סרטן השד התוך-גולגולתי גרורות מוח מודל עכבר לאפיון תאי חיסון וסטרומלים במנינגות ובפקעת ריח

סיכום

הפרוטוקול קובע גרורות מוח של סרטן השד באמצעות חיסון תוך-גולגולתי ומאפיין באמצעות ציטומטריית זרימה, תת-קבוצות מפתח של תאי לימפה ומערכת החיסון המווסתות את מערכת החיסון המוחית. ניתוחים אלו מספקים תובנות על הדינמיקה החיסונית ותאי הסטרומל שמעצבות את מיקרו-סביבת המוח, ומנחים פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

תקציר

מערכת העצבים המרכזית (CNS) מוקפת בממשקים חיסוניים מיוחדים, כולל קרום המוח והפקעת הריחנית, שיכולים לשמש הן כנתיבים מתירים להתיישבות גרורתיות והן כנקודות כניסה לתגובות חיסוניות אנטי-גידוליות. הבנת האופן שבו דינמיקת תאי החיסון מתפתחת בתוך מבנים אלו במהלך התקדמות הגרורות היא חיונית לזיהוי מנגנונים התומכים או מגבילים את צמיחת הגידולים במוח. פרוטוקול זה מפרט את הקמת מודל עכברים לסרטן השד (BCBM) באמצעות הזרקה תוך-גולגולתית של תאי סרטן השד E0771 לעכברים C57BL/6. לאחר התפתחות הגידול, קרום המוח והפקעת הריחית מפורקים בקפידה, מתעכלים אנזימטית ומעובדים לתלייה חד-תאית. אוכלוסיות אלו מנותחות באמצעות ציטומטריית זרימה ספקטרלית רב-פרמטרית כדי לאפיין באופן מקיף תת-קבוצות תאי לימפואידים, מיאלואידים וסטרומלים בתוך נישות חיסוניות הקשורות למערכת העצבים המרכזית. תהליך עבודה זה מאפשר ניתוחים השוואתיים בין בקרות נושאות גידול לאלו שאינן גידוליות, ומזהות שינויים בממשקי החיסון של מערכת העצבים המרכזית שעשויים להוות בסיס להתחמקות חיסונית ולייצג מטרות טיפוליות פוטנציאליות. בסך הכול, הפרוטוקול מספק גישה ניתנת לשחזור לחקר BCBM ולבחינת ויסות החיסון בממשקים בין מערכת החיסון למערכת החיסון ההיקפית. ניתן להתאים אותו לקווי תאים סרטניים נוספים, אימונותרפיות או מודלים גנטיים לעכברים כדי לחקור מנגנוני עמידות חיסונית ותגובה טיפולית בתוך מיקרו-סביבת המוח.

מבוא

גרורות מוח הן הגידולים הממאירים הנפוצים ביותר המשפיעים על מערכת העצבים המרכזית (CNS), ומתרחשים בתדירות גבוהה יותר מגידולי מוח ראשוניים. סרטן ריאות, סרטן השד ומלנומה הם סוגי הסרטן העיקריים שמתפשטים^לרוב למוח. מבין אלה, גרורות מוח בסרטן השד (BCBM) מהוות אתגר קליני משמעותי, המשפיעות על 10%–30% מהמטופלות עם מחלה גרורתית ומראות שכיחות גוברת בעקבות טיפולים מערכתיים משופרים והתקדמות בהדמיה מוחית². הפרוגנוזה אצל חולי BCBM נותרת חלשה, שכן טיפולים זמינים – כולל ניתוח, רדיותרפיה וכימותרפיה – הם ברובם פליאטיביים, ותסמינים נוירולוגיים משפיעים קשות על איכות החיים³. למרות שטיפולים ממוקדים ואימונותרפיות נחקרים כאסטרטגיות משלימות, התועלת הקלינית של אימונותרפיה בגרורות מוח נותרת מוגבלת ^4,5,6.

