מאמר שיטה

תיוג מטבולי של הטרנסקריפטום המתהווה בעובריות מוקדמת של Xenopus

DOI:

10.3791/70591

⸱

27 במרץ 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים שיטות מפורטות לתיוג מטבולי ולטיהור תמלילים מתחילים לניתוח טרנסקריפטום בעוברים מוקדמים של Xenopus באמצעות 5-אתיניל-אורידין (5-EU).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העובר המוקדם דורש שעתוק חדש של גנים זיגוטיים מהגנום הזיגוטי שהיה רדום לאחר ההפריה. אתגר מרכזי היה לזהות במדויק את התמלילים החדשים ולקבוע את זמן הביטוי שלהם במהלך הפעלת הגנום הזיגוטי (ZGA). כאן, אנו מספקים נהלים מפורטים לתיוג מטבולי של התמלולים המתפתחים על ידי 5-אתיניל-אורידין (5-EU) בעוברים מוקדמים של Xenopus laevis . לאחר ההפריה, 5-EU מוזרק מיקרו לעוברים בשלב תא אחד כדי לסמן מטבולית את ה-RNA החדש שהועתקו במהלך ZGA. ה-EU-RNA המתהווים מטוהרים לאחר ביוטינילציה באמצעות תגובות מתווכות בכימיה קליק, והטרנסקריפטום המתהווה נקבע באמצעות ריצוף מהדור הבא. חשוב לציין כי שיטה זו בעלת רגישות וספציפיות גבוהות שמאפשרות אפיון של גנים שמופעלים בפועל נמוך. לכן, גישה זו מספקת כלי עוצמתי לחקר הדינמיקה של שעתוק גנים במהלך ההתפתחות המוקדמת, וניתן להכליל אותה למערכות או רקמות עובריות אחרות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר ההפריה, העובר נמצא תחת שליטה של גורמים אימהיים שמופקדים בביצית, בעוד שהגנום הזיגוטי שקט לשעתוק למשך תקופה; הוא מופעל כדי לתמלל מאות עד אלפי גנים החיוניים להתפתחות מאוחרת יותר, כולל הגדרת גורל התא ויצירת שכבת הנבט 1,2,3,4,5,6. תופעה זו של הפעלת הגנום הזיגוטי (ZGA) במהלך המעבר מהאם לזיגוטי (MZT) שמורה מאוד בכל מיני המטאזואה, אם כי תזמון ה-ZGA משתנה בין מינים 1,2,3,4,5,6. הבנת האופן שבו ZGA מווסת אינה רק חשובה להבנת העקרונות הבסיסיים של ההתפתחות המוקדמת, אלא גם מציעה פוטנציאל לפיתוח אסטרטגיות חדשות לאבחון וטיפול בהפרעות התפתחותיות ולהגברת בריאות הרבייה.

אתגר מרכזי בחקר ZGA היה לזהות במדויק תמלולים חדשים ולקבוע את זמן הופעתם במהלך הפעלת הגנום הזיגוטי (ZGA). עקב הדומיננטיות של תמלולים אימהיים בעובריםמוקדמים 7, הרמות הגבוהות של תמלולים אלו יכולות להסתיר את גילוי התמלולים החדשים במהלך ZGA, במיוחד עבור גנים בעלי פעילות נמוכה, באמצעות RNA-seq קונבנציונלי. כדי להתגבר על האתגר הזה, פיתחנו שיטה למדידת הטרנסקריפטום המתהווה באמצעות תיוג מטבולי של התמלילים המתפתחים עם 5-אתיניל-אורידין (5-EU), ולאחר מכן ביוטינילציה של ה-EU-RNA המתהווים באמצעות כימיה בלחיצה וטיהורם לצורך ריצוף (EU-RNA-seq)8,9,10. בהשוואה לשיטות פרופיילינג תמלוליות מתחילות אחרות, כמו אלו המשתמשות ב-4-תיאורידין (4sU)11,12, תיוג 5-EU הוא מאוד ספציפי באמצעות כימיה קליק, ניתן להשתמש בו הן להדמיה והן לריצוף, ואינו דורש המרה כימית. יתרה מזאת, ה-EU-RNA-seq המתהווה רגיש מאוד ומזהה מאות גנים, שהפעלתם אינה ניתנת לזיהוי על ידי RNA-seq8 הקונבנציונלי. גישה זו אפשרה לנו גם לקבוע במדויק את תחילת הפעלת הגנים הזיגוטיים הבודדים ולפרופיל את דפוסי המרחב-זמן הייחודיים של ZGA במהלך העוברהמוקדם 8.

