הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

המחשת הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים של עוברים מוקדמים

397 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70592

⸱

3 באפריל 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטות להמחשת שעתוק ראשוני במהלך הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים במהלך העובר המוקדם.

תקציר

העובר המוקדם דורש את המעבר מהאם לזיגוטי (MZT) שמחייב את הפעלת הגנום הזיגוטי (ZGA). במהלך ZGA, מאות עד אלפי גנים מתועתקים, דבר חיוני לתהליכים שונים בהתפתחות העובר המוקדמת, כולל שמירה על הישרדות עוברית, הגדרת גורל התא והיווצרות שכבת נבט. אתגר מרכזי בחקר ZGA היה להמחיש ישירות את ZGA בתאים בודדים של עוברים מוקדמים. כאן, אנו מתארים שיטה להמחשה ישירה של ZGA בתאים בודדים של עוברים מוקדמים על ידי תיוג מטבולי של תמלילים מתחילים באמצעות 5-אתיניל אורידין (5-EU), ולאחר מכן הצמידת RNA של ה-EU-RNA המתהווים עם פלואורופורים באמצעות כימיה של קליק, והמחשתם בעוברים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, תוך שימוש ב-Xenopus laevis כמודל. שיטה זו אפשרה לנו לעקוב אחר ZGA חד-תא בעוברים שלמים ולחשוף את ההופעה ההטרוגנית של ZGA במרחב ובזמן במהלך העובר המוקדם. ניתן להשתמש בו במערכות עובריות או רקמות אחרות לחקר שעתוק גנים וויסות הגנום ברמת התא היחיד.

מבוא

במהלך ההתפתחות המוקדמת, העובר עובר את המעבר מהאם לזיגוטי (MZT) שמעביר בהדרגה את הבקרה ההתפתחותית מהגורמים האימהיים לאלו של הגנים הזיגוטיים. ה-MZT דורש הפעלה של הגנום הזיגוטי שהיה רדום בתחילה, תהליך הנקרא הפעלת הגנום הזיגוטי (ZGA); הגנים המבוטאים במהלך ZGA נדרשים להגדרת גורל התא המוקדם, גסטרולציה ויצירת ציר 1,2. חשוב לציין ש-ZGA נשמר בכל המטאזואנים, ותזמון ה-ZGA נשלט בקפדנות, אם כי הוא משתנה בין מינים 3,4. דיסרגולציה של ZGA עלולה להוביל להשלכות חמורות, החל ממומים התפתחותיים ועד מוות עוברי, כגון הפלה. לכן, חקר המנגנונים של ZGA חשוב לא רק להבנת יסודות ויסות הגנים, אלא גם בעל השלכות קליניות משמעותיות.

אתגר מרכזי בחקר ZGA היה הדמיה ישירה של ZGA בקנה מידה גדול בעוברים מוקדמים וחקירת המנגנונים שלה ברמת התא היחיד. התגברנו על אתגר זה על ידי פיתוח שיטה המשתמשת בתיוג מטבולי של תמלולים מתפתחים במהלך ZGA עם 5-אתיניל אורידין (5-EU), ולאחר מכן הצמדת RNA של EU-RNA מתהווים לפלואורופורים באמצעות כימיה של קליקים והדמיה בעוברים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, תוך שימוש ב-Xenopus laevis כמודל. העובר הגדול של Xenopus (בקוטר ~1.2 מ"מ) מכיל גרדיאנט בגודל תא, וה-ZGA בקנה מידה גדול מופיע סביב שלבי הבלסטולה האמצעיים (עם התחלה סביב שלב 7 והשיא סביב שלב 9), מה שהופך אותו למודל אידיאלי לחקר דפוסי ZGA5. באמצעות שימוש בתיוג 5-EU בעוברי Xenopus מוקדמים, הצלחנו להמחיש ולכמת ישירות את ה-ZGA בקנה מידה גדול בתאים בודדים של עוברים מוקדמים שלמים, מה שהוביל אותנו לגלות דפוס מרחבי-זמני חדש של ZGA המוסדר בעיקר לפי גודל התא 5,6.

כאן אנו מתארים את פרטי הגישה הזו, שהותאמה מעבודות קודמות עם אופטימיזציות 5,7, כולל קיבוע עוברים לאחר סימון מטבולי של תמלולים מתחילים עם 5-EU, הצמדת RNA של EU-RNA מתהום עם פלואורופור באמצעות תגובת קליק8, וצביעת חיסון לסמנים תת-תאיים, ולאחר מכן ניקוי העוברים להדמיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות עובריות אחרות, כולל דגי זברה 9,10, או להשתמש בריצוף לפרופיל הטרנסקריפטום11 המתהווה, ולתמוך ביישומו הכללי והרחב בסוגי דגימות וניתוחים שונים. בסך הכול, שיטה זו מספקת אמצעי חשוב חדש לחקר מנגנוני ויסות גנום בתאים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבודות בעלי חיים המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום קרוליינה.

1. הכנה לפני תחילת הפרוטוקול

הערה: לפני תחילת הפרוטוקול, הכינו את הפתרונות הבאים באמצעות מים ללא RNase.

  1. הכינו 1× תמיסת מלח טריס-בופר (TBS), pH 7.6: 50 מ"מ טריס-HCl ו-150 מ"מ NaCl. כוון את ה-pH ל-7.6. אחסן בטמפרטורת החדר. תשתמש בבופר תוך חודשיים.
  2. הכינו 1× טריס-באפר סליין עם טווין 20 (TBST), pH 7.6: הוסף טריטון X-100 בריכוז סופי של 0.1% (נפח/נפח) ל-1× TBS (pH 7.6) שהוכן על ידי מים ללא RNase. אחסן בטמפרטורת החדר. השתמש בבופר בתוך חודש.
  3. הכינו 4% פרפורמלדהיד (PFA)/1× MEM: ערבב בקבוקון אחד (10 מ"ל) עם 16% PFA ו-4 מ"ל של 10× MEM (1000 מ"מ 3- (N-מורפולינו)חומצה פרופאןסולפונית [MOPS] pH 7.4, 20 מ"מ EGTA, ו-10 מ"מ MgSO4). הוסף מים ללא RNase ל-40 מ"ל. עליקווט ואחסן בטמפרטורה של -20°C. השתמש בפתרון בתוך 6 חודשים.
  4. הכינו 70%, 50% ו-25% מתנול ב-0.5× SSC: ערבבו מתנול ו-0.5× SSC ב-3:1, 1:1 ו-1:3, בהתאמה. השתמש בפתרון בתוך שישה חודשים.
  5. הכינו תמיסת הלבנה: ערבבו כדי להגיע לריכוז סופי של 2% (vol/vol)H2 O2, 5% (vol/vol) פורמיד, ו-0.5× SSC במים ללא RNase. הכינו את התמיסה הזו ממש לפני השימוש.
  6. הכינו תמיסת חסימה: הוסיפו ריכוז סופי של 10% (נפח/נפח) סרום עזים ו-0.2% (משקל/נפח) BSA ב-1× TBST. אחסנו בטמפרטורה של -20°C. השתמש בפתרון בתוך 6 חודשים.
  7. הכינו תגובת ניקוי BABB: ערבבו חלק אחד של אלכוהול בנזיל (BA) ו-2 חלקים של בנזיל בנזואט (BB). אחסן בטמפרטורת החדר. השתמש בפתרון בתוך 6 חודשים.

2. תיקון עוברים עם 5-EU-מיקרו-הוזרק

  1. כדי להזריק מיקרו-5-אתיניל-אורידין (5-EU) לעוברים חד-תאיים, יש לפעול לפי ההליכים שתוארו קודם11. תנו לעוברים להתפתח לשלבים הרצויים של ZGA, למשל שלב 9 כאשר ZGA מתרחש באופן פעיל ברוב התאים של העובר.
  2. כדי לקבע את העוברים המוזרקים ב-5 מיקרו-EU, הוסף תחילה כ-1.8 מ"ל של 4% PFA/1× MEM לתוך בקבוקון זכוכית סינטילציה של 2 מ"ל. לאחר מכן השתמשו בפיפטה פלסטית להעברת ~20 עוברים לבקבוקון הזכוכית. מזער את כמות המדיום שמוסיפים לבקבוק הזכוכית.
  3. מלאו את בקבוקון הזכוכית למעלה עם תוספת של 4% PFA/1× MEM. סגור את הבקבוקון עם המכסה; אין להשאיר בועות אוויר מאחור.
  4. הנח את בקבוקון הזכוכית על סיבוב וסובב את העובר במהירות נמוכה (למשל, 10 סל"ד) למשך לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר.
  5. השתמש בפיפטה כדי להסיר בזהירות את הקיבוס. מלא את בקבוקון הזכוכית ב-100% מתנול. הנח את בקבוקון הזכוכית על סיבוב וסובב את העוברים במהירות נמוכה למשך 5 דקות.
  6. הסר בזהירות את המתנול והוסיף מתנול חדש. חזור על הסיבוב וההתייבשות לפחות פעמיים כדי שהעוברים יהיו מיובשים לחלוטין.
  7. אחסן את העוברים במתנול בטמפרטורה של מינוס 20°C.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. תנו לעוברים להישאר במתנול לפחות יומיים לפני שממשיכים בצעדים הבאים. ניתן להשתמש בעוברים תוך חודשיים.

3. הצמידת RNA מתהווים עם פלואורופור באמצעות תגובת קליק

  1. כדי להחזיר את העוברים, תחילה מוציאים את המתנול מבקבוקון הזכוכית, ואז מוסיפים 2 מ"ל של 75% מתנול ב-0.5× SSC, וסגרו את הבקבוקון עם המכסה. הנח את בקבוקון הזכוכית על סיבוב וסובב את העוברים במהירות נמוכה למשך 5 דקות.
  2. הסר את הנוזל מבקבוקון הזכוכית אחרי הסיבוב. חזור על השלב לעיל ברצף על ידי שימוש ב-50% מתנול ב-0.5× SSC, 25% מתנול ב-0.5× SSC, ו-0.5× SSC. כדי להחזיר את העוברים לנוזל מלא, חזרו על השטיפה הסופית עם 0.5× SSC לפחות פעמיים.
  3. הוסף 2 מ"ל של תמיסת הלבנה טרייה (2% H,2O2 ו-5% פורמיד ב-0.5× SSC) לבקבוקון. שים את בקבוקון הזכוכית על חתיכת נייר אלומיניום, ואז הנח אותו מתחת לנורת LED במרחק שלא יתחמם את הדגימות.
  4. להלבין את העוברים באור עד שכל הפיגמנטים הופכים ללבנים, שבדרך כלל לוקח 5–6 שעות. שימו לב שבגלל פירוק H2 O2 ל-O2, הוא ייצור בועות אוויר קטנות שיכולות לגרום לעוברים לצוף. בדקו את העוברים מדי פעם (למשל, כל 30 דקות) וסובבו בעדינות את בקבוקון הזכוכית כדי לאפשר להם להתמקם בתמיסת ההלבנה.
  5. הסר בזהירות את הבופר להלבנה. הוסף 2 מ"ל של 0.5× SSC כדי לשטוף את העוברים במהירות. חזור על השטיפה המהירה שוב אם צריך.
  6. הוסף 2 מ"ל של 1× TBST לבקבוקון הזכוכית. הנח את בקבוקון הזכוכית על סיבוב וסובב את העוברים במהירות נמוכה למשך שעה. הסר את הנוזל מבקבוקון הזכוכית אחרי הסיבוב.
  7. חזור על השלב למעלה לפחות 5 פעמים. יש לשים לב ששטיפה יסודית של העוברים היא קריטית לשלבים הבאים.
  8. הוסיפו 2 מ"ל של 1× TBS לבקבוקון הזכוכית. הנח את בקבוקון הזכוכית על סיבוב וסובב את העוברים במהירות נמוכה למשך 5 דקות. הסר את הנוזל מבקבוקון הזכוכית אחרי הסיבוב.
  9. חזור על השלב למעלה שוב.
  10. הכינו את התערובת לתגובת קליק בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל על ידי הוספת החומרים הבאים כדי להגיע לריכוזים הסופיים של 100 מ"מ טריס-HCl (pH 8.5), 1 מ"מ CuSO4, 25 מיקרומום טטראמתילרודאמין (TAMRA)-אזיד, ו-100 מ"מ חומצה אסקורבית. הוסיפו חומצה אסקורבית אחרונה לתגובה. פיפט למעלה ולמטה כדי לערבב טוב.
  11. הוסיפו 200 מיקרולטר תערובת תגובה לעוברים בבקבוקון הזכוכית. ודא שנפח תערובת התגובה מספיק כדי לטבול את כל העוברים בבקבוקון. דגרו במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
  12. הסר בזהירות את תערובת תגובת הקליק. יש לשים לב שניתן לראות פלואורסצנציה לא ספציפית על העוברים. שטוף במהירות את העוברים פעמיים עם 1× TBST, ואז שטוף אותם ב-1× TBST לפחות 5 פעמים, תוך החלפת התמיסה כל שעה כפי שתואר למעלה.
  13. המשיכו לשטוף את העוברים על ידי החלפת 1× TBST כל שעתיים, והשאירו אותם ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על סיבוב. להפסיק לשטוף כשכמעט לא נראה פלואורסצנציה לא ספציפית. שימו לב שמכיוון שהשאריות מתגובת הלחיצה עלולות להזיק לצביעת חיסון בהמשך, ודאו שהעוברים נשטפים היטב במשך יום–יומיים לפני הממשיכים לצעדים הבאים.

4. צביעת חיסון של עוברים עם סמנים תת-תאיים (אופציונלי)

  1. כדי לחסום את העוברים, הסר את 1× TBST מבקבוקון הזכוכית בשלב השטיפה האחרון למעלה, והוסיף 200 מיקרוליטר מתמיסת החסימה (10% סרום עזים/0.2% BSA/1× TBST). עטוף את בקבוקון הזכוכית בחתיכת נייר אלומיניום כדי להגן על העוברים מאור. הנח את בקבוקון הזכוכית על נוטאטור ונער בעדינות את העוברים לפחות שעה בטמפרטורת החדר (או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס).
  2. מדלל את הנוגדן הראשי (למשל, נוגדן אנטי-H3) ב-1:1,000 ב-200 מיקרוליטר של 10% סרום עזים/1× TBST. הוסיפו את הנוגדן המדולל לבקבוקון זכוכית ועטפו את הבקבוקון בחתיכת נייר אלומיניום. דגרו את העוברים בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על נוטאטור במהירות נמוכה.
  3. הסר בזהירות את הנוגדן מבקבוקון הזכוכית. שטוף במהירות את העוברים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של 1× TBST לבקבוקון הזכוכית והסרתו.
  4. הוסף 2 מ"ל של 1× TBST לבקבוקון הזכוכית, ואז עטוף אותו בחתיכת נייר אלומיניום. הנח את בקבוקון הזכוכית על סיבוב וסובב את העוברים במהירות נמוכה למשך שעה. הסר את הנוזל מבקבוקון הזכוכית אחרי הסיבוב.
  5. חזור על השלב למעלה לפחות 5 פעמים.
  6. לדלל את הנוגדן המשני (למשל, נוגדן ארנב Alex Fluor 488) ב-1:1,000 ב-200 מיקרוליטר של 10% סרום עזים/1× TBST. אם יש צורך בצביעת DNA, יש לדלל את צבע ה-DNA (למשל, TO-PRO-3) יחד עם הנוגדן המשני.
  7. הוסיפו את הנוגדן המדולל לבקבוקון זכוכית ועטפו אותו בנייר אלומיניום. דגרו את העוברים בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על נוטאטור במהירות נמוכה.
  8. הסר בזהירות את הנוגדן מבקבוקון הזכוכית. שטוף במהירות את העוברים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של 1× TBST לבקבוקון הזכוכית והסרתו.
  9. הוסף 2 מ"ל של 1× TBST לבקבוקון הזכוכית, ואז עטוף אותו בחתיכת נייר אלומיניום. הנח את בקבוקון הזכוכית על סיבוב וסובב את העוברים במהירות נמוכה למשך שעה.
  10. חזור על השלב למעלה לפחות 5 פעמים.

5. ניקוי עוברים לפני הדמיה קונפוקלית

  1. כדי לייבש את העוברים, הסר בזהירות את הבופר מבקבוק הזכוכית לאחר השטיפה הסופית, והוסיף 2 מ"ל של 100% מתנול. עטוף את בקבוקון הזכוכית בנייר אלומיניום, הנח אותו על סיבוב, ותן לעוברים להסתובב במהירות נמוכה למשך 5 דקות. הסר את הנוזל מבקבוקון הזכוכית אחרי הסיבוב.
  2. חזור על השלב למעלה לפחות 5 פעמים.
  3. כדי לייבש את העוברים לחלוטין, חזרו על השלב הנ״ל לפחות 5 פעמים תוך שימוש ב-2 מ"ל של 100% מתנול חסר מים.
  4. הסר בזהירות כמה שיותר מתנול מבקבוק הזכוכית.
  5. השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף לאט 500 מיקרוליטר מחומר הניקוי BABB לתוך הבקבוקון. העוברים יצופים ב-BABB ויחכו 10 דקות עד שכל העוברים יתיישבו בתחתית הבקבוקון. שימו לב שהעוברים יהפכו כמעט לבלתי נראים, ויש להסיר בזהירות את ה-BABB מבלי לפגוע בעוברים.
  6. חזור על השלב הנ״ל לפחות פעמיים נוספות, או עד שלא ייראו קווי שלירן. כדי לנקות את העוברים לחלוטין, יש להשאיר אותם ב-BABB למשך יום–יומיים לפני ההדמיה.
  7. צרו תאי הדמיה על ידי חיתוך ריבוע קטן (למשל, ~5 מ"מ × 5 מ"מ) מסרט ה-VHB בעובי ~ 1.1-1.2 מ"מ (דומה לגודל העובר) וגודל ~10 מ"מ × 10 מ"מ, ולאחר מכן הדבקתו על זכוכית כיסוי בגודל 24 מ"מ × 40 מ"מ.
  8. העבר בזהירות את העוברים שנוקו לתוך התא, ואז כסו אותם בכוס כיסוי נוספת. העוברים יהיו בתוך הכריך של משקפי כיסוי כדי שניתן יהיה לצלם את שני הצדדים.
  9. בצע הדמיה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עוברים של Xenopus laevis בשלב התא היחיד הוזרקו מיקרו עם 5-EU, ועוברים בשלב 9 היו קבועים כאשר התרחש ZGA בקנה מידה גדול ברחבי העובר. העוברים עובדו בהתאם לפרוטוקול כפי שתואר לעיל. RNA מתפתחים בעוברים סומנו ב-TAMRA-אזיד באמצעות תגובת קליק, היסטון H3 סומן באמצעות נוגדן אנטי-היסטון H3, ו-DNA סומן ב-TO-PRO-3. העוברים צולמו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרת 10×. כפי שמוצג באיור 1, ה-EU-RNA המתהווים (באדום) זוהו בגרעינים של התאים העובריים, עבורם H3 (בירוק)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ZGA מייצג אחד המעברים הקריטיים ביותר בשלבים הראשונים של התפתחות העובר 2,3. כאן תיארנו נהלים מפורטים להכנת דגימות להמחשה ישירה של ZGA בעוברים מוקדמים של Xenopus במלואם, כולל קיבוע עוברים שהוזרקו ב-5-EU, הצמידת RNA מתהווים עם פלואורופור באמצעות תגובת קליק, צביעת סמנים תת-תאיים לאחר תגובת הקליק, ופינוי עוברים להדמיה קונפוקלית7. מכיוון שכמות ה-5-EU המשולבת פרופורציונלית לשעתוק המתמשך, עוצמת אות הפלואו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים למעבדת מתיו גוד באוניברסיטת פנסילבניה על ההכשרה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד וההתפתחות האנושית ע"ש יוניס קנדי שרייבר (R03HD105802).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16% פאראפורמלדהיד (PFA)EMS15710-Sליצירת הפתרון הקיבעוני
20&00; SSCמדיאטקMT46-020-CMלהכנת תמיסת ההלבנה
מיקסר נואטינג תלת-ממדיVWR76595-802לעוברים מטורפים
בקבוקוני ברג בקוטר 9 מ"מ (2 מ"ל)VWR46610-722לעיבוד עוברים
נוגדן H3 אנטי-היסטוןאבקאםab1791לצביעת חיסון
חומצה אסקורביתסיגמא-אלדריץ'A7506על יצירת תגובת הקליק
אלכוהול בנזילסיגמא-אלדריץ'305197לניקוי עוברים
בנזיל בנזואטאקרוס אורגניקס105860010לניקוי עוברים
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אלדריץ'A3059ליצירת פתרון החסימה
קבלים לבקבוקי בורג 9 מ"מ (2 מ"ל)VWR46610-712לעיבוד עוברים
זכוכית כיסוי (24 מ"מ ופ; 40 מ"מ)VWR48393-060ליצירת תא הדמיה
CuSO4סיגמא-אלדריץ'61230על יצירת תגובת הקליק
אתילנביס (אוקסיתילניטרילו) חומצה טטראצטית (EGTA)תרמו פישר סיינטיפיקAC409915000ליצירת הפתרון הקיבעוני
Fiji ImageJNIHלעיבוד תמונות
פורמידתרמו פישר סיינטיפיקAC181090010להכנת תמיסת ההלבנה
פיפטות זכוכית פסטרVWR14673-010להעברת BABB
נוגדן משני נגד עזים אלכס פלואר 488תרמו פישר סיינטיפיקA27034לצביעת חיסון
סרום עזיםאבקאםab7481ליצירת פתרון החסימה
מי חמצןסיגמא-אלדריץ'H1009להכנת תמיסת ההלבנה
מגנזיום סולפט (MgSO4)תרמו פישר סיינטיפיקM65-500ליצירת הפתרון הקיבעוני
מתנולתרמו פישר סיינטיפיקA4524לייבוש עוברים
מתנול, חסר מיםסיגמא-אלדריץ'322415לייבוש עוברים
MOPSתרמו פישר סיינטיפיקAC172631000ליצירת הפתרון הקיבעוני
מערבל נואטינג רב-מצביVWR76595-812לעוברים מטורפים
פיפטת העברה מפלסטיקתרמו פישר סיינטיפיק13-711-9AMלהעברת עוברים
להב סכין גילוחתרמו פישר סיינטיפיק18-100-970לחיתוך סרטים
מים ללא RNaseתרמו פישר סיינטיפיקBP561-1ליצירת פתרונות ללא RNASE
Roto-Mini PLUS (רוטטור)VWR470313-912להעברת עוברים
טטרמתילרודאמין (TAMRA)-אזידאבקאםAB146486על יצירת תגובת הקליק
TO-PRO-3תרמו פישר סיינטיפיקT3605לצביעת DNA
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'10789704001להכנת בופר הכביסה
בסיס טריזמה (בסיס טריס)סיגמא-אלדריץ'T1503ליצירת בופר טריס
קלטות VHB 3M GPH-110GF (45 מ"ל)VWR76524-608ליצירת תא הדמיה
מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 700צייסלהדמיה קונפוקלית

מקורות

  1. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  5. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  6. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  7. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in whole-mount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  8. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  9. Chan, S. H., et al. Brd4 and P300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  10. Adar-Levor, S., et al. Cytokinetic abscission is part of the midblastula transition in early zebrafish embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (15), e2021210118(2021).
  11. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח תאי יחידעובריות מוקדמתמעבר אימהי-זיגוטיסימון תמלילים ראשוניים5-Ethynyl Uridineכימיה של לחיצה (Click Chemistry)מיקרוסקופיה קונפוקליתעוברים של Xenopus laevisבקרה גנומית
המחשת הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים של עוברים מוקדמים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.