עבודות עדכניות חידדו את הבנתנו את מערכת החיסון המוחי ואת העניין מחדש במסלולים לימפתיים תפקודיים הקשורים למערכת העצבים המרכזית, כולל כלי הלימפה בקרום המוח⁷ ורירית האף⁸. מבנים אלו יוצרים רשת לימפה רציפה שמקיפה את המוח ומתפרסת בסמוך לפקעת הריח וללוח הקריבריפורם, ולבסוף מתחברת לבלוטות הלימפה הצוואריות. מערכת זו ממלאת תפקידים מרכזיים בהומאוסטזיס נוזלים, במעקב חיסוני ובתנועת תאי חיסון בין מערכת העצבים המרכזית לאיברי הלימפה ההיקפיים^. ככל שהעניין בגישות אימונותרפיות לגידולים במוח וגרורות גובר, הממשקים הלימפתיים-חיסוניים הללו מתגלים כנתיבים מבטיחים, אך עדיין לא נחקרו מספיק, שבאמצעותם מערכת החיסון עשויה לתקשר עם נגעים תוך-גולגולתיים. בנוסף, המנגנונים השולטים בגיוס תאי מערכת החיסון למיקרו-סביבת גידולי המוח וכיצד תאים אלה מתקשרים בסביבה הייחודית הזו עדיין אינם מובנים היטב. יחד, פערים אלו מדגישים את הצורך במודלים ופרוצדורות פרה-קליניות המאפשרים ניתוח מקיף של אינטראקציות גידול-חיסון ותומכים בפיתוח אסטרטגיות לשיפור החסינות נגד גידולים נגד גרורות מוח.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשלב יצירת מודל עכבר BCBM חיסוני שניתן לשחזור באמצעות חיסון תוך-גולגולתי סטריאוטקסי של תאי E0771 עם בידוד וניתוק של קרום המוח והפקעת הריח לאימונופנוטיפ באמצעות ציטומטריית זרימה ספקטרלית. גישה זו מאפשרת מידול מבוקר של BCBM כדי להעריך את בטיחות ויעילות ההתערבויות הטיפוליות ומאפשרת אפיון מעמיק של אוכלוסיות החיסון והסטרומליות בממשק הלימפתי-חיסוני של המוח, ומספקת תובנות לגבי השחקנים התאים המעצבים את מיקרו-סביבת גידול המוח ומשפיעים על תגובות הטיפול.

מודלים של בעלי חיים נשארים חיוניים לחקר גרורות במוח, שכן היבטים קריטיים רבים של התקדמות גרורות אינם ניתנים לשכפול במבחנה. פותחו מספר מודלים של עכברים במצב חי ליצירת גרורות מוח, כל אחת עם יתרונות ומגבלות ספציפיים¹⁰. מודלים של גרורות ספונטניות, כולל השתלה אורתוטופית או מודלים מהונדסים גנטית של עכברים, מחקים בצורה קרובה יותר התקדמות מחלה קלינית אך לעיתים נדירות יוצרים נגעים תוך-גולגולתיים, דורשים לוחות זמנים ניסיוניים ארוכים, ולעיתים קרובות מניבים שונות גבוהה בשל מחלות חוץ-גולגולתיות נרחבות. גישות מערכתיות, כולל הזרקות תוך-לבבי, תוך-קרוטידי או זריקות זנב, מכניסות תאי גידול למחזור הדם ומדמות טוב יותר הפצה המטוגנית, אקסטרווזציה של מחסומי דם-מוח וקולוניזציה. עם זאת, מודלים אלו אינם תופסים את השלבים הראשונים של פלישת הגידול הראשוני ולעיתים קרובות מייצרים גרורות חוץ-גולגולתיות נרחבות ומשתנות, במיוחד בריאות. מבין המודלים המערכתיים, להזרקה תוך-קרוטידית יש את השונות הנמוכה ביותר, אך היא דורשת מומחיות כירורגית מתקדמת. לחילופין, הזרקה תוך-גולגולתית מציעה מספר יתרונות, כולל שליטה מדויקת במיקום הגידול, התפתחות מהירה וניתנת לשחזור גידול, והפחתת שונות בין ניסויים. גישה זו עשויה להיות גם מושלמת על ידי השתלת גידול ראשוני אורטופופי ואחריה כריתה כירורגית, כדי לחקות בצורה מדויקת יותר את מהלך הגרורות. למרות שהזרקה תוך-גולגולתית אינה משחזרת את כל מפל הגרורות ואינה מתאימה לחקר פלישה והפצה מוקדמת, היא מספקת מודל חזק להערכת יעילות טיפולית נגד נגעים מבוססים ולבחינת אינטראקציות בתוך מיקרו-סביבת המוח. מגבלה ידועה היא שההזרקה עצמה עלולה לגרום לדלקת עצבית מקומית, שעלולה להשפיע על קריאות מערכת החיסון, שניתן להעריך אותן על ידי השוואת פרופיל חיסון בעכברים שהוזרקו ולא הוזרקו.

האפיון החיסוני של קרום המוח והפקעת הריחית נותר תחום מחקר יחסית חדש ופחות נחקר. רוב המחקרים מסתמכים על דגימות¹¹ של בלוטת לימפה במוח או צוואר הרחם, שאינן מצליחות ללכוד את הרכב התאים הייחודי ואת תפקודי החיסון המיוחדים של רקמות אלו הקשורות ללימפה. שיקום שני המבנים מספק מבט רחב ומעשיר יותר על מערכת החיסון המוחית. כאשר משולבים עם ציטומטריית זרימה ספקטרלית רב-פרמטרית, זרימת עבודה זו תומכת בפרופילינג מהיר של אוכלוסיות תאי חיסון רבות ונדירות המעורבות בתקשורת חיסונית היקפית בין מערכת העצבים המרכזית. זה כולל כימות של סמנים פני שטח ותוך-תאים לזיהוי תת-קבוצות תאים, הערכת מצבי הפעלה והערכת שינויים שנגרמו על ידי טיפול. שיטות נוספות לניתוח מערכת החיסון של מערכת העצבים המרכזית שאינן מכוסות בפרוטוקול זה כוללות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ואימונופלואורסצנציה (IF), אשר שומרות על התפלגות מרחבית של תאי החיסון אך מוגבלות על ידי ריבוב סמנים נמוך, כימות סובייקטיבי וייצוג חסר של סוגי תאים נדירים¹². לאחרונה, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) הרחיב את היכולת לפרופיל אוכלוסיות חיסוניות במערכת העצבים המרכזית על ידי גילוי מצבים תאיים ותוכניות שעתוק ברזולוציה גבוהה. למרות שמספק תובנות טרנסקריפטומיות חזקות, scRNA-seq מוגבל על ידי עלות, ארטיפקטים של דיסוציאציה, ניתוק תמלול ואובדן רזולוציה ברמת חלבון^13,14. ציטומטריית זרימה, אף שהיא חסרת ניתוח מרחבי ורגישה להשפעות הקשורות לדיסוציאציה, מציעה רזולוציה פנוטיפית גבוהה יותר באמצעות פאנל רב-פרמטרי מתקדם ומספקת פרופיל חיסון כמותי חזק.

ביחד, המתודולוגיות המתוארות כאן מספקות פלטפורמה גמישה ועוצמתית למידול BCBM ולבחינת דינמיקת החיסון בממשקי הלימפה של מערכת העצבים המרכזית, התומכות בפיתוח פרה-קליני של טיפולים המיועדים הן למיקרו-סביבת גידולי המוח והן למסלולי הוויסות החיסונית הנלווים לו.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הפקולטה לרוקחות, אוניברסיטת ליסבון. הפרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי הרשות המוסמכת הפורטוגזית להגנת בעלי חיים, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (הפניה 0421/000/000/2021).

1. הכנת תאי E0771 להשתלה ב-in vivo

1. במכסה סטרילי, תרבית תאי E0771 בבקבוקון T75 באמצעות Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת של 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% (v/v) פניצילין וסטרפטומיצין (PEST).
   1. ודאו שהתאים מאומתים באמצעות פרופיל STR עם קבלת הספק ומאומתים ללא מיקופלזמה באמצעות בדיקות שגרתיות. תרב תאי גידול לפחות ל-2–8 מעברים לאחר הפשרת המוח.
2. ביום ההשתלה, ודאו שהתאים בריאים ו-80-90% מתלכדים. הסר את המדיום ושוטף תאים עם מלח מפופר פוספט (PBS).
3. הוסיפו טריפסין לבקבוק ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו פי שלושה נפח של מדיום מווסף (DMEM עם 10% v/v FBS ו-1% v/v PEST) כדי לנטרל טריפסין ולנתק תאים.
4. להעביר תאים לצינור ולצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הסר את הסופרנטנט ותשהה מחדש את הכדור ב-PBS לספירת תאים.
5. צנטריפוגה שוב (300 x g ל-5 דקות), משליכים סופרנאנט, ומשלים מחדש תאים ב-PBS בריכוז של 1 x 10⁵ E0771 תאי E0771 ב-2 מיקרוליטר לכל בעל חיים. השאר את תליית התא על קרח עד לחיסון הגידול. הכינו את תליית התא מיד לפני ההזרקה.

2. חיסון גידול תוך-גולגולתי באמצעות מכשיר סטריאוטקסי

1. יש להשיג נקבות C57BL/6 עכברים (6-8 שבועות) ולהתרגל למוסד בעלי החיים לפחות 7 ימים לפני הניתוח. שמור על עכברי בית בתנאים מבוקרים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וספק אוכל ומים לפי רצון.
   הערה: מומלץ לפחות חמישה בעלי חיים לכל קבוצת ניסוי כדי להבטיח עוצמה סטטיסטית מספקת לפרופיילינג חיסוני השוואתי משמעותי בין מצבים נושאי גידול למצב בקרה.
2. הכינו את שדה הניתוח ואת כל החומרים הנדרשים לפני תחילת ההליך:
   1. כלי ניתוח: להבי סכין, מספריים, מלקחיים, מחזיקי מחטים, חוט תפירה.
   2. ציוד ואחרים: מכשיר סטריאוטקסי, מזרק זכוכית, מקדחה, מכונת גילוח, מטליות כותנה, משטח חימום.
   3. הרדמה: הכינו קטמין-זילזין (K-X) (25 מ"ג/מ"ל ו-2 מ"ג/מ"ל, בהתאמה) ב-PBS בצינור של 15 מ"ל.
   4. הקלה בכאבים: הכינו בופרנורפין ב-15 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS בצינור של 15 מ"ל.
   5. פתרונות נוספים: פובידון-יוד, מי חמצן 3% V/V (H2 O₂), משחה עינית.
      אזהרה: H2_{O 2} מזיק אם נבלע ועלול לגרום לגירוי בעור.
3. הרדמה את העכבר על ידי הזרקה תוך-פריטוניאלית (i.p.) של K-X (100 מיקרוליטר ל-10 גרם משקל גוף). אשר הרדמה מספקת על ידי היעדר תגובה לצביטת האצבע.
4. מרחו משחה עינית על שתי העיניים למניעת התייבשות והניחו את העכבר על כרית חימום לאורך כל ההליך.
5. לגלח את הקרקפת ולחטא את אזור הניתוח עם פובידון-יוד. יש ליצור חתך אורך של 1 ס"מ לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת.
6. נקה את הגולגולת החשופה עם H₂O_{2 באמצעות} מטלית כותנה בתנועה מעגלית כדי לדמיין את הברגמה. אם יש קצף מופרז, הסר אותו עם מטוש יבש.
7. מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית. הגדר את הברגמה כנקודת ייחוס (0.0) ומדד 2.5 מ"מ לרוחב ו-0.5 מ"מ קדמי לברגמה. סמן את אתר ההזרקה.
8. הסר את העכבר וקדח חור קטן בקואורדינטות המסומנות. הימנע מקידוח עמוק מדי כדי למנוע נזק מוחי.
9. התקן את המזרק על המזרק. החזירו את התאים והעמיסו את מזרק הזכוכית בנפח מספיק לשתי הזרקות (4–5 מיקרוליטר). אל תכין יותר משתי זריקות בכל פעם כדי למנוע התייצבות של התאים.
10. ממקם מחדש את העכבר בסטריאוטקס, יישר את המחט עם החור, והוריד אותו לאט לעומק של 3.0 מ"מ לתוך הפרנכימה של המוח. הזרקו תאים (או PBS סטריליים לשליטה מדומה) במהירות של 1 מיקרוליטר לדקה.
11. לאחר ההזרקה, השאר את המחט במקום לפחות דקה אחת, משך 1.5 מ"מ, החזק עוד דקה, ואז משיך לגמרי. זה ממזער זרימה חוזרת ומבטיח הצטברות תא תקינה.
12. סגור את החתך בתפרים ומרח פובידון-יוד. ניתן בופרנורפין (100 מיקרוליטר) תת-עורית.
13. השאר את העכבר על כרית חימום עד להחלמה מלאה מההרדמה. החזיר את העכבר לכלוב נקי ועקוב מדי יום אחר מצוקה, סימנים נוירולוגיים או זיהום.

3. פרפוזיה תוך-לבבית בעכבר

1. הרדמה עכברים באמצעות הזרקת I.p. של K-X (100 מיקרוליטר ל-10 גרם משקל גוף). אשר הרדמה מספקת על ידי היעדר תגובה לצביטת האצבע.
2. באמצעות מספריים, יש לבצע חתך בגודל 5–6 ס"מ דרך דופן הבטן ושני חתכים דרך כלוב הצלעות עד לעצם הבריח. היזהרו לא לחתוך כלי דם משמעותיים.
3. כשהלב חשוף, חתכו את העלייה הימנית כדי לאפשר זרימת דם. הזריק PBS קר לחדר השמאלי עם מזרק 20 מ"ל המצויד במחט 25G × 1 אינץ'.
4. הפסק את הפרפוזיה כאשר הנוזל שזורם החוצה נקי מדם. לעכברים בוגרים, זה דורש בערך 20 מ"ל PBS.

4. בידוד קרום המוח והפקעת הריח של העכבר

1. לאחר פרפוזיה תוך-לבבית, ערפו את ראש העכבר באמצעות מספריים כירורגיים. הסר את הקרקפת לגמרי כדי לחשוף את הגולגולת.
2. באמצעות מספריים, חתכו את הגולגולת במישור הרוחבי מהאזור האחורי לכיוון העיניים, תוך זהירות שלא לפגוע ברקמת המוח שמתחת. הוצא בעדינות את המוח באמצעות מלקחיים דקים, תוך הימנעות ממגע או גירוד של פני הפנים הפנימיים של הגולגולת.
3. לאחר הסרת המוח, קרום המוח הדורלי נשאר מחובר לפני השטח הפנימי של הגולגולת. טבלו את הגולגולת ב-PBS קר למשך לפחות 5 דקות כדי להקל על הפרדה שלמה של קרום המוח.
4. נתח את פקעת הריח מהאזור הקדמי של המוח והעבר אותה ל-PBS קר לאחסון זמני עד לעיבוד.
5. באמצעות מלקחיים דקים, ניתקו בעדינות את קרום המוח מפני הפנים של הגולגולת על ידי הרמת וקילוף עדין של שכבת הרקמה הדקה. העבר את קרום המוח ל-PBS קר עד לעיבוד נוסף. הימנעו מקריעת הרקמה כדי להבטיח התאוששות מיטבית במורד הזרם.

5. פירוק רקמות לתאים בודדים

1. מנינגים
   1. העבר את קרום המוח ל-3 מ"ל RPMI 1640 המכיל 0.05% קולגנאז II ו-DNase I. דגר במשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב עדין כל 10 דקות. עיכול יתר מפחית את חיוניות התאים ויש להימנע ממנו.
   2. להעביר רקמה מעוכלת דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרון לצינור של 50 מ"ל. נתק מכנית את הרקמה שנותרה על ידי לחיצה עדינה של בוכנת מזרק על המסננת ושטוף עם 5 מ"ל PBS.
   3. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט ותשהה מחדש את הכדור ב-3 מ"ל PBS.
   4. חזרה על צנטריפוגה. השליכו סופרנאנט, החזירו את הכדור האחרון בנפח שנותר, והעבירו לפלטת U-תחתית עם 96 בארות.
2. פקעת ריח
   1. הסר PBS והפרדה מכנית של רקמות באמצעות בומפה עם מזרק. הוסף 3 מ"ל תמיסת עיכול המכילה 0.02% קולגנאז II בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS). דגרו במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב עדין כל 10 דקות.
   2. העבירו מתלה תא דרך מסננת של 70 מיקרון לצינור של 50 מ"ל ושטפו עם 10 מ"ל PBS.
   3. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט ותשהה את הכדור האחרון בנפח שנותר. העבר לפלטת U-תחתית עם 96 בארות.
3. אחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיצבעו.
   הערה: בצעו צביעה באותו יום כדי להבטיח חיוניות מיטבית של התאים.

6. צביעת תאים ורכישת ציטומטריית זרימה

1. עיצוב פאנלים
   1. אנא עיין בטבלה 1.
      הערה: הפאנל בפרוטוקול זה תוכנן עבור ציטומטר זרימה ספקטרלי המצויד ב-4 לייזרים (סגול, כחול, צהוב-ירוק ואדום) ובסך הכל 51 גלאים (48 פלואורסצנציה + 3 ערוצי פיזור). יש לעצב את הפאנל בהתבסס על תצורת ציטומטר הזרימה והחלבונים/הסמנים הרלוונטיים.
2. צביעת תאים
   1. צנטריפוגה את לוחות ה-U עם 96 בארות בטמפרטורה של 300 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליך בזהירות את הסופרנטנט. מהשלב הזה ואילך, להגן על הלוחות מפני אור.
   2. הוסיפו צבע חיוניות של 50 מיקרוליטר (FVD, דילול 1:5000 אינץ' PBS) לבארות המתאימות ודגרו במשך 20 דקות ב-RT. שטפו עם 150 מיקרוליטר PBS, צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט. הוסף צבע חיוניות רק לבקרות ולדגימות.
   3. חסמו קולטני Fc על ידי דגירה של תאים עם 30 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-CD16/CD32 (0.01 מיקרוגרם/מ"ל בבופר FACS: PBS עם 2 מ"מ EDTA ו-0.5% BSA) למשך 10 דקות על הקרח. שטוף עם 170 מיקרוליטר בופר FACS, צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, וזרוק את הסופרנטנט.
   4. הוסף 30 מיקרוליטר תערובת נוגדנים או בקרה בצבע יחיד (שהוכן לפי דילול הנוגדנים המפורט בטבלת החומרים, בבופר FACS) ודגר במשך 20 דקות על הקרח. שטוף עם 170 מיקרוליטר בופר FACS, צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, וזרוק את הסופרנטנט.
   5. קיבעו תאים עם 100 מיקרוליטר 2% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 20 דקות ב-RT. שטפו עם 100 מיקרוליטר PBS, צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והשליכו סופרנאנט.
      הערה: עבור סמנים תוך-תאיים, החלף שלב זה בקיבוע וחדירות באמצעות סט בופר מסחרי, ולאחר מכן בצע צביעה תוך-תאית לפני השעיה סופית.
   6. החזירו את כדורי התא הסופיים ב-200 מיקרוליטר של בופר FACS. אחסון לוחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לרכישה על ציטומטר הזרימה.
3. בקרות צבע בודד ופלואורסצנציה מינוס אחד (FMO)
   1. דגימות מוצבעות בצבע יחיד נדרשות לאופטימיזציה של פירוק הערבוב. תאים משמשים לדגימות בצבע יחיד עבור הסמנים המראים שיאים חיוביים ושליליים. אחרת, עדיף ומומלץ להשתמש בחרוזי פיצוי כדי להשיג ערבוב אופטימלי. הכינו חרוזי פיצוי לנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      הערה: הכנת בקרות FMO היא שלב חשוב להשגת גייטינג תקין, במיוחד עבור סמנים שאינם מציגים שיאים חיוביים ושליליים ברורים. הכינו מספר דגימות FMO לפלואורוכרומים שונים לפי הצורך.
   2. הכינו דגימות FMO לאנטיגנים על פני התא על ידי ביצוע השלבים בחלק 6.2 אך החרגו את הנוגדן המעניין מתערובת הנוגדנים בשלב 6.2.4.
4. רכישת וניתוח ציטומטריית זרימה
   1. הפעל את הציטומטר, השיק את תוכנת רכישת ציטומטר הזרימה, והכן את חרוזי בקרת האיכות (טיפה אחת ב-300 מיקרוליטר PBS) בצינור דגימה בגודל 12x75 מ"מ בזמן שהמכונה מתחממת (לפחות 30 דקות).
   2. נקה את המכשיר על ידי הפעלה: 3 דקות 10% אקונומיקה, 30 דקות H₂O בקצב זרימה גבוה. החזירו את קצב הזרימה לנמוך לצעדים הבאים.
   3. בחר את לשונית האיכות, טען את הצינור והריץ את החרוזים על ידי לחיצה על התחלה. ברגע שבקרת האיכות מסתיימת, מופיעה הודעה שאומרת "עבר".
   4. גש ללשונית רכישה, בחר או צור את הניסוי והתחל את הרכישה על ידי סגירת תאים לפי FSC ו-SSC. השגת שליטה נקייה וצבעונית אחת, הרץ את אשף ההפרדה ושמור את ההגדרות. המשך לקנות דגימות מוכתמות.

תוצאות

לאחר חיסון תוך-גולגולתי של תאי E0771, עכברים פיתחו נגע סרטן שד מקומי בקואורדינטות הסטריאוטאקסיות היעד. הקואורדינטות הסטריאוטקסיות המיועדות לפרנכימה הסטריאטלית (2.5 מ"מ לרוחבי, 0.5 מ"מ קדמי לברגמה, ו-3.0 מ"מ ונטרלי מהברגמה) נבחרו בהתבסס על אטלסים סטנדרטיים למוח העכברים ותוארו קודם לכן גישות השתלה תוך-גולגולתית^15,16. אזור זה נמצא בשימוש נרחב להשתלת גידול תוך-גולגולתי בשל נגישותו ויכולתו לתמוך בהשתלת גידול תוך הפחתת דליפה לחדרים או לאורך מסלול ההזרקה. בפרוטוקול זה, ...

דיון

על ידי שילוב השתלת גידול תוך-גולגולתי עם בידוד, דיסוציאציה ואפיון חיסוני של קרום המוח והפקעת הריחית, פרוטוקול זה מאפשר חקירה מפורטת של האינטראקציה הדינמית בין מיקרו-סביבת גידול המוח לממשקי החיסון הקשורים למערכת העצבים המרכזית. השיטה מספקת היווצרות גידולים תוך-גולגולתיים ניתנת לשחזור, תליות תאים איכותיות, ופתרון תת-מערכת חיסונית חזקה. עם זאת, השתלה תוך-גולגולתית עוקפת את השלבים הראשונים של מפל הגרורות ואינה משחזרת לחלוטין את הגרורות הספונטניות במוח. לכן, חוקרים המעוניינים בהפצה מוקדמת עשו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphine
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable
Surgi