אנו מתארים כאן את ההליכים המפורטים להכנת דגימות עבור EU-RNA-seq כדי לפרופיל את הטרנסקריפטום המתהווה באמצעות עוברים מוקדמים של Xenopus laevis כמודל. פרוטוקול זה מותאם משיטה קודמת 10,13 עם אופטימיזציות קלות בפרוצדורות, כולל הזרקת מיקרו-5-EU לעוברים בשלב תא אחד, ביוטינילציה של RNA של EU-RNA מתהווים באמצעות תגובת קליק, וטיהורם לצורך ריצוף (איור 1). כדי להבטיח שכפול, בהתאם לשלבי העוברים המוקדמים עם שפע משתנה של תעתיקים מתחילים, יש להשתמש ב-1–10 מיקרוגרם RNA כולל כקלט, אם כי ניתן עדיין להשתמש בכמות נמוכה יותר. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במערכות עובריות אחרות, כגון דרוזופילה14 וזברה15, וברקמות נוספות13. שיטה זו היא כלי עוצמתי להבנת שעתוק גנים ומנגנוני ויסות בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל חשיפת עקרונות חדשים של העובר המוקדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודות בעלי חיים המתוארות במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) של אוניברסיטת דרום קרוליינה. בטיחות מעבדות וסילוק פסולת צריכות לעמוד בתקנות המוסדיות.

1. הכנת תגובות ומאגרים

  1. 20x MMR (תמיסת Marc Modified Ringer): ערבב 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, ו-40 mM CaCl2. כוון את ה-pH ל-7.8 עם NaOH. אוטוקלב ואחסן בטמפרטורת החדר.
  2. 3% Ficoll (עם v/v)/0.5x MMR: מוסיפים בהדרגה 1.5 גרם Ficoll 400 ל-50 מ"ל של 0.5x MMR תוך ערבוב עדין עם מוט ערבוב מגנטי עד שה-Ficoll מתמוסס לחלוטין. אוטוקלאב ושמור על 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  3. תמיסת מאגר 5-אתיניל אורידין (5-EU): ליצירת תמיסת המאגר של 50 מ"מ, יש להוסיף 372.8 מיקרוליטר של בופר (יש לשים לב שכל בופר התואם למיקרו-הזרקה יכול לשמש, למשל 1x TBS, pH 7.6) לבקבוקון של 5 מ"ג. ערבב טוב ויצר 2 מיקרו ליטר אליקווט. אחסן בטמפרטורה של -80°C.

2. מיקרוהזרקה של 5-EU לעוברים חד-תאיים

  1. כדי לקבל עוברים של Xenopus , יש לעקוב אחרי פרוטוקולים סטנדרטיים לביצוע הפריה חוץ-גופית (IVF) (למשל, ראו Sive ואח', 2007)16. העובר צריך להיות ב-0.1x MMR, מוכן לשימוש.
  2. הוסף 1 מ"ל של 3% Ficoll/0.5x MMR לתא הזרקה העשוי מזכוכית סטנדרטית (25 מ"מ x 75 מ"מ). השתמשו בפיפטה פלסטית להעברת 20 (או יותר במידת הצורך) עוברים למרכז תא המיקרו-הזריקה.
  3. השתמש בפינצטה עדינה כדי לחתוך בזהירות את קצה הקצה הדק מאוד של מחט הזכוכית ולהדביק את המחט אנכית (כשקצה הקצה פונה כלפי מטה) על חימר הדגם שעל קיר הספסל. השתמש בפיפטה P2 עם קצה המיקרולודר כדי להוסיף 0.5 מיקרוליטר של 50 mM 5-EU מהחלק העליון של מחט הזכוכית.
  4. הרכיבו את המחט על מיקרומניפולטור. השתמש בפיפטה P10 כדי להוסיף 10 מיקרוליטר שמן הלוקרבון על מיקרומטר שלב ולשים אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  5. כדי לכייל את נפח ההזרקה, תחילה השתמש ברגל כדי ללחוץ את הרצפה על הרצפה המחוברת למיקרו-מזרק ולהזריק טיפה לשמן ההילוקרבון על המיקרומטר. בהתאם לגודל הטיפה, יש להתאים את הלחץ וזמן ההזרקה על המיקרואינגקטור כדי לקבוע שנפח ההזרקה יהיה 10 ננו-ליטר, כלומר 0.27 מ"מ בקוטר במיקרומטר.
  6. השתמש בפינצטה ביד אחת כדי להחזיק את העובר, ביד השנייה להחזיק את המיקרומניפולטור, ולהזריק 10 ננו-ליטר של 50 mM EU לעוברים בשלב התא האחד. הריכוז הסופי של 5-EU בעובר הוא ~0.5 מ"מ.
  7. לאחר הזרקת מיקרו, השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק כדי להעביר את העוברים מתא ההזרקה לצלחת זכוכית חדשה המכילה 3% Ficoll/0.5x MMR. השאירו את העוברים שהוזרקו בפיקול למשך ~1 שעה.
  8. הסר בזהירות את תמיסת Ficoll והחלף את המדיום ב-0.1x MMR. שמור על עוברים ב-0.1x MMR עד לשימוש נוסף. יש לעקוב באופן קבוע אחר התפתחות העוברים ולהסיר כל עובר חריג במידת הצורך.
  9. כאשר העוברים מגיעים לשלבי ההתפתחות הרצויים, השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק כדי להעביר 10 עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. השתמשו בפיפטה P200 כדי להסיר בזהירות כל מדיום שנותר בצינור, והקפאו את העוברים בחנקן נוזלי.
    הערה: כדי להבטיח את הקשיחות והשחזור, אספו רק עוברים שהם תקינים בהתאם למראה שלהם לעומת הביקורת. להסיר ולהוציא עוברים חריגים מהניתוח הנוסף. במידת הצורך, לאסוף גם את אותו מספר עוברים ללא מיקרוהזרקה כמו בביקורת שלילית.
  10. אחסן את העוברים במקפיא בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.

3. סך הפקת RNA ומדידת ריכוז

הערה: השתמשו בערכת חילוץ RNA מלאה מבוססת ממברנת סיליקה לבידוד RNA כולל מעוברים מוקדמים ובערכת כימות RNA רגישות גבוהה מבוססת פלואורסצנציה כדי לקבוע את ריכוזי ה-RNA. עקבו אחרי ההוראות שניתנות על ידי הערכה, והשלבים הבאים משתנים מעט מהמדריך. כל התמיסות והמגיבים המשמשים בשלבים הבאים צריכים להיות נטולי RNase.

  1. הניחו את הדגימות מהמקפיא בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח.
  2. הוסף 700 מיקרוליטר של Buffer RLT מערכת חילוץ ה-RNA בכל צינור. השתמש בפיפטה P1000 כדי לפיפט למעלה ולמטה לפחות 15 פעמים או עד שכל העוברים מומסים.
  3. השאירו את הדגימות על הקרח למשך 20 דקות. ערבבו בעדינות שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים כדי להומוגן לחלוטין את העוברים.
  4. הוסיפו 700 מיקרוליטר של 70% אתנול לעוברים ההומוגניים. פיפט למעלה ולמטה כדי לערבב היטב ולהעביר את 700 מיקרולטר התערובת לעמודת ספין.
  5. צנטריפוגה את העמודה בעוצמה של 10,000 x g למשך דקה. השליכו את ה-flow-through. חזור על הצנטריפוגה עד ששאר התערובת מוכנה.
  6. הוסף 350 מיקרוליטר מ-Buffer RW1 ובצנטריפוגה את העמודה בעוצמה של 10,000 x g למשך דקה. השליכו את ה-flowthrough.
  7. הוסיפו בזהירות 80 מיקרולטר DNase I למרכז הממברנה בעמודה. דגרו 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הוסף 350 מיקרוליטר של Buffer RW1 וצנטריפוגה את העמודה בעוצמה של 10,000 x g למשך דקה. השליכו את ה-flowthrough.
  9. הוסף 500 מיקרוליטר של Buffer RPE וצנטריפוגה את העמודה ב-10,000 x g למשך דקה. השליכו את ה-flowthrough. חזור על הכביסה שוב.
  10. ייבשו את העמודה על ידי צנטריפוגה נוספת ב-10,000 x g למשך 2 דקות.
  11. העבר את העמודה לצינור חדש ללא RNase. מוסיפים בזהירות 35 מיקרוליטרH2O ללא RNase למרכז הממברנה בעמודה.
  12. צנטריפוגה את העמודה בעוצמה של 10,000 x g למשך דקה. אסוף את ה-RNA המשוחרר והשאר על הקרח.
  13. כדי למדוד את ריכוז ה-RNA, יש להכין תחילה את תמיסת העבודה באמצעות ערכת הכימות של ה-RNA על ידי דילול המגיב (צבע) של ה-RNA ב-1:200 בבופר ה-RNA. מחשב את הנפח הכולל של התמיסה הפועלת בהתאם למספר התקנים הכולל והכין 200 מיקרוליטר לכל תקן או דגימה.
  14. תקים רצועת 8 צינורות בגודל 0.2 מ"ל. כדי לדלל כל תקן, הוסף 10 מיקרו-ליטר ל-190 מיקרוליטר של התמיסה העובדת. כדי לדלל כל דגימה, הוסף 1 מיקרוליטר ל-199 מיקרוליטר של תמיסת העבודה. ערבב טוב.
  15. שים את רצועת 8 הצינורות בפלואורומטר. בחר את מבחן ה-RNA, כייל לפי התקנים, וקרא את ריכוזי הדגימות.

4. ביוטינילציה וטיהור של EU-RNA בתחילת דרכו

הערה: ערכת לכידת RNA מתפתחת מבוססת כימיה בלחיצה משמשת לביוטינילציה ולמשיכת ה-EU-RNA המתהווה. עקבו אחרי ההוראות שמספקת הערכה, והשלבים הבאים משתנים במעט. RNA מעוברים שאינם מוזרקים, וכן RNA של EU-RNA ללא ביוטינילציה, יכולים לשמש כבקרות רקע לספציפיות pulldown down.

  1. ביוטינילציה וניקוי RNA
    1. לכל דגימה, מערבבים את הרכיבים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ליצירת תגובת קליק של 50 מיקרוליטר: RNA כולל (1–10 מיקרוגרם), 1x בופר EU, 2 mM CuSO4, 0.25 mM ביוטין אזיד, 10 mM תוסף 1, ותוסף 12 mM 2.
    2. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על נוטאטור.
    3. בכל תגובה למעלה, הוסף 1 מיקרוליטר גליקוגן, 50 מיקרוליטר של אצטט אמוניום 7.5 מיליון, ו-700 מיקרוליטר של 100% אתנול מקורר. פיפט למעלה ולמטה 5 פעמים כדי לערבב אותם טוב.
    4. שים את הצינור במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ושמור אותו ללילה.
    5. צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 13,000 x g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
    6. הוסיפו 700 מיקרוליטר של 75% אתנול וערבבו בעדינות כדי להחזיר את הכדור לתלייה. צנטריפוגה את הצינור ב-13,000 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. חזור על הכביסה שוב.
    7. ייבשו את הכדור באוויר במשך 5–10 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את הכדור ל-10 מיקרוליטרH2O ללא RNase.
  2. טיהור EU-RNA
    1. כדי להוריד את ה-EU-RNA המתהווה, עבור כל דגימה, יש לחלק 5 מיקרו ליטר של חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    2. הוסיפו 9 מיקרולטר של בופר שטיפה 2. ערבב טוב והניח את הצינור על מתקן מגנטי. תן לזה לעמוד 2 דקות. הסר את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עוד פעמיים. תלה מחדש את החרוזים ב-5 מיקרוליטר של Wash Buffer 2.
    3. הכינו את תערובת המאסטר הבאה בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל (15 מיקרוליטר לכל דגימה): 12.5 מיקרוליטר של בופר קישור RNA (רכיב G), 0.2 מיקרוליטר של RNase OUT מדולל ביחס 1:10, ו-2.3 מיקרוליטר H2O ללא RNase. הוסף 15 מיקרוליטר מהתערובת לכל צינור המכיל את דגימת ה-RNA.
    4. דגרו במשך 5 דקות על בלוק חום בטמפרטורה של 69 מעלות צלזיוס. שים את הצינור על הקרח.
    5. הוסף 5 מיקרו-ליטר מהחרוזים הנשטפים מראש לכל צינור המכיל את דגימת ה-RNA. דגרו ל-30 דקות על נוטאטור בטמפרטורת החדר.
    6. הוסף 50 מיקרוליטר של בופר שטיפה 1. ערבב טוב והניח את הצינור על מתקן מגנטי. תן לזה לעמוד 2 דקות. הסר את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עוד 4 פעמים.
      הערה: הסופרנטנט לאחר השטיפה הראשונה, שלכאורה מכיל רק את התמלולים האימהיים, ניתן לאסוף למדידת הטרנסקריפטום האם.
    7. הוסיפו 50 מיקרו-ליטר של בופר כביסה 2. ערבב טוב והניח את הצינור על מתקן מגנטי. תן לזה לעמוד 2 דקות. הסר את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עוד 4 פעמים.
    8. תלה מחדש את החרוזים ב-5 מיקרוליטר של Wash Buffer 2. החרוזים, המכילים את ה-EU-RNA המתהווה, מוכנים לסינתזה ישירה של cDNA ולהכנת ספרייה.
      הערה: לפני המשך להכנת הספרייה, ניתן להעריך את ההעשרה של תמלולים מתחילים על ידי מדידת ביטוי של גנים בודדים ידועים באמצעות תגובת שרשרת שעתוק הפוך-פולימראז (RT-PCR).

5. הכנה וריצוף ספריית RNA

  1. השתמשו בערכות זמינות מסחרית להכנת ספריות ה-cDNA ופעל לפי ההוראות שניתנות על ידי הערכה. השתמשו בערכת הכמותית של NEBNext Library עבור Illumina כדי לכמת את הספריות ולאגד אותן.
  2. איחד את הספריות בהתאם להוראות של ערכות הרצף מהדור הבא הנפוצות בשימוש. דילל את הספריות ל-~1.8 pM לפני טעינתן לסיקוונסר השולחן כדי להגיע לצפיפות אשכולות אופטימלית של ~200k/mm2 במהלך הריצוף. רצף את הספריות באמצעות רצף הדור הבא הנפוץ בשימוש. השתמשתי בריצוף זווג של 75 bp ל~20 מיליון קריאות לדגימה.
  3. כימות את קריאות הטרנסקריפטומיות על ידי יישור הרצפים לבניית הגנום Xenopus laevis 9.2 באמצעות סלמון17 וביצוע ניתוח ביטוי גנים שונה באמצעות DESeq218. כדי להמחיש את השיאים בדפדפן הגנום, מיפו את הרצפים לגנום באמצעות STAR19 והציגו ב-Integrative Genomics Viewer (IGV)19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עוברים של Xenopus laevis (ארבעה שכפולים ביולוגיים) בשלבים שבין 5 ל-9 שעות לאחר ההפריה (hpf) בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, המכסים את השלבים משלב 5 (עם מעט ZGA בקנה מידה גדול) ועד שלב 9 (עם ZGA גבוה), עובדו בהתאם לפרוטוקול מעל8. ה-RNA הכולל, ה-EU-RNA המטוהר וה-RNA הזורם שימשו להכנת הספריות וסודרו. כפי שמוצג באיור 2, על ידי השוואת הטרנסקריפטום המתהווה בעוצמה של 6–9 כוחות סוס לבין זה ב-5 כ"פ, מספר הולך וגדל של גנים מופעלים באופן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן סיפקנו פרוטוקול מפורט לתיוג מטבולי של הטרנסקריפטום המתהווה בתחילת העובר, כולל מיקרוהזרקה של 5-EU לעוברים חד-תאיים, חילוץ RNA כולל ומדידת ריכוזיהם, וביוטינילציה וטיהור של ה-EU-RNA המתהווים להכנת ספרייה וריצוף (EU-RNA-Seq) (איור 1). עקב הרגישות והספציפיות הגבוהה של הגישה בהשוואה לסך כל ה-RNA-seq, פרוטוקול זה אפשר לנו לא רק לקבוע במדויק הן את רמת הטרנסקריפטום והן את זמן ההופעה של הטרנסקריפטום המתהווה במהלך ה-ZGA, אלא גם לגלות דפוסי הפעלה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למעבדת מתיו גוד באוניברסיטת פנסילבניה על מתן ההכשרה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד וההתפתחות האנושית ע"ש יוניס קנדי שרייבר (R03HD105802).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
&; PUPM מיקרואינג'קטורוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסUPUMPלמיקרוהזרקה (מיקרוהזרקה בלחץ)
5-ehtynyl uridineתרמו פישר סיינטיפיקE10345למיקרוהזרקה (תיוג טראקנסקריפטים מתחילים)
מיקרוסקופים סטריאוסקופים זום ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130למיקרוהזרקה (הדמיית עוברים)
אצטט אמוניוםסיגמא-אלדריץ'A2706עבור משקעים של RNA
חומצה אסקורביתסיגמא-אלדריץ'A7506לתגובה ללחיצה
נימי זכוכית בורוסיליקטוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסTW100-4למיקרוהזרקה (ייצור מחטים מזכוכית)
צנטריפוגהאפנדורף5425Rלצנטריפוגה
ערכת לכידת RNA מתפתחת Click-iTתרמו פישר סיינטיפיקC10365לביוטינילציה וטיהור RNA צעיר
CuSO4סיגמא-אלדריץ'61230לתגובה ללחיצה
DNase Iרוש דיאגנוסטיקה4716728001לצורך חילוץ RNA
Ficoll 400סיגמא-אלדריץ'GE17-0300-10למיקרוהזרקה (עוברים מדגירים)
צלחת פטרי זכוכית (60 מ"מ)VWR75845-542לצורך הפריה
גליקוגןתרמו פישר סיינטיפיקAM9510עבור משקעים של RNA
Halocarbon Oil 27סיגמא-אלדריץ'H8773למיקרוהזרקה (כיול נפח הזרקה)
L-ציסטאיןסיגמא-אלדריץ'168149לפירוק עוברים
טיפים למיקרולודרקליבר סיינטיקלEPE-5242956003למיקרוהזרקה (טעינת 5-EU לתוך מחט הזכוכית)
ערכת כמותית של ספריית NEBNext ל-IlluminaNEBE7630לכימות ספרייה
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)אילומינה20024906לרצף
פלואורומטר Qubi Flexתרמו פישר סיינטיפיקQ33327למדידת ריכוז RNA
ערכת קישור HS ל-RNA קיוביטתרמו פישר סיינטיפיקQ32852למדידת ריכוז RNA
ערכת מיני RNeasyקיאגן74104לצורך חילוץ RNA
מיקרומטר שלבהמדע של וורד470175-914למיקרוהזרקה (כיול נפח הזרקה)
RNA-seq אוניברסלי עם NuQuantNuGEN0364להכנת ספרייה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).
  2. Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  3. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), (2019).
  4. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  5. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  6. Tadros, W., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts. Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).
  7. Schier, A. F. The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas. Science. 316 (5823), 406-407 (2007).
  8. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  9. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  10. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  11. Heyn, P., et al. The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species. Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).
  12. Bhat, P., et al. Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis. Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).
  13. Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts. STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).
  14. Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns. Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).
  15. Chan, S. H., et al. Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. , (2007).
  17. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  18. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  19. Dobin, A., et al. Ultrafast universal rna-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  20. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  21. Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity. Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).
  22. Battich, N., et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies. Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Xenopus5 EthynyluridineRNA

מאמרים קשורים