0.1% riboflavin solutions used in collagen crosslinking treatment for patients with keratoconus. Clin Ophthalmol. 15, 2607-2617 (2021).
  27. Lee, H. J., Fernandes-Cunha, G. M., Myung, D. In situ-forming hyaluronic acid hydrogel through visible light-induced thiol-ene reaction. React Funct Polym. 131, 29-35 (2018).
  28. Fernandes-Cunha, G. M., Lee, H. J., Kumar, A., Kreymerman, A., Heilshorn, S., et al. Immobilization of growth factors to collagen surfaces using pulsed visible light. Biomacromolecules. 18 (10), 3185-3196 (2017).
  29. Schuldt, C., et al. Dose-dependent collagen cross-linking of rabbit scleral tissue by blue light and riboflavin treatment probed by dynamic shear rheology. Acta Ophthalmol. 93 (5), 328-336 (2015).
  30. Kubo, M., Sonoda, Y., Muramatsu, R., Usui, M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (7), 1539-1546 (2001).
  31. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jiménez-Martínez, M. C. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunol Investig. 40 (2), 183-196 (2011).
  32. Yazdanpanah, G., et al. A light-curable and tunable extracellular matrix hydrogel for in situ suture-free corneal repair. Adv Funct Mater. 32 (24), 2113383(2022).
  33. Niknejad, H., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A. Induction of apoptosis, stimulation of cell-cycle arrest and inhibition of angiogenesis make human amnion-derived cells promising sources for cell therapy of cancer. Cell Tissue Res. 363 (3), 599-608 (2016).
  34. Kakavand, M., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A., Niknejad, H. Blood compatibility of human amniotic membrane compared with heparin-coated ePTFE for vascular tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 11 (6), 1701-1709 (2017).
  35. Basasoro, A., et al. The influence of amniotic membrane proteins on corneal regeneration when delivered directly or using hydrogel platforms. Front Med (Lausanne). 12, 1498319(2025).
  36. Tsubota, K., Goto, E., Shimmura, S., Shimazaki, J. Treatment of persistent corneal epithelial defect by autologous serum application. Ophthalmology. 106 (10), 1984-1989 (1999).
  37. Geerling, G., MacLennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 88 (11), 1467-1474 (2004).
  38. Jeng, B. H., Dupps, W. J. Autologous serum 50% eyedrops in the treatment of persistent corneal epithelial defects. Cornea. 28 (10), 1104-1108 (2009).
  39. Romo-Valera, C., et al. In vitro evaluation of gelatin-based hydrogels as potential fillers for corneal wounds. Biomacromolecules. 26 (6), 3344-3355 (2025).
  40. Romo-Valera, C., et al. Comparison of the regenerative potential of different functionalized gelatin-based hydrogels as fillers of rabbit corneal wounds. Front Med (Lausanne). 12, 1667446(2025).
  41. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Surv Ophthalmol. 45 (6), 493-515 (2001).
  42. Kay, J., Calandra, J. Interpretation of eye irritation tests. J Soc Cosmet Chem. 13 (6), 281-289 (1962).
  43. Weidinger, A., Poženel, L., Wolbank, S., Banerjee, A. Sub-regional differences of the human amniotic membrane and their potential impact on tissue regeneration application. Front Bioeng Biotechnol. 8, 613804(2021).
  44. Romo-Valera, C., Etxebarria, J., Freire, V., Durán de la Colina, J., Arluzea, J., et al. An in vitro pre-screening model to evaluate the corneal anti-inflammatory effect of human blood-derived products and amniotic membrane extracts incorporated into gelatine-based hydrogels. Experimental eye research. 260, 110617(2025).
  45. Ingraldi, A. L., Audet, R. G., Tabor, A. J. The preparation and clinical efficacy of amnion-derived membranes: a review. J Funct Biomater. 14 (10), 531(2023).
  46. Murri, M. S., et al. Amniotic membrane extract and eye drops: a review of literature and clinical application. Clin Ophthalmol. 12, 1105-1112 (2018).
  47. Shakouri-Motlagh, A., O’Connor, A. J., Kalionis, B., Heath, D. E. Improved ex vivo expansion of mesenchymal stem cells on solubilized acellular fetal membranes. J Biomed Mater Res A. 107 (1), 232-242 (2019).
  48. Acharya, M., Gour, A., Dave, A. Commentary: tarsorrhaphy. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 33-34 (2020).
  49. Dhillon, H., Bahadur, H., Raj, A. A comparative study of tarsorrhaphy and amniotic membrane transplantation in the healing of persistent corneal epithelial defects. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 29-33 (2020).
  50. Maharjan, S. S., Pant, A. R., Joshi, P., Shrestha, P., Sharma, R. Outcomes of fungal corneal ulcer with impending perforation after temporary suture tarsorrhaphy. Nepal J Ophthalmol. 14 (27), 72-81 (2022).
  51. Bamrolia, N. R., Arora, R., Yadava, U. Unusual presentation of a case of Sjogren’s syndrome with neurological and ocular manifestation. Cont Lens Anterior Eye. 35 (2), 85-88 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים