מאמר שיטה

מניפולציה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים של Xenopus

213 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70602

⸱

10 באפריל 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטת היצרה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים מעוברים חד-תאיים של Xenopus laevis .

תקציר

מאפיין מגדיר של אמבריוגנזה מוקדמת הוא הירידה המהירה והאקספוננציאלית בגודל התא הבודד בעוד שנפח העובר הכולל נשאר קבוע. יחס הנוקלאוציטופלזמה (N:C) ממלא תפקיד קריטי בוויסות פעילויות תאיות ומולקולריות החיוניות לעובריות מוקדמת. מניפולציה פיזית של גודל העובר, אם כן, מהווה דרך חשובה לחקור מנגנוני התפתחות אלו. הגודל הגדול (~ 1.2 מ"מ בקוטר) והפלסטיות ההתפתחותית הגבוהה של העוברים המוקדמים של Xenopus laevis הופכים אותם למודל אידיאלי לניתוח פיזי ומניפולציה לבחינת מנגנוני ההתפתחות. כאן, אנו מתארים גישה ליצירת עוברים מיניאטוריים עם נפח ציטופלזמי משתנה ויחס N:C על ידי היצרת עוברים חד-תאיים של Xenopus laevis עם קשרי שיער. העוברים הקטנים שנוצרו הוכחו כמי שמתחילים הפעלה מוקדמת של הגנום הזיגוטי (ZGA) הנגרמת ישירות מהקטנת גודל התא וצמיחת יחס N:C. עוברים מיניאטוריים אלה, שניתן להכליל אותם למערכות עובריות אחרות, מספקים כלי ייחודי ועוצמתי לפירוק מנגנונים מתווכים בגודל בהתפתחות העובריים המוקדמת.

מבוא

אחת התכונות הבולטות ביותר של אמבריוגנזה מוקדמת היא ההפחתה האקספוננציאלית של גודל התא הבודד בתוך עובר השומרת על נפח קבוע. סינתזת DNA מהירה והפחתת גודל התא מובילות לעלייה ביחס הנוקלאוציטופלזמה (יחס N:C), שמשחק תפקיד חשוב בוויסות מספר פעילויות מובחנות של מעבר לבלסטולה אמצעית (MBT) במערכות עובריות מודליות, כולל שעתוק גנים זיגוטי, הארכת מחזור התא ותנועתיות תא 1,2,3,4 . מניפולציות של יחס N:C על ידי שינוי פלואידיית DNA תומכות בחשיבותו התפקודית בתהליך העובר המוקדם במספר מערכות מודל 3,4,5,6.

מניפולציה פיזית של גודל העובר מהווה טכניקה חשובה לחקר מנגנוני רגולציה בהתפתחות העוברית המוקדמת7. הסרה ציטופלזמית באמצעות שאיבה, המשנה את יחס ה-N:C בעוברים מוקדמים בעכברים, גורמת לדחיסה מוקדמת8. יתרה מזאת, הפחתת גודל העובר של דג הזברה באמצעות חיתוך גילתה מנגנון חדש מבוסס גרדיאנט של קנה מידה סומיט9. יתרה מזאת, הפחתת נפח הציטופלזמה בעוברי Xenopus חשפה דינמיקת מחזור תאים התלויה ביחס N:C10. חשוב לציין, על ידי יצירת עוברים מיניאמורים של Xenopus באמצעות הפחתת גודל התא ותיוג תמלילים מתחילים עם 5-אתיניל-אורידין (5-EU) בתאים בודדים, הראינו כי הפחתת גודל התא מעוררת הפעלה של הגנום הזיגוטי (ZGA) באופן תלוי במינון11. תוצאות אלו תומכות בתפקיד הקריטי של גודל התא בתהליך העובר המוקדם.

כאן, אנו מתארים הליך מפורט ליצירת עוברים קטנים של Xenopus laevis באמצעות מניפולציה פיזית באמצעות קשרי שיער (איור 1)10,11. גישה זו בונה על השימוש הבסיסי של ניופורט וקירשנר (1982) בכיווץ לולאת שיער בעוברי Xenopus 1 המוקדמים, ומספקת פרוטוקול ברור ואמין ליצירת עוברים קטנים ככלים ניסיוניים. בנוסף, שיטה זו מתאימהלמערכות עובריות נוספות, מה שיאפשר גילוי מנגנונים חדשים של עובריות מוקדמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבודות בעלי חיים המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום קרוליינה.

1. הכנת חומרים

  1. הכנת פתרונות
    1. הכינו 20× MMR על ידי ערבוב 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, ו-40 mM CaCl2. כוון את ה-pH ל-7.8 עם NaOH. אוטוקלב ואחסן בטמפרטורת החדר.
    2. הכינו תמיסה עם מדיום גרדיאנט צפיפות של 3% (משקל/נפח) על ידי ערבוב של 1.5 גרם מדיום גרדיאנט צפיפות ל-50 מ"ל של 0.5× MMR. ערבבו בעדינות עם מוט ערבוב מגנטי עד שהפולימר נמס. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    3. הכינו ג'ל אגרוז 1% בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ על ידי ערבוב 0.5 גרם אגרוז ל-50 מ"ל של 0.1× MMR. חממו במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז, ואז מוסיפים 5 מ"ל אגרוז כדי לצפות את תחתית תבנית פטרי בקוטר 60 מ"מ בשכבה דקה.
  2. הכנת קשרי שיער לעוברים מתכווצים
    1. קח כמה שערות דקות וחתוך אותן לחתיכות ~5 ס"מ.
    2. השתמש בפינצטה כדי להכניס קצה אחד של השיער לקצה P10 בעומק של כ-~1 ס"מ.
    3. שים שעווה על כף וחמם אותה כדי להמיס את השעווה. טבלו במהירות את קצה ה-P10 שמחובר לשיער בשעווה, ותנו לה להתייבש למשך דקה. ודא שהשיער מקובע בקצה קצה ה-P10.
    4. השתמש בפינצטה כדי ליצור בזהירות קשר מעל השיער. כוון את גודל הלולאה ל-~1.5 מ"מ. גזם את הבולט אם צריך. שים את הקשר בצד לשימוש עתידי.
    5. חזור על השלבים הנ״ל כדי ליצור יותר קשרי שיער לפי הצורך.

2. יצירת עוברים מיניאטוריים של Xenopus

  1. כדי לקבל עוברים של Xenopus , יש לעקוב אחרי פרוטוקול סטנדרטי לביצוע הפריה חוץ-גופית (IVF) (לדוגמה, ראו Sive et al., 2007)12. העובר אמור להיות ב-0.1× MMR, מוכן לשימוש.
  2. כדי לדמיין ZGA בתאים בודדים של עוברים מוקדמים ולחקור את מנגנוני הרגולציה שלהם, הזרקה מיקרו-מזריקה לעוברים בשלב תא אחד עם 5-אתיניל-אורידין (5-EU) כדי לסמן מטבולית את התמלולים המתחילים11,13 לפני המשך ההליכים הבאים.
  3. כאשר עוברים נמצאים ~שעה לאחר ההפריה (hpf), השתמשו בפיפטה פלסטית להעברת ~20 עוברים בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ (מכוסה בג'ל אגרוז 1%) המכילה ~15 מ"ל מדיום מדיום גרדיאנט צפיפות 3% / 0.5× MMR.
  4. השתמשו בפינצטה ביד אחת כדי לסובב עובר בזווית של ~45–60 מעלות תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להגיע לקוטב הצמחי (חצי הכדור החיוור). החזק את העובר המוטה עם פינצטה והשתמש במחט של 30 גרם ביד השנייה כדי לנקב בזהירות את עמוד הצמח. שחרר קצת ציטופלזמה על ידי לחיצה עדינה על העובר.
  5. כסו בזהירות קשר שיער המותקן בקצה P10 על העובר כך שהמוט החייתי (חצי הכדור האפל) יהיה בתוך קשר השיער. התאימו את מיקום הקשר לפי גודל העובר המיני הרצוי.
  6. החזק את פיפטת P10 ביד אחת והשתמש בפינצטה ביד השנייה כדי למשוך את שני קצות הקשר בכיוונים מנוגדים. קשר השיער יתהדק סביב העובר, בין הקוטב הצמחי (שלם) לקוטב הצמחוני (עם שחרור הציטופלזמה). חתוך את קשר השיער במקום שבו הוא מתחבר לקצה ה-P10.
  7. חזור על השלבים 2.4–2.6 למעלה כדי ליצור את כמות העוברים המיניאטוריים הרצויה.
  8. תנו לעוברים להישאר במדיום גרדיאנט צפיפות של 3% / 0.5× MMR למשך ~1–2 שעות. לאחר מכן, הסר את המדיום עם פיפטת P1000 מבלי להפריע לעוברים וממלא מחדש ב-15 מ"ל של 0.1× MMR.
  9. תנו לעוברים להתפתח לשלבים הרצויים, ואז השתמשו בפינצטה כדי להסיר בזהירות את הקשרים מהעוברים המיניאטוריים.
  10. אסוף את העוברים לניתוח רצוי, כמו המחשת ה-ZGA בתאיםבודדים 11,13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עוברי Xenopus laevis בשלב התא היחיד היו מכווצים עם קשרי השיער כפי שתואר לעיל. העוברים הבקר והמיני-עוברים בשלב ~9 (8.5 כוחות סוס ב-23 מעלות צלזיוס) צולמו תחת מיקרוסקופ סטריאו. כפי שמוצג באיור 2, הנפח של חלק מהעוברים המיניאטוריים הוא ~1/3 מהנפח של עוברי הביקורת. תוצאה זו מצביעה על כך שניתן למניפולציה של עוברי Xenopus המוקדמים ליצירת עוברים מיניאטורים, מה שמספק מודל ייחודי לחקר השפעת גודל התא על הדינמיקה של מחזור התא10 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת עוברים מיניאטוריים ב-Xenopus על ידי היצרה פיזית של עוברים בשלב תא אחד עם קשרי שיער. גישה זו מספקת ראיות ישירות לכך שהקטנת גודל התא גורמת ל-ZGA בעובר מודל11.

מספר היבטים של פרוטוקול זה קריטיים ליצירת עוברים קטנים בהצלחה. כדי ליצור קשרי שיער, חשוב להשתמש בשיער דק ועמיד, רצוי של תינוקות. ככל שהשערות עבות ושבריריות יותר, כך קשה יותר ליצור או להשתמש בקשרים. יתרה מזאת, יש להימנע מטיפול בצבעי שיער או מרככים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים למעבדת מתיו גוד באוניברסיטת פנסילבניה על מתן ההכשרה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד וההתפתחות האנושית ע"ש יוניס קנדי שרייבר (R03HD105802).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 30-GBD Medical305128לניקוב עוברים
צלחות פטרי חד-פעמיות בקוטר 60 מ"מVWR25384-092לדגירה של עוברים
מיקרוסקופים סטריאוסקופים זום ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130להמחשת עוברים
אגרוזסיגמא-אלדריץ'A-9414לציפוי צלחות פטרי
פינצטה דומונט, סגנון 5מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים72701-Dלכיוונון והחזקת עוברים
Ficoll 400סיגמא-אלדריץ'GE17-0300-10לדגירה של עוברים
טיפ פיפט TipOne, גיל 10 ומיקרו; LUSA Scientific1111-3700להרכבת קשרי השיער
בלוק שעווה, שחורחברת קרוליינה ביולוגיה סופליי974228להרכבת קשרי השיער

מקורות

